Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов

Катичев, Алексей Ростиславович

Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

Катичев, Алексей Ростиславович АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Нижний Новгород МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.21 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов»

Автореферат диссертации на тему "Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов"

005006091

На правах рукописи

Катичев Алексей Ростиславович

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ ПРИ НАБЛЮДЕНИИ СИЛЬНО РАССЕИВАЮЩИХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ОБЪЕКТОВ

01.04.21 - лазерная физика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 5 ЛЕК 2011

Нижний Новгород - 2011

005006091

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования —Нижгородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского"

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

Е. А. Сергеева

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

А. Н. Резник, Институт физики микроструктур РАН

кандидат физико-математических наук

А. И. Корытин, Институт прикладной физики РАН

Ведущая организация: Национальный исследовательский Саратовский госу-

дарственный университет им. Н. Г. Чернышевского, г. Саратов

Защита состоится -ffi " ЦШЮМ 20^г. в Д1 ртационного совета Д 212.160.07 при Нижегородском гос

СЮ

- часов на заседании

диссертационного совета Д 212.16У.07 прЬ Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 1, ауд. 420.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Автореферат разослан " "

2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета г/^-

к.ф.-м.н., доцент ' '^¿уОу В.В. Черепенников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Разработка и развитие методов неинвазивной визуализации внутренних структур биологических объектов является одной из приоритетных физических задач. Изучение структуры биотканей на микроскопическом уровне дает возможность исследовать принципы и механизмы функционирования живых организмов. Область применения данных методов достаточно широка и включает такие актуальные направления, как эмбриология, нейробиология, онкология, биоэлектрогенез растений и многие другие. В частности, нейробиология изучает механизмы формирования и обучения сложных нейрональных структур мозга млекопитающих как на срезах тканей мозга, так и на лабораторных животных. В эмбриологии важной задачей исследования является мониторинг процессов формирования живых организмов на клеточном уровне. Изучение механизмов генерации электрических сигналов у высших растений, играющих важную роль в процессе передачи информации и регуляции, является одной из фундаментальных задач современной биофизики и осуществляется с помощью систем имиджинга с клеточным разрешением. В онкологии актуальной задачей является анализ процессов проникновения и распространения новообразований в здоровую ткань. Для проведения такого рода исследований необходим метод, позволяющий осуществлять неинвазивный имиджинг структур биотканей. Основными требованиями при этом являются возможность получения изображений с различных слоев с высокой селекцией по глубине и клеточным пространственным разрешением. Среди современных методов анализа вышеуказанным требованиям соответствуют методы конфокальной и двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии. Данные методы базируются на принципах флуоресцентного анализа и заключаются в регистрации сигнала флуоресценции, возбуждаемой в объекте исследования с помощью лазерных остросфокусиро-ванных пучков.

В слабо рассеивающих средах разрешающая способность методов лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ) находится на уровне дифракционного предела и достигает 200 нм, что позволяет получать изображения структур биотканей на уровне отдельных органелл с глубин вплоть до нескольких миллиметров. Однако, ЗБ визуализация внутренней структуры сильно рассеивающих образцов биотканей методами ЛСФМ с сохранением высокого пространственного разрешения существенно ограничено. Выявление конкретных физических причин, лежащих в основе этих ограничений, а также определение рабочего диапазона глубин, в пределах которого возможно получение изображений с высоким разрешением, остаются актуальными проблемами оптики.

Известно, что многократное рассеяние вызывает изменение пространственного распределения флуоресценции и ухудшает условия детектирования полезного сигнала. Исследование влияния многократного рассеяния на качество изображений, получаемых системами ЛСФМ, требует подробного изуче-

ния распространения излучения в рассеивающих средах с учетом особенностей оптической системы формирования изображения. Существующие в настоящее время стандартные аналитические подходы либо ограничиваются рассмотрением однократного рассеяния, либо описывают диффузно рассеянное "бесструктурное" излучение на больших расстояниях от источника. Однако, в переходном интервале глубин, в котором в результате многократного рассеяния происходит трансформация лазерного пучка накачки, приводящая к потере разрешения," построенные в указанных приближениях модели неприменимы. В связи с этим все большую актуальность приобретает компьютерное моделирование изображений, формируемых методами ЛСФМ в условиях рассеяния, позволяющее проанализировать особенности процесса распространения лазерного пучка в средах, по своим оптическим свойствам приближенных к биологическим тканям, а также исследовать зависимость получаемых результатов от различных параметров системы формирования изображения и исследуемого объекта. На основании результатов моделирования можно получить универсальную оценку предельных глубин визуализации с помощью различных модификаций ЛСФМ, а также сформулировать рекомендации по оптимизации и расширению возможностей этого метода.

При численном моделировании распространения излучения в случайно-неоднородных средах наиболее часто применяется статистический метод Монте-Карло, основанный на многократном расчете случайных траекторий фотонов в исследуемой среде и последующем обобщении полученных результатов. Параметры, определяющие движение фотонов, задаются в соответствии с макроскопическими оптическими параметрами среды, а начальные условия и условия регистрации — согласно оптическим особенностям системы формирования изображения. Количество фотонов, необходимых для моделирования реальных физических процессов и минимизации шумов счета, составляет не менее 1 млн. При этом расчет их траекторий на стандартных вычислительных машинах будет занимать длительное время. В связи с данной проблемой возникает задача оптимизации программного кода и применение высокопроизводительных машин с параллельной архитектурой вычислений.

Цель диссертации

Целью диссертации является развитие численных моделей, описывающих формирование изображений сильно рассеивающих сред методами конфокальной и двухфотонной ЛСФМ, а также исследование областей применения данных методов и выработка рекомендаций по повышению их информативности. Для достижения данной цели в работе были решены следующие задачи:

1. Предложен и программно реализован для вычислителя с параллельной архитектурой численный алгоритм моделирования остросфокусиро-ванных гауссовых пучков в сильно рассеивающей среде на основе метода Монте-Карло.

2. Выполнено моделирование изображений рассеивающих объектов с однородным и неоднородным распределением флуорофора, сформированных методами конфокальной и двухфотонной ЛСФМ.

3. Для каждого из методов исследовано влияние оптических свойств среды, характеристик флуорофора и особенностей системы детектирования флуоресцентного сигнала на получаемые изображения, выявлены основные факторы, определяющие возможности регистрации полезного сигнала из сильно рассеивающих образцов, и определен рабочий диапазон глубин визуализации.

4. Исследованы особенности нелинейно возбуждаемой флуоресценции коллоидных полупроводниковых нанокристаллов ("квантовых точек") как наиболее перспективных флуорофоров для конфокальной и двухфотонной микроскопии.

Научная новизна

1. На основе статистического алгоритма Монте-Карло впервые предложены и программно реализованы для вычислителя с параллельной архитектурой метод численного моделирования остросфокусированных пучков и метод моделирования формирования изображений в установках лазерной сканирующей микроскопии;

2. На основе результатов моделирования впервые исследованы факторы, влияющие на предельную глубину визуализации сильно рассеивающих объектов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (кЛСФМ). Впервые получена численная оценка предельной глубины регистрации полезного сигнала в зависимости от оптических свойств среды и параметров системы формирования изображения;

3. На основе результатов численного моделирования изображений в системах двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии (дфЛСФМ) впервые получены зависимости предельной глубины визуализации от параметров рассеивающей среды;

4. Впервые выполнено численное моделирование формирования изображений рассеивающих объектов с однородным и неоднородным распределением флуорофора;

5. Впервые в модельном эксперименте проанализирован эффект ухудшения разрешающей способности системы дфЛСФМ при использовании коллоидных квантовых точек (С<18е/2п5) в качестве флуорофоров.

Практическая значимость работы

Результаты работы могут быть использованы при исследовании структуры биологических объектов методами ЛСФМ. Выявление факторов, влияющих на максимальную глубину визуализации и пространственное разрешение, позволит разработать рекомендации по оптимизации параметров установок, что может быть использовано для расширения возможностей существующих систем конфокальной и двухфотонной ЛСФМ.

Реализация метода численного моделирования для расчетов остросфоку-сированных пучков на вычислителях с параллельной архитектурой позволяет значительно сократить время выполнения численного эксперимента.

Проведенное исследование нелинейных свойств коллоидных квантовых точек, предлагаемых в качестве флуоресцентных маркеров для визуализации структуры биотканей методом дфЛСФМ, позволило найти предельные значения мощности пучка накачки, при которой, с одной стороны, сохраняется высокое пространственное разрешение, а с другой стороны, обеспечивается визуализация с наибольшей глубины.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод Монте-Карло моделирования распространения излучения в сильнорассеивающих средах, использующий квазиоптический подход для описания остросфокусированных гауссовых пучков и оптимизированный для вычислителя с параллельной архитектурой, позволяет моделировать процесс формирования изображений в системах ЛСФМ.

2. Предельная глубина визуализации структуры рассеивающей среды в системах кЛСФМ ограничена низким уровнем полезного сигнала, зависит от типа используемого флуорофора и характеристик оптической системы формирования изображения, и для стандартных флуорофоров составляет 2—3 длины рассеяния фотона.

3. Предельная глубина визуализации структуры рассеивающей среды в системах дфЛСФМ ограничена засветкой от слоев, лежащих выше фокальной плоскости, зависит от числовой апертуры объектива, но не зависит от типа используемого флуорофора, и составляет 6—7 длин рассеяния фотона.

4. Эффект насыщения у коллоидных квантовых точек CdSe/ZnS, используемых в качестве флуорофоров в методе дфЛСФМ, возникает при средней мощности излучения накачки 5—10 мВт и зависит от величины сечения двухфотонного поглощения, соотношения между интервалом следования импульсов накачки и времени релаксации флуоресценции, ухудшая при этом пространственное разрешение метода.

Апробация результатов и публикации

Обоснованность научных положений и выводов, сформулированных в диссертации, подтверждается применением широко распространенного метода численного моделирования распространения излучения в биологических тканях (метод Монте-Карло); совпадением ряда представленных в диссертации результатов в частных случаях с известными результатами, полученными другими авторами.

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях Topical Problem of Biophotonics (Нижний Новгород, Россия, 2009, 2011), международной конференции Biophysics & Bioelectrochemistry for Medicine (Чиснадиоара, Румыния, 2009), международной конференции Laser Appli-

cation in Life Sciences (Оулу, Финляндия, 2010), международных конференциях Saratov Fall Meeting - SFM (Саратов, Россия, 2008, 2009), международном симпозиуме Russian-Franch-Germany Laser Symposium (Нижний Новгород, Россия, 2009).

По теме диссертации опубликовано 13 тезисов докладов и 3 статьи в журналах из перечня, рекомендованного ВАК для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Личный вклад автора

Автором были самостоятельно разработаны алгоритмы моделирования, проведены численные и модельные эксперименты. Постановка задач и анализ полученных результатов проводились совместно с научным руководителем Сергеевой Е. А.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы и списка работ по диссертации. Общий объем диссертации составляет 105 страниц, включая 40 рисунков, список литературы из 111 наименований, список работ по теме диссертации из 16 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во Введении кратко обоснована актуальность работы, определены цели диссертационной работы, и описаны задачи, которые были выполнены для достижения поставленных целей, также приведена структура диссертации.

Глава 1 является обзорной и посвящена использованию метода ЛСФМ и его модификаций для визуализации структур биологических тканей. В параграфе 1.1 описываются спектральные характеристики некоторых компонент биотканей в оптическом диапазоне длин волн (400—1300 нм), поясняются особенности рассеяния излучения оптического диапазона в биотканях. Приводится анализ ряда высокоразрешающих оптических методов, развитых в настоящее время для исследования биологических объектов, указываются типичные параметры пространственного разрешения этих методов. В параграфе 1.2 рассматриваются общие принципы флуоресцентной микроскопии, а также описываются два наиболее распространенных вида ЛСФМ — конфокальная микроскопия и двухфотонная микроскопия. Основная характеристика, описывающая разрешение этих методов - так называемый радиус Эйри (р.Э.):

гэ = 0.61ША,

где Л — длина волны возбуждающего излучения, NA — числовая апертура объектива. Подчеркивается необходимость использования объективов с большим значением числовой апертуры NA (Ш>0.6) для достижения наилучшего пространственного разрешения ЛСФМ. В параграфе 1.3 обсуждаются требования к флуорофорам, используемым для маркирования компонент биотканей в методах конфокальной и двухфотонной микроскопии. В качестве перспектив-

ного класса флуорофоров отмечаются коллоидные квантовые точки в связи с их исключительной яркостью, а также особенностями спектров возбуждения и флуоресценции. В параграфе 1.4 рассмотрена проблема описания распространения оптического излучения в рассеивающих и поглощающих средах. Определены основные макроскопические параметры сред — показатели поглощения ц„ и рассеяния ц,, а также фазовая функция рассеяния р{9) и фактор анизотропии рассеяния равный среднему косинусу угла однократного рассеяния. Приведена краткая характеристика теории переноса излучения и её наиболее часто используемых приближений. Указано, что численное моделирование распространения излучения в рассеивающей и поглощающей среде более универсально по сравнению с решениями, полученными аналитическими методами. Дано краткое описание метода Монте-Карло — численного метода, широко используемого при моделировании оптических сигналов и изображений в средах, по своим оптическим характеристикам приближенных к биотканям. Обозначена необходимость оптимизации скорости численных расчетов в связи с большим объемом вычислений.

Глава 2 содержит оригинальные результаты и посвящена вопросам численного моделирования изображений, получаемых в системах ЛСФМ. В параграфе 2.1 приведены общие формулы, описывающие изображения в системах конфокальной и двухфотонной ЛСФМ в нерассеивающей среде. Теоретический подход к описанию построен на использовании функции размытия точки (ФРТ) системы построения изображений. Построены аналитические ФРТ для систем конфокальной и двухфотонной ЛСФМ, в которых в качестве возбуждающего излучения используются сфокусированные лазерные пучки с гауссовым профилем интенсивности. Для систем кЛСФМ продемонстрировано, каким образом размер конфокальной диафрагмы ("пинхола") сказывается на пространственном разрешении. Показано, что конфокальная диафрагма оказывает влияние не только на уменьшение размера элемента разрешения (определяемом по ширине функции размытия точки на уровне полувысоты), но и существенно снижает сигнал флуоресценции, регистрируемый из областей вне объема разрешения. Для систем дфЛСФМ показано, что размеры элементов поперечного и продольного разрешения несколько превышают соответствующие размеры пространственного разрешения конфокальной системы ЛСФМ при использовании пинхола оптимального размера, соответствующего одному радиусу Эйри в фокальной плоскости объектива. Параграф 2.2 посвящен разработке алгоритма компьютерного моделирования изображений, формируемых системами ЛСФМ в рассеивающей среде, на основе численного метода Монте-Карло. Рассмотрены принципы Монте-Карло моделирования распространения излучения в средах, по своим оптическим свойствам близких к биотканям, указаны особенности моделирования изображений структурированной флуоресцирующей среды в системах ЛСФМ. Для наиболее эффективного моделирования изображений предложен подход, основанный на численном расчете эффективной ФРТ в среде с заданными оптическими параметрами, с последующей сверткой этой функции с трехмерным распределением флуорофора. Для расчета ФРТ в системах ЛСФМ предложен метод Монте-Карло моделирования остросфокусиро-

ванных лазерных пучков с гауссовым профилем интенсивности. В параграфе 2.3 описана адаптация алгоритма численного моделирования эффективной ФРТ для вычислителя с параллельной архитектурой, которая позволила повысить скорость расчетов в 100 раз по сравнению с вычислениями на центральном процессоре.

Глава 3 содержит оригинальные результаты и посвящена Монте-Карло моделированию изображений биоткани, сформированных методом конфокальной ЛСФМ, а также исследованию ограничений данного метода, обусловленных рассеянием. При выполнении вычислений предполагалось, что оптические свойства среды одинаковы для излучения на длине волны накачки и флуБоресценции, поскольку величина сдвига Стокса в общем случае не превышает 100 нм. В параграфе 3.1 обоснована актуальность определения предельной глубины визуализации в системах конфокальной микроскопии. Глубина визуализации определяется глубиной фокусировки возбуждающего излучения в исследуемой среде. Ее типичные значения, достигаемые на установках конфокальной микроскопии, позволяют регистрировать сигнал флуоресценции из 3—4 слоя клеток, при этом построение изображений с больших глубин оказывается невозможным. Приводятся типичные оптические параметры биотканей а также факторы, предположительно ограничивающие глубину их визуализации. Для численной оценки предельной глубины визуализации необходимо исследовать структуру ФРТ в среде, характеризующейся многократным рассеянием. В следующих параграфах последовательно рассматривается влияние рассеяния на составляющую ФРТ, связанную с возбуждением флуоресценции, и на составляющую, определяющую детектирование флуоресценции. В параграфе 3.2 в рамках Монте-Карло моделирования эффективной ФРТ исследовано пространственное распределение эффективности возбуждения флуоресценции в рассеивающей среде. Моделирование проведено для сред с различными значениями показателей рассеяния и факторов анизотропии, характерными для биологических тканей в видимом спектральном диапазоне. При этом предполагалось, что линейное поглощение излучения в биоткани не оказывает заметного влияния на эффективность возбуждения флуоресценции в диапазоне глубин в пределах 1 мм. Для выяснения влияния рассеяния на пространственное разрешение была рассчитана форма профиля возбуждения флуоресценции вблизи фокуса. Результаты численного моделирования для различных длин рассеяния фотонов сравнивались с продольными (рис. 1 (а)-(в)) и поперечными (рис. 1 (г)-(е)) профилями гауссова пучка, распространяющегося в нерассе-ивающей поглощающей среде с соответствующей эффективной длиной поглощения фотона. Показано, что пространственное разрешение метода кЛСФМ не подвержено влиянию рассеяния до глубин визуализации, не превышающих 10—15 длин рассеяния фотона в среде 15 = 1//4. При дальнейшем увеличении глубины наблюдения острая фокусировка возбуждающего излучения "размывается" из-за многократного рассеяния, что приводит к потере разрешения и снижает селективность возбуждения.

Радиус, мкм Радиус, мкм Радиус, мкм

(г) (Д) (е)

Рис. 1. Профили продольного и поперечного распределения флуоресценции в рассеивающей среде с однородным распределением флуорофора. Для сравнения приведены профили мощности гауссова сфокусированного пучка в нерассеивающей поглощающей среде. Глубины фокусировки (а), (г) да = 1; (б), (д) да = 4; (в), (е) да = 10.

В параграфе 3.3 исследуется влияние рассеяния на собирающую способность систем конфокальной ЛСФМ для различных размеров конфокальной диафрагмы. Численное моделирование собирающей способности в рассеивающей среде проводится для тех глубин визуализации, для которых сохраняется острая фокусировка возбуждающего излучения. Несмотря на сохранение поперечного разрешения в таком диапазоне глубин, ФРТ будет отличаться из-за снижения эффективности детектирования фотонов. Часть флуоресцентных фотонов, "рожденных" в фокальном объеме и исходно удовлетворяющих условиям эффективной регистрации, на пути к объективу отклонится от исходного направления и не попадет в конфокальную диафрагму. Таким образом, величина флуоресцентного сигнала будет ослаблена по сравнению с нерассеивающей средой. На рис. 2 приведены графики собирающей способности системы конфокальной микроскопии для различных глубин фокусировки излучения накачки.

л &

ю о о о с о к (П

3 9 го

о. ^

ю о О

0,1-

0,01

1Е-3

1Е-4

100 д.Э. 10Д.Э. 1 Д.Э.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Глубина, мм

0,5

Рис. 2. Собирающая способность системы кЛСФМ как функция глубины фокусировки в рассеивающей среде (д, = 10 мм"1, g = 0.9, п = 1.33) для указанных значений радиусов ггинхола. Длина волны эмиссии 500 нм, МА = 1.

По результатам численного моделирования сделан вывод, что собирающая способность систем конфокальной ЛСФМ снижается с глубиной по закону, близкому к зависимости ехр(-ац^), где а =. 0.6/^1 - (ЫА/п)2 — фактор, связанный с числовой апертурой объектива и показателем преломления исследуемой среды п. Для диафрагм небольшого размера (1—10 р. Э.) скорость спадания не проявляет зависимости от размера конфокальной диафрагмы. В параграфе 3.4 определяется предельная глубина визуализации структур биотканей для систем конфокальной микроскопии. По мере увеличения глубины наблюдения уровень полезного сигнала, регистрируемого детектором системы, снижается и в итоге становится сравнимым с уровнем шумов детектора. При этом повышать уровень излучения накачки не позволяет требование неинвазивности зондирующего излучения. Для систем с ограниченной конфокальной диафрагмой (радиус менее 10 р. Э.) представляется возможным сделать оценку мощности сигнала флуоресценции в зависимости от предельной средней мощности излучения накачки Р0 на границе среды и параметров рассеяния в среде. В этом случае, при условии оптимального размера пинхола предельная глубина наблюдения рассчитывается как

-1л

1-лД-(М/лГ 2(1-(¿^тУ.!^,)-').^!-'

где I, — сечение поглощение флуорофоров, С — концентрация флуорофоров, Нтт — минимальное количество фотонов, необходимое для получения приемлемого соотношения сигнал/шум, А1 — время накопления сигнала для одной точки изображения,ц — квантовый выход флуоресценции, еет — энергия одного кванта флуоресценции. Для значений Ш>0.6, типичных для биологического эксперимента сечений поглощения флуорофоров, значений их концентрации и парамет-

ров регистрирующей аппаратуры, соответствующих коммерческим установкам кЛСФМ, максимальная глубина не превышает 2—3 длины рассеяния /„.

В параграфе 3.5 приводятся результаты численного моделирования изображений модельных сред с неоднородным распределением флуорофоров для различных показателей рассеяния и размеров конфокальной диафрагмы, а также результаты эксперимента по определению предельной глубины визуализации внутренних структур реальных биотканей. Демонстрируется соответствие теоретических выкладок предыдущих параграфов с результатами экспериментов и численного расчета.

Глава 4 содержит оригинальные результаты и посвящена моделированию изображений биоткани, формируемых системами дфЛСФМ. В параграфе 4.1 обсуждаются особенности построения эффективной ФРТ системы двухфотонной ЛСФМ в рассеивающей среде и рассматривается проблема численной оценки предельной глубины наблюдения. В параграфе 4.2 демонстрируются результаты численного расчета распределений плотности флуоресценции при различных глубинах фокусировки пучка накачки.

Показано, что на больших глубинах становится существенным влияние приповерхностной «засветки» (рис. 3). Глубина, начиная с которой флуоресценция из фокуса маскируется приповерхностным свечением, зависит как от параметров рассеяния среды, так и от числовой апертуры объектива. Данная глубина ограничивает область наблюдения структуры среды с высоким контрастом.

2 -о

Глубина, мм

0 02 04 0.6 0 8 Глубина, мм 1

- ■¡¡¡^ . О

Глубина, мм

Рис. 3. Двумерные распределения плотности двухфотонного возбуждения флуоресценции при различных глубинах фокусировки пучка накачки. Глубины фокусировки z,= 250 мкм, z2= 500 mkm,z3= 750 мкм. z4= 1000 мкм. Параметры моделирования /js= 10мм"1 NA = 0 6

^ =0,9.

Аксиальные зависимости мощности флуоресценции, проинтегрированной по поперечной координате, от глубины фокусировки пучка накачки, позволяют

оценить вклад всего объема области приповерхностной засветки. Параграф 4.3 посвящен определению предельной глубины визуализации изображений в системах двухфотонной ЛСФМ в рассеивающих средах. На основе аксиальных профилей мощности флуоресценции накачки проведены оценки для глубины фокусировки, на которой сигнал из области приповерхностного свечения оказывается выше, чем из фокального объема. Эту глубину можно приближенно считать верхней границей, дальше которой установки двухфотонной микроскопии не позволяют получать контрастные изображения. На рисунке 4 приведены графики зависимости предельной глубины визуализации от длины рассеяния фотонов в среде для нескольких комбинаций параметров g и А'А.

1,4-1

5 1,2- ^

я 1,0-х

й 0,85

к 0,6-х

ц 0,4-

§ 0,2-о. С

0,0-)-.-,-.-,-,-1-.-1---1—.

0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20

Длина рассеяния фотона в среде, мм

Рис. 4. Предельная глубина визуализации метода двухфотонной микроскопии для разных длин рассеяния фотонов, ограниченная приповерхностной флуоресценцией

Зависимость предельной глубины от длины рассеяния фотонов (15=1/^х) оказывается почти линейной. Согласно приведенным графикам, оценка предельной глубины для значения числовой апертуры МЛ = 0.6 составляет гтах= 6/Л а для ЫА = 1 гтт~715.

В параграфе 4.4 приведены результаты моделирования изображений модельных сред с неоднородным распределением флуорофоров. Продемонстрирована значительная потеря контраста получаемых изображений на глубинах, превышающих 5 длин рассеяния фотонов.

В Главе 5 рассмотрены особенности применения коллоидных полупроводниковых нанокристаллов ("квантовых точек") в качестве флуорофоров для систем двухфотонной ЛСФМ. В параграфе 5.1 описываются структура и флуоресцентные свойства квантовых точек гетероструктуры Сс&е/гпЗ. Отмечается, что в ряде экспериментальных исследований был замечен эффект насыщения флуоресценции у квантовых точек (КТ) при нелинейном возбуждении высокоинтенсивным фемтосекундным излучением. Стандартная теория двухфотонной флуоресценции, применяемая для растворов органических красителей, предсказывает квадратичную зависимость мощности двухфотонной флуоресценции от

мощности накачки. Однако при больших мощностях для квантовых точек данное соотношение не выполняется вследствие их высокого сечения двухфотон-ного поглощения. Данный эффект нуждается в специальном исследовании, поскольку он налагает ограничения на величину мощности излучения накачки при использовании КТ в качестве флуорофоров в системах двухфотонной ЛСФМ. В параграфе 5.2 рассматривается уточненная теоретическая модель эффекта насыщения флуоресценции квантовых точек при двухфотонном возбуждении. Она основана на использовании квазиклассического подхода, когда фемтосекундное импульсное излучение с гауссово-лоренцовским профилем интенсивности взаимодействует с квантовой двухуровневой системой с известными характеристиками возбуждения и релаксации. Данная модель позволяет рассчитать мощность двухфотонной флуоресценции в зависимости от мощности накачки и предсказать отклонение этой зависимости от квадратичного закона. Показано, что насыщение флуоресценции КТ обусловлено двумя факторами: большим значением сечения двухфотонного поглощения и медленной релаксацией частиц флуорофора в невозбужденное состояние по сравнению с характерным периодом следования импульсов накачки.

Для верификации разработанной модели был выполнен модельный эксперимент по измерению зависимости мощности двухфотонной флуоресценции суспензии коммерческих КТ гетероструктуры Сс^еЖпБ в окрестностях спектрального максимума от средней мощности накачки.

Средняя мощность накачки, мВт

Рис.5. Теоретические и экспериментальная зависимости средней мощности флуоресценции

от средней мощности накачки.

Данные эксперимента сопоставлены с результатами расчета сигнала флуоресценции в рамках стандартной теории двухфотонной флуоресценции и с помощью уточненной модели, учитывающей эффект насыщения (рис. 5). Показано, что в условиях, характерных для реального биологического эксперимента, эффект насыщения флуоресценции КТ начинает проявляться при средних

мощностях накачки, превышающих 5 мВт, что полностью соответствует предложенной теоретической оценке.

В параграфе 5.3 продемонстрировано, что эффект насыщения флуоресценции КТ вызывает ухудшение пространственного разрешения метода ДФМ. С использованием разработанной теоретической модели построены графики зависимости размеров элемента поперечного и продольного разрешения от средней мощности накачки. Показано, что в условиях, характерных для реального биологического эксперимента, при мощности накачки 10 мВт поперечный элемент разрешения увеличивается на 30%, а продольный - почти в 2 раза. Влияние эффекта насыщения также было изучено экспериментально: визуализирована рассеивающая среда, представляющая собой суспензию полистироловых шариков, маркированных квантовыми точками, для разных мощностей накачки. На рис. 6 продемонстрировано ухудшение разрешения при увеличении средней мощности накачки, которое заметно уже при 8 мВт.

181131 Им ИИвДа н

ШНШЯШНИНННВ! *1 ' ' ИИМЯИ!! 1|Ш11Ш1||ЯШ1|111|||1| 111111И1?ШВЯ1

Рис 6. Потеря пространственного разрешения метода ДФМ с ростом средней мощности ихтучения накачки вследствие насыщения двухфотонното поглощения у квантовых точек.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы, полученные в ходе выполнения диссертационной работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработан алгоритм численного моделирования изображений, формируемых методами конфокальной и двухфотонной микроскопии, с применением современных графических процессоров в качестве вычислителей. В его основе лежит принцип Монте-Карло моделирования для распространения излучения в рассеивающих и поглощающих средах. Алгоритм адаптирован для моделирования остросфокусированных гауссовых пучков с использованием квазиоптического подхода. Показано, что использование графических процессоров позволяет вплоть до сотен раз увеличить скорость расчетов.

2. Проведено численное моделирование изображений рассеивающей среды, формируемых кЛСФМ, с однородным и неоднородным распределением флуорофора. Показано, что в рассеивающей среде пространственное разрешение метода сохраняется до глубин, не превышающих 10—15 длин рассеяния фотонов. При этом глубина визуализации структуры рассеивающей среды в системах конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии ограничена не потерей пространственного разрешения, а низким уровнем полезного сигнала. Показано, что величина предельной глубины зависит от типа используемого флуорофора и характеристик оптической системы формирования изображения, и для стандартных флуорофоров не превышает 2—3 длины рассеяния фотона.

3. Проведено численное моделирование изображений рассеивающей среды, формируемых дфЛСФМ, с однородным и неоднородным распределением флуорофора. Выполнен расчет предельной глубины визуализации структуры биологических тканей в системах двухфотонной микроскопии. Показано, что в рассеивающей среде главным фактором, ограничивающим глубину визуализации, является возникновение приповерхностной флуоресценции, на фоне которой полезный сигнал из фок&чьной перетяжки не может быть зарегистрирован. Предельная глубина визуализации зависит от числовой апертуры объектива, но не зависит от типа используемого флуорофора и составляет 6—7 длин рассеяния фотонов в среде.

4. С помощью модельного эксперимента продемонстрирован эффект насыщения флуоресценции коллоидных квантовых точек С<ЗБе/2п5 в условиях, соответствующих двухфотонному возбуждению в коммерческих установках дфЛСФМ. Полученная зависимость мощности двухфотонной флуоресценции от мощности накачки демонстрирует отклонение от квадратичного закона при средних мощностях накачки, превышающих 5 мВт. В рамках теоретической модели показано, что эффект насыщения у квантовых точек возникает при средней мощности излучения накачки 5—10 мВт в зависимости от величины сечения двухфотонного поглощения и соотношения между интервалом следования импульсов накачки и временем релаксации флуоресценции. Показано, что в условиях, характерных для реального биологического эксперимента, насыщение двухфотонной флуоресценции квантовых точек приводит к ухудшению пространственного разрешения метода двухфотонной микроскопии.

СПИСОК РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1. Катичев А. Р., Сергеева Е. А. Проявления эффекта насыщения поглощения у коллоидных квантовых точек — флуорофоров для многофотонной флуоресцентной микроскопии // Оптика и спектроскопия. — 2009. — Т. 107. — №6, —С. 887—893.

2. Сергеева Е. А., Катичев А. Р., Киршчин М. Ю. Формирование сигнала двухфотонной флуоресцентной микроскопии в условиях сильного рассеяния: теоретическое и численное моделирование // Квантовая электроника.

— 2010. —Т. 40. —№ 12. — С. 1053—1061.

3. Брткина А.А., Дубасова Л.В., Балалаева КВ., Орлова А.Г., Сергеева Е.А., Катичев А.Р., Шахова Н.М. Исследование внутриклеточного распределения фотосенсибилизаторов трех типов в опухолевых клетках человека методом лазерной сканирующей микроскопии // Технологии живых систем.

— 2011,—№8

4. Sergeeva Е. A., Katichev A. R. Factors affecting ultimate imaging depth of two-photon fluorescence microscopy in scattering medium // Proceedings of SPIE.

— 2010. — Vol. 7547. — P. 75470K.

5. Katichev A. R., Sergeeva E. A. Deep fluorescence microscopy imaging of Biological tissues with the use of one- and two-photon excited quantum dots // International Spring School Biophysics and Bioelectrochemistry for Medicine 2009, Book of abstracts. — Bucharest: Romanian Society for Pure and Applied Biophysics, 2009 - P. 29.

6. Katichev A. R., Sergeeva E. A. Deep fluorescence microscopy imaging of Biological tissues with the use of two-photon excited quantum dots //Russian-French-German Laser Symposium 2009. Book of abstracts. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009. — P. 153.

7. Katichev A. R., Sergeeva E. A. Optical limitations of dense biotissue imaging with two-photon fluorescence microscopy // Topical Problems of Biophotonics 2009. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009 — P. 103.

8. Sergeeva E. A. Katichev A. R., Balalaeva I. V. Potentialities of deep two-photon fluorescence microscopy imaging using quantum dots // Topical Problems of Biophotonics 2009. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009 —P. 72.

9. Brilkina A. A., Dubasova L.V., Balalaeva I. V., OHova A. G., Sergeeva E. A., Katichev A. R., Shakhova N. M. Subcellular Distribution of photosensitizers in human cancer cells // Topical Problems of Biophotonics 2009. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009 — P. 359.

10. Sergeeva E.A., Katichev A. R., Balalaeva I. V., Brilkina A. A. Study of excitation saturation effect in colloidal quantum dots used for multiphoton fluorescence microscopy // Advanced Laser Technologies — ALT 2008, Book of abstracts.

— Szeged: LaserSkill Ltd., 2008. — P. 213.

11. Sergeeva E. A., Katichev A. R., Shirmanova M. V. et al. Imaging the 3D Vascular distribution of colloid quantum dots in mice using multiphoton fluorescence microscopy // Laser Applications in Life Sciences—2010, Book of Abstracts. — Tampere: Tampere university press, 2010. — P. 72.

12. Katichev A. R., Sergeeva E. A. Effect of pinhole size on collection efficiency of commercial multiphoton microscopy systems in scattering objects // Laser Applications in Life Sciences—2010, Book of Abstracts. — Tampere: Tampere university press, 2010. — P. 284.

13. Шахова H. M., Балалаева И. В., Каптчев А. Р. и др. Разработка технологии мониторинга фотодинамической терапии на основе методов оптического биоимиджинга // Фундаментальные науки — медицине, Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям программы в 2009 г. — М.: фирма "Слово", 2009. — С. 95.

14. Фикс И. И., Кириллин М. Ю., Катичев А. Р. Реализация метода Монте-Карло на CUDA для задач оптической биомедицинской диагностики // Применение гибридных высокопроизводительных вычислительных систем для решения научных и инженерных задач. Доклады в рамках всероссийской научно-практической конференции — Н. Новгород: ННГУ, 2011 — С. 15—17.

15. Katichev А. 11, Sergeeva Е. A. GPU-Based Simulation of Nonlinear Fluorescence Imaging in Biotissue with Inhomogeneous Fluorophore Distribution // Topical Problems of Biophotonics 2011. Proceedings. —N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2011 — P. 55.

16. Sergeeva E. A., Katichev A. R., Kirillin M. Yu. Refined Forward Problem Solution for Biotissue Optical Properties Reconstruction // Topical Problems of Biophotonics 2011. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2011—P. 93.

ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение

Глава 1. Лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия как метод визуализации структуры биотканей

1.1. Оптические методы визуализации структур биотканей

1.2. Методы лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии

1.3. Флуорофоры для систем ЛСФМ. Проблема выбора флуорофоров для систем двухфотонной микроскопии

1.4. Проблема описания распространения излучения в рассеивающих средах

Глава 2. Численное моделирование изображений лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ)

2.1. Общие формулы, описывающие изображения в системах конфокальной и двухфотонной ЛСФМ в нерассеивающей среде

2.2. Разработка алгоритма компьютерного моделирования изображений ЛСФМ в рассеивающей среде на основе численного метода Монте-Карло

2.3. Ускорение расчетов с помощью графических процессоров

2.4. Основные выводы

Глава 3. Монте-Карло моделирование изображений биоткани, сформированных методом конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии

3.1. Проблема предельной глубины визуализации в кЛСФМ

3.2. Пространственное распределение флуоресценции, возбуждаемой в результате линейного поглощения излучения накачки в сильно рассеивающей среде

3.3. Собирающая способность системы кЛСФМ в рассеивающей среде

3.4. Предельная глубина визуализации структуры биотканей для систем кЛСФМ

3.5. Моделирование изображений рассеивающих сред с неоднородным распределением флуорофора. Экспериментальная проверка максимально достижимой глубины визуализации биологических тканей

3.6. Основные выводы

Глава 4. Монте-Карло моделирование изображений биоткани, сформированных методом двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии

1.1. Особенности моделирования эффективной функции рассеяния точки установок двухфотонной микроскопии

1.2. Распределение мощности двухфотонно возбуждаемой флуоресценции в рассеивающей среде с однородным распределением флуорофоров

1.3. Определение предельной глубины наблюдения дфЛСФМ в рассеивающих средах

1.4. Моделирование изображений рассеивающих сред с неоднородным распределением флуорофоров

1.5. Основные выводы

Глава 5. Использование коллоидных квантовых точек в качестве флуорофоров для повышения глубины визуализации в системах двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии

5.1. Структура и флуоресцентные свойства квантовых точек

5.2. Описание эффекта насыщения флуоресценции квантовых точек при двухфотонном поглощении

5.3. Влияние эффекта насыщения на пространственное разрешение изображений структуры биотканей в системах дфЛСФМ

5.4. Основные выводы Заключение Литература

Список работ по диссертации

Подписано в печать 24.11.2011. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Тир. 100 экз. Зак. 786.

Типография Нижегородского госуниверситета 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Катичев, Алексей Ростиславович

Введение.

Глава 1. Лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия как метод визуализации структуры биотканей.

1.1. Оптические методы визуализации структур биотканей.

1.2. Метод лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии.

1.3. Флуорофоры для систем ЛСФМ. Проблема выбора флуорофоров для систем двухфотонной микроскопии.

1.4. Проблема описания распространения излучения в рассеивающих средах.

Глава 2. Численное моделирование изображений лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии (ЛСФМ).

2.1. Общие формулы, описывающие изображения в системах конфокальной и двухфотонной ЛСФМ в нерассеивающей среде.

2.2. Разработка алгоритма компьютерного моделирования изображений ЛСФМ в рассеивающей среде на основе численного метода Монте-Карло.

2.3. Ускорение расчетов с помощью графических процессоров.

Введение диссертация по физике, на тему "Исследование предельных возможностей лазерной сканирующей микроскопии при наблюдении сильно рассеивающих флуоресцирующих объектов"

Разработка и развитие методов неинвазивной визуализации внутренних структур биологических объектов является одной из приоритетных физических задач. Изучение структуры биотканей на микроскопическом уровне дает возможность исследовать принципы и механизмы функционирования живых организмов. Область применения данных методов достаточно широка и включает такие актуальные направления, как эмбриология, нейробиология, онкология, биоэлектрогенез растений и многие другие. В частности, нейробиология изучает механизмы формирования и обучения сложных нейрональных структур мозга млекопитающих как на срезах тканей мозга, так и на лабораторных животных. В эмбриологии важной задачей исследования является мониторинг процессов формирования живых организмов на клеточном уровне. Изучение механизмов генерации электрических сигналов у высших растений, играющих важную роль в процессе передачи информации и регуляции, является одной из фундаментальных задач современной биофизики и осуществляется с помощью систем имиджинга с клеточным разрешением. В онкологии актуальной задачей является анализ процессов проникновения и распространения новообразований в здоровую ткань. Для проведения такого рода исследований необходим метод, позволяющий осуществлять неинвазивный имиджинг структур биотканей. Основными требованиями при этом являются возможность получения изображений с различных слоев с высокой селекцией по глубине и клеточным пространственным разрешением. Среди современных методов анализа вышеуказанным требованиям соответствуют методы конфокальной и двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии. Данные методы базируются на принципах флуорес- Д;' 7 центного анализа и заключаются в регистрации сигнала флуоресценции, возбуждаемой в объекте исследования с помощью лазерных остросфокусированных пучков.

Известно, что многократное рассеяние вызывает изменение пространственного распределения флуоресценции и ухудшает условия детектирования полезного сигнала.

Исследование влияния многократного рассеяния на качество изображений, получаемых системами ЛСФМ, требует подробного изучения распространения излучения в рассеивающих средах с учетом особенностей оптической системы формирования изображения. Существующие в настоящее время стандартные аналитические подходы либо ограничиваются рассмотрением однократного рассеяния, либо описывают диффузно рассеянное "бесструктурное" излучение на больших расстояниях от источника. Однако, в переходном интервале глубин, в котором в результате многократного рассеяния происходит трансформация лазерного пучка накачки, приводящая к потере разрешения, построенные в указанных приближениях модели неприменимы. В связи с этим все большую актуальность приобретает компьютерное моделирование изображений, формируемых методами ЛСФМ в условиях рассеяния, позволяющее проанализировать особенности процесса распространения лазерного пучка в средах, по своим оптическим свойствам приближенных к биологическим тканям, а также исследовать зависимость получаемых результатов от различных параметров системы формирования изображения и исследуемого объекта. На основании результатов моделирования можно получить универсальную оценку предельных глубин визуализации с помощью различных модификаций ЛСФМ, а также сформулировать рекомендации по оптимизации и расширению возможностей этого метода.

Цель диссертации

Целью диссертации является развитие численных моделей, описывающих формирование изображений сильно рассеивающих сред методами конфокальной и двухфо-тонной ЛСФМ, а также исследование областей применения данных методов и выработка рекомендаций по повышению их информативности. Для достижения данной цели в работе были решены следующие задачи:

1. Предложен и программно реализован для вычислителя с параллельной архитектурой численный алгоритм моделирования остросфокусирован-ных гауссовых пучков в сильно рассеивающей среде на основе метода Монте-Карло.

Новизна полученных результатов

1. На основе статистического алгоритма Монте-Карло впервые предложены и программно реализованы для вычислителя с параллельной архитектурой метод численного моделирования остросфокусированных пучков и ¡V метод моделирования формирования изображений в установках лазерной сканирующей микроскопии;

5. Впервые в модельном эксперименте проанализирован эффект ухудшения разрешающей способности системы дфЛСФМ при использовании коллоидных квантовых точек (Сс18е/2п8) в качестве флуорофоров.

На защиту выносятся следующие научные положения

1. Метод Монте-Карло моделирования распространения излучения в силь-норассеивающих средах, использующий квазиоптический подход для описания остросфокусированных гауссовых пучков и оптимизированный для вычислителя с параллельной архитектурой, позволяет моделировать процесс формирования изображений в системах ЛСФМ.

4. Эффект насыщения у коллоидных квантовых точек СёБе/гпЗ, используемых в качестве флуорофоров в методе дфЛСФМ, возникает при средней мощности излучения накачки 5—10 мВт и зависит от величинь1 сечения двухфотонного поглощения, соотношения между интервалом следования импульсов накачки и времени релаксации флуоресценции, ухудшая при этом пространственное разрешение метода.

Практическая значимость

Реализация метода численного моделирования для расчетов остросфокусирован-ных пучков на вычислителях с параллельной архитектурой позволяет значительно сократить время выполнения численного эксперимента.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы и списка работ по диссертации. Общий объем диссертации составляет 105 страниц, включая 40 рисунков, список литературы из 111 наименований, список работ по диссертации из 16 наименований.

Заключение диссертации по теме "Лазерная физика"

5.4. Основные выводы

В результате теоретического и экспериментального исследования эффекта насыщения флуоресценции при двухфотонном поглощении фемтосекундного лазерного излучения коллоидными квантовыми точками Ссйе^пБ, используемыми в качестве флуорофоров в коммерческих установках метода двухфотонной ЛСФМ, показано, что данный эффект приводит к ухудшению пространственного разрешения метода при средней мощности излучения накачки более 5 мВт.

Заключение

Сформулируем кратко основные результаты диссертации.

1. Разработан быстродействующий алгоритм численного моделирования изображений, формируемых методами конфокальной и двухфотон-ной ЛСФМ. Алгоритм основан на принципе Монте-Карло моделирования распространения излучения в рассеивающих средах, адаптирован для моделирования остросфокусированных гауссовых пучков и ориентирован на применение современных графических процессоров в качестве вычислителей.

2. На основе моделирования процесса формирования изображений методом конфокальной ЛСФМ установлено, что в рассеивающей среде пространственное разрешение метода сохраняется до глубин, не превышающих 10-15 длин рассеяния фотона. Показано, что предельная глубина визуализации ограничена низким уровнем полезного сигнала и зависит от типа используемого флуорофора и характеристик оптической системы формирования изображения. Для стандартных флуорофоров глубина визуализации не превышает 2-3 длины рассеяния.

3. На основе моделирования процесса формирования изображений методом двухфотонной ЛСФМ установлено, что главным фактором, ограничивающим глубину визуализации данным методом в рассеивающей среде, является возникновение приповерхностной флуоресценции. Показано, что предельная глубина визуализации зависит от числовой апертуры объектива и составляет 6-7 длин рассеяния фотона.

4. В результате теоретического и экспериментального исследования эффекта насыщения флуоресценции при двухфотонном поглощении фем-тосекундного лазерного излучения коллоидными квантовыми точками Сс18е/Еп8, используемыми в качестве флуорофоров в коммерческих установках метода двухфотонной ЛСФМ, показано, что данный эффект приводит к ухудшению пространственного разрешения метода при средней мощности излучения накачки более 5 мВт.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Катичев, Алексей Ростиславович, Нижний Новгород

1. Boulnois, J. -L. Photophysical processes in recent medical laser developments: A review // Lasers in Medical Science. — 1986. — Т. 1, № 1. — C. 47—66.

2. Patterson, M. S., Wilson, В. C., Wyman, D. R. The propagation of optical radiation in tissue I. Models of radiation transport and their application // Lasers in Medical Science. — 1991. —T. 6, № 2. — C. 155—168.

3. Schmitt, J. M„ Kumar, G. Optical scattering properties of soft tissue: a discrete particle model // Appl Opt. — 1998. — T. 37, № 13. — C. 2788—2797.

4. Drezek, R., Dunn, A., Richards-Kortum, R. Light scattering from cells: finite-difference time-domain simulations and goniometric measurements // Appl Opt. — 1999. — T. 38, № 16. — C. 3651—3661.

5. Бори, M., Вольф, Э. Основы оптики. — M.: Наука. Гл. ред. физ.-мат. лит., 1973 — 720 с.

6. Deng, X., Gu, М. Penetration depth of single-, two-, and three-photon fluorescence microscopic imaging through human cortex structures: Monte Carlo simulation // Appl Opt. — 2003. — T. 42, № 16. — C. 3321—3329.

7. Тучин, В. В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях: • 2-е изд., испр. и доп. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2010 — 488 с.

8. Masters, В. R. Encyclopedia of Life Sciences. Wiley Online Library, 2010

9. White, J. G., Amos, W. В., Fordham, M. An Evaluation of Confocal Versus Conventional Imaging of Biological Structures by Fluorescence Light-Microscopy // Journal Of Cell Biology. —1987. — T. 105, № 1. — C. 41—48.

10. Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional architecture of a polytene nucleus // Nature. —1983. — T. 302, № 5910. — C. 676—681.11. Пат. US 3013467, 1961

11. Schmitt, J. M., Kniittel, A., Yadlowsky, M. Confocal microscopy in turbid media // Journal of the Optical Society of America A. —1994. — Т. 11, № 8. — C. 2226—2235.

12. Sheppard, C. J. R., Wilson, T. The Image of a Single Point in Microscopes of Large Numerical Aperture // Proceedings of the Royal Society of London Series A, Mathematical and Physical Sciences. — 1982. — T. 379, № 1776. — C. 145—158.

13. Carlsson, K„ Danielsson, P. E., Lenz, R., Liljeborg, A., et al. Three-dimensional microscopy using a confocal laser scanning microscope // Optics letters. — 1985. — T. 10, № 2. —C. 53—55.

14. Carlsson, K., Aslund, N. Confocal imaging for 3-D digital microscopy // Applied optics. — 1987. — T. 26, № 16. — C. 3232—3238.

15. Zill, S., Frazier, S. F., Neff, D., Quimby, L., et al. Three-dimensional graphic reconstruction of the insect exoskeleton through confocal imaging of endogenous fluorescence // Microscopy Research and Technique. — 2000. — T. 48, № 6. — C. 367—384.

16. Petford, N., Miller, J. A. Three-dimensional imaging of fission tracks using confocal scanning laser microscopy // American Mineralogist;(United States). — 1992. — T. 77

17. Pironon, J., Canals, M., Dubessy, J., Walgenwitz, F., Laplace-Builhe, C. Volumetric reconstruction of individual oil inclusions by confocal scanning laser microscopy // European Journal Of Mineralogy. — 1998. — T. 10, № 6. — C. 1143—1150.

18. Anamalay, R. V., Kirk, T. B., Panzera, D. Numerical Descriptors For The Analysis Of Wear Surfaces Using Laser-Scanning Confocal Microscopy // Wear. — 1995. — T. 181 — C. 771—776.

19. Hamza, R., Zhang, X. D. D., Macosko, C. W., Steve, R., Listemann, M. Imaging open-cell polyurethane foam via confocal microscopy // Polymeric Foams: Science And Technology. — 1997. — T. 669 — C. 165—177.

20. Ling, X., Pritzker, M. D„ Byerley, J., Burns, С. M. Confocal scanning laser microscopy of polymer coatings // Journal Of Applied Polymer Science. — 1998. — T. 67, № 1. —C. 149—158.

21. Paddock, S. W. Further developments of the laser scanning confocal microscope in biomedical research // Proc Soc Exp Biol Med. — 1996. — T. 213, № 1. — C. 24—31.

22. Strieker, S. A., Whitaker, M. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in living cells // Microscopy research and technique. — 1999. — T. 46, № 6. — C. 356—369.

23. Amos, W. В., White, J. G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research // Biol Cell. — 2003. — T. 95, № 6. — C. 335—342.

24. Bohnke, M., Masters, B. R. Confocal microscopy of the cornea // Progress in Retinal and Eye Research. — 1999. — T. 18, № 5. — C. 553—628.

25. Феофанов, А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Усп. биол. хим. — 2007. — Т. 47 — С. 371— 410.

26. Vicidomini, G. Image Formation in Fluorescence Microscopy // From Cells to Proteins: Imaging Nature across Dimensions. — 2005. — C. 371—393.

27. Fricker, M. D„ Chow, С. M., Errington, R. J., May, M., et al. Quantitative imaging of intact cells and tissues by multi-dimensional confocal fluorescence microscopy I I Experimental Biology Online. — 1997. — T. 2, № 19. — C. 1-23.

28. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences // Nat Biotechnol. — 2003. — T. 21, № 11. — C. 1369—1377.

29. Centonze, V. E„ White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging // Biophys J. — 1998. — T. 75, № 4. — C. 2015—2024.

30. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy // Science. — 1990. — T. 248, № 4951. — C. 73—76.

31. So, P. T. C., Dong, C. Y„ Masters, B. R., Berland, K. M. Two-Photon Excitation Fluorescence Microscopy // Annual Reviews of Biomedical Engineering. — 2000. — T. 2 — C. 399—429.

32. Diaspro, A., Bianchini, P., Vicidomini, G., Faretta, M., et al. Multi-photon excitation microscopy // Biomed Eng Online. — 2006. — T. 5 — C. 36.

33. He, G. S., Yong, K. T., Zheng, Q., Sahoo, Y., et al. Multi-photon excitation properties of CdSe quantum dots solutions and optical limiting behavior in infrared range // Opt Express. — 2007. — T. 15, № 20. — C. 12818—12833.

34. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy // J Microsc. — 2011. — T. 243, № 3. — C. 221—226.

35. Le Grand, Y., Leray, A., Guilbert, T., Odin, C. Non-descanned versus descanned epifluorescence collection in two-photon microscopy: Experiments and Monte Carlo simulations // Optics Communications. — 2008. — T. 281, № 21. — C. 5480—5486.

36. Tromberg, B. J., Shah, N., Lanning, R., Cerussi, A., et al. Non-invasive in vivo characterization of breast tumors using photon migration spectroscopy // Neoplasia. — 2000.1. T. 2, № 1-2. — C. 26—40.i

37. Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media // Optics Communications. — 2001. — T. 188 — C. 25—29.

38. Gu, M., Schilders, S. P., Gan, X. Two-photon fluorescence imaging of microspheres embedded in turbid media // Journal of Modern Optics. — 2000. — T. 47, № 6.1. C. 959—965.

39. Gan, X., Gu, M. Spatial distribution of single-photon and two-photon fluorescence light in scattering media: Monte Carlo simulation // Appl Opt. — 2000. — T. 39, № 10. — C. 1575—1579.

40. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:A1203 regenerative amplifier // Opt Lett. — 2003. — T. 28, № 12. — C. 1022—1024.

41. Xu, C., Webb, W. W. Measurement of two-photon excitation cross sections of molecular fluorophores with data from 690 nm to 1050 nm // J. Opt. Soc. Am. B. — 1996. — T. 13, №3. — C. 481—491.

42. Zimmermann, C., Vuletic, V., Hemmerich, A., Ricci, L., Hänsch, T. W. Design for a compact tunable Ti:sapphire laser // Optics Letters. — 1995. — T. 20, № 3. — C. 297—299.

43. Rubart, M. Two-photon microscopy of cells and tissue // Circ Res. — 2004. — T. 95, № 12. —C. 1154—1166.

44. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy // Nat Methods. — 2005. — T. 2, № 12. — C. 932—940.

45. Feijö, J. A., Moreno, N. Imaging plant cells by two-photon excitation // Protoplasma. — 2004. — T. 223, № 1. — C. 1-32.

46. Andersson, H., Baechi, T., Hoechl, M., Richter, C. Autofluorescence of living cells // Journal of microscopy. —1998. — T. 191 — C. 1—7.

47. Tsien, R. Y„ Ernst, L., Waggoner, A. Fluorophores for confocal microscopy: photophysics and photochemistry // Handbook of biological confocal microscopy. — 2006. — C. 338—352.

48. Bestvater, F., Spiess, E., Stobrawa, G., Hacker, M., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging // J Microsc. — 2002. — T. 208, № Pt 2. — C. 108—115.

49. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels // Science. — 1998. — T. 281, № 5385. — C. 2013—2016.

50. Chan, W. C. W., Nie, S. Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection // Science. — 1998. — T. 281, № 5385. — C. 2016—2018.

51. Michalet, X., Pinaud, F. F., Bentolila, L. A., Tsay, J. M., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics // Science. — 2005. — T. 307, № 5709. — C. 538—544.

52. Pinaud, F., Michalet, X., Bentolila, L. A., Tsay, J. M., et al. Advances in fluorescence imaging with quantum dot bio-probes // Biomaterials. — 2006. — T. 27, № 9. — C. 1679—1687.

53. Walling, M. A., Novak, J. A., Shepard, J. R. Quantum dots for live cell and in vivo imaging // Int J Mol Sci. — 2009. — T. 10, № 2. — C. 441—491.

54. Padilha, L., Fu, J., Hagan, D., Van Stryland, E., et al. Two-photon absorption in CdTe quantum dots // Opt Express. — 2005. — T. 13, № 17. — C. 6460—6467.

55. Hardman, R. A Toxicologic Review of Quantum Dots: Toxicity Depends on Physicochemical and Environmental Factors // Environmental Health Perspectives. — 2006.

56. Т. 114, № 2. — C. 165—172.

57. Исимару, А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах: В 2-х томах. — М.: Мир, 1981 — 285 с.

58. Marchesini, R., Bertoni, A., Andreola, S., Melloni, E., Sichirollo, A. E. Extinction and absorption coefficients and scattering phase functions of human tissues in vitro // Appl Opt. — 1989. — T. 28, № 12. — C. 2318—2324.

59. Schmitt, J. M., Ben-Letaief, K. Efficient Monte Carlo simulation of confocal microscopy in biological tissue // J Opt Soc Am A Opt Image Sei Vis. — 1996. — T. 13, № 5.1. C. 952—961.

60. Patterson, M. S., Wilson, B. C., Wyman, D. R. The propagation of optical radiation in tissue. II: Optical properties of tissues and resulting fluence distributions // Lasers in Medical Science. — 1991. — T. 6, № 4. — C. 379—390.

61. Kienle, A., Patterson, M. S., Dögnitz, N., Bays, R., et al. Noninvasive Determination of the Optical Properties of Two-Layered Turbid Media // Appl Opt. — 1998.1. T. 37, № 4. — C. 779—791.

62. Johns, M., Giller, С., German, D., Liu, H. Determination of reduced scattering coefficient of biological tissue from a needle-like probe // Optics Express. — 2005. — T. 13, №13. — C. 4828-4842.

63. Cheong, W. F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues // Quantum Electronics, IEEE Journal of. — 1990. — T. 26, № 12. — C. 2166—2185.

64. Yoon, G., Welch, A., Motamedi, M., Gemert, M. Development and application of three-dimensional light distribution model for laser irradiated tissue // Quantum Electronics, IEEE Journal of. — 1987. — T. 23, № 10. — C. 1721—1733.

65. Simpson, C. R., Kohl, M., Essenpreis, M., Cope, M. Near-infrared optical properties of ex vivo human skin and subcutaneous tissues measured using the Monte Carlo inversion technique // Phys Med Biol. — 1998. — T. 43, № 9. — C. 2465—2478.

66. Palmer, G. M., Ramanujam, N. Monte Carlo-based inverse model for calculating tissue optical properties. Part I: Theory and validation on synthetic phantoms // Appl Opt. — 2006. — T. 45, № 5. c. 1062—1071.

67. Кравцов, Ю. А., Орлов, Ю. И. Геометрическая оптика неоднородных сред. — М.: Наука, 1980

68. Contini, D., Martelli, F., Zaccanti, G. Photon migration through a turbid slab described by a model based on diffusion approximation. I. Theory // Appl Opt. — 1997. — T. 36, № 19. — C. 4587—4599.

69. Kim, A. D„ Ishimaru, A. Optical diffusion of continuous-wave, pulsed, and density waves in scattering media and comparisons with radiative transfer // Appl Opt. — 1998. — T. 37, № 22. — C. 5313—5319.

70. Chen, В., Stamnes, K, Stamnes, J. J. Validity of the diffusion approximation in ,, bio-optical imaging // Appl Opt. — 2001. — T. 40, № 34. — C. 6356—6366.

71. Kokhanovsky, A. A. Small-angle approximations of the radiative transfer theory // Journal of Physics D: Applied Physics. — 1997. — T. 30 — C. 2837.

72. Будак, В. П., Сармин, С. Э. Решение уравнения переноса излучения методом сферических гармоник в малоугловой модификации // Оптика атмосферы. — 1990. — Т. 3, № 9. — С. 981—987.

73. Howell, J. R. Application of Monte Carlo to heat transfer problems // Advances in heat transfer. — 1969. — T. 5 — C. 1-54.

74. Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues // Comput Methods Programs Biomed. — 1995. — T. 47, № 2. —C. 131—146.

75. Boas, D., Culver, J., Stott, J., Dunn, A. Three dimensional Monte Carlo code for photon migration through complex heterogeneous media including the adult human head // Opt Express. — 2002. — T. 10, № 3. — C. 159—170.

76. Fang, Q. Mesh-based Monte Carlo method using fast ray-tracing in Pliicker coordinates //Biomed Opt Express. — 2010. — Т. 1, № 1. — C. 165—175.

77. Fang, Q., Boas, D. A. Monte Carlo simulation of photon migration in 3D turbid media accelerated by graphics processing units // Optics express. — 2009. — T. 17, № 22. — C. 20178—20190.

78. Ren, N., Liang, J., Qu, X., Li, J., et al. GPU-based Monte Carlo simulation for light propagation in complex heterogeneous tissues // Opt Express. — 2010. — T. 18, № 7. — C. 6811—6823.

79. Alerstam, E., Yip Lo, W. C., Han, T. D., Rose, J., et al. Next-generation acceleration and code optimization for light transport in turbid media using GPUs // Biomed Opt Express. — 2010. — Т. 1, № 2. — C. 658—675.

80. Webb, R. H. Confocal optical microscopy // Reports on Progress in Physics. — 1996. —T. 59 — C.427.

81. Шен, И. P. Принципы нелинейной оптики. — М.: Наука. Гл. ред. физ.-мат. лит., 1989 — 560 с.

82. Prahl, S. A., Keijzer, М„ Jacques, S. L., Welch, A. J. A Monte Carlo model of light propagation in tissue // Dosimetry of Laser Radiation in Medicine and Biology. — 1989. — T. 5 — C. 102—111.

83. Milsom, P. K. A ray-optic, Monte Carlo, description of a Gaussian beam waist-applied to reverse saturable absorption // Applied Physics B: Lasers and Optics. — 2000. — T. 70, № 4. — C. 593—599.

84. Swartling, J., Pifferi, A., Enejder, A. M., Andersson-Engels, S. Accelerated Monte Carlo models to simulate fluorescence spectra from layered tissues // J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. — 2003. — T. 20, № 4. — C. 714—727.

85. Alerstam, E., Svensson, T., Andersson-Engels, S. Parallel computing with graphics processing units for high-speed Monte Carlo simulation of photon migration I IJ Biomed Opt.2008. — T. 13, № 6. — C. 060504.

86. Arndt-Jovin, D. J., Robert-Nicoud, M., Kaufman, S. J., Jovin, T. M. Fluorescence digital imaging microscopy in cell biology // Science. — 1985. — T. 230, № 4723. — C. 247—256.

87. Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy // Microscopy And Microanalysis. — 2011. — T. 17, № 4. — C. 614—617.

88. Tanbakuchi, A. A., Rouse, A. R., Gmitro, A. F. Monte Carlo characterization of parallelized fluorescence confocal systems imaging in turbid media // J Biomed Opt. — 2009.1. T. 14, № 4. — C. 044024.

89. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy // Handbook of Biological Confocal Microscopy. — 2006. — C. 20—42.

90. Sheppard, C. J. R., Gan, X., Gu, M., Roy, M. Signal-to-noise ratio in.confocal microscopes // Handbook of biological confocal microscopy. — 2006. — C. 442—452.

91. Dixon, A., Heinlein, T., Wolleschensky, R. Need for Standardization of Fluorescence Measurements from the Instrument Manufacturer's View // Standardization and Quality Assurance in Fluorescence Measurements II. — 2008. — C. 3-24.

92. Rose, A. Television pickup tubes and the problem of vision // Advances in Electronics and Electron Physics. — 1948. — T. 1 — C. 131—166.

93. Vukojevic, V., Heidkamp, M., Ming, Y., Johansson, B., et al. Quantitative single-molecule imaging by confocal laser scanning microscopy // Proc Natl Acad Sci USA. — 2008. —T. 105, № 47. — C. 18176—18181.

94. Chang, E„ Thekkek, N., Yu, W. W., Colvin, V. L., Drezek, R. Evaluation of quantum dot cytotoxicity based on intracellular uptake // Small. — 2006. — T. 2, № 12. — C. 1412—1417.

95. Yu, Q., Heikal, A. A. Two-photon autofluorescence dynamics imaging reveals sensitivity of intracellular NADH concentration and conformation to cell physiology at the single-cell level // J Photochem Photobiol B. — 2009. — T. 95, № 1. — C. 46—57.

96. Lin, S. J., Ford, E., Haigis, M., Liszt, G., Guarente, L. Calorie restriction extends yeast life span by lowering the level of NADH // Genes Dev. — 2004. — T. 18, № 1. — C. 12—16.

97. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy // J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. — 2006. — T. 23, № 12. — C. 3139— 3149.

98. Сергеева, E. А. Влияние рассеяния на предельную глубину визуализациив методе двухфотонной флуоресцентной микроскопии // Квантовая электроника. — 2010.1. Т. 40, №5. —С. 1053—1061.

99. Ying, J., Liu, F., Alfano, R. R. Spatial distribution of two-photon-excited fluorescence in scattering media // Appl Opt. — 1999. — T. 38, № 1. — C. 224—229.

100. Brakenhoff, G. J., Muller, M., Ghauharali, R. I. Analysis of efficiency of two-photon versus single-photon absorption for fluorescence generation in biological objects // Journal Of Microscopy-Oxford. — 1996. — T. 183 — C. 140—144.

101. Larson, D. R., Zipfel, W. R., Williams, R. M., Clark, S. W., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo // Science. — 2003. — T. 300, № 5624. —C. 1434—1436.

102. Звелто, О. Принципы лазеров: Пер. с англ. — 3-е перераб. и доп. изд. — М.: Мир, 1990 — 560 с.

103. Brokmann, X., Messin, G., Desbiolles, P., Giacobino, E., et al. Colloidal CdSe/ZnS quantum dots as single-photon sources // New Journal of Physics. — 2004. — T. 61. C. 99.

104. He, J., Mi, J., Li, H., Ji, W. Observation of interband two-photon absorption saturation in CdS nanocrystals // J Phys Chem B. — 2005. —- T. 109, № 41. — C. 19184— 19187.

105. Cianci, G. C., Wu, J., Berland, K. M. Saturation modified point spread functions in two-photon microscopy // Microsc Res Tech. — 2004. — T. 64, № 2. — C. 135—141.

106. Lounis, B., Bechtel, H. A., Gerion, D., Alivisatos, P., Moerner, W. E. Photon antibunching in single CdSe/ZnS quantum dot fluorescence // Chemical Physics Letters. — 2000. — T. 329, № 5-6. — C. 399^104.

107. Список работ по диссертации

108. Журналы, входящие в список ВАК

109. А1. Катичев А. Р., Сергеева Е. А. Проявления эффекта насыщения поглощения у коллоидных квантовых точек — флуорофоров для многофотонной флуоресцентной микроскопии // Оптика и спектроскопия. — 2009. — Т. 107. — № 6. — С. 887—893.

110. А2. Сергеева Е. А., Катичев А. Р., Кириллин М. Ю. Формирование сигнала двухфо-тонной флуоресцентной микроскопии в условиях сильного рассеяния: теоретическое и численное моделирование // Квантовая электроника. — 2010. —Т. 40. — № 12. — С. 1053—1061.

111. А4. Sergeeva Е. A., Katichev A. R. Factors affecting ultimate imaging depth of two-photon fluorescence microscopy in scattering medium // Proceedings of SPIE. — 2010. — Vol. 7547. — P. 75470K.1. Тезисы докладов

112. A7. Katichev A. R., Sergeeva E. A. Optical limitations of dense biotissue imaging with two-photon fluorescence microscopy // Topical Problems of Biophotonics 2009. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009 — P. 103.

113. A8. Sergeeva E. A. Katichev A. R., Balalaeva I. V. Potentialities of deep two-photon fluorescence microscopy imaging using quantum dots // Topical Problems of Biophotonics 2009. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2009 — P. 72.

114. A16. Sergeeva E. A., Katichev A. R., Kirillin M. Yu. Refined Forward Problem Solution for Biotissue Optical Properties Reconstruction // Topical Problems of Biophotonics 2011. Proceedings. — N. Novgorod: Institute of Applied Physics, 2011 — P. 93.