Исследование роли липидов в слиянии клеточных мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Институт Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

'Ч

На правах рукописи

Фролов Вадим Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЛИПИДОВ В СЛИЯНИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Специальность: 02.00.03 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-1997

Работа выполнена в лаборатории биоэлектрохимии Института Электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН,

в лаборатории математических методов в биологии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, и в лаборатории клеточной и молекулярной биофизики Национального Института Детского Здоровья и Человеческого Развития Национального Института Здоровья (№Н), США.

Научный руководитель -Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

Доктор химических наук Ю.А. Чизмаджев

Доктор физико-математических наук К.В. Шайтан

Доктор биологических наук A.B. Зеленин

Институт Биоорганической Химии им. Шемякина-Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится окгТлё^А 1997 г. в_час._мин.

на заседании диссертационного совета К.053.05.68 при Московском Государственном Университете им. М.В Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Электрохимии РАН.

Автореферат разослан "/5~" 1997 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Уктуальность проблемы. Бимолекулярная липидная пленка - липидный жслой, является основной структурой клеточной мембраны. Бислой формируется в водном окружении из амфипатических липидных молекул, гид-юфильные полярные головы которых обращены наружу, в воду, а гидрофобные углеводородные "хвосты" - внутрь бислоя. Такая структура определяет два основных свойства клеточных мембран. Они замкнуты: 'мембраны ненавидят края", и плохо проницаемы для большинства водорастворимых молекул. Эти свойства лежат в основе барьерной функции шеточных мембран: мембраны отделяют содержимое внутриклеточных ор-:анелл от цитоплазмы, цитоплазму - от внеклеточной среды; практически иобая биологическая мембрана формирует какой-либо замкнутый компар-гмент. Тем не менее нормальное функционирование клетки невозможно без многочисленных актов объединения или слияния таких исходно разделенных мембранных образований.

Под слиянием в строгом смысле понимается объединение водных объемов, ограниченных мембранами, и перераспределение липидного и белкового материала между взаимодействующими мембранами. Слияние происходит при каждом акте экзоцитоза или секреции, лежит в основе внутриклеточного транспорта, формирования и рециркуляции плазматической мембраны. Слияние клеток наблюдается в эмбриогенезе, например, при образовании миофибрилл (слияние миобластов), в процессе оплодотворения (слияние сперматозоида с яйцеклеткой). Оболочечные вирусы проникают в клетку путем слияния вирусной и клеточной (либо эндосомальной) мембран.

Клеточные мембраны не сливаются спонтанно. Слияние контролируется специальными белками слияния, как правило, целыми белковыми комплексами. В последнее время достигнут большой прогресс в определении и изучении белковых комплексов, опосредующих слияние в самых различных системах (секреция, вирусное слияние, оплодотворение). Обнаруженная высокая специфичность и регулируемость работы белковых "машин слияния" позволяет исследователям предполагать, что именно белок полностью определяет энергетику слияния на всех стадиях процесса [Lindau М. & Almers W., 1995, Cur. Op. Cell Biol].

Тем не менее в основе любого акта слияния лежит локальное нарушение целостности липидных бислоев взаимодействующих мембран с последующим соединением их уже новым образом. Именно на этой стадии структурной перестройки бислоев липидный матрикс мембраны может играть решающую роль. Каким образом белок слияния индуцирует реструктуризацию бислоев, какова роль лппидов в этом процессе? Какие пебис-лойные, промежуточные структуры формируют при этом липиды? Белок или липид определяет энергетику этих промежуточных структур? Несмотря на большое количество информации о работе белковой машины слияния,

детали структурной реорганизации липидных бислоев клеточных мембран при слиянии неизвестны.

Таким образом, изучение промежуточных липидных структур в слиянии клеточных мембран важно и необходимо для понимания механизма слияния в целом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов, лежащих в основе структурной перестройки липидных бислоев клеточных мембран в процессе слияния. При постановке задач была выбрана следующая рабочая гипотеза. Роль белка слияния сводится к локальному сближению липидных бислоев клеточных мембран до расстояния, на котором происходит спонтанное слияние двух плоских бислойных липидных мембран (БЛМ). Промежуточные структуры, принимаемые липидами клеточных мембран, аналогичны промежуточным структурам, наблюдаемым при слиянии двух БЛМ, их энергетика описывается в рамках сталко-вой (stalk) теории, развитой в лаборатории Ю.А. Чизмаджева для слияния БЛМ (1984-87 гг.). Для доказательства рабочей гипотезы предполагалось показать, что:

1. клеточное слияние можно регулировать так же, как и слияние БЛМ, добавляя на разных стадиях слияния экзогенные липиды в различные монослои мембран;

2. экзогенные липиды различной молекулярной геометрии влияют на кинетику слияния в соответствии с предсказаниями сталковой теории;

3. слияние липидных бислоев клеточных мембран проходит через те же промежуточные стадии, что и слияние двух БЛМ.

Для осуществления поставленных задач было необходимо:

1. разработать экспериментальные методики, позволяющие фиксировать различные стадии одиночного акта слияния клеточных мембран;

2. провести теоретические оценки кинетики диффузионного перераспределения липидов через промежуточные структуры слияния для выяснения временных ограничений экспериментальных методов, используемых для детектирования слияния моно- и бислоев.

Научная новизна и практическая значимость работы: в работе был использован новый экспериментальный подход, заключающийся в качественном сравнении двух процессов: слияния клеточных мембран и слияния двух плоских БЛМ. Несмотря на огромную разницу между двумя экспериментальными системами (наличие белка слияния, отсутствие контроля как ли-пидного состава так и геометрии области контакта в случае клеточног о слияния), представленный материал демонстрирует качественное сходство процессов перестройки бислоев мембран при слияния в обеих системах. Тем не менее, в работе впервые экспериментально показано, что ни белок слияния, ни липиды не определяют полностью энергетику реструктуризации мембран. На примере слияния клеточных мембран, индуцированного белком слияния вируса гриппа гемагглютинином (ГА), предложен новый вариант "синтетической" модели слияния, учитывающий роль как липидного матрикса мембран, так и белка слияния ГА. Однако необходимо отметить,

по полученные результаты по липидной регуляции слияния клеточных мембран янпяются универсальными в том смысле, что они могут быть использованы в исследованиях и при интерпретации данных по слиянию, индуцированному различными белковыми комплексами. Результаты представляют практическую ценность для прикладных медицинских исследований, связанных со слиянием клеточных мембран, а именно для изучения механизмов инфекций, вызываемых оболочечными вирусами, нарушений секреции, процесса оплодотворения.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены на Международной Конференции по Межклеточным Взаимодействиям (1994 г., Пущино), Фрумкинских конференциях молодых ученых в Институте Электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН (Москва, 15 июня 1995 г. и 18 июня 1997 г.) на 40-м (26 февраля - 3 марта 1996 г., Baitimor, USA) и 41-м (2-7 марта 1997 г., New-Orleans, USA) конгрессах Американского Биофизического общества и на XXXIII Международном Конгрессе Физиологических Наук (30 июня - 5 толя 1997, Ст.-Петербург).

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ и 7 тезисов докладов на конференциях.

Струсттра диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 82 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 21 рисунок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение Представлена актуальность темы, сформулированы цель и задачи диссертационной работы, ее научная новизна и основные положения, выносимые на защиту.

Обзор литературы В первом разделе обзора литературы рассматриваются основные положения сталковой теории слияния мембран. Производится краткий анализ экспериментальных данных по слиянию чисто липидных мембран в различных модельных системах (слияние штосом между собой, слияние липосом с БЛМ и слияние двух БЛМ). Затем рассматриваются основные стадии слияния двух БЛМ и вводится понятие сталка - локального объединения контактных монослоев мембран (Рис. 1). Энергия изгиба монослоев мембран дает один из основных вкладов в изменение свободной энергии системы при слиянии. Энергия изгиба, в свою очередь, определяется средней спонтанной кривизной монослоя, зависящей от молекулярной геометрии липидов мембраны. Липиды-конусы, формирующие мицеллы с положительной средней кривизной монослоя, ингибируют формирование сталка, имеющего отрицательную среднюю кривизну, липиды с противоположной геометрией (обратные конусы) - облегчают (Рис. 1).Необходимо отметить, что липиды с разной молекулярной геометрией влияют на среднюю кривизну монослоя аддитивно: добавка одинакового числа конусов и обратных конусов практически не меняет среднюю кривизну.

_1 2 3 4

EZEE3 ЕЦ^ЕЗЕЕг^ЕЗ _/£

Е

1

обратный конус

6

пора

QOOO 0000 бислой

Рис. 1. А. Стадии слияния БЛМ: (1) плоско параллельный контакт; (2) образование двуз полусталков за счет термических флуктуацш кривизны мембраны; (3) формирование стал ка - локального объединения контактных мо нослоев мембран; (4) стадия монослойноп слияния, на которой в результате радиально го расширения сталка формируется контакт ный бислой, и (5) мембранная трубка ил полное слияние. Б. Молекулярная геометри липцдов. В первом ряду схематически прсг ставлены три основные формы молекулы ли пцда, которые характеризуются т.н. парамеп полусталк ром упаковки f = V/(a h), где V и h это объе и длина молекулы, а- площадь, приходяща) ся на полярную голову липида в плоскости бислоя; при f<l молекула имеет конусообра; ную форму (лизоформы липцдов, например, лизофосфатидилхолин (ЛФХ)), при f=l - щ линдр (фосфатидилхолин (ФХ)), Г>1 - обратный конус (фосфатндилэтаноламин (ФЭ/ либо жирные кислоты (например, олеиновая кислота (ОК)). Во втором ряду перечислен; энергетически выгодные структуры, принимаемые липмдами разной геометрии: мицелл (положительная средняя кривизна монослоя), ламеллярная фаза (нулевая кривизна) и hi вертированная мицелла (отрицательная кривизна). В третьем ряду представлены xapai терные дефекты - пора и полусталк, формируемые соответственно конусами и обратные конусами в бислое.

Второй раздел обзора посвящен слиянию клеточных мембран в ра личных экспериментальных системах. Основное внимание в этом раздет уделяется экспериментальным данным по липидной регуляции слияш [Chernomordik L. et al., 1995, J. Memb. Biol.], а именно, ингибированию m зоформами липидов слияния в различных клеточных системах.

В третьем разделе рассматривается слияние оболочечных вирусов клеткой-мишенью, и, в основном, вирус гриппа и его белок слияния гемаг лютинин (ГА). Мембрана вируса гриппа содержит всего 3 белка (ГА, не: раминидазу и М2). Благодаря такой простоте вирусной мембраны, ГА я ляется наиболее изученным из всех белков слияния, и поэтому П индуцированное слияние используется в качестве модели слияния биолог: ческих мембран в целом [White J., 1992, Science].

ГА полностью ответственен за слияние - он опосредует как начальнь рецептор-зависимый контакт с мембраной-мишенью, так и последующ слияние, вызываемое понижением рН среды до - 5. ГА был кристаллизов, как в нейтральной (рН 7), так и в слиятельно активной (рН 5) конформац ях, т.е. известны детали структурной перестройки ГА, приводящей к ели нию. Показано, что вследствие конформационной перестройки ГА N-koh

"2-субъединнцы, т.н. пептид слияния, проникает как в мембрану-мишень, гак и d вирусную мембрану. На вирусной мембране молекулы ГА формируют тримеры, которые и являются слиятельно активными единицами, тричсм для осуществления слияния необходимо формирование комплекса 13 нескольких тримеров. Первым событием, экспериментально фиксируемым при ГА-слиянии, является формирование поры слияния — ионного канала, соединяющего сливающиеся везикулы. Пора имеет электрическую проводимость, сходную по порядку величины с проводимостью одиночного канала щелевого контакта [Bukauskas F.F. et al., 1994, Biophys. J.], на начальном этапе эволюции поры наблюдаются флуктуации проводимости канального типа. Затем пора расширяется, обеспечивая возможность инъ-гкции вирусного генома. Характерно, что через маленькие ГА-поры ли-гтидный обмен между сливающимися мембранами не происходит [Tse F.W. et al., 1993, J. Cell Biol]. Все это позволяет предположить, что ГА на начальной стадии слияния формирует чисто белковую пору (канал), через которую может осуществляться только "водный", но не липидньш обмен. Затем гакая пора расширяется, встраивая в стенки липид ("белковая" модель, см.

Пептид слиянии

ТЯТтЯТ?..

Трнмер ГА

в

Трапемембранный

Мембран а_____мишень

«iiMnjiitt

Вирусная мембрана

домен

mm

Рис. 2. А. Основные стадии ГА- индуцированного слияния: (1) рецепториый контакт (взаимодействие ГА с остатками сиаловых кислот на поверхности мембраны- мишени); (2) конформационное изменение ГА, приводящее к проникновению пептида слияния в мембрану-мишень и вирусную мембрану (См. также Б); (3) а (белковая модель): формирование тримерами ГА белкового канала; б (липидная модель): образование сталка в результате локального сближения мембран, индуцировашюго ГА, при этом ОК промотиру-ет образование сталка ("правильная" молекулярная геометрия), а ЛФХ ингибирует (ср. Рис. 1); (4) расширение поры. Б. Сталк внутри слиятелыюго комплекса; В. Белковый канал, формируемый ГА, расширяется, встраивая в стенки липид.

Рис.2А-За и 2Б).

Согласно альтернативному предположен!«), пора исходно липидная ("липидная" модель). Липидный обмен через маленькую пору ограничен

из-за большой кривизны стенок поры, что накладывает ограничения на коэффициент диффузии липидного зонда в поре. При этом формирование сталка. предшествует открытию поры (Рис. 2А-36 и 2В). Это предположение базировалось, в основном, на данных по ингибированию клеточного слияния лизолипидами [Chernomordik L. et al., 1995, J. Memb. Biol.].

Третья часть обзора литературы заканчивается анализом данных, свидетельствующих в пользу белковой или липидной точек зрения. Материалы и методы В качестве модельного процесса было исследовано слияние, вызываемое белком слияния вируса гриппа гемагглютинином (ГА). Изучалось слияние стабильно трансформированных клеток, экспрес-сиругащих ГА, с различными клетками и БЛМ. В процессе слияния контролировались: (а) липидный обмен между взаимодействующими мембранами (по перераспределению различных флуоресцентных мембранных зондов); (б) "водный" обмен между сливающимися компартментами (по перераспределению различных водорастворимых флуоресцентных зондов и электро-физиологически, по электрической проводимости поры слияния). Исследовались одиночные акты слияния, т.е. слияние в паре ГА-несущая клетка/ клетка-мишень или БЛМ.

Клеточные линии. Были использованы клетки НАЬ2, экспрессирующие ГА штамма вируса A/Japan/305/57, и НАЗООа клетки (Х:31 штамм). Клетки обеих линий экспрессируют ГА в мембранной плотности, сравнимой с плотностью ГА на оболочечной мембране вируса гриппа. Как партнеры слияния использовались: человеческий эритроцит, клетки PLC/PRF/5 (гепатокар-цинома человека), ВНК-21 (почка Mesocricetus auraíus), MDCK (почка собаки), VERO (почечный эпителий Cercopithecus sabaeus). БЛМ. Горизонтальные БЛМ формировали на отверстии диаметром 100-200 щи по методу Мюллера-Рудина [Mueller et al., 1962, Nature] из растворов различных фосфолипидов в сквалене. БЛМ содержали также ганглиозиды (Gdu и GQib, 5 мол.% к липиду).В экспериментах сначала осуществлялось рецепторное взаимодействие мембраны-мишени и ГА-несущей мембраны, затем инициировалось изменение конформации ГА.

Активация ГА. (трипсин) Как НАЬ2 так и НАЗООа экспрессируют неактивный предшественник ГА, т.н. ГАО. Для превращения Г АО в активный ГА проводилась протеолитическая обработка клеток раствором, содержащим 5 fig/ml трипсина, 10 минут при комнатной температуре. В отдельных экспериментах концентрация трипсина и длительность обработки варьировались с целью изменения мембранной поверхностной плотности ГА. (рН) ГА меняет конформацию при понижении рН среды. Вероятность ГА-слияния имеет зависимость от рН, близкую к колоколообразной с максимумом при рН = 4,9, причем рН 4,5 или 5,5 неэффективны. В экспериментах для инициации слияния использовались растворы с рН 4,8 +.5,4. Флуоресцентные методы. (Зонды) Использовались липидные зонды R18 Dil 12, Dil 16, Dil 18, РКН26, родамин-фосфатидилэтаноламин (Р-ФЭА), и водорастворимые зонды карбоксифлуоресцеин (КФ) и BCECF. Липидные

;011ды загружались во внешний монослой клеточных мембран, а водорастворимые - в цитоплазму. (Спектрофлуориметрия) Исследовалась кинетика перетекания липидного зонда (R18 или Р-ФЭА) при слиянии. Зонд шточали п мембрану одной из клеток пары в концентрации самотушения, регистрировалось увеличение сигнала флуоресценции при переходе зонда в мембрану другой клетки. Измерения проводились интегрально, т.е. регистрировался сигнал от большого количества слияний. (Флуоресцентная мик-юскопия) Регистрировалось перераспределение мембранных и водных зондов в парах клеток. При этом изучались либо эффективность слияния, т.е. :канировалось большое количество клеточных пар (не менее 200 в эксперименте) и регистрировался факт перетекания зонда (да/нет; при этом эффек-гавность перехода зонда оценивалась как отношение количества пар с перетеканием к общему количеству просмотренных пар), либо кинетика перетекания зонда в отдельной паре. В последнем случае проводилась видео :ъемка процесса перетекания зонда (как правило, одновременно на данной паре клеток проводились и электрофизиологические измерения). Затем данные обрабатывались с помощью компьютера, кинетика перетекания зонда определялась по росту интегральной интенсивности флуоресценции мембраны, исходно не содержащей зонда. Зонда использовались в концентрации, далекой от самотушения.

Основная часть данных, зарегистрированных с помощью чисто флуоресцентных методик, получена совместно с Е. Лейкиной (NIH, США). Измерение электрической проводимости поры слияния. (Метод измерения адмиттанса клеточной мембраны, система НАЬ2/эритроцит [Е. Neher & А. Marty, 1982, PNASJ) При слиянии эритроцита с клеткой НАЬ2 площадь а, следовательно и емкость клеточной мембраны НАЬ2 увеличивается. В процессе слияния, пока проводимость поры по переменному току Gp сравнима с (йСэ (где Сэ -емкость мембраны эритроцита, a ra=2;rf - частота переменного тока) реальная (Re) и мнимая (Im) часть адмиттанса мембраны НАЬ2 по-

ю-Сз-Gp (co-C3)2-G

лучают приращения: Л Im = —--^ и ARe =—--при этом

Gp +(со -Сэ) Gp + (со -Сэ)

G_ = +(ARe) Метод Неера- Марти (см. Рис. 3) позволяет изме-

р ARe

рять в реальном времени Alm и ARe, а следовательно, и Gp при условии малости Alm и ARe по сравнению с исходным адмиттансом мембраны (что справедливо в системе НАЬ2/эритроцит, т.к. Сэ~ 1 иФ, Снаь2~ 20 пФ). (Одновременная регистрация проводимости поры слияния и кинетики перетекания липидного зонда) В экспериментах по слиянию в паре НАЬ2/эритроцит применялась комбинация метода Неера-Марти и флуоресцентной микроскопии высокой чувствительности. При этом регистрация проводимости поры была синхронизирована во времени с флуоресцентными измерениями, что позволяло сравнить кинетику роста проводимости поры и перетекания липидного зонда.

Рис. 3. Экспериментальная установка для измерения адмнтганса клеточной мембраны. В режиме фиксации потенциала (whole-cell configuration) к мембране приложено напряжение синусоидальной формы; регистрируемый ток через преобразователь ток/ напряжение подастся на фазовый детектор, где выделяются синфазная (Re) и сдвинутая на 90° по фазе по отношению к приложенному напряжению (Im) части, которые пропорциональны приращению адмиттанса мембраны. Изменения адмитганса и проводимость поры вычисляются с использованием калибровочных коэффициентов. При Gp »шСэ Alm соответствует приращению емкости мембраны Н АЬ2.

(Метод двойного отведения от целой клетки (Double whole-cell)). Для использования этого метода для регистрации проводимости поры соискателем были разработаны две новые модельные системы (см. Результаты и их обсуждение): межклеточное слияние в системе HAb2/PLC (работа велась совместно с с.н.с. НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского А.Я. Дуниной- Барков-ской) и слияние клетки НАЬ2 с БЛМ (модификация метода Г.Б. Меликяна [G.B. Melikyan et al., 1993, J. General Physiol.], работа велась совместно с аспирантом МГУ A.B. Самсоновым). В отличие от метода Неера- Марти, этот метод позволяет фиксировать напряжение на контактном бислое (контактной области) и измерять емкость бислоя. Метод также позволяет электрически контролировать утечки, возникающие при формировании поры и через стенки поры (Рис. 4).

Рис. 4. Метод двойного отведения от целой клетки. В этом методе фиксируется потенциал между цитоплазмами двух клеток (НАЬ2 и PLC, левая часть рисунка) или между цитоплазмой НАЬ2 и отсеком 2 (противоположном содержащему клетку) ячейки для формирования БЛМ (правая часть рисунка). Проводимость поры Gp= Ij/(Vi-V2), сопротивление утечки оценивалось как Rrni- Vi/Imi (где ml соответствует мембране НАЬ2, а т2 - БЛМ или мембране клетки PLC), предполагается, что Rni « R, Rmi-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Эффективность слияния клеточных мембран, вызванного ГА, может определяться свойствами мембраны-мишени. В рамках используемой в работе экспериментальной стратегии сравнения двух процессов, ГА-слияния и слияния двух БЛМ, представлялось необходимым разработать клеточную модельную систему, позволяющую осуществлять экспериментальный протокол, сходный с использованным для изучения слияния двух БЛМ [Либерман Е.А и Ненашев В.А, 1963, Биофизика]. Было необходимо подобрать клетку-партнер для НАЬ2, которая позволяла бы использовать метод двойного отведения от целой клетки (см. Материалы и Методы), т.е. фиксировать потенциал на мембранах обеих сливающихся клеток, и, следовательно, накладывать потенциал на область контакта. В качестве возможных партнеров слияния были протестированы клетки PLC/PRF/5, ВНК-21, MDCK и VERO. Эффективность межклеточного слияния оценивалась методом флуоресцентной микроскопии по перераспределению мембранного и водного маркеров в парах клеток. Клетки PLC сливались с НАЬ2 с эффективностью 60-100% (сравнимой с наблюдаемой при слиянии НАЬ2 с эритроцитом), ВНК-21 - около 20 %, клетки же линий MDCK и VERO не сливались с НАЬ2. Таким образом, была найдена новая клетка-партнер слияния для НАЬ2. Причины, лежащие в основе "устойчивости" клеток линий MDCK и VERO к слиянию требуют дальнейшего исследования. Мембраны клеток обеих линий содержат необходимые рецепторные участки для связывания с ГА. Слияние может быть затруднено каким-либо стерическим фактором (локальная геометрия мембраны, плохой доступ к рецептору). Нельзя исключить, что липидный состав клеточной мембраны-мишени может быть ответственен за неэффективность слияния.

II. Экзогенные липиды регулируют ГА-индуцируемое слияние клеточных мембран на ранних стадиях процесса. Следующим этапом работы являлось исследование влияния липидного состава мембран на слияние клетки НАЬ2 с эритроцитом. Эта система была выбрана из-за ее сравнительной простоты. Кроме того, на данный момент она является наиболее общепринятой моделью для изучения ГА-слияния.

II.1. Лизоформы липидов ингибируют, а ненасыщенные жирные кислоты промотируют ГА-опосредованное слияние Лизоформы, добавленные во внеклеточную среду (в объемной концентрации от 0.1 до 102 цМ в зависимости от длины углеводородного хвоста), уменьшали, а олеиновая кислота (ОК) увеличивала эффективность слияния клеток НАЬ2 с эритроцитами, оцениваемую по перераспределению мембранного маркера (Рис. 5). Концентрация лизолипидов в растворе, необходимая для полного ингибирования слияния, сильно зависела от длины углеводородного хвоста (С12-С18) используемого липида (Рис. 5 А). Тем не менее эффективные мембранные концентрации лизолипидов были сходны по порядку величины (Рис. 5 Б). Липиды оказывали влияние не только на эффективность, но и на кинетику слияния: лизоформы замедляли, а ОК ускоряла переход мембранного зонда

А ЛФХ 100

»Il

200 í4 g v© £¡3

150 e^ -JlOO

S lio

0 50 100 150 200 250 300 время после пониженна рН, с

Рис. 5. Влияние экзогенных лнпцдов на слияние. А. Зависимость эффективности слияния от концентрации липнда в рас-250 § >| творе (1 - ОК, 2 - лауроил (С12)-ЛФХ, 3 -миристоил (С14) ЛФХ, 4 - пальмитоил (С16) ЛФХ, 5 - сгеароил (С18) ЛФХ). Б. Зависимость эффективности слияния от мембранной концентрации липида. В. Влияние экзогенных лнпидов на кинетику слияния.

(Рис. 5 В). Сходные результаты были получены и для перераспределения водорастворимого флуоресцентного маркера, лизолипиды уменьшали эффективность перехода зонда, а ОК увеличивала (Рис. 6).

100

0 5 10 15 20 мембранная концентрация, мои'1.%

S g 200 1150

i loo

Oí

оt

а

50 О

IS

КФ R18

it

Рис. 6. Эффективность перераспределения мембранного (R18) и водорастворимого (КФ) маркеров при слиянии НАЬ2 с эритроцитом в контроле, при добавлении в межклеточную среду 50 цМ олеоил ЛФХ, 50 цМ ОК или по 50 цМ ЛФХ и ОК. Эффективность слияния при добавлении ЛФХ+ОК статистически неотличима от контроля.

Контроль ЛФХ ОК ЛФХ+ОК

ОК и лизоформы действовали на слияние аддитивно, т.е. добавка одинакового количества олеиновой кислоты и олеоил-ЛФХ (имеющих сходный коэффициент распределения между раствором и мембраной) не приводила к изменению эффективности слияния (Рис. 6).

Необходимо также отметить, что эффективные концентрации липидов зависели от используемого для активации ГА рН. Чем ближе рН к оптимальному (рН 4.9), тем больше липида необходимо добавить для получения эффекта (см. Таблицу 1). Таким образом, ингибирующие концентрации ли-золипидов определяются количеством активированного ГА (предполагается, что ГА не имеет промежуточных конформаций и рН влияет только на вероятность конформационного перехода), т.е. наблюдается синергизм действия ГА и липида.

(блнця 1. Эффективность перехода R18 при различных рН. За 100% принимается эф-зсгивность перехода зонда при том же рН, но без липидных добавок.

рН 4,9 рН 5,15 рН 5,2 рН 5,3

!0 цМ стеароил ЛФХ 90±5 % 50±5 % 20±8% 5+2 %

25 цМОК — 180±20% 280±60% 700+80%

.2. Линиды действуют на стадии, предшествующей как липидному обмену, »к и образованию поры слияния Пора слияния малого радиуса (при нагл ьной проводимости в 100 пС радиус можно оценить как 0.1 нм) не фик-фуется по перераспределения водорастворимого маркера, так как такие аркеры, как правило, имеют большие размеры. Для детекции поры был спользован более чувствительный метод измерения адмиттанса клеточной ембраны. На Рис. 7 показаны типичные примеры регистрации, получае-ых этим методом при слиянии НАЬ2 с эритроцитом в контроле (А) и в рисутствии лнзолипидов (Б). В контроле поры открывались в 10 из 12 экс-ериментов через 16,8 ± 8,9 с после понижения рН среды. В момент откры-ия поры имели проводимость от 70 до 1200 пС. В присутствии во внекле-очной среде 25 цМ лауроил ЛФХ, в 10 из 15 экспериментов не было за-иксировано изменений реальной части клеточного адмиттанса (11с), пре-ышающих 50 пС (Рис. 7 Б). Для малых пор (Ср « иСэ) Ср = А11е (см. Ма-ериалы и Методы), поэтому отсутствие изменений реальной части Не ад-итганса показывает, что лизолипиды ингибируют формирование пор

Рис. 7. А. Изменения реальной (Не) и мнимой (1т) частей адмиттанса мембраны НАЬ2 при слиянии с эритроцитом; Сое соответствует проводимости мембраны по постоянному

жу; увеличение емкости (1т) на ~ 1 нФ соответствует полному слиянию одного эритро-ита. Б. Ингибирование формирования поры слияния в присутствии 25 цМ лауроил-ЛФХ межклеточной среде. Стрелками показан момент поштения рН внеклеточной среды до [I 4,9.

1.3. Экзогенные липиды эффективны на стадии слияния, следующей как за ецепторным контактом, так и за изменением конформации ГА. В опти-[альных физиологических условиях (37°С) через примерно 100 с. после по-ижения рН до 4,9 100% молекул ГА меняют конформацию и встраивают ептид слияния во взаимодействующие мембраны. Если в системе 1АЬ2/эритроцит в присутствии лизоформ понизить рН внеклеточной среды о 4,9, а затем, через 100 е., повысить рН обратно до 7,2 (импульс кислого

пияния.

А

Im

1 пФ

Re 1 нС

20 с

50 с

рН длиной в 100 е.), система перейдет на т.н. липид-чувсгвительную стадию (ЛЧС) слияния. Если на ЛЧС отмыть лизоформы липидов альбумином, то мембраны сольются спонтанно, без дополнительной активации ГА. Добавление на ЛЧС жирной кислоты (в количестве, необходимом для нейтрализации лизолипида) также вызывает спонтанное слияние. Эффективность такого "восстановленного" слияния сравнима с эффективностью слияния в контроле. Таким образом, действие лизоформ на слияние является полностью обратимым.

Фермент протеиназа-К (ПКК) разрушает слиятельно-активную но не нейтральную конформацию ГА. Аппликация ПКК на ЛЧС приводит к потере слиятельной компетентности белка: после отмывки лизолипидов слияния не происходит. Таким образом на ЛЧС ГА уже принял слиятельно-активную конформацию.

Фермент нейраминидаза разрушает на мембране-мишени рецепторы ГА (сиаловые кислоты). Добавление нейраминидазы до слияния, при нейтральном рН (7,2) приводит к нарушению рецепторного контакта и отделению эритроцитов от НАЬ2. На ЛЧС нейраминидаза неэффективна, что позволяет предположить, что пептид слияния на ЛЧС уже проник во взаимодействующие мембраны и удерживает их в контакте.

Таким образом, можно предположить, что в последовательности стадий ГА-индуцированного слияния (см. Рис. 2) ЛЧС разделяет стадии 2 и 36 (проникновение пептида слияния и формирование сгалка), т.е. на ЛЧС белок уже сблизил мембраны, но сталк не формируется из-за навязанной ли-зоформами большой положительной средней кривизны контактных монослоев.

III. ГА вызывает полуслияние клеточных мембран, или объединение контактных монослоев мембран без образования поры слияния III.1. В оптимальных условиях ГА вызывает образование поры слияния, которое предшествует липидному обмену. Высокочувствительная микрофлуо-риметрия (video-enhanced fluorometry), используемая в экспериментах, проводимых в рамках диссертационной работы , и в работе Tse et al1993, JCB,

A

20 c

к 4 c

Рис. 8. А. Зависимость проводимости поры слияния (кривая 1) и количества липидного зонда, перешедшего в мембрану НАЬ2 (кривая 2) от времени. Проводимость поры пересчитывалась по изменению ад-миттанса мембраны НАЬ2, а количество липидного зонда оценивалось по интегральной флуоресценции мембраны НАЬ2, как описано в Материалах и Методах. Стрелка показывает начало 100 с. импульса рН 4.9. Б. Флуктуации проводимости поры слияния канального типа (фликер); участок записи, выделенный квадратом в А, увеличенная шкала

е фиксирует липидного обмена через поры, имеющие проводимость Gp < ,5 ± 0,3 нС. Типичная картина слияния представлена на Рис. 8: здесь пере-од мембранного зонда был зарегистрирован после того, как проводимость оры превысила 2 нС. Насколько сильно коэффициент диффузии зонда в орс должен быть меньше коэффициента диффузии зонда на клеточной [смбране чтобы обеспечить такую временную задержку? В следующей час-и работы были числено оценены характерные времена перетекания липид-ого зонда через одну пору, предполагая, что проводимость одиночной по-ы равна средней проводимости поры в момент открытия (или G„ ~ 0,5 нС). II.2. Теоретические оценки потока липидной метки были проделаны в гредположении, что одна цилиндрическая пора соединяет две сферические езикулы (Рис. 9). Была решена система дифференциальных уравнений

5С| D _1

& .

е. =9. =Н)4^Г(С2-С,),И 1 00

-г---~(sin(0. i= 1, 2, с граничными условиями на

(Ri)2 вт(в4> v v v У

ферах 1 и 2:

1 dCj

Rj Ô9j

0=71

= 0 ; r= 1, 2

"¡о И 1 * 1

де С,/бу - концентрация липидного зонда на /-той сфере, й,- радиус /-1011 феры, в, - широта, 0Ю- угол соединения /-той сферы с порой, О и Ор - коэф-

Рис. 9

фициенты латеральной диффузии липидного зонда на сферах и в поре соответственно. Для Г)р« И найдено аналитическое решение для характер-но-го времени г перераспределения зонда между сферами

1 2R?R?

---1—а для Б„ ~ О задача

•ешена числено. Основным результатом является то, что для Ор близких к ), г слабо зависит от Ор, для Ор = О и Ор - /210 времена практически не 1азличаются (310 с. и 370 с. соответственно). Полученные времена (около -00 с) меньше экспериментально наблюдаемых времен задержки (при Ор < |,5 нС, т.е. при условии открытия только одной поры, г > 1000с), что воз-южно только при сильном (на несколько порядков) уменьшении 1)р.

Такое ограничение подвижности зонда не говорит однозначно о бел-:овой природе поры. Тем не менее это является сильным аргументом про-ив применимости к ГА-слиянию сталковой теории, согласно которой ста-[IIя монослойного слияния предшествует открытию поры. Поскольку кле-очные мембраны, в отличие от БЛМ, не имеют менисков, контактный >ислой не может иметь большую площадь. Однако объединение контактах монослоев, а следовательно, и обмен липидным зондом между ними (.олжны предшествовать открытию поры. Возможно ли, сильно замедлив гроцесс ГА-индуцированного слияния в целом и, тем самым, увеличив вре-

мя жизни системы на всех промежуточных стадиях, зарегистрировать иолу-слияние - перетекание липидного зонда без формирования поры? Ш.З. ГА вызывает полуслияпне клеточных мембран в неоптимальпых для физиологического слияния условиях

а. Полуслшние при активации ГА понижением рН среды до 5,3. Вероятность конформационного перехода молекулы ГА зависит от рН. При активации

Рис 10. Полуслин-

фцуоресценцня

0.5 нС

ние мембран, инициированное ГА при рН 5,3. А. Эф-фективноегь перехода мембранного зонда РКН26 (кружки ) и водорастворимого зонда КФ ( квадратики) при активации ГА растворами с разным рН. Б. Ре________________________________ гистрация полулапе зреют - 20 с 100 с 400 с 525 с 650 с _

t AV «, J.UU ». v v v слияния методом

измерения адмиттанса совмещенным с высокочувствительной флуориметрней. Реальная часть (Re) адмиттанса мембраны ПАЬ2 не меняется, в то время как интегральная флуоресценция мембраны НАЬ2 растет в результате перехода зонда РКН26 с мембраны эритроцита. Это соответствует полуслиянию НАЬ2 и эритроцита, т.к. ÀRe=Gp (см. подпись к Рис. 7). Стрелка указьшает начало импульса рН 5.3. В. Видеоизображение слияния в паре клеток, соответствующее регистрациям, представленным на Рнс. 10 Б. Поле зрения (пэтч-пипетка видна справа, эритроцит прикреплен слева к клетке НАЬ2, шкала 10 цм) и последовательный ряд флуоресцентных видеоизображений, иллюстрирующих переход зонда с мембраны эритроцита (исходно слева) на мембрану НАЬ2 (0 времени соответствует началу импульса рН).

ГА раствором с неоптимальным рН эффективность перераспределения мембранных и водных зондов падает. Однако с повышением рН от оптимального значения 4,9 до 5,5 эффективность перехода водного маркера надает быстрее, чем липидного (Рис. 10 А). При аппликации рН 5,3 водорастворимый зонд практически не перераспределяется, в то время как эффективность перехода мембранного зонда близка к 50%. Электрофизиологические эксперименты, проведенные при рН 5,3, показали, что в ряде случаев (см. Таблицу 2) ГА вызывал переход липидного зонда без образования поры с проводимостью, превышающей 50 пС, как это показано на Рис. 10 Б,В, б. Полуслияние, вызванное понижением концентрации ГА на мембране. При активации слияния раствором с неоптимальным рН может меняться ка* количество слиятельно-компетентных тримеров ГА, так и конечная коН' формация ГА. В следующей серии экспериментов мы варьировали мем

данную концентрацию ГА, используя различные протеолитические пре-эбработки клеток НАЬ2. При уменьшении концентрации трипсина или эемсни предобработки, концентрация ГА на мембране падала. В экспери-ентах с клетками iiAb2 с пониженной мембранной плотностью ГА также ыло обнаружено полуслияние (см. Таблицу 2).

Иолуслияте при субоптималъных температурах. ГА-индуцированное 1ИЯННС можно замедлить, понизив температуру среды. В экспериментах, роводимых при температуре 20+1 °С, в ряде случаев ГА вызывал полу-иияние мембран эритроцита и клетки НАЬ2 (Таблица 2). Известно stegmann Т. et al., 1985, Biochemistry], что конформационный переход ГА и роникновения пептида слияния в мембрану происходит при 0°С (с харак-ерным временем порядка минуты). Поэтому можно предположить, что онижение температуры до 20°С влияет не на конформационный переход 'А, а на сборку белкового комплекса слияния (см. Обзор Литературы), 'аблица 2 суммирует данные по ГА-слиянию в неоптимальных условиях.

'аблица 2. ГА-индуцированное слияние в неоптимальных условиях.

ГА ГА ГА, трипсин* ГА

рН 4,9 5,3 4,9 4,9

Температура, °С 33 33 33 20

Количество эксперимен- 14 17 11 21

тов

Полуслияние 0 7 3 4

Малые поры** 3 6 2 10

Полное слияние 9 0 1 2

нет отклика*** 2 4 5 5

; - предобработка НАЬ2 низкой (1 цг/мл, 2 минуты) концентрацией трипсина;

'* - поры, не открывшиеся полностью, имеющие проводимость менее 3 нС 400 с. после

гервого открытия:

'** - не фиксируется ни открытия поры, ни перехода мембранного зонда.

[II.4. Полуслияние стабильно. В неоптимальных условиях не наблюдается самопроизвольного перехода от полуслияния к полному слиянию. Более того, полуслияние между НАЬ2 и эритроцитом, полученное при аппликации рН 4,9 при 20°С, не удается трансформировать в полное слияние при ювышении температуры среды до 33°С (5-10 минут после полуслияния).

Таким образом, полуслияние, вызываемое ГА в неонтимальных условиях, не является промежуточной стадией слияния. Можно предположить что из-за малой плотности (рН, трипсин) либо подвижности (температура) гримеров ГА, среднее количество тримеров в комплексе слияния уменьшается, что и приводит к стабильному полуслиянию. Так ли это, и каким образом стабильное полуслияние связано с нормальным физиологическим слиянием? Следующая часть работы посвящена этим вопросам.

IV. Слияние клеточных мембран, вызванное ГА, можно остановить на стадии локального объединения контактных монослоев мембран. Из этой стадии система переходит либо в полуслияние (в неоптимальных условиях), либо в полное слияние (в оптимальных условиях)

IV.! Понижением температуры как слияние, так и полуслияние можно остановить на стадии (т.н. низко-температурная стадия или НТС), предшествующей липидному обмену и образованию поры слияния. Аппликация раствора с кислым рН (4,9, 5,1, 5,3) к клеточным парам НАЬ2/эритроцит либо НАЗООа/эригроцит при температуре 4°С не приводит ни к перераспределению флуоресцентных зондов, ни к формированию поры слияния (Рис. 11). Тем не менее, конформационное изменение ГА происходит (см ниже).

Рис. 11. Низкая температура (4°С) ингибирует формиро-0.4 цф *ание поры слияния между НАЬ2 и эритроцитом. Стрелка показывает начало 300 с. импульса рН. То, что ГА активировался в эксперименте, контролировалось в каждом д эксперименте*- после прекращения записи 1 среды подни-

малась до 37°С (при рН 7,2). Повышение температуры вызывало переход как водного, так и мембранного зонда из эритроцита в клетку НАЬ2. 1^2. НТС следует как за рецепторным контактом, так и за изменением кон-формации ГА При I 4°С после активации ГА импульсом рН, ни флуоресцентные, ни водные зонды (использовались все зонды, перечисленные в Материалах и Методах) не перераспределяются между клетками (максимальное конрольное время ожидания - 30 часов в нейтральном рН при 4°С после импульса рН 4,9 при 4°С). Если же после приложения импульса рН при 4°С температуру среды увеличить до 37°С, клетки сольются без приложения дополнительного рН. Эффективность такого слияния сравнима с контролем (слияние в нормальных условиях). При этом на 4°С происходит как конформационное изменения ГА, так и проникновение пептида слияния в мембраны (Доказательство аналогично проведенному для ЛЧС (см. выше), с использованиеми нейраминидазы и ПКК). 1У.З. Слияние на НТС не игибируется лизоформами, т.е. НТС следует за ЛЧС. Для проверки этого утверждения были проведены две серии экспериментов, протоколы которых схематически представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Схемы экспериментальных протоколов (1) и (2), приведены 1? и рН внеклеточной среды, а также наличие/отсутствие 140 цМ лауроил ЛФХ в среде; (нет) обозначает отсутствие перехода липидного зонда на данной стадии эксперимента.

1 4°С, ЛФХ, рН 7,2 (нет) => 4°С, рН 4,9, ЛФХ (нет) => 4°С, рН 7,2, ЛФХ (нет) => 22°С, рН 7,2, ЛФХ (нет) => 22°С, рН 7,2 (переход зонда)

2 4°С, рН 4,9 (нет) => 4°С, рН 4,9, ЛФХ (нет) => 4°С, рН 7,2, ЛФХ (нет)=> 22°С, рН 7,2, ЛФХ (переход зонда)

1ш

Ие

В первом случае (протокол 1) ЛФХ был добавлен при 4°С перед активацией ГА и находился в среде в течение всего эксперимента. При этом система не проходит через НТС: активация ГА и последующий нагрев не приводят к слиянию. Только при отмывке лизолипида происходит переход зонда. Во втором случае (протокол 2) добавка ЛФХ после активации ГА (на НТС) не приводит к ингибированию перехода зонда при последующем нагреве. Таким образом, мы приходим к следующей феноменологической последовательности стадий ГА-слияния: рецепторный контакт, инкорпорация пептида слияния, ЛЧС, НТС, сталк, пора. При этом ЛЧС и НТС фиксируются как при слиянии (рН 4,9) так и при полуслиянии (рН 5,3). Что же определяет развитие процесса (слияние или полуслияние) после НТС либо ЛЧС? IV.4. При недостаточном количестве тримеров ГА в комплексе слияния возникает полуслияние. Аппликация рН 5,3 при 33°С приводит к полуслиянию мембран НАЬ2 и эритроцита. Как предполагалось (см. III), в этих условиях вероятность формирования комплекса с необходимым для полного слияния количеством тримеров ГА мала. Комплексы же с меньшим количеством тримеров, сформировавшись, инициируют полуслияние. На ЛЧС или НТС конформационная перестройка ГА уже произошла, и, следовательно, возможна агрегация ГА в комплекс. Дальнейшего же развития процесса не происходит. Поэтому длительная инкубация на ЛЧС или НТС должна приводить к увеличению количества ГА-комплексов, опосредующих полное слияние (т.е. переход липидного и водорастворимого зондов). Это подтверждают следующие эксперименты:

а. ГА активировался раствором с рН 5,3 при 4°С (10 мин. импульс), затем система выдерживалась при рН 7,2, 4°С, после чего клетки нагревались до 37°С. Эффективности перехода водорастворимого и липидного зонда представлены в Таблице 4. Видно, что эффективность перехода водорастворимого зонда растет с увеличением времени инкубации при рН 7,2, 4°С.

Таблица 4. Влияние времени инкубации после приложения рН 5,3, 4°С, на эффективность перехода зондов (см. Материалы и Методы) после нагрева. Контроль рН 5,3, 37°С

Контроль 1 мин. 5 мин. 10 мин. 20 мин.

Липидный зонд 90±5 % 60±10% 70±7 % 80+5 % 80+5 %

водорастворимый зонд 10±3% 2±1 % 10±4 % 20±3 % 30+5 %

К таким же результатам приводило увеличение времени инкубации после импульса рН 5,3 на ЛЧС.

б. Фермент ПКК действует на ГА в слиятельно-компетентной конформации (II.3). Аппликация ПКК (0,05 мг/мл, 5 мин. при 4°С) на НТС приводит к ингибированию слияния при последующем нагреве (IV.2), т.к. ПКК разрушает все активные ГА. Использование же умеренной обработки (0,1 мг/мл ПКК, менее 3 мин, при 4°С) приводит к разрушению только части тримеров, и поэтому к полуслиянию, как это иллюстрирует Таблица 5. Таким образом, варьируя количество тримеров ГА в комплексе, можно "переключать" систему НАЬ2/эритроцит между слиянием и полуслиянием.

Таблица 5. Влияние обработки ферментом ПКК после импульса рН 4,9, 4°С, на эффективность перехода зондов после нагрева; контроль - нет ферментной обработки.

Контроль 100 с. 150 с. 150 с. ЛФХ* 200 с. 600 с.

Липидный зонд 100% 100% 98+1% 98±1% 95±2 % 60±10%

Водорастворимый зонд 90±5 % 20±10 % 7±2% 25±10% 5+2 % 0%

* - лауроил-ЛФХ загружен во внутренний монослой эритроцитов, см. IV.5.

IV.5. Добавка ЛФХ в дистальные (неконтактные) монослои мембран на НТС приводит к увеличению эффективности перехода водорастворимого зонда.

Согласно сталковой теории, ЛФХ, находясь вв дистальных монослоях, должен уменьшать стабильность контактного бислоя и, тем самым, облегчать полное слияние. Для проверки этого утверждения было исследовано слияние НАЬ2 с эритроцитами, во внутренний монослой которых был загружен ЛФХ (при инкубации в растворе, содержащем 170 цМ лауроил-ЛФХ, 3 часа, с последующей отмывкой альбумином ЛФХ из внешнего монослоя). В экспериментах с ПКК (См. IV.4, Таблицу 5) присутствие ЛФХ по внутреннем монослое эритроцитов приводило к увеличению эффективности перехода водорастворимого зонда без изменения эффективности перехода липидного зонда.

IV.6. На НТС контактные монослои мембран объединены. Из НТС при нагреве до 37°С спонтанно получается как пора слияния (рН 4,9, 4°С), так и полуслияние, т.е. объединение контактных монослоев (рН 5,3, 4°С). Нет ли уже на НТС липидной непрерывности или, другими словами, не является ли НТС станком?

Если на НТС существует липидная непрерывность, то почему нет перехода липидного зонда (спустя 30 ч. после активации ГА)? В физиологических условиях (37°С, рН 4,9 формирование поры слияния также предшествует липидному обмену. Для объяснения этих фактов было предположено, что тримеры ГА формируют вокруг зоны слияния плотное кольцо-розетку (fusion rosette), которое и затрудняет липидный обмен (экспериментальные данные, подтверждающие существование такой структуры приведены в Обзоре Литературы и в IV.4). Внутри такого кольца формируется сталк, контактный бислой, и пора слияния. Расширение поры приводит к разрушению кольцевой структуры и липидному обмену. Следующие эксперименты показывают, что искусственное разрушение "белкового забора" приводит к переходу мембранного зонда на НТС:

IV.6.1. Аппликация на НТС гипотонической (1:3) среды приводит к переходу липидного зонда в парах НАЬ2/эритроцит (с эффективностью до 50% в сравнении с эффективностью перехода зонда при нагреве клеток). Необходимо отметить, что осмотический шок неэффективен на ЛЧС.

V.6.2. Использование ферментной обработки (0,1 мг/мл ПКК, 1 мин. при °С) приводит к перераспределению R18 на НТС, без нагрева. (20 ± 5% от ффективности перехода зонда при нагреве).

В то же время необходимо подчеркнуть, что разрушение всех тримеров 'Л на НТС приводит к ингибированию слияния (IV.2). Напомним также, го количество лизолипида, необходимое для полного ингибирования лияния определяется числом слиятельно-активных тримеров ГА (Таблица ). Таким образом, экспериментальные данные, представленные в пп. II -V, говорят о том, что синергизм действия ГА и липидов необходим на всех тадиях на всех стадиях структурной перестройки бислоев мембран. ГА не олько опосредует сближение мембран и формирование сталка. На НТС ¡елковый комплекс необходим для поддержания сталка, развитие уже формированного сталка определяется количеством тримеров ГА в ком-[лексе.

В пользу формирования в ГА слиянии липидных промежуточных труктур могут говорить следующие экспериментальные данные, получение на других модельных системах.

Кинетика роста проводимости поры слияния между клетками НАЬ2 и 'LC зависит от приложенного к поре электрического потенциала (Рис. 12). i системе HAb2/PLC (см. I) было исследовано влияние приложенного к онтактной области потенциала (т.е. разности потенциалов, фиксируемых в ;итоплазме первой и второй клеток по отношению к внеклеточной среде, м. Материалы и Методы) на кинетику роста проводимости поры слияния. 1редполагалось, что в случае формирования контактного бислоя, потенциал, уменьшая стабильность бислоя, будет ускорять рост межклеточной роводимости и уменьшать время ожидания от активации ГА до открытия оры. Полученные предварительные данные представлены на Рис. 12.

г Рис. 12. Влияние

G, п С 60

I-L

10 мВ

0 20 40 60 80 100 t, с

приложенного к поре слияния электрического потенциала с ДУ=50мВ (Л) и ДУ=30 мВ (Б) на проводимость поры.. Импульсы ЛУ=50мВ вызывали рост проводимое™ норы, если длина импульса т >40 с.

0 20 40 60 80 100 г, с

рансконтактный потенциал, начиная с порогового значения в ~ 50 мВ, ызывает рост проводимости поры, причем пороговое значение напряже-ия зависело (как и при пробое) от длины импульса. Сейчас ведется набор кспериментальных данных, необходимых для анализа явления.

Также проводятся исследования влияния липидного состава мембран на слияние и полуслияние в системе НАЬ2/БЛМ, позволяющей варьировать в широких пределах состав как контактного, так и дистального монослоя БЛМ. Некоторые предварительные данные представлены в диссертации. VI. При электрическом пробое БЛМ регистрируются одиночные липидные поры, сходные по проводимости с порами слияния. Было показано (совместно с аспирантом МГУ Меликовым К.Ч.), что при электрическом пробое БЛМ определенных составов, можно наблюдать одиночные липидные поры, как это показано на Рис. 13. Поры имеют проводимость того же порядка, что и поры слияния. На начальных этапах пробоя наблюдаются флуктуации проводимости канального типа, напоминающие фликер ли-пидных пор. Также при пробое регистрируется стадия медленного роста проводимости БЛМ, характерная для пор слияния (ср. Рис 8).

Для пробоя БЛМ используются достаточно высокие напряжения, однакс зарегистрировать одиночные поры при обратимом пробое БЛМ возможно в зависимости от состава БЛМ, и при АУ ~ 100 мВ. Таким образом, оди ночную липидную пору можно, по крайней мере феноменологически, рас сматривать как модель поры слияния.

1. На примере слияния клеточных мембран, индуцированного белком слия ния вируса гриппа гемагглютинином, показано, что в основе структурно» перестройки бислоев мембран при слиянии лежит взаимодействие бет; слияния и липидного матрикса, ни белок, ни липид не определяют полно стью энергетику процесса.

2. Определены основные стадии слияния бислоев клеточных мембран: фор мирование белкового комплекса слияния, объединение контактных моно слоев мембран, образование поры слияния; и выявлена роль ГА и липидно го состава мембран на этих стадиях.

3. Показано, что липидный состав клеточных мембран влияет на слияние i согласии с предсказаниями сталковой теории: спонтанная кривизна кон тактных монослоев определяет вероятность их объединения, спонтанна: кривизна дистальных монослоев влияет на формирование поры. Это по зволяет предположить, что на стадии локального объединения контактны монослоев формируется сталк.

4. Обнаружено, что совместное действие нескольких тримеров Fj (предположительно формирующих белковый комплекс слияния), необхс

2

Рис. 13. Проводимость БЛМ на начальной стадии пробоя. БЛМ сформирована из дифитаноил-ФХ как описано в Материалах и Методах,. Стрелка показывает момент приложения ступени напряжения в 350 мВ.

2с

ВЫВОДЫ

лмо для формирования сталка.

Установлено, что количество слиятельно-компетентных тримеров ГА в змплексс слияния определяет развитие сталка: уменьшение числа триме-эв педег к ннгибированию формирования поры слияния.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Фролов В.А., Быченко А.Б., Дунина-Барковская А.Я., Чизмаджев Ю.А., Циммер-берг Дж. Слияние экспрессирующих гемагтлютинин клеток NIH ЗТЗ НАЬ2 с клетками других линий. // Биол. Мембраны. 1995. Т. 12. № 3. С. 288-293. Куменко Д.А., Фролов В.А. Количественное описание процесса перераспределения липидного зонда между сливающимися клетками. // Биол. мембраны. 1996. Т. 13. С. 545-551.

Самсонов А.В., Фролов В.А. Перераспределение липидного зонда на ранних стадиях слияния бислойных липидных мембран. // Биол. мембраны. 1996. Т. 13. С. 598-604. Полончук JI.O., Фролов В.А., Юськович А.К., Дунина-Барковская А.Я. Действие арахидоновой кислоты на проводимость межклеточных контактов гепатоцитов мыши в первичной культуре. // Биол. Мембраны. 1997. Т. 14. № 2. С. 184-199. Chernomordik L.V., Leikina Е., Frolov V.A., Bronk P., Zimmerberg J. An early stage of membrane fusion mediated by the low-pH conformation of influenza hemagglutinin depends upon membrane lipids. // J. Cell Biol. 1997. V. 136. P. 81-94.

Тезисы докладов на международных конференциях.

Frolov V.A., Bytchenko А.В., Dunina-Barkovskaya A.Ya., Chizmadzhev Yu.A., Zimmerberg J. Fusion partners for NIH 3T3 HAb2 fibroblasts: new experimental model to study single-cell events of hemagglutinin-induced fusion. // Workshop of Intercellular Communications. 1994. Puschino. ITEB. P. 41.

Frolov V.A., Dunina-Barkovskaya A.Ya., Zimmerberg J., Chizmadzhev Yu.A. Double whole-cell recordings of HA-mediated fusion between HAb2 and PLC cells. // Biophys. J. 1996. V. 70. P. A84.

Frolov V.A., Leikina E., Bronk P., Chernomordik L., Zimmerberg J. Wild-type HA induces hemifusion between cell membranes. // 1997. Biophys. J. V. 72. P. A14. Leikina E., Frolov У.А., Zimmerberg J., Chernomordik L. Low temperature-arrested stage of influenza hemagglutinin cell-cell fusion is subsequent to the lipid sensitive fusion stage but prior to lipid mixing and fusion pore formation. // Biophys. J. 1997. V.72. P.A300.

l Melikov K. Ch., Samsonov A.V., Frolov V.A. Bilayer lipid membrane conductance fluctuations mimic early fusion pore conductance flickering. II 1997. P003.14. XXXIII Int. Cong. Physiol. Sci. Abstracts.

. Samsonov A.V., Melikov K.Ch., Yusipovich A.I., Frolov Y.A. The study of early stages of membrane tube collapse. // 1997. P017.03. XXXIII Int. Cong. Physiol. Sci. Abstracts. . Frolov V.A., Leikina E., Chernomordik L., Zimmerberg J. Hemifusion intermediate in biological membrane fusion. // 1997. P017.02 XXXIII Int. Cong. Physiol. Sci. Abstracts.