Исследование стационарных и нестационарных потоков в капиллярах методами лазерной доплеровской микроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.ВЛОМОНОСОВА

Ть ол -——

i ~ OUI 100/физический факультет

На правах рукописи

УДК 535.33:578.087:621.378

ГЛОНТИ Важа Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СТАЦИОНАРНЫХ И НЕСТАЦИОНАРНЫХ ПОТОКОВ В КАПИЛЛЯРАХ МЕТОДАМИ ЛАЗЕРНОЙ ДОПЛЕРОВСКОЙ МИКРОСКОПИИ.

Специальность 01.04.21 — лазерная физика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Метод лазерной доплеровской спектроскопии (ЛДС) за тридцать лет своего существования зарекомендовал себя как один из наиболее удобных и информативных методов исследования динамических характеристик светорас-сеивающих объектов. Особый интерес для биомедицинских исследований представляют исследования потоков жидкостей, присущих живым объектам (протоплазма, кровь и др.) с высоким (порядка 10 мкм) пространственным разрешением. Для проведения таких исследований разработаны лазерные доплеровские микроскопы (ДДМ) — лазерные доплеровские анемометры высокого разрешения, построенные чаще всего на базе оптического микроскопа. В этих приборах удачно сочетаются возможности, которые предоставляет экспериментатору ЛДС (бесконтактность, высокое разрешение, неинвазивносгь, быстрота получения информации о скорости при широком диапазоне измерений и др.) с теми удобствами и возможностями исследований, которые предоставляют современные оптические микроскопы — высококачественная оптика, точная механика, широкий спектр дополнительных приставок и др. Одно из главных достоинств подобного прибора — возможность постоянного визуального контроля за исследуемым объектом, а также за размерами и положением в образце измерительного объема. Если все это сочетается с высокочувствительной аппаратурой регистрации и точной системой обработки сигнала на основе современных цифровых анализаторов спектра или фотонных корреляторов, то при помощи таких приборов можно получать результаты, которые невозможно достичь другим способом.

Со времени создания первого ДДМ [T.Maeda, F.Fujime, 1972 г.} несколько научных групп в мире занимались разработкой и созданием этих приборов. Были реализованы ЛДМы работающие как по однолучевой, так к по дифференциальной схеме ЛДС. регистрирующие излучение рассеянное как »перед, так и назад. Были разработаны также приборы, в которых зондирующее и рассеянное излучение транспортировалось при помощи световодов, причем в этом случае удалось достичь рекордных размеров измерительного объема — 2x2x2 мкм^, что позволило проводить измерения внутри одиночного эритроцита [T.Tanaka, I.Nishio at al.J. При помощи таких приборов проводились высокоточные измерения в искусственных капиллярах fH.Mishroa, T.Asakuraf, исследования мнкроцир-куляции крови [C.E.Riva. J.E.Grumvaid el а(.|, измерения скорости кровотока в сетчатке глаза (T.Tanaka. G.BenedekJ и ряде других сосуда» кровеносной системы, определение коэффициентов диффузии для различных компонент цитоплазмы

» для обработки полученной информации разработать математическое и программное обеспечение;

• разработать систему стабилизации скорости течения жидкости в искусственных капиллярах, произвести калибровку прибора и отработку методики измерений;

• провести измерения профилей скорости различных жидкостей® стеклянных капиллярах различного размера при стационарном и нестационарном потоке;

• провести исследования скоростных характеристик течения цитоплазмы водоросли Ше11а;

• провести анализ возможности получения информации о распределении скоростей в потоке по сигналу однолучевого ЛДС;

• разработать кювету для исследования сдвигового течения Куэтта и провести измерения профиля течения различными методами.

Новизна работы

• впервые создан универсальный модульный знахочувствительный лазерный доплеровский микроскоп, автоматизированный на базе ЭВМ, с пространственным разрешением до 5 мкм и диапазоном измерения скоростей от микрон в секунду до сантиметров в секунду;

• получены профили скоростей от потоков различных, в том числе и иеньюто-новских, жидкостей (реополиглюкин, плазма крови с тенями эритроцитов); получены профили скорости нестационарных потоков в искусственных каналах в различных фазах цикла колебаний "капельного генератора";

• впервые методом ЛДС получен профиль скорости течения цитоплазмы в изолированной клетке пресноводной водоросли ЫИеИа;

• впервые предложен и успешно опробован алгоритм восстановления профиля потока жидкости по спектру однолучевого ЛДС при определенных предположениях о характере течения;

Научная и практическая ценность работы

> Полностью на отечественной приборной н элементной базе собран универсальный лазерный доплеровский спектрометр высокого разрешения, с помощью которого можно решать широкий спектр разнообразных задач биологии, биофизики, медицины, гидродинамики и пр. Проведена его калибровка и отработана методика выполнения измерений. Разработано программное обеспечение, которое дает возможность осуществлять эксперимент в режиме реального времени и позволяет обрабатывал, вводимый сигнал по алгоритму БПФ, вводить спектры, построенные спектро-

оптимальным обр>азом проводить исследования скоростных характеристик потоков светорассеивающих частиц, присущих медико-биологическим объектам, с высоким пространственным разрешением.

♦ Разработанный пакет программ обеспечивает необходимые гибкость и удобство обработки результатов измерений.

• Разработанная методика проведения измерений позволяет с хорошей точностью регистрировать профили скорости потоков различных жидкостей.

• Данные, полученные при тестировании стационарных и нестационарных потоков воды, говорят о ее ньютоновских свойствах, а данные, полученные при тестировании суспензии эритроцитов о кеньютоновсхих свойствах этой суспензии при данной концентрации;

♦ Предложенные алгоритмы восстановления профиля скорости по спвктру одволучевого ДЦМ позволяют в ряде случаев быстро определять закон распределения скоростей.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации опубликованы в >0'печатных работах и докладывались и обсуждались на следующих конференциях и семинарах: Всесоюзные семинары "Лазеры в народном хозяйстве" (Москва, 1986г., 1988 г.), Всесоюзный семинар "Лазерная биофизика и диагностические применения лазеров • биологии и медицине" (Саратов, 1986г.), XIII Международная конференция но когерентной и нелинейной оптике (Минск, (988г.), IV Советско-чехословацкий семинар "Динамика и активность биологических макромолекул: .лазерный м компьютерный эксперимент" (Ереван, 1988г.), И Международная конференция по лазерному еветорассянию биологических объектов (Печ Венгрия 1988), Н Всесоюзный семинар "Лазерная биофизика и новые применения в медицине" (Тарту, 1989г.), Всесоюзный семинар "Измерения в потоках. Методы, аппаратура и применения" (Москва, 1990г.), Международная конференция "Оптика в науках о жизни" (Гармнш-Партикирхен, Германия, 1990г.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и списка пггературы. Диссертация изложена на ^¿3 страницах, содержит ^З7 рисунков. Список литературы включает наименований.

Во введении проведен сравнительный анализ различных методов ¡»агностики потоков, используемых для исследования биологических объектов, >аскрыты особенности применения метода ДДС дня решения биофизических

В §1.5 приведен обзор публикаций, посвященных лазерным доплеровским микроскопам. Рассмотрены основные конструктивные особенности большинства приборов, приведены их основные данные (характерный линейный размер измерительного объема — 2+100 мкм, диапазон измеряемых скоростей от 50 мкм/с до 20 мм/с). Рассмотрены различные способы обработки сигнала, применяемые в этих ЛДМах. Приведены задачи, решаемые с помощью этих приборов (определение коэффициентов диффузии, измерение скорости кровотока и др.), обсуждены полученные данные.

В главе И подробно рассмотрены назначение, конструкция и работа различных узлов разработанного нами микроскопа, приведены основные его параметры. Описана автоматизированная система обработки сигнала, представлено описание программного пакета обраболси данных.

В §2.1 описана оптико-механическая часть прибора, состоящая из виброзащитного стола, непосредственно микроскопа "Люмам Р1 **, Не-Не лазера ЛГ-79-1 мощностью 10 мВт н диаметром пучка 2 мм, оптической системы, расщепляющей луч на два равной интенсивности, системы сдвига частоты лазерного излучения, состоящей кз двух АОМов, системы фокусировки, состоящей из подвижного юстируемого кронштейна н набора объективов разного увеличения, элементов собирающей оптики — микроскопного объектива, через который также осуществляется наблюдение за объектом, и системы регистрации оптического сигнала.

Система регистрации оптического сигнала состоит из разработанных автором бысгрозаменяемых модулей, таких хак модул» подвижного зеркала, служащий для пропускания лазерного излучения на поверхность диафрагмы и отражения остального света на видикон телекамеры, модуль подвижной точечной Х-У диафрагмы диаметром 50 + 300 мкм, служащий для выделения того участка изображения объекта, сигнал от которого должен попасть на фотоприемник, н модуль фотоприемника, подходящий для различных ФЭУ (ФЭУ-79, ФЭУ-129, ФЭУ-51). Для освещения объектов снизу применяется специальный осветитель.

Постоянный визуальный контроль за объектом и положением в нем измерительного объема осуществляется как непосредственно через окуляр-измеритель, так и при помощи телемонитора, что позволяет группе сотрудников участвовать в проведении наблюдений и снижает утомляемость исследователя. При необходимости изображение может быть записано на видеомагнитофон. Для фиксации н перемещения образцов предметный столик микроскопа снабжен специальными зажимами и оснащен микрометрическими подачами, позволяющими перемещать объект по трем направлениям с шагом до 5 мкм.

§2.2 посвящен описанию часта Л ДМ, осуществляющей обработку сигнала. В нее входят. ФЭУ с максимумом чувствительности в красной области; специально сконструированный усилитель со съемными фильтрами для подавления иизхо-

секунды;

• визуальный контроль за положением измерительного объема и окружающей структуры через окуляр и на видеомониторе;

• возможность реализации как дифференциальной, так и однолучевой схемы ЛДС с рассеянием как вперед, так и назад;

° возможность исследования пульсирующих потоков с синхронизацией сбора данных;

В главе III описана методика измерений при помощи ЛДМ, приведши результаты тестовых измерений скоростей потоков вода и других жидкостей в искусственных капиллярах, параметров течения протоплазмы в одиночных клетках водоросли ЫИеНа.

§3.1 содержит описание методической части экспериментов по регистрации профилей скорости. Описаны построенные нами три разные гидросистемы, предназначенные дня формирования стабильного потока в тонких капиллярах (внутренним диаметром до 50 мкм). Одна из них на базе вращающегося поршня осуществляет также перемешивание жидкости дня предотвращения оседания и агрегации частиц. Описаны модельные эксперименты по регистрации профиля скорости при стационарном течении воды в круглых и плоских стеклянных капиллярах с точностью не хуже 7%. Приведены характерные профили течения реополиглюкина и теней эритроцитов в плазме. Отмечен неньютоновский характер их течения. С целью моделирования нестационарных потоков собран капельный генератор и проведена регистрация профилей скорости в различных фазах цикла колебаний. Представлены профили, соответствующие ньютоновскому характеру нестационарного течения воды.

В §3.2 описан широко используемый для изучения внутриклеточной подвижности объект—клетки междоузлий харовой водоросли ШгеИа, рассмотрен ряд работ, посвященных ее исследованию. Отмечено, что для адекватного построения модели генерации движущей силы необходимо точное знание распределения скоростей течения цитоплазмы и клеточного сока. Приведены полученные при горизонталь ном и вертикальном сканировании профили скорости течения. Погрешность при определения профилей -12%

Глава IV посвящена анализу применимости однолучевого ЛД-спектрометра для определения профиля скорости. Отмечено, что для снятая одного профиля посредством сканирования измерительным объемом дифференциального ЛДС требуется значительное время (от нескольких минут до получаса), за которое многие параметры потока могут измениться. Корме того, при зондировании биообъектов часто невозможно избавиться от рассеянного от стенок канала опорного излучения, что приводит к работе даухлучевого спектрометра одновременно в однояучевом в дифференциальном режимах. Поэтому

I экспериментов, позволяющая регистрировать скорости до нескольких метров в секунду. Для этого использовался аналоговый анализатор спектра СК4-73 с полосой обзора 20 Гц+150 МГц, сигнал с которого накапливался и обрабатывался цифровым анализатором СК4-72 и далее вводился в ЭВМ. Такая организация обработки обеспечивала хорошую оперативность и высокую точность измерений.

§5.3 содержит результаты, полученные при тестировании течения Куэтта дифференциальным ЛДМ. Представлены, характерные профили сдвигового течения. Как и следовало ожидать, профиль представляет собой наклонную прямую. Отклонение экспериментальных точек от прямой по методу наименьших квадратов не более 10%.

В §5.4 приведены результаты зондирования сдвигового течения однолучевым ЛДМ. Получены характерные доплеровскне спектры, после обработки которых по алгоритмам, предложенным в §4.2, были получены значения т= 1 с погрешностью ~15% для первого алгоритма и ~10%—для второго.

В заключении сформулированы основные результаты работы. (. Разработан и создан многофункциональный ЛДМ, позволяющий проводить исследование динамических параметров физических и биологических объектов по характеру квазиупругого светорассеяния.

2. Разработано программное обеспечение комплекса.

3. Проведена калибровка прибора и отработана методика измерений.

4. Предложен ряд систем для стабилизации скорости потока жидкости в гидросистеме.

5. Проведаны эксперименты на стеклянных капиллярах. С шагом 10-1-20 мкм получены профили скорости течения воды и других жидкостей с погрешностью ~7%. Проведены измерения профилей скорости нестационарного течения в различных фазах работы капельного генератора.

6. Проведены измерения в одиночных клетках водоросли ШеИа, впервые методом ЛДС зарегистрирован профиль течения цитоплазмы и клеточного сока в этих клетках.

7. Сконструирована кювета и система привода для создания сдвигового течения. Получены профили скорости течения Куэтта.

8. Предложен метод восстановления профиля скорости по спектру одиояуче&ого ЛДС. Разработаны алгоритмы решения как прямой задачи построения спектра при известном законе распределения скоростей, так и обратной задета восстановления профиля по виду доплеровского спектра.

). Экспериментально проверена эффективность предложенных алгоритмов при тестировании потоков в искусственных капиллярах и в течении Куэтта,