Изучение пенициллинацилазы E. coli с помощью производных четырехкоординированного форсфора тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ГГ& №

АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ 5100РГАН1ЧН01 X1M1I ТА НАФТОХШИ HAH УКРА1НИ

на правах рукспису

ЦЕРша Володаыир Мшсолайовхгч

БИВЧЕНКЯ ПЕН1ШШНАВДЛАЗИ Е. coli ЗА Д0П0М0Г0Ю ГОХ1ДШХ ЧОТИРЬОХКООРДИНОВАНОГО ФОСФОРУ

02.00.10 - <51оорган1чна х1ы1я, х!м1я природннх та ф1зАолог1чно активних речовин

АВТОРЕФЕРАТ днсертацИ ка здобуття наукового отупеня кандидата х!ы1чнпх наук

Кн1в - 1095

Робота виконаяа в 1вститут1 б1оорган1чно1 х1м11 та нафтох1м11 HAH Укра1нн.

Науковий кер1вник: акадек1к HAH Ухра1нв, доктор Z1U14BBZ наук В.П.Кухар

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор 01олог1чнк2 наук С. 0. Кудщов

кандидат хШчнзх наук А. 1.Вовк.

Пров1дна орган1зац1я: Ф1зико-чс1м1чниа 1нститут 1м.

0. В. Богатсысого HAH Укра1ни.

Эахкст в1д<5удеться "_££_" 1995 р. на

зас!данн1 спец1ал1зовано! вчено! ради Д 01.80.01 в

1нстатут1 01ооргая1чЕо1 xtiill та на$гох1Ш1 HAH Укра!нв (253300, Ка1в, в ул. Муриаксыса 1).

3 дисертад!ев коаао сзнайомитась у <310д1отеа1 1нституту Ь1оорган1ЧЕо1 xlull та нафтоИмП HAH Укра!нк (253880, Ки1в, вул. Мурыансыса 1).

Автореферат роз1слаш2 ■ ихсТоиа^а/ 1995 р.

Вчений сокретар

спец1ал1аовано1 вчэно! ради Д.ЛФздоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Дктуалья1сть темя. Пен1цил1нащиаза (ПА) (КФ 3.5.1.11) - фермент, ко катал1зуе г1дрол1з ам1дного зв'язку в молекул! бензилпен1цил!ну з утворенням 8-ам1нопен1циланово1 (8-АПК) 1 фен1лоцтово1 кислот, а також г1дроя1з ряду 1яших ам!лнхх 1 складяоеф1рних : пох1дних фен!лсцтово! кислота. Кр1м того, фермент використовуеться для розд1лення енант1омер1в, введения 1 зняття захисних груп в органичному синтез!. 1нтерес до ПА в значн1й м!р1 зумовлений практичное вахлгв!стг синтезу нап1»сиятетичних пенШклШв. Встановлення механ1зм1в ферментативного катал!зу, топограф:I активних центр1в фермент1в е одним з актуалъних завдаиь б1ооргаи1чно1 Х1м11. Як 1нструмент для «ого вир1шення традтЦйно вйкористовуютъся спецнф1чн1 1нг1б!торя фермент!в. В останн! рока для створення 1нг1б1тор!в г!дрол1тичних фермент!в пл1дним выявилось застосування концепт I аналог!в перех!дного стану, основе® яко! е припущення про хомплемезтарн!сть активного центру ферменту до структур, то в1дпов1давть пром1*ним станам ферментативного пронесу. 0ргая1чн1 сполуки •4-коордияоваяого фосфору мокуть добре коделювати такий переПяний стан, во 1 е причиною 1х вшсорнстання для створення 1нг!б1тор1в - аналог1в перех1дного стану. Внвчения механ!зму футсЩонування ферменту е предметом пост1йних досл1дхень, 1 фосфороргатчю сполуки, ■ мохуть бути перспективнями для вир!шення цьогс эавдання.

Петою робота був пошук нових фосфороргая1чних 1нг!б1тор1в ПА 1 доел!дхення 1х !нг1бувчо1 дН. Зокрема. необх1дко було вивчити взаемозв'язок м!х актизн!стс

г .

синтезованих 1нг1б!тор!в та особливостями 1х будови. . во могло спринта встановленню механ1зму фунхЩонувакня ферменту,

Наткова новизна 1 практична значим!стъ. Синтезовано рад нових фосфорорган1чяих сполух г стаб1лыгах аналог!в ймов1рних 1нтерыед1ат1в - до виникають в лроцес! ферментативного г1дрол1эу субстрат1в, 1 вивчено взаемодю з ПА. Запропоновано модель зв'язуваняя фосфорорган1чнвх !нг!б1тор1в в активному центр1 ферменту. Зд1Яснено анализ впливу стереоелектронши параметр!в молехул фосфорорган! чних 1нг1б!тор1в на 1хзв'язуванняз ферментом.

Вперше вотановлено, ао моноарилов1 еф1ри бензилфосфоново! хяслоти на основ! пара-зам1дених фенол! в з електроноакаедторнюш замЮннкамж е селехтившшя необоротними 1нг1б1торами ПА. Визвачено х1нетачя1 параметри процесу 1нахтивац!1 1 роаглянуто можливиа мехав1зм цього процесу. Вперше вивчено взаемод!о ПА з бензилалк1лкетонами I бензилалк1лкарб1нолами. Фосфорорган!чн1 !нактиватрри мохуть бути вшсористан! як зручн! селективн! титранти для визначення абсолютно! ; концентрат 1 ахтивних центр!в ферменту.

.Апробаа1я роботе. 0креи1 частинн робота допов1дались на м!хнародн!в конференц!! молодих вчаних з орган1чно1 та б1оорган!чно1 х!м11 1Рига. .1891 р.), IX м1хнародноиу сшшоз1ум1 з х!м!1 фосфору (С-Петербург, 1993 р.). ХШ м1хнародн!й хонференцП по х1и!1 фосфору Иерусалим, 1995 р.), наукових конферетЦях 1нституту б1оорган1чно1 х1мП та нафтох!м11 (1989 1 1993 р.).

Пубя1кац!I. , Освоений зм1ст дисертац1йно1 робота викладения в 8 пубя1кац!ях.

Структура робота. Дисертаа1йна< робота схладаеться 3i вступу, огляду л1тератури, результата експериментальких досл1джень та ix обговорення, опису матер1ал1в та метод1в, списку цитовано! л1тератури., Дисертац1я вшсладена на /ЛР стор1нках друкованого тексту i ьтостроваяа V таблицами,

схемами та (2 малинками.

Конкретний особистий внесок дисертанта. Ехсперименталь-на частика робота виконана дисертантом особасто.

М^тододогИ- метояи досл!дження. В робот! викорис-товузали препарат ПА э Е. ' coli. А1гтявн1сть синтезозаних сполук визначали рееструючи спектрсфотоыэтрично зм!ну оптично! густили (Х=400 ям), виаслисх реакцП ферментативного г!дрол1зу субстрату за наявност1 1нг1б!тор1в. Як субстрата використовували п-к1троан1л1д фен1лоцтозо! кислота Сп-НАФОЮ 1 л-карбокси-гс-нiтроанtriд фен1лоцтово! кислота (ДИШАФОК)., Натематичну обробку експериыентальнях далих зд!2снсвали ва ПЕОМ за програмов Enzfitter.

ОСЙОВН1 РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТЙ

1. ¡mm i сдагез досфороргдщчедх iHnprroptB па

Виб1р структурких еяеыент!в при створенн1 фос$орорган!чних 1нг1б1тор1в базувався на концепаП аналоПв переИдного стану (кал. 1) та bis в!доких законом!рностях

О О" О"

" 1 1 а) . С б) С—X bi Р—X

е х е он к No

Мал. 1. Пор!внянкя структура а) молекула субстрату; б) пере2.1днсго стану при реакцП г!дрол!зу; в) сполуки 4-хоордннаи1йного фосфору.

фунхцЮнування ПА. Виходячи з цього, як . мохлив1 1нг1б1торп ПА, були синтезован1 ам1дн1 та складноеф1ря1 пох1дн1 бензилфосфоново! кислоти. Синтез $осфорорган!чних сполук зд1йснений за схемос 1. Була-проведена оШнка г1дрол1тично1 стаб!льност1 х1лькох типових представник1в цих сполук 1 показано, до вони, по-лерше, не е субстратами . ПА, \ по-друге. досить стаб!льн1 в умовах тестуванкя активност1 ферменту.

2. ЕЗАеМОЛЯ ФОСФОРОРГАН 1ЧНИХ СПОЛУК 3 ПА.

Характер 1нг16угчо1 д!1. Синтезован1 пох1дн1

бензилфосфоново! кислоти (1)-(1Б) виявились конхурентними оборотными 1нг161торами ПА, з Kj наведекими в табл. 1. При розбавленн1 розчину ПА, ахтивн1сть яко! була знижена на 75я внасл1док додання великих концентрац1й 1нг1б1тор1в (2) або (9), в1дбуваеться свидке в1дновлення активност1 ферменту (мал. 2). Ш результата св1дчать про те, до синтезован1 фссфсрорган1чн1 1нг1б1тори зв'язуються з ПА .шбидко i зворотно.

рН-заяехн1сть. Зв'язування 1нг1б1тора (2) ферментом пом1тно пол1пшуеться при энигеын! рН реакц1Яно! cyuiml. виходячи на плато при рН <7 (мал. 3). Практично такий же 1 характер рН-залехност1 Ку в реакцИ ' ферментативного г!дрол1зу бензилпен1цил1ну, а тако* рН-залэяност1 1нг1бування вГдомим конкурентним 1нг1б1тором ПА фен1лоцтовос кислотою. Це св!дчить на корпеть того, коов'язувгння фосфонату (2) i субстрату контролюеться одними 1 тими е 1сногенн;:1.ш трупами.

СелективкЮть. Знайдено, ко сполуки (2) та (S) не впзтивають на активы i сть а-х1мотрипсину 1 nanaiHy в

Схема 1.

уснз ¥СН(К)С03СНз Я ш

даУЧ • < * СеР^Р-ШСНСОзСНз

С1 Е13Н НдСО К

В=СНз, 141); й=СНз, 0-С5) Ь-А1аОСН2С6Н5/Е13М Й=1-С4Нд, Ь-(7а)

8 Но/раек с) в . - +

Ь (За) ЬЧЗ)

Й _

С6Н5СН2?~ШГНС02и ""-

0И й

К=СНз, Ь-(2); К=СНз, Б-(6) й=1-С4Нд, Ь-(7)

8 1. СоНсСНрОН/ЕЦК 8 ЯуМО(С)

СоНцСНоРС1о —в-5—2-*-» скнссад-шснсо?сно —'--

6"5 ^ 2 2 !._А1а0Ме/Е13Н с %Сн|о Щ Е13Н/МеШ

Ь (4а)

С6Н5СН2Р-ШСНС02СН3 Е13НИ+ О" СНд I (4)

№ Ь-Н0СН(СНо)С0-,СоН= 2 1-ВиККр 3%С%РЧ -2 С6%СН2Г°?НС02С2Н5 --

I (8)

С6п3ъп2гч

С1 Е13Н • НдСО СН3

I

II 1.И0Н й

I (10) I (9)

Л ОСНд С р ш I] 1-ВиШр 8

8 ^ СсНдСНзР-ШСбНд -2 С6Н5СН2Р-ННС61%

С1 Ь13к 0СН3 1-ВиКНд0"

(11а) (11)

Табл. 1, 1нг1бування пен1цил1нацилази фосфонатами.

N слояука

hi

N

сполука

Kt. мМ

1 CgHgCHgPÍ 0)-NHCHCOgCHg 4,9±0,9

ОСН3

2 CgHgCHgPtOJ-NHCHCO^i 0,31±0.06

OLÍ СН3

3 С0%СН^(О)-NHCHCOgNa 0,28±0,05

Ц CHg

4 Се1%С1у(0)-КНСНС02СНз -2,1*0,4

Et3NH¿ CHg

5 C6%CH2P(0)-(0)NHCHC02OT3 3,5±0,5

¿CHg CHg

0 CgHgCHgPtO-íPJNHCHCOgLl 1,8±0,2 ¿Li CHg

7 CgHgCHgP(0)-NHÇHCOgLi 1,3*0,25

¿LÍ снгауснз^

8 C6H5CH2P(0)-0CHC02C2H5 О±2,2

IcHg

9 CgHgCHgPíOJ-OCHCOgH 1.22±0.08

OH ¿Hg

10 CgHgCHoP(o)-OCHCOgCgHg 6.7±0,5 t-BuNHgO CHg

11 CgHgCHgPl O ) -NHCgHg 0,48±0,03 t-BuNHgO

12 CgHgCHgPíOJ-OCHg 8±1,2

¿H

13 С^а^ИОМЮзНд 15±1,8

OH

14 CgHgCHgPtObOCgHg 0,33*0,04

OH

15 Св%(ЯЦ>(0)-0Н 2.4±0,5

OH

16 C6%CHgP(0)-H 1±0,1Ö

¿H

Сгуп!нь розбавлення, п рН

Нал.- 2. Вплив. розбавлення Мал. 3. Залеан!сть конотанти

сум1ш! фермент-!нг1б1тор 1нг1бування ферменту сполукою

на активн1стъ ферменту <з (2) в!д рН.

врахуванням розбавлення). .

<сондентрац!ях менших 13,6 иМ : та .50 мМ в!дшшдно.

Вплив структура 1нг!б!тор!в на зв'язування з Ферментом. На основ1 даних табл. 1 мохна запропонувати схематичну модель зв'язування ефектор!в в активному центр! ферменту (мал. 4), яка дозволяе пояснити .роль трьох шдцентр!в зв'язування: 80Х0 ! Селективн!сть д!1 синтезованих сполук визначаеться наявн1ств в Р^-положены! бензильно! групп з високос спор!днен!стс до 2^-п!дцентру ферменту. Важлива роль ц!еГ групи у зв'язуванн! з ферментом шдтверджуеться тим, ао-зам!на в сполуц! (2) бензильно! групи на метильну дас ам!дофосфонат. який не 1нг1буе фермент нав!ть при концентрац! 1 30 мМ. Стереох! М1Я фрагмент)' Р^, як 1 очхкувалось, суттево впливае на ефективн1сть зв'язування 1Нг!б1тор!в а ферментом, ас видно з спхвставлення значень К,

йохо • для сполук (2) 1 . (6). . Однак вплив., стереоконф! гурад! I заливку в

О Р^-полохенн! в даному випадку

А СцНдС^-С-Ш-Р виявляеться набагато слабк!ше,

О" н1ж це спостер!гаеться для

Б С6НдСН2-С-Ш-К ; у субстрат! в. Р1зниця х • в. ' ¿й стереоконф! гурацП Р^-$рагмен-

0" . т!в д!еф!р!в (1) 1 (5) практично

В С&Н5СН2-1>-Х-К не впливас на спор1днен!сть цих

■ 0 сполук э ферментом. Явке

а а - послабления, в ' пор!внянн1 з Р1 Рохо субстратами, вшшву

Мал. 4. Модель зв'язуван-.стереох!м!чноГ конф!гурац!1 ня ефектор1в в активному Р|[-фрагмент1в !нг!б!тор1в на центр! ПА. ефектиыпсть 1х зв'язування з

■ ферментом - спрнчинено, очевидно, наявшстю в молекулах цйх сполук фрагменту 4-координац1 йного фосфору 1 обумовлое необх!дность вид1лення 20Х0~ зв' язуючого шдцентру ферменту. > ..." _ -. '

Фосфонат (8), ш.о м1 стать в Р^-положенн! залишок Ь-лактату, зв'язуеться з ПА в менш!й ы1р1, к1* ам!дофосфонат (2) 1з залишком 1.-алан!ну в цьому . пологенн!. Йаявн1сть негативного заряду в Р^-фрагмент1 молекули . 1 кг!б!тора помхтно пол!пшуе його. зв'язування э ферментом.,

АкШдофосфонат (11) 1 моно$ен!ловий еф!р бензилфосфоново! кислоти (14) зв'язуються з ферментом пом!тно краще, н1ж моноалкллов! еф!ри (12) 1 (13). 0ск1льки субстрата - анШди, . алх!лов1 ! арилов) еф!ри фен1лоцтово1 кислота - ьзаемод!ють з ПА практично однаково,; ц1-вгдмлнност"! в спо;пдкеност! з ферментом можна пояснити

наявн1ств в структур! цих сполук фрагменту 4-координованого Фосфору.

В Рохо-положенн1 вс! синтезован! • 1нг!б1тори м!стять тетраедричну рксифосфон1льну трупу, .яка в!др!зняеться в!д плоско! тригонально! групи субстрату перш за все пом!тно б!льшим об'ёмом, а також здатн!сти нести повний негативний заряд. ПояваГ негативного заряду в Рохо-полохенгп (що супроводжуеться одночасно зменшенням общему фосфон!льного фрагменту), при деметилюванш не приводить до суттсвого зб1льшення спор1дненост1 з ферментом. Це вит!кае з пор!вняння значень К^ ам!дофосфонат1в (1) ! (4>, фосфонат!в (8) ! (10). Пом1тно сильн!ше зв'язування сполук (2) 1 (0) в пор1внянн! з в!дпов!дними сполуками (1) 1 (8) обумовлено, можливо; наявн1стю в!льно! карбоксильно! групи в Р^-положенн! цих кислот, а ' не зарядом оксифосфон1льного фрагменту. •

Синтезован! фосфорорган!чн1 сполуки загалом виявились пом!рними по. сил! 1_нг1 б\торами ПА, що зв'язуються з ферментом приблизно так, як 1 субстрата - пох1дн! фен!лоцтово! кислоти. Знижена спор1днен1сть до ПА, пор1вняно з оч!куванос, може пояснюватисъ тим, що фермент в!ддае перевагу ефекторам з основним, Незарядженим станом тригонапьного карбон!лу, Сл1д, однак, врахувати ! те, що фосфонатна група б1 лыса за об'емом, н!ж в1дпов1дний фрагмент перех1дного стану субстрату. Тому, не викяючено, що 0ксифосфон1льний залишок не може оптимальним чинсм розм!ститись в 5охо-п!дцентр! ферменту, що ослаблюе зв'язування 1нг!б!тор1в з ПА.

ю

Э. БЕНЗИЛАЛК!ЛКЕТОНИ 1 БЕНЗИЛАЛК1ЛКАРБ1Н0ЯИ - СИНТЕЗ , 1 01ИНКА 1НПБУЮЧ01 АКТИВНОСТГ

3 кетою дальшого досл!дження фактор! в,- ко впливавть яа зв'яэуванна ефектор1в з ПА I додаткового Шдтвердхення деяких з виаенавецених висновк!в, був зд1йснений синтез ряду кетон1в I спирт1в - стаб1льних аналог1в субстрат1в. В Р^-положеша вс1 сполуки мали г!дрофобний залишок, . в Рохо-положенн1 - плоек! кетонн! (сполуки 18. 20, 22, 23) чи тетраедричнГ спиртов1 (сполуки 19. 21) фрагмента, а в Р^-положенн! - нейтральн! або негативно заряджеи1 групи. Структура та !нг!буюча активность сполук представлена в таблиц! 2. Потр1бно, проте в1дзначити, «о трифторметилкетони (22) ! (23), в умовах експерименту, 1снуить переважно у вигляд1 гем-д!ол1в - продукт!в приеднання молекули води до активовано! карбон!льно! групи.

Вс1 доел!джен! сполуки виявились конкурентниыи !нг161торами ПА. Пор1вняння ^ кетон!в (18) ! (201, з одного боку, 1 структурно 1м в!дпов!дних карб1нол!в (19) 1 (21) св!дчить про пом1тне зменшення спор1дненост1 до. ферменту при переход! в!д кетон!в до карб!нол1в. Причиною цього могло бути те, «о при зв'язуванн1 кетон1в (18) 1(20) суттеву роль вШграе утворення нап!вкетал!в за. участв г!дроксильно1 групи залишку серину в активному центр! ферменту. Однак, характерними . ознаками такого. механ1зму !нг!бування е:набагато м!цн1ше зв'язування (в 100-1000 раз1в) трифторметилкетон1 в в пор!внянн! з метилкетонами; р1зке пад1ння (в 300-10000 раз!в) 1нг!буючо1 здатност! при переход! в1д кетон!в до в!дпов!дних карб!нол!в; здеб1лыюго спостер!гаеться пов1льне зв'язування !нг!б!тора з ферментом.

u

Таблти 2/Будова та 1нг5буюча активн!сть бензилалк1 лкетон!в 1 бензйлалк1лкарб1нол!в.

N сполуки сполука Kj, мМ

18

19

20 21 22. ' 23

1нг!б1торам С185—C23J ц1 харахтерн! ознаки не властив1. Тому можна припустите, то утв'орення нап1вкетал!в при вземодИ xeroHiB э активним центром ферменту не е виэначальним фактором зв'язування. В такому разI в!дм!нност! в 1нг1бу»ч1и активност! при переход! в!д кетон!в (18) i (20) so карб!нол!в (19). i (21) сл!д зв'язувати з особливостями етруктури самих 1нг)б1тор!в, а саме - зам1ною карбон!льно1 групи (С=0) на спиртову (СН-ОН). Одержан! результате св1дчать про те, до ПА кране зв'язуе 1нг1б!тори, ао масть в Рохо-полохенн1 плоску тригональну карбонi льну групу, а не тетраедричну спиртову трупу або близъку до не! по просторов! й будов! гем-д!.ольну гр'/пу г1дратоваких

CgHgCHg-C-CHj : • 0,22±0,03

И

С^%СН2-^Н-СН3 8,3+0,7 ОН

c6f¥3I2"|"CH2CH2C02H 0,031i0,003

CßHgCHg-CH-CH^COgH 0,56¿0,07

¿H ;

C8%Cf^-C-CF3 1,16±0,09 0

C6B5CH2CH2-C-CF3 0,70*0,07 0

трифторметилкетон1в. Можлзво, саие крацим зв'язуванняы ефектор1в (субстрат1в 1 1нг1б1тор1в) в основному стан1 а незарядженим тригональшш карбон1льнии фрагментом 1 пояснюеться пом1рна 1нг1 бухта активн1сть фосфорорган!чних• iHriôiTopiB на основ! сполук 4-координованого фосфору.

Одержан1 результата п1дтвердхують такох ран1ше зроблений висновок про вахливу роль негативного заряду в Р^-иоложенн1 молекули 1нг1б1тора, до пом1тно п1дсилюе спор1днен1сть до ферменту. Ile видно при пор1внякн1' констант 1нг1бування. сполук (18) i (£0), (19) 1 (21). Синтезована 4-оксо-5-фен1лпентанова кислота (20) . е . одним з найефективн1ших хонхурентних 1щчб1тор1в^ ПА. V

4. MOHOAPWiOBt ШРИ БЕИЗЮМООЮНРВО! КИСЛОТИ - Г/ НЕОБОРОТН! 1НАКТИВАТОРИ ПЕННДШНАПШЗИ. : '

Виходячя з данях про сприятливий валив негативного заряду,, а такох фаноксигрупи в Р^-пояохенн! молекули 1нг1<31тора, нами був зд1йснвнна синтез монофен!лового еф1 ру бензилфосфоново! кислота, цо ы1стив в п-полохенн1 феноксигрупи карбоксильная залишок. Ця сполука ввивалась необоротним 1нактиватором ПА. до спонукало нас синтезувати ряд под1бних еф1р1в бензилфосфоново! кислота 1 вивчити ïx взаеиод1d з ферментом. .

К!неточна схема rroonecv. Фосфонатн! 1нг1б1тори (24)-(27) (табл.3) вхе в невисоких концентрац1ях з пом1тнов Евидк1ст1) 1нактивують ПА з Е. coll. Ефекгивн! константа швидкост1 1нактивац11 псевдопершого порядку не залежать лШйно в!д концентрат! 1нактиватора (мал.5), ао св!дчить про ям1н1кальку" схему проаесу взаемод!I 1нг1б1тора з ферментом. яка включав оборотну стадЮ утворення пром!хного .ком-

, шгексу фермент-Iкг1б1тор ще до стадИ 1нактивац11. К! не : тичн! параметра процесу 1н-активапП ферменту п1д д1еп вивчених 1нг1б!тор1в по схем! Э представлен! в табл.3.V Ефективн1сть фосфо-натянх спояук зм1нветься в иирохих мехах 1 виэначасть-с*; очевидно, характером - аршюксигрупи. При цьому виэяачальну роль вШграе не наявн1сть (чи в1дсут-. н1сть) негативного заряду на Шй груп!, а елехтроно-акцепторн1 властивост1 за-мЮшпса в пара-яолохенн! / " ■ . : , , ; :

високо! 1кактнвувчо1 активност! анЮнних фосфонат1в типу

Схема 3. •'•'. и

Е +1 Е - I —Е—I

(24М27) по в 1 дношешго до г!дрол 1 тичного ферменту вэ е трив!альшш. Б1льшв того, нейтральная метилариловий . еф!р (28) виявився далеко не таким ефехтивним 1нг1б1тором, як в1дпов1дяий мояоариловиа еф1р (25). Це пом!тно в!др1зняе ПА в! а тапових сёривових г!дролаз, для яких !нг1бусча актавнЮть кейтральних фосфонат1в ! фосфат!в на к1лька порядк1в перевшуе актива 1 сть Ыдпов1дних моноан1онних пох!дних.

200 300 Ш, ихИ

Мая. 5. Эалехв1сть ефективяо! константа ивиисост! 1нактива-ц11 ПА &1Д д1ев сподукн (26) в!д концентрацП 1нагп£ватора.

Таблица 3. К1нетичн1 параметра 1наятивац11 ПА аридоввни е$1рами бенз илфосфоново! кислота 1 бензилхлориеталкетоном.

сполука КА к1н кц,^ кЦ^И

(мМ) (зев-1) (МхвГ1 (МхвГ4

24 С61%С112Р(0)0-^-002Н 0,45 0,8 1.78Х103 5В ^

' он V

25 ^НдШусОЮ-^ЧХ^СНз 0,10 4.0 40Х103 1270

ОН

ге с8н5ау»(0)о-<^)-со2с1уу% 0,013 2,8 2оо*1(^ ,7000

¿Н '

27 СеН5С^РС0)0-^^-1Ю2 0,007 8,5 1220Х103 40000

он • 'Л'-Ч

28 С6%РН2Р(0)0-^^Ч»2С% , 106 ;

оснз

29 С61%ау5С1уя 0,045 2.7 ВОхЮ3 2000

о

Механ1зм реакпИ 1нактиваШ1. Одержан! результата доэволясть розглядати реаюМю 1нактивад11 ПА моноариловюш еф1рами бензилфосфоново! кислоти як фюсфорилювання Пдроксилыю! групи серину, -во входить в активная центр ферменту (схема 4).

Схема 4.

О О

Е-ОН + ^НдСН^-О-Ат -* Е-О-^-Оу^Нд + АгОН

О" ¿~

Виб1р Ше1 модел1 1нактивад11 ферменту базуеться на таких даних. По-перие, реахц!я 1нактавац11 ПА фосфонатами

Н сполуки

мае Перший порядок по 1нг1б1тору; процес !нактивац11 супроводжуеться стех1ометричним вид!ленням в!дпов!дних фенол1в АгОН. як1 у випадху 1нг1б!тор1в (25) J (28) яетехтувались i к1льк1сно оц!отвались методом ВЕРХ, а у випадку 1нг1б1тора (27) - спектрофотометрично (Тайл. 4).

Таблиця 4. Сгех1ометр1я взаемод!î 1нг1б1тора (27) i пен1шш1нацилази в 0,1 M фосфатному буфер! рН 7,0.

Концентра«!я, мкМ

Пвн1цил!нааилаза 1нг!б!тор (27) п-Н1трофенол

6,00 5,55 5,58

8,00 16,66 6,62 (110Х)а

0.00 166,88 8,62 (110Х)а

1,80 166,66 1,82 (10Ша

3,80 166,66. 3,90 ( 102îi)a'

S,70 166,68 5,58 (98Я)а

а В процентах по в1дношенно до концентрат 1 ферменту при ШХЕ].

Завдяхи висок1й швидхост! взаемод!! !нг!б!тора э ферментом зг1дно стех1ометр11 1:1, а такох Яого г!дрол!тачн1Я стаб1льност1 1 висок1й специф1чност1, 1нг1б!тор (27) може бути втсористаний як зручяий 1 селектизний татрант актавних центр1в ПА. По-друге, ефективна константа шведкост1 !нактивац11 ферменту при одн1й ф1ксован1й концентрат! 1нг1б1тора 1 неяасичуючих концентрат ях субстрату залетать в!д концентрац11 субстрату (мал. 6). 11неаризац!я данях в

*

координатах св1дчить про конкурентами характер

1нг1бування. Портрете, в повн1ств 1нактивованому фермент1, но в1докремлений в1д надлишку 1кг1б1тора (25) гель-ф1льтрац1ев, методом ЯМР 31Р спектросКопП детектуеться-каявн1сть атому фосфору з х1м1чним эсувом, характерним для фосфонат1в (<5р 27,0 м.д). 1нактивованиЯ фермент не в!дновлввав свое активн1сть при тривалому витримуванн1 з високими концентрациями 6-АПК, яка реактиву® фермент, 1нактивований ФМСФ. Висока г!дрол1тична стаб1льи1сть комплексу фермент-1 нг!61тор св1дчить на користь утворення 0-фосфон1льовакого, а не И-фосфонIльованого пох1дного ферменту. 1 нарешт1, спостер1гаеться л1н1йна залехн1сть & координатах узагальненого р1вняння Бренстеда 1дк1н/К1-рКа(мал. 7), во св1дчить на користь единого механ1зму взаемод!! ферменту з фосфонатними 1накткватораыи. Чим вида кислота!сть фенолу АгОН, тим кранов групов, во в1дцеплюсться, е зам1сник АгО в реакц1ях нуклеоф!льного зам!щення при атом1 фосфору 1 там ефективн!шим с в1дпов1дний 1нактиватор. Такий процес, як в!домо, мае пентакоординований перех1дкий стан, в якому зам1сникам при атом! фосфору властиза тригонально-<51л1рам1дальна геометр!я (мал. 8). Нейтралы^ фосфонати значно перевахавть моноан!онн1 фосфонати своев здатн1стю " до реакд1й нуклеоф!льяого зам! ¡ценна при атсм1 фосфору. У випадку ПА якраз моноан1онн! фосфонати е ефектавними !нактаваторами, ао повинно дуги сйумовлено зластивостями самого ферменту. Можна пркпустити наявн1сть е активному центр1 ПА значно ¿¡льеого, в сср1внянн! з типсвими сериновими протеазами, позитивного електростатичного потенц!алу, який 1 нейтрал1зуе негативний потенц!ал ак!ону фосфоаатного !нг!<3!тора 1 полегвуе

нуклеоф!льну атаку на атом фосфору.

2 4 6 8 10 ÎS]xl05, M

Мал. б. Залежн1сть ефективно! Мал. 7. ЗалежнЮть констант константи швидкост1 1нактива- другого порядку реакцП 1нак-

ц11 ПА сполуков (25) в1д кон- тивацИ ПА сполуками (24)-(27)

центрацП п-НАФОК. 113= в!д хислотяост1 в1дпов1дних

1,17x10-5 М. фенол! в.

1видк!сть фосфон1лювання ПА фосфонатними 1 кг)di торам; набагато (в 108 1 б1льше раз!в) перевищуе ишидх!сть ■ неферментативного спонтанного г1дрол1зу цих сполук 1 близька до швидкост! ферментативного Пдрол1зу субстрата ферменту. Це дозволяв ввахати, ¡до в процес 1нахт;:ва:;;1 залучений звичайний механ1зм функц!онування ферменту. Висо?:а швидкЮть 1нахтивац11 вказус на те, цо активная центр ферменту здатний ефективно стабШзувати такий перохь-ннЯ стан. Це южна пояснити (кр!м наявнсст! позитивного потенц1алу) ! кравдм зв'язуванням 1нтермед!ату в активному центр!. Д1йсно, утворення пере:Пдного стану супроводлуеться

перетворенням тетраедричного S. активний центр

g0Ar

Мал. 8. Модель перех!дного стану при 1яахтивац11 ПА в активному центр!.

фосфонату (эв'язування якого в

активному цеатр1 оШнветься як пом!ряе) в тригональну <51п1рам1ду, в як!й бензильна група 1 фосфон1льний кисень знаходяться п1д кутом 120, до структурно nOBHiCTD В1ДПОВ1— дае залишков! фен!лоцтово! кислота з плоское карбон!льнов групос (цей фрагмент зв'язуеться в активному цен-

тр! оптимальним чином). Пот!м 1нтермед1ат в!дееплсе групу "ОАг, ао • приводить до утворення 1нертного фосфорг.льованого ферменту (фосфоновий аналог ацилферменту). Кого висока стаб1льн!сть обумовлена, з одного боку, нездатн1стю фермента Пдрол1зувата цей неприродний ацилфермент, а з 1 ншого боку. еизькос ефективн!сто нуклеоф!льно! атаки иохливими низькомолекулярними реагентами по анЮнному фоофонату. Таким чином, вивчен! моноарилов1 бензилфосфоната, з точки эору мехая!зму ix all, поеднувть в соб! риси 1нг1б!тор!в -аналоги перех!дного стану ("transition-state analogues"), 1 1нг1б1тор1в, ао вгасористовують механ!зм ферментативного яроцесу ("mechanism-based inhibitors").

ВИСНОВКИ 1) Еиходячх з кснцепц!! аналог!в перех!дного стану ферментативного пронесу синтезован! !нг!б!тори ПА (КФ 3.5.1.11) - складноеф!рн1 та ам!дн! пох!дн! бензилфосфоново!

кислота. Вивчена г!дрол1тична стаб1льн1сть синтез ованих сполук.

2) Встановлено, ¡но скяадноеф1рн1 та ам!дн1 пох1дн1 бензнлфосфоново! кислота, ях1 м1стять фрагмента а—окси- 1 а-вШяоетслот, алх!лових спирт1в, фенолу- 1 анШну е селективними конкурентними 1нг1б1тораш! ПА.

. 3) Запропоновано модель зв'язування фосфорорган!чних 1яг1<51тор1в в активному иентр1- ПА. Розглянуто вплив стереоелектронних параметр! в молекул 1нг!б1тор1в на 1х спор!днея1сть з ферментом. Показано, до селективн1сть я11 вивчензх 1яг!б1тор1в обуыовлена наявн1ств бензильяо! трупа фосфон!льного фрагменту.Г Знайдеяо, ' до ефективнЮть зв'язуваяняз ПА залезать в!д параметра фрагмент 1 в 1нг1б1тор1в, до зв'язан! 1з залишком бензилфосфоново! кислота, серед яких найвадлив1шима с стереох!м1я (1нг!б1тори з Ь-гсояф1 гураа1ею эв'язупться храде) та заряд Р£-фрагменту (наявн1сть негативного заряду пом1тно пол1пшуе- зв'яэуваняя 1нг1<51тор1в з ферментом).

4) Вивчена спор!днен!сть з ПА бензилалк1лкетоя1в та в1дпов1дних бензилалк!лкарб1нол1в 1 встановлено, до сполухи з плоское тригональнов карбон! льнов групов 1нг1бують фермент в 20-40 раз1в краде, н1хв!дпов!дн! сполуки з тетраедричниы спиртовим фрагментом. Знайдеяо, до 4-оксо-5-фен1лпентанова кислота е одним з найб!льи ефективких хонкурентних 1нг1б!тор1в ПА з К^ 31 мкМ.

5) Ззаадено, до мэноаридов! еф!ри бензилфосфоново! кислота, як! м1стять фрагмента пара-зам1 йенах фенол! в з електроноакцепторними зам1сниками. е селехтивнима необоротяима !нг!61торами ПА. Вазяачено к!нетичн1 параметра !нактиваа!1 ферменту цими фосфонатами I розглянуто можливиа

механ1зм цього процесу. Показано, ко вивчен1 фосфонати можуть бути використан! як зручз1 титранти для виэначеняя абсолютно! концентрац!! активних центр1в ПА.

СПИСОК ПУБЛ1КАЦ1И ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАШI

1. Солоденко В. А., Цернюх В. Н., Кухарь В.П. Фосфорсодержащие ингибиторы пенициллинацилазы. // Докл. АН Украины. 1992. N

2. С. 113-117.

2. Солоденко В. А., Цернюк В.Н., Кухарь В. П. Фосфорсодержащие ингибиторы пенициллинацилазы. 2. Дизайн, синтез и изучение гидролитической 'стабильности производных фосфоновых кислот как потенциальных ингибиторов пенициллинацилазы. // Укр. биохиы. журн. 1993. Т. 65. N 6. С. 33-42.

3. Солоденко В. А., Цернюк В. В., Кухарь В. П. фосфорсодержащие ингибиторы; пенициллинацилазы. 3. Инглбирование пенициллинацилазы Escherichia coll фосфонатшпш аналогами субстратов. // Укр. биохим. журн. 1993. Т. ; 85, N 6. С. 42-50.

4. Цернюк В. Н., Солоденко В. А., Кухарь В. П. Ингибированяе пенициллинацилазы из Е. coll , бензилалхилкетонами и бензилалкилкарбинолами. // Укр. биохим. журн. 1995. Т. 67. Н 5. С. 28-32.

5. Солоденко В.А., Цернюк В.Л., Шишкина И.П.. Галушко С.В., Кухарь В. П. Необратимое ингибирование пенициллинацилазы из Е. coli моноариловыми эфирамн беазшгфосфоновой кислоты. // Укр. биохим. журн. 1995. Т. 87. N 5; С. 32-42.

6. Tsernjuk V., Solodenko V.. Kukhar V. Ar yl benz у 1phosphonates • - a new class of irreversible penicillin acylase inhibitors. XIII Intenational Conference or. Phosphorus Chemistry. Jerusalem. Israel. July 16-21.

1995, p. 150.

Церкгк B.H. йз учение пеншданшнацшгазы £. coli с помощьв производных чэтыреххоординированного фосфора. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности: 02.00.10 - биоорганичесхая химия, химия природных и физиологически активных веществ. Институт биоорганическоа химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 1995.

Запинается в научных работ, описывающих методы синтеза производных четырехкоординированного фосфора и исследования ах баологичесхоя активности а отношении пенициллипацилазы из Е. coll. Установлено, что производные

чэтарехкоординадионного фосфора мсгут служить полезными инструментами для изучения активного центра фермента. Предлозэяы соединения для использования в качестве титрантов при определении концентрации активных центров пввааиляикапялазн.

Tsemjuk V. К. Investigation of Е. coli penicillin acylase with 4-cooordinated phosphorus derivates (canuscript).

Dissertation subsitted in fulfilment of requirements for a scientific degress of Candidate of Sciences (Cheaistry) in tha fiold3 of 02.00.10. - Bioorganic Cheaistry, Chanistry of Natural and Physiologically Active Substances. Institute of Bioorganic Cheaistry and Patrcchenistry, HAS of Ukraine, Kiev, 1S95.

5 scientific works are dafended which include Eethods of 4-coordinated phosphorus derivates synthesis and investigation of their biological activity in E. coli psnicillin acylaso inhibiting. It has boen shewn that bsnzylphcsphcnic acid derivator could be used аз an instrument for psnicillin acylaso study. The compounds has been propped cs ti traits for activa centres concentrations datcrainaticn.

йшчов! слова: пзн1цил1пшшлаза. . активная центр. фэс$орорган1чп! lnrldlT"^ мплч-этга 1нг1бування.

Шдписаяо до друку 1к11. 95г. Формат 60x84/16 Пап1р офсетняй. Умовн.-друк.аркуш. 4,0. Об.-ввд.архуш 1,0. Тираз/оо. Замовл. ¿¡54 .

ЯолХграф. д1льн. 1истг;?уту ел0ктродинам11ш Ж Укра1ш), 252580, Кп1в-57, просп8ет Перемогс,5Б