Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы методами молекулярного моделирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
|
Строганов, Олег Валентинович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2007
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.15
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
г"95
На правах рукописи
СТРОГАНОВ ОЛЕГ ВАЛЕНТИНОВИЧ
ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОГО
МОДЕЛИРОВАНИЯ
02 00 15 - катализ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2007
003163795
Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени M В Ломоносова
Научный руководитель доктор химических наук, профессор Швядас Витаутас Юозапас-Каятоно Научный консультант: кандидат химических наук Чилов Гермес Григорьевич
Официальные оппоненты
доктор химических наук, профессор Немухин Александр Владимирович доктор химических наук, профессор Чувылкин Николай Дмитриевич
Ведущая организация Институт физиологически активных веществ РАН
Защита состоится «13 » ноября 2007 года в 1 б00 час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени M В Ломоносова
Автореферат разослан 12 октября 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат химических наук Сакодынская И К
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Пенициллинацилаза (ПА) известна как фермент, используемый в производстве ß-лактамных антибиотиков Научный интерес к ПА обусловлен уникальными каталитическими свойствами и механизмом катализа На примере ПА из Escherichia coli (Е coli) показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может быть использован для решения задач тонкого органического синтеза Однако несмотря на обилие экспериментальных данных, описывающих каталитические свойства фермента, надежное понимание молекулярного механизма фермент-субстратной специфичности до сих пор отсутствует Изучение ПА методами теоретической химии представляет значительный интерес, так как, с одной стороны, может дать важную информацию о молекулярных основах механизма действия ПА, и, с другой стороны, позволит использовать эту информацию для рационального дизайна фермента
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлось использование методов молекулярного моделирования для решения следующих задач изучения конформационной лабильности ПА из Е coli,
исследования связывания субстрата в реакции гидролиза ß-лактамных антибиотиков,
характеристики механизма связывания нуклеофила в реакции ацильного переноса на ß-лактамные нуклеофилы,
исследования субстратной специфичности ПА из Ecoli и механизма хиральной дискриминации в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов
Научная новизна Методоми молекулярной динамики (МД) впервые охарактеризованы конформационные изменения ПА и их влияние на механизм связывания субстратов и каталитические свойства фермента С помощью молекулярной динамики и молекулярного докинга обнаружен и охарактеризован продуктивный сайт связывания пенициллина и впервые проведен анализ вклада положительно заряженных аминокислотных остатков в связывание субстрата Предложена модель ферментативного гидролиза ß-лактамных антибиотиков, учитывающая непродуктивное связывание и конформационную лабильность фермента на кинетические параметры реакции Исследован механизм ацильного переноса на ß-лактамные нуклеофилы, катализируемого пенициллинацилазой, и выявлены факторы, влияющие на эффективность связывания нуклеофила, скорость превращения ацилфермента и накопление продуктов ацильного переноса Впервые изучены особенности связывания энантиомеров N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов пенициллинацилазой Охарактеризована роль заряженной группы и гидрофобного радикала в хиральной дискриминации энантиомеров субстрата Показана важность упорядоченной структуры растворителя для связывания полярных групп субстратов и альтернативных центров связывания для хиральной дискриминации субстратов Полученные результаты позволили количественно предсказать соотношение констант Михаэлиса для ферментативной реакции гидролиза энантиомеров
Практическая значимость работы С помощью методов молекулярного моделирования впервые реконструированы детали каталитического механизма синтеза и гидролиза ß-лактамных антибиотиков, без которых описание кинетики действия такого промышленно важного фермента, как ПА, является неполным На основе разработанных молекулярных моделей предложен способ расчета кинетических параметров ферментативной реакции, позволяющий предсказывать эффективность связывания субстрата и его каталитического превращения. Разработанная методология молекулярного моделирования представляет возможность изучения субстратной специфичности ПА in silico и является основой для рационального дизайна ПА и других промышленных гидролаз
Апробация работы Результаты исследований были представлены на международных конференциях 8-ой Школе В А Фока по квантовой и вычислительной химии, г Н Новгород, 2004 г, "Ломоносов-2004", г Москва, 2004 г, «Biomedical Engineering», Мюнхен, Германия, 2005 г, «Biocatalysis-2005 и «Biocatalysis-2007», г Санкт-Петербург, 2005 и 2007 гг , "Biotrans-2005 The Key to Industrial Biotechnology", г Делфт, Нидерланды, 2005 г, "Биотехнология и медицина", Москва, 2006 г, Научно-практической конференции «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002 -2006 гг », г Москва, 2006 г, "Environmental Biocatalysis From remediation with enzymes to novel green processes", Кордоба, Испания, 2006 г, Международной школе молодых ученых «Theoretical Modeling of Ligand Binding and Enzyme Catalysis», Тромсе, Норвегия, 2005 г, Симпозиуме по сотрудничеству Европейского Союза и России в области биотехнологии, г Суздаль, 2007 г, обсуждены на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета, семинарах отдела биокинетики НИИ Физико-химической биологии имени А Н Белозерского и Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и протоколов расчетов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 7 схем и 75 рисунков
Содержание работы
Роль конформационной лабильности фермента в катализе и связывании субстратов
Исторически кристаллические структуры комплексов ПА с ингибиторами были разделены на два подмножества по наличию или отсутствию конформацион-ного перехода боковых цепей остатков aR145 и aF146' В так называемой «закрытой» конформации гуанидиновая группа остатка aR145 связана с карбонильным кислородом остатка bF24 и гидроксильным кислородом bY31, а в открытой кон-
1 Done S Н, Branmgan J А , Moody Р С Е, Hubbard R Е Ligand induced conformational change in penicillin acylase J Mol Biol, 1998,284 463-475
формации боковой радикал аргинина повернут в раствор. Изучение конформаци-онной динамики спирального региона а143-а146 в траекториях, где наблюдались переходы между двумя конформациями подтверждает, что смещения боковых це-I пей остатков аЯ145 и аР146 является лишь частью более сложных структурных перестроек в активном центре фермента (рисунок 1). Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на связывание субстратов обусловлено тем, что остаток ар 146 образует одну из стенок «гидрофобного кармана» - компактной гидрофоб-| ной области активного центра, в которой связывается ацильная часть субстрата. Эта гидрофобная область соединена с раствором узким горлышком, которое имеет эллиптическую форму. В закрытой конформации фермента горлышко гидрофобно-| го кармана слишком узко чтобы позволить связаться ацильной части субстрата, однако при переходе фермента в открытую конформацию и смещении бокового радикала остатка аБИб главный диаметр увеличивается до 9А, что достаточно для проникновения субстрата в гидрофобный карман.
А. Закрытая конформация Б. Открытая конформация
Рисунок 1. Открытая (А) и закрытая (Б) конформации пенициллинацилазы.
Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на каталитические свойства фермента связано с системой конформационных переходов остатков а0148, аБ149, ЬР71 и Ь№41. Смещение С°-атома аР146 приводит к изменениям положения основной цепи остатков а8147-а8149, наиболее важным из которых является изменения угла ф остатка а0148 с 75° до 120°. Этот конформационный переход освобождает дополнительное место для бокового радикала ЬР71, который смещается как целое, более плотно прижимаясь к спирали, что приводит к увеличению сольватно-доступной площади остатка оксианионного центра Ь№4], что дестабилизирует оксианионный центр как за счет изменения энергии водородных связей с карбонильным кислородом субстрата, так и за счет уменьшения времени их жизни. Таким образом, переход из открытой в закрытую конформацию ПА оказывает существенное влияние на механизм проникновения субстратов в активный центр фермента, эффективность связывания и каталитическую активность: в открытой конформации облегчено проникновение субстрата в активный центра, а в закрытой облегчен катализ как за счет лучшего связывания, так и за счет благо-
приятной геометрии. Поэтому для корректного моделирования и описания кинетики ферментативной реакции необходимо учитывать обе конформации.
Параметризация силового поля для р-лактамных субстратов
Для того, чтобы проводить МД расчеты комплексов фермента с (3-лактамными субстратами и нуклеофилами (рисунок 2) для исследуемых соединений были определены молекулярно-механические (ММ) параметры, согласованные с силовым полем ОРЬБ-АА.
Рисунок 2. Р-лактамные лиганды, для которых проводилась ММ параметризация.
Наибольший интерес представляло описание торсионных барьеров при вращении аминогруппы нуклеофилов и связи С-Ы для БП. Профиль энергии определялся методами квантовой механики (КМ), затем подбирались ММ параметры соответствующих двугранных углов с тем, чтобы зависимость энергии от угла пово-
-120 0 120 240 0 120 240 360
угол поворота, 0 угол поворота, °
Рисунок 3. Профиль энергии при вращении амидной группы и аминогруппы нуклеофилов вокруг связи, соединяющей их с четырехчленным циклом р-лактамного ядра.
КМ расчеты показали, что аминогруппа нуклеофилов и амидная связь пенициллина не может свободно вращаться вокруг связи С-КГ, соединяющей их с ¡3- I лактамным кольцом: на профиле энергии имеется четко выраженный минимум энергии (рисунок 3), а барьер вращения составляет 11.2 ккал/моль для БП, 6.7 ккал/моль для 6-АПК и 7.7 ккал/моль для 7-АДЦК. Жесткая взаимная ориентация ' реагирующей группы и Р-лактамной части молекулы существенно ограничивает область возможного расположения карбоксильной группы субстрата.
Локализация продуктивного центра связывания пенициллина
Для локализации продуктивного центра связывания БП с ПА были использованы имеющиеся рентгеноструктурные модели комплекса Михаэлиса (рисунок 3) - модель ES1 (комплекс БП с неактивным мутантом bN241A'), модель ES2 (комплекс медленно гидролизуемого субстрата сульфоксипенициллина с нативным ферментом2). Помимо этого для моделирования комплекса Михаэлиса были использованы результаты докинга БП в активный центр фермента (модель ES3). Стабильность каждого вероятного положения связывания БП оценивалась с помощью молекулярно-динамических траекторий.
Рисунок 3. Связывание БП в активном центре - стартовые структуры (А) и среднее положение (Б).
В структуре 1БХУ (прототип системы ЕБ1) уходящая группа субстрата контактировала с остатками аБ146 и ЬБ71, и опиралась на пару остатков - аЯ145 и аР146 - которые при связывании субстрата переключались в открытую конформа-цию. После замены ЬА241 обратно на Азп и старта МД, уходящая группа субстрата сместилась к противоположной стороне активного центра и сформировала контакты с остатками ЬЯ263 и ЬИ388. Однако вместо карбонильного кислорода субстрата оксианионный центр оказался занят кислородом От каталитического серина. 10 не МД траектории ЕБ1 не хватило, чтобы субстрат вытеснил серин из оксианионного центра, поэтому получить полностью продуктивное состояние стартовав со структуры 1РХУ не удалось.
В траекториях Е82 и ЕБЗ уходящая группа субстрата (тиазолидиновое кольцо и карбоксильная группа) приняла одно и то же положение, что подтверждает стационарную природу найденного сайта связывания. Ацильная часть субстрата в
1 Alkema W. B. L., Hensgens C. M. H., Kroezinga E. H., De Vries E., Floris R., Van der Laan J. M., Dijkstra B. W., Janssen D. B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Eng.. 2000, 13: 857-863.
2 McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A. Crystal structure of penicillin acylase enzymesubstrate complex: structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol., 2001, 313: 139-150.
моделях ЕБ2 и ЕБЗ удовлетворяла всем критериям предреакционного состояния Водородные связи карбонильного кислорода субстрата с остатками оксианионного центра присутствовали с заселенностями близкими к единице, карбонильный углерод субстрата и гидроксильная группа каталитического остатка находились в плотном Ван-дер-Ваальсовом контакте, и их взаимная ориентация подходила для нуклеофильной атаки в течение всей траектории Аминогруппа удерживалась в состоянии благоприятном для переноса протона с помощью водородных связей с кислородами основной цепи остатков ЬИ241 и ЬС?23
В связывании уходящей группы субстрата заметную роль играют остаток Ь8386, который образует водородную связь с карбонильным кислородом четырехчленного цикла, и остатки ЬЯ263, ЬЫ388, взаимодействующие с карбоксильной группой субстрата. Другой положительно заряженный остаток - аШ45 - взаимодействует с БП опосредованно, через мостиковые молекулы воды
Механизм связывания р-лактамных антибиотиков и их производных
Экспериментальное исследование роли положительного заряда в связывании Р-лактамных антибиотиков показало, что при удалении отрицательного заряда с БП (переходе от БП к его метиловому эфиру, БПМе) связывание субстрата ухудшается Аналогичное ухудшение связывания происходит при замене положительно заряженного аЕ.145 на лейцин. Однако одновременное удаление зарядов с субстрата и фермента не приводит к существенному ухудшению связывания субстрата (таблица 1)
Таблица 1. Экспериментальные определенные значения кинетических параметров гидролиза |3-лактамных антибиотиков
Субстрат Км, мкМ ксаЬ С
Ш45Ь Ю45Ь
БП 40 17 42 " 19
БПМе 12 42 12 12
Молекулярно-динамическое исследование комплексов Михаэлиса для систем \\Т-БП, \УТ-БПМе, Ю45Ь-БП, Ю45Ь-БПМе показало, что удаление положительно заряженного остатка или замена карбоксильной группы на ее метиловый эфир не приводит к существенному изменению положения связывания субстрата Расчет свободной энергии связывания субстрата с ферментом с использованием эмпирической функции свободной энергии подтвердил, что учет только продуктивного связывания субстрата с закрытой конформацией фермента не позволяет объяснить экспериментальные соотношения энергий связывания субстратов
Для учета влияния открытой конформации фермента на связывание субстрата были рассчитаны траектории продуктивных комплексов открытой конформации фермента с субстратом для систем \¥Т-БП, \¥Т-БПМс, Ю45Ь-БП, Щ45Ь-БПМе Сравнение траекторий закрытой и открытой конформаций фермент-субстратных
комплексов показывает, что существенных различий в положениях субстрата и рассчитанных свободных энергиях связывания не наблюдается (таблица 2).
Таблица 2. Рассчитанные значения свободных энергий связывания БП и БПМе для открытой и закрытой конформаций нативного фермента и мутанта аЮ45Ь.
Субстрат ЛОьы, закрытая конформация, открытая конформация,
ккал/моль ккал/моль
■МТ Ш45Ь Я145Ь
БП -7.3 -6.8 -7.9 -7.3
БПМе -7.2 -7.2 -7.5 -7.5
Для объяснения экспериментальных значений констант Михаэлиса кинетическая схема ферментативной реакции была расширена за счет включения альтернативных фермент-субстратных комплексов. Поиск альтернативных комплексов осуществлялся с помощью молекулярного докинга, отбирались те конформации, в которых положение молекулы субстрата существенно перекрывалось с положением субстрата в продуктивном центре связывания. Было обнаружено два типа альтернативных комплексов: непродуктивные (рисунок 4Б) и предпродуктивные. Непродуктивные комплексы характеризовались связыванием карбоксильной группы субстрата или метилового эфира вблизи остатка а145, при этом бензольное кольцо субстрата связывалось в гидрофобной полости вблизи остатка ЬШ88. В предпро-дуктивных комплексах молекула субстрата связывалась в обратном положении: бензольное кольцо контактировало с остатком а145, а метальная группа располагалась вблизи остатка Ь№88 (рисунок 4В).
Рисунок 4. Продуктивное (А), непродуктивное (Б) и предпродуктивное (В) связывание субстрата в активном центре ПА. Более темные области поверхности представляют положительно заряженные остатки.
Включение в рассмотрение предпродуктивных и непродуктивных комплексов расширяет кинетическую схему ферментативной реакции:
ksnp kspp kp Kai Схема 1 Кинетическая схема
ESnp < Езакрьггая + S ■ ESpp « ES * EP ферментативного гидролиза ß-
" лактамных антибиотиков, учиты-
Е , ■ | , вающая альтернативные сайты
, KS№ , kspp^ , кр ^ , рр связывания субстрата и конфор-
np " '-'открытая + Ь - ЬЬрр - ЪЬ ЬР мацонные переходы ПА
Исследование альтернативных центров связывания ß-лактамных субстратов показало, что наиболее стабильны непродуктивные комплексы WT-БП (поскольку в этом случае карбоксильная группа субстрата контактирует с положительно заряженным aR145) и предпродуктивные комплексы aR145L-EIlME (образование этого комплекса выгодно из-за взаимодействий метальной группы сложного эфира с гидрофобным участком поверхности фермента вблизи остатка N388 и гидрофобных взаимодействий бензольного кольца с остатком aL145) Молекулярно-динамические расчеты позволяют также дать оценку отношения каталитических констант для исследованных систем Для этой цели была использована статистика предреакционных состояний рассчитывалось время жизни конформаций субстрата, удовлетворявших критериям предреакционного состояния. Критерии включали в себя наличие обеих водородных связей оксианионного центра, плотный Ван-дер-Ваальсов контакт между атакующим и атакуемым атомами (гидроксильный кислород Or bSl и карбонильный углерод амидной группы субстрата), близость угла нуклеофильной атаки к 90° (рисунок 5)
н1
Рисунок 5 Структурные критерии предреакционного состояния для фермент-субстратных комплексов наличие водородных связей оксианионного центра, расстояние атаки <3 5А, угол нуклеофильной атаки <20°
Таблица 3 Рассчитанные и экспериментальные значения кинетических параметров ферментативного гидролиза р-лактамных антибиотиков
Система Км, мкМ kCat, С
расчет эксперимент расчет эксперимент
WT БП 4 1 40 35 42
R145LBI1 163 17 20 19
WT БПМс 12 12 14 12
R145L БПМе 48 42 9 1 12
Результаты расчетов константы Михаэлиса согласуются с экспериментальными значениями (см таблицу 3), что свидетельствует об адекватности предложенной модели связывания Р-лактамных субстратов с ферментом
Изучение МД траекторий предпродуктивных фермент-субстратных комплексов позволило предложить механизм проникновения субстрата в активный центр
фермента. Представляется, что связывание субстрата проходит в несколько стадий. На первом этапе субстрат связывается в предпродуктивном центре в открытой конформации фермента, при этом его карбоксильная группа образует водородную связь с остатком Ь№88, а карбонильный кислород четырехчленного цикла - с остатком Ы1263 (рисунок 6А).
Рисунок 6. Последовательные стадии проникновения субстрата в активный центр фермента: образование предпродуктивного комплекса (А) и переход в продуктивный комплекс (Б-В). Через некоторое время происходит смещение боковых радикалов остатков Ь№88 и Ы1263, что, в свою очередь, приводит к смещению субстрата из предпродуктивного центра связывания, причем фенилацетильная часть входит в гидрофобный карман. Далее происходит обратное смещение боковых радикалов остатков Ь№88 и ЬК263, при этом субстрат опускается в гидрофобный карман, заканчивая переход в продуктивный центр связывания (рисунок 6Б). Затем, по-видимому, происходит переход фермента в закрытую конформацию (рисунок 6В), так как именно в закрытой конформации облегчен каталитический акт.
Изучение связывания р-лактамных нуклеофилов в активном центре пени-циллинацилазы и влияния природы ацильной группы на нуклеофильность
Был исследован механизм реакции ацильного переноса на Р-лактамные нук-леофилы, катализируемой пенициллинацилазой (схема 2)
Схема 2. Кинетическая схема реакции ацильного переноса, катализируемой пенициллинацилазой. Р - целевой продукт, Р2 — продукт побочного гидролиза ацилфермента, ЕА - ацилфермент, Ыи -нуклеофил, ЕАЫи - ацилфермент-нуклеофильный комплекс
Выход целевого продукта - Р-лактамного антибиотика - определяется соотношением скоростей аминолиза и гидролиза ацилфермента, которые, в свою очередь, зависят от константы связывания нуклеофила и констант скоростей гидролиза и аминолиза:
(
Методами молекулярного докинга и динамики были исследованы комплексы ацилфермент-нуклеофил, в которых нуклеофил - 6-АПК или 7-АДЦК продуктивно связывался с ацилированным ферментом, содержащим фенилацетилеерин (PAS) или фенилглицилсерин (PGS). Во всех изученных комплексах ацилфермент-нуклеофил аминогруппа нуклеофила занимала строго определенное положение, образуя две водородные связи: одна из них с терминальным азотом ацилированно-го серина, вторая - с карбонильным кислородом остатка bQ23. Эти водородные связи фиксировали аминогруппу нуклеофила в строго определенном положении, благоприятном для нуклеофильной атаки: неподеленная пара электронов аминогруппы обращена к атакуемому карбонильному углероду PAS или PGS, а водородная связь аминогруппы остатка Ы делает возможным перенос протона от нуклеофила на терминальную аминогруппу b-цепи фермента (рисунок 7).
Жесткое закрепление аминогруппы двумя водородными связями накладывает ограничение на подвижность р-лактамной части субстрата, поскольку КМ-расчеты показали наличие ярко выраженного энергетического минимума на профиле энергии при повороте вокруг связи, соединяющей аминогруппу с 4-х членным (3-лактамным кольцом в структуре нуклеофилов. Ограничение выражается в том, что продуктивной конформации соответствует только одно положение (5-лактамного кольца и в этом положении карбонильный кислород Р-лактамного ядра нуклеофилов взаимодействует с ЬЯ263, а карбоксильная группа связывается с остатком Ь83 86.
Сравнение сайтов связывания р-лактамного ядра в ацилфермент-нуклеофильных комплексах 6-АПК и 7-АДЦК показывает, что молекула 7-АДЦК более комплементарна поверхности фермента: водородные связи карбоксильной группы 7-АДЦК с Ь8386 более прочны и стабильны, чем соответствующие водородные связи 6-АПК, а карбоксильная группа располагалась значительно ближе к ЬК263 (таблица 3). Причиной этому является различие в ориентации карбоксильной группы относительно четырехчленного Р-лактамного кольца и аминогруппы: в молекуле 6-АПК карбоксильная группа расположена перпендикулярно плоскости четырехчленного кольца, а в молекуле 7-АДЦК карбоксильная группа лежит практически в плоскости кольца и поэтому может образовывать выгодные контакты с ферментом.
Рисунок 7. Продуктивное связывание нуклеофилов в активном центре ПА (на приме'ре PAS). Молекула 6-АПК показана светлым, 7-АДЦК - темным цветом.
Таблица 4. Свободная энергия связывания и время жизни водородных связей нуклеофилов с ферментов в продуктивных комплексах ацилфермент-нуклеофил.
Система
AGbind,
ккал/моль
Водородные связи fi-лактамной части субстрата ) - bR263 COO"-bS386:Hg COO"-bS386:H
С=0 - bR263
COQ" - bS386:Hg
6-АПК, PAS
6-АПК, PAS
7-АДЦК, PAS 7-АДЦК, PAS
-4.6 -4.9 -5.7
-5.8
58 24 67 97
90 86
10
99 86
10
Для изучения влияния ацильной группы на нуклеофильность были рассчитаны траектории свободных ацилферментов PAS и PGS в воде. Молекулярная динамика показала, что введение дополнительного заместителя при переходе от PAS к PGS приводит к дестабилизации закрытой конформации фермента. При переходе к открытой конформации сольватно-доступная площадь остатка bN241, входящего в оксианионный центр ПА, увеличивается. В случае комплексов ацилфермент-нуклеофил или фермент-субстрат увеличение сольватно-доступной площади не приводит к значительным последствиям, поскольку молекула лиганда, связанная в продуктивном сайте, экранирует оксианионный центр от растворителя. Однако в свободном ацилферменте увеличение доступности bN241 приводит к ослаблению водородных связей с bR263, удерживающий bN241 в оксианионном центре из-за конкуренции со стороны молекул воды. Поэтому в траектории PGS из-за открытия конформации фермента оксианионный центр был дестабилизирован и периодически обратимо разрушался (рисунок 6).
<
Рисунок 6. Стереоизображение конформаций PGS и PAS ацилфермента.
H
Рисунок 7. Критерии предреакционной конформации для нуклеофильной атаки молекулы воды: наличие водородных связей оксианионного центра и водородной связи молекулы воды с аминогруппой ЬБ1, расстояние атаки <3.5А, угол нуклеофильной атаки <20°
Можно предположить, что именно дестабилизация оксианионного центра свободного ацилфермента ответственна за увеличения соотношения амино-лиз/гидролиз при переходе от PAS к PGS разрушение оксианионного центра ведет к уменьшению времени жизни предреакционных конформаций молекул воды (рисунок с водой) и, следовательно, к уменьшению скорости гидролиза ацилфермента Расчетные значения параметра нуклеофильности ß0 для систем PAS, PGS и 6-АПК, 7-АДЦК, основанные на статистическом анализе near attack conformation (NAC), показали хорошее согласование с экспериментальными величинами (таблица 5)
А, = , кл = constEANM4CEAN, h = constEAA^CEA, Кп=е RT
Таблица 5 Свободная энергия связьшания и статистика предреакционных состояний для исследованных систем Сравнение экспериментальных и расчетных значений параметра
нуклеофил ацильный донор AGbmd, ккал/моль NACean, % NACEA, % нуклеофильность ßo, M"1 расчет эксперимент
6-АПК PAS -4 6 38 17 - 16
7-АДЦК -5 7 24 58 44
6-АПК -4 9 42 69 54
7-АДЦК -5 7 45 300 380
Изучение субстратной специфичности и хнральной дискриминации в реакциях гидролиза ТЧ-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов
Способность энантиоселективно гидролизовать Ы-фенилацетильные производные аминокислот и их модифицированных аналогов является одним из наиболее интересных и практически важных каталитических свойств фермента В зависимости от наличия или отсутствия отрицательно заряженной группы в субстратах, а также от природы бокового радикала энантиоселективность и связывание может меняться в широких пределах В работе было проведено молекулярное моделирование связывания энантиомерных субстратов в активном центре фермента, которое позволило выяснить роль бокового радикала и полярной группы в хираль-ной дискриминации Простейшая схема реакции без учета конформационной лабильности фермента и непродуктивного связывания субстратов подразумевает, что константа Михаэлиса непосредственно связана с константой диссоциации продуктивных комплексов
Км=К$=е **
Различия в связывании Ь- и О-энантиомеров субстратов обусловлены тремя факторами
- различием в положении ацильной части и гидролизуемой амидной группы
- различным положением бокового радикала субстратов,
- различиями в положении карбоксильной группы субстратов
Анализ молекулярно-динамических траекторий взаимодействия Ы-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов с ферментом показал, что ацильная часть субстрата связывается в гидрофобном кармане одинаково прочно как для Ь- так и для Б-энантиомеров. Для изучения влияния карбоксильной группы на энантиоселективность ПА был исследован механизм связывания в активном центре ряда модифицированных аналогов И-РИас-Ак, в которых карбоксильная группа заменена на гидроксильную (ТЧ-РЬас-А1а0Н), метиловый эфир (Ы-РЬас-А1аОМе) и фосфоновую группу (Ъ1-РЬас-А1аР03).
При изучении продуктивной конформации Ь-энантиомера Ы-РЬас-А1а выяснилось, что карбоксильная группа субстрата непосредственно не контактирует ни с одним положительно заряженным остатком активного центра. Сравнение комплексов Михаэлиса Ь- и О-энантиомеров показывает, что положение карбоксильной группы О- и Ь-энантиомеров ]Я-РЬас-А1а отличается незначительно. Карбоксильная группа Б-энантиомера расположена на расстоянии 7.4 А от Ы1263, и 7.3 А от аШ45; для Ь-энантиомера эти расстояния равны 6.7 и 8.2 А, соответственно (рисунок 8).
Рисунок 8. Продуктивные конформации комплексов Ь- и О-энантиомеров Н-РЬас-А1а с ПА
Столь малое различие в положении карбоксильной группь! Ь- и Э-энантиомеров Ы-РЬас-А1а относительно аШ45 и аИ263 приводит к тому, что электростатическое взаимодействие карбоксильной группы а-аминокислот с положительно заряженными остатками пенициллинацилазы не играет существенной роли в хиральной дискриминации субстратов. Этот вывод косвенно подтверждается экспериментальными данными по энантиоселективности гидролиза ]М-РЬас-производных фосфонового аналога аланина1, соотношение констант Михаэлиса Б-и Ь-энантиомеров которого (Км.о/Кмц = 72) не сильно отличается от соотношения для Ы-РЬас-А1а (Км,0/Км,ь = 70), хотя при рН 7.5 значительная часть Ы-РЬас-А1аР03 должна находиться в полностью ионизированном состоянии с зарядом -2. Таким образом, наличие отрицательно заряженной группы в субстрате само по себе вносит значительный вклад в соотношение констант связывания энантиомеров, кото-
1 Мироненко Д.А., Козлова Е.В., Швядас В.К., Солоденко В.А., Кашева Т.Н., Кухарь В.П. Кинетические закономерности и энантиоселективность действия пенициллинацилазы в реакциях гидролиза ^'-фенилацетильных производных 1-аминоэтилфосфоновой кислоты и ее эфиров. Биохимия. 1990, 55(6), 1124-1131.
рый, однако, практически не связан с электростатическим взаимодействием с близлежащими положительно заряженными остатками фермента.
Детальное изучение молекулярно-динамической траектории №-РЬас-А1а показало, что карбоксильная группа связана с полярными остатками фермента системой консервативных мостиковых молекул воды (рисунок 9). Эти молекулы воды осуществляют эстафетную передачу водородных связей с Ы1263, ЬБ386 и ЬС>23 на карбоксильную группу субстрата и обладают чрезвычайно низкой скоростью обмена с окружающим раствором: в среднем один обмен происходит за 300-1000 пс.
1
\-1'11ас-1.-Д1а '^'^С...... £ —
С,, ¿^£><523
Рисунок 9. Система консервативных мостиковых молекул воды между Ь-энантиомером 14-РИас-АЬ и ферментом.
В отличие от Ь-энантиомера, Б-энантиомер не взаимодействовал с ферментом с помощью эстафетной передачи водородных связей: образованию стабильных водяных мостиков не происходило из-за того, что между полярными остатками фермента и карбоксильной группой располагался боковой радикал. Сравнение связывания модифицированных аналогов аланина показало, что при удалении отрицательного заряда, во-первых, исчезают мостиковые молекулы воды, и, во-вторых, меняется положение полярной группы Б-энантиомеров, которая начинает связываться вблизи остатка ЬР71, реализуя тем самым классическую трехточечную модель связывания энантиомерных субстратов. Комплексы Михаэлиса для фосфоно-вого аналога аланина, напротив, не сильно отличались от продуктивных комплексов Ы-РЬас-А1а.
Таким образом, роль карбоксильной группы в хиральной дискриминации энантиомеров М-фенилацетильных производных а-аминокислот на эт£ше связывания заключается в организации системы из консервативных мостиковых молекул воды, эстафетно передающих водородные связи на субстрат.
Для изучения специфичности участка связывания бокового радикала в активном центре фермента были рассчитаны траектории комплексов Михаэлиса Ь- и Б-энантиомеров Ы-фенилацетильных производных лейцина, изолейцина, валина, фенилаланина и фенилглицина. Во всех исследованных комплексах боковой радикал Ь-энантиомера связывается в гидрофобной области, образованной остатками ЬБ71 и ЬБ256. Позиция карбоксильной группы для Ь-энантиомеров зависит от объема и разветвленности бокового радикала. Если боковой радикал не имеет разветвлений при Ср-атоме (1\Г-РЬас-РЬе, Ы-РЬас-Ьеи) карбоксильная группа взаимодейст-
|вует с ферментом через систему мостиковых молекул воды. В тех случаях, когда боковой радикал имеет разветвление при Ср-атоме (Ы-РЬас-Р!^, И-РИас-Не, Ы-РЬас-Уа1), карбоксильная группа образует непосредственную водородную связь с ЪК263 (рисунок 10), поскольку иное положение привело бы к перекрыванию Ст-атомов I бокового радикала субстрата с бензольным кольцом ЬР71.
I
ЬР71 / .. Ч>/
о ,
....... ЬЯ263
У
ГЧ-РЬас-Ь-Ьеи
1 .....
№71 ]
V /' (
" Г I — ЬК263
О^гГУ
К-РЬас-Ь-Р!^
V
>
V
"О с. уС;
ЬЯ263
К-РЬас-П-Ьеи
ЬР71 Л
Л
ЬЮбЗ
Р*-РЬас-0-Р1^
Рисунок 10. Продуктивное связывание Ь- и В-энантиомеров М-РИас-Ьеи и Ы-РЬас-РЬ§.
Объем бокового радикала важен и для связывания О-энантйомсров М-фенилацетильных производных аминокислот. Гидрофобный боковой радикал Б-энантиомеров контактирует с остатками Ы1263, Ь№88 и Ъ8386. Для Ы-РЬас-О-РЬе и Ы-РЬас-В-Уа1 связывание происходит без стерических затруднений, и карбоксильная группа занимает то же положение, что и в случае К-РЬас-0-А1а. Однако уже для Ы-РЬас-Ьеи боковой радикал субстрата периодически выталкивает амид-ную группу из оксианионного центра, при этом карбоксильная группа разворачивается в сторону ЬР71. Размещение бокового радикала "М-РЪас-О-Пе еще более невыгодно и приводит к искажению взаимной ориентации взаимодействующих атомов субстрата и фермента. М-РЬас-Р1щ является самым неудобным в исследованном ряду: в ходе МД траектории субстрат практически полностью покинул продуктивную конформацию, карбонильный кислород амидной группы вышел из оксианионного центра, а карбонильный углерод большую часть времени проводил на расстоянии, значительно превышающем пороговое значение для нуклеофильной атаки.
Удаление карбоксильной группы на одно метиленовое звено при переходе от Ь-Р1^ к Ь-(3-РЬе ведет к тому, что карбоксильная группа начинает взаимодействовать непосредственно с положительно заряженным Ы1263. Вероятно, такое взаимодействие имеет место для всех Ь-форм ^-аминокислот, поскольку в большинстве изученных продуктивных конформаций Ь-энантиомеров а-аминокислот карбоксильная группа располагалась на расстоянии 5-бА от ЬИ263. Переход от а- к |3-
аминокислотам в корне меняет связывание О-энантиомера субстрата, карбоксильная группа которого теперь также способна образовывать солевой мостик с ЬК263 (рисунок 11). Сравнение продуктивных конформаций Ь- и Б-р-РЬе показывает, что у обоих энантиомеров сайты связывания бокового радикала и карбоксильной группы схожи. Различие в сайтах связывания двух энантиомеров заключается в том, что гидролизуемая амидная группа Б-энантиомера выходит из оксианионного центра, что ведет к значительному ухудшению предреакционных статистик. Кроме того, в МД траектории Ь-энантиомера присутствовали водяные мостики с ЬС)23. В траектории И-РИас-О-Р-РЬе эти водяные мостики образоваться не могли, так как вода была вытеснена С°-атомом Р-РЬе.
Рисунок 12. Продуктивное связывание Ь- и О-энантиомеров "Ы-РЬас-р-Авр.
]\Г-фенилацетил-аспарагиновая кислота является интересным примером для исследования механизма хиральной дискриминации фенилацетильных производных а-аминокислот, поскольку химическое строение этого субстрата таково, что его Б-энантиомер напоминает р-аминокислоту, и, вероятнее всего, должен связываться в активном центре схожим образом. Экспериментальные данные говорят о том, что соотношение Км,о/Км,ь обращено по сравнению с остальными исследованными а-аминокислотами и составляет 0.36. Однако обращения суммарного значения энантиоселективности не наблюдается, поскольку соотношение каталитических констант необычайно высоко (300). Молекулярная динамика показала, что в продуктивных комплексах Ы-РЬас-Азр реализуется классическая трехточечная модель связывания энантиомеров субстратов (рисунок 12). Карбоксильная группа Ь-энантиомера связывается в том же месте, что и №РЬас-Ь-А1а, и взаимбдействует с полярными остатками активного центра фермента посредством водяных мостиков. Карбоксильная группа бокового радикала М-РЬас-Ь-Азр контактирует с остатком
Рисунок 11. Продуктивное связывание Ь- и Б-энантиомеров №РЬас-|3-РЬе.
Р71, но в большей степени экспонирована в раствор Комплекс Михаэлиса Э-нантиомера действительно напоминает сайт связывания Ы-РЬас-Ь-|3-РЬе карбок-ильная группа бокового радикала Ы-РЬас-Б-АБр образовывает водородные связи с Я263 и ЬБ386 Прочный солевой мостик с ЬК263 по всей видимости является основной причиной столь прочного связывания Б-энантиомера и обращения отношений констант Михаэлиса О- и Ь-энантиомеров Однако такое размещение бокового радикала О-энантиомера Ы-РИас-Аэр приводит к тому, что карбонильный кислород гидролизуемой амидной связи ослабляет взаимодействие с оксианионным центром, и ориентация взаимодействующих атомов искажается, что ведет к значительному ухудшению статистики предреакционных состояний по сравнению с Ь-энантиомером
Построенная модель связывания энантиомеров И-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов позволяет объяснить качественные закономерности хиральной дискриминации субстратов и предсказать отношения констант Михаэлиса Ь- и Б-энантиомеров Однако некоторые экспериментальные данные по связыванию хиральных субстратов нуждаются в дополнительном анализе Наиболее резкие расхождения рассчитанных и экспериментальных отношений констант Михаэлиса наблюдались для М-РЬас-Р1^ молекулярно-динамическое изучение продуктивного связывания и расчет свободной энергии с помощью эмпирической скоринговой функции показали, что И-форма №РЬас-Р1^ связывается почти на 2 ккал/моль хуже, чем Ь-энантиомер Однако экспериментальные данные свидетельствуют, что отношение констант Михаэлиса Б- и Ь-энантиомеров является самым низким в ряду Ы-фенилацетильных производных а-аминокислот и составляет 1 9
Объяснение недооценки энергии связывания О-энантиомера появляется при рассмотрении альтернативных сайтов связывания Ы-фенилацетильных производных аминокислот Связывание субстратов за пределами активного центра ПА характерно для всего ряда исследованных соединений Однако непродуктивные и предпродуктивные конформации, найденные в ходе исчерпывающего докинга Ы-фенилацетильных производных гидрофобных алифатических аминокислот характеризовались низкими энергиями связывания и не могли существенно повлиять на хиральную дискриминацию энантиомерных субстратов Ситуация радикально меняется при переходе от разветвленных алифатических аминокислот к аминокислотам с ароматическим боковым радикалом (Ы-РЬас-РЬе, Ы-РИас-РЬщ, Ы-РЬас-Р-РЬе) Анализ результатов докинга показывает, что помимо продуктивной конформации субстрата в активном центре значительной энергией обладают так называемые «обращенные» непродуктивные конформации, в которых боковой радикал аминокислоты погружен в гидрофобный карман ПА, а карбоксильная группа занимает место в оксианионном центре (рисунок 13)
Таблица 6. Рассчитанные и экспериментальные значения констант Михаэлиса для энантиомеров >}-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов.
Система расчет !ЕКМ Км,ь Км, ЦМ эксперимент 18 Км
А1а Ь -4.8 -3.47 5.7 13 -4.89 70
Б -3.8 -2.72 910 -3.04
Ь -4.2 -3.04 4.4
А1а-ОМе
О -3.3 -2.39
Ь -3.4 -2.49 1.4
А1а-ОН
О -3.2 -2.34
ь -4.2 -3.02 0.94 37.5 -4.43 72
А!а-РОЗ
о -4.2 -3.05 2700 -2.57
РИе ь -6.5 -4.68 3.9 1.5 -5.82 227
о -5.6 -4.08 340 -3.47
-6.6
ь (-4.7) -4.74 12.8 17 -4.77 1.9
Б -3.7 -3.63 33 -4.48
(-5.1)
Р-РИе Ь -6.2 -4.50 1.6 14 -4.85 20
Б -5.9 -4.29 280 -3.55
ь -3.2 -2.34 0.79
РЕА
о -3.4 -2.44 54 -4.27
Не ь -7.1 -5.17 67
э -4.6 -3.34
ь -6.9 -4.99 95 12 -4.92 225
Уа1
э -4.2 -3.01 2700 -2.57
ь -6.0 -4.31 44 31 -4.51 148
Ьси
о -3.7 -2.67 4600 -2.34
ь -7.6 -5.52 58.3 110 -3.96 31
Aгg
Б -5.2 -3.75 3400 -2.47
Аэр Ь -5.5 -3.97 0.07 230 -3.64 0.36
Б -7.1 -5.11 83 -4.08
1 В скобках даны энергии связывания в обращенной конформации
3
Рисунок 14. Сравнение рассчитанных и экспериментальных соотношений Км.э/Кмх-Сплошная линия соответствует прямой у=х.
-1.5 -1
1од(КмоУК)Л[^), эксперимент
Наиболее высокие энергии связывания, предсказанные для обращенных | комплексов в ходе докинга, наблюдались в случае М-РЬас-Р!^, поскольку в этом | соединении карбоксильная группа способна связываться в оксианионном центре, не создавая стерических затруднений для размещения бензольного кольца бокового радикала в гидрофобном кармане. Для Ь- и Б-энантиомеров Ы-РЬас-Р!^ были рассчитаны траектории обращенных комплексов в открытой и закрытой I конформациях фермента. Обращенное связывание Ь-энантиомера фенилглицина осложнено стерически: размещение карбоксильной группы в оксианионном центре ' ведет к перекрыванию алифатического атома ацильной группы с остатком аР146. (Поэтому обращенная конформация Ы-РИас-Ь-Р]^ гораздо менее выгодна по сравнению с комплексом Михаэлиса. Обращенные комплексы Б-энантиомера Ы-I РЬас-РЬ§ оказались более прочны, поскольку перекрывание бокового радикала | субстрата с остатком аБНб не происходит. Для размещения бокового радикала ТМ-1 РЬас-Б-РЬ§ необходимо, чтобы аЮ45 перестал контактировать с Ъ¥24, поэтому прочное непродуктивное связывание О-энантиомеров возможно только в открытой конформации фермента. Расчеты свободной энергии связывания показали, что обращенная конформация 0-Р1щ превосходит по прочности продуктивный комплекс и поэтому вносит основной вклад в величину константы Михаэлиса. Учет обращенных конформаций субстратов позволил улучшить согласование рассчитанных значений констант Михаэлиса с экспериментальными значениями (таблица б, рисунок 14).
Выводы
1 Установлена роль открытой и закрытой конформаций ПА из Е соЬв каталитическом механизме фермента в открытой конформации фермента облегчено связывание субстрата, в закрытой - протекание реакции
2 В образование продуктивного комплекса ПА с БП и БПМЕ основной вклад вносят взаимодействия с остатками гидрофобного кармана, водородные связи амидной группы субстрата с остатками оксианионного центра, а также водородные связи карбонильного кислорода Р-лактамного кольца с Ь11263 и ЬЫ388
3 Обнаружены предпродуктивный и непродуктивный сайты связывания БП и БПМе, находящиеся за пределами активного центра ПА, энергия связывания субстрата в этих сайтах сопоставимыма с энергией продуктивного связывания Учет этих комплексов необходим для количественного описания кинетики ферментативного гидролиза р-лактамных антибиотиков
4 Основной вклад в продуктивное связывание нуклеофилов с ацилферментом вносят взаимодействия с остатками Ы1263 и ЬБЗБб Повышенная нуклеофиль-ность 7-АДЦК по сравнению с 6-АПК достигается за счет энергетически более выгодного взаимодействия с ферментом
5 Изменение реакционной способности нуклеофилов в реакциях ацильного переноса от различных доноров ацильной группы (О-фенилглицинамида и фе-нилацетамида) обусловлено конформационным равновесием между открытой и закрытой формами ацилфермента в открытой форме оксианионный центр менее устойчив, что приводит к снижению вероятности гидролиза при использовании Б-фенилглицинамида как донора ацильной части
6 Карбоксильная группа Ь-стереоизомеров Ы-фенилацетильных производных аминокислот образует прочные контакты с остатками Ы1263 и Ь<323 посредст- | вом мостиковых молекул воды, которые играют определяющую роль в хи-ральной дискриминации отрицательно заряженных субстратов
7 В связывание бокового радикала Ь-энантиомера субстрата основной вклад вносят остатки ЬБ71 и аБ146, мутации по данным остаткам наиболее перспективны для получения новых стереоселективных биокатализаторов Связывание бокового радикала Б-энантиомеров происходит менее специфично
8 Для количественной интерпретации стереоселективности ПА в отношении И-фенилацетильных производных ароматических аминокислот необходим учет непродуктивного связывания субстратов
писок публикаций по теме диссертации
1 Stroganov О V, Chilov G G, Svedas V К Force field parametnzation for 6-aminopenicillanic acid J Mol Structure THEOCHEM, 2003, V 631 p 117-125 Г Г Чилов, О В Строганов, В К Швядас Изучение связывания субстратов в активном центре пенициллинацилазы методами молекулярного моделирования Биохимия, 2007, т 72, вып 1 , стр 71-81
Чилов Г Г, Строганов О В , Новиков Ф Н, Стройлов В С , Швядас В К Рациональный дизайн биокатализаторов для фармацевтики и биотехнологии Международная конференция «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию», Москва, 28-30 марта 2006 г, стр 66-67
4 Chilov G G , Stroganov О V , Svedas V К. Combined molecular docking and molecular dynamical studies of the substrate binding in the active site of penicillin acy-lase, Materials of International Conference "Biotrans-2005 The Key to Industrial Biotechnology", Delft, The Netherlands, 2005, p 102
5 Chilov G G , Stroganov О V , Svedas V К Combmed molecular docking and molecular dynamical studies of the substrate bindmg m the active site of penicillin acy-lase Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005 Fundamentals and Applications», St Petersburg, Russian Federation, 2005, p 73
6 Строганов О В , Чилов Г Г, Швядас В К Изучение участка связывания нук-леофила в активном центре пенициллинацилазы из Е coli методами молекулярного моделирования Материалы XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», издательство Московского университета, Москва, 2004, т 1,стр 30
7 Chilov G G , Stroganov О V , Svedas V К Substrate binding in the active site of penicillin acylase molecular dynamical studies 8-th Session of the V A Fock School on Quantum and Computational Chemistiy, 2004, V Novgorod, Russia, Abstract 1021
8 Шошина H В Новиков Ф H, Строганов О В Молекулярное моделирование энантиоселективности пенициллинацилазы в реакциях гидролиза ацильных производных аминокислот Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», издательство Московского университета, Москва, 2007, т 1,стр 67
9 Stroganov О V , Novikov F N , Shoshina N V , Chilov G G , Svedas V К Molecular modeling of enantioselectivity of penicillin acylase Abstacts of International Conference "Biocatalysis 2007 Fundamentals and Applications", Moscow-St Petersburg, Russian Federation, p 130-131
Список сокращений и обозначений
ПА пенициллинацилаза
БП бензилпенициллин
БПМе метиловый эфир бензилпенициллина
6-АПК 6-аминопенициллановая кислота
7-АДЦК 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота PAS фенилацетилсерин
PGS фенилглицилсерин
N-Phac- N-фенилацетил-
Phg фенилглицин
МД молекулярная динамика
ММ молекулярная механика
КМ квантовая механика
Подписано в печать 10.10.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 пл Тираж 100 экз. Заказ № 670 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к. А-102
Содержание.
Список сокращений.
Введение.
1 Литературный обзор.
1.1 Строение и механизм пенициллинацилазы.
1.1.1 Общие сведения о ферменте.
1.1.2 Кинетические исследования механизма катализа.
1.1.3 Структура активного центра пенициллинацилазы.
1.1.4 Строение и механизм действия пенициллинацилазы по данным РСА.
1.1.5 Строение участка связывания ацильной части.
1.1.6 Участок связывания нуклеофила.
1.1.7 Исследование пенициллинацилазы методами теоретической химии.
1.2 Метод молекулярной динамики.
1.2.1 Общее описание метода.
1.2.2 Силовое поле ОРЬБ-АА.
1.2.3 Методы интегрирования уравнений движения.
1.2.4 Расчеты при постоянной температуре.
1.2.5 Использование периодических граничных условий.
1.2.6 Ускорение МД-расчетов.
1.3 Методы молекулярного докинга.
1.3.1 Алгоритмы сканирования потенциальной поверхности.
1.4 Методы расчета свободной энергии связывания.
1.4.1 Введение.
1.4.2 Метод возмущений свободной энергии.
1.4.3 Методы линейной корреляции свободной энергии.
1.4.4 Приближения аддитивных вкладов в свободную энергию связывания.
1.4.5 Использование эмпирических скоринговых функций для расчета ДИ.
1.5 Методы расчета каталитических констант.
1.5.1 Введение.
1.5.2 Гибридные квантово-механические/молекулярно-механические методы расчета поверхности потенциальной энергии.
1.5.3 Метод эмпирической валентной связи.
1.5.4 Приближенные оценки соотношений каталитических констант.
2 Экспериментальная часть.
2.1 Пакеты программ, использованные в работе.
2.2 Конструирование моделей систем для расчета траекторий.
2.2.1 Параметризация силового поля лигандов.
2.2.2 Конструирование моделей ферментов.
2.2.3 Конструирование фермент-субстратных комплексов.
2.2.4 Релаксация системы.
2.2.5 Параметры молекулярно-динамических расчетов.
2.2.6 Анализ траекторий.
2.2.7 Расчет свободной энергии связывания лиганда с ферментом.
2.2.8 Расчет предреакционной статистики для продуктивных фермент-субстратных комплексов.
3 Результаты и обсуждение.
3.1 Общая характеристика структуры ПА в растворе.
3.2 Конформационная лабильность ПА.
3.2.1 Конформационные переходы в активном центре ПА.
3.2.2 Оценка энергии перехода из открытого в закрытое состояние.
3.3 Механизм действия пенициллинацилазы.
3.3.1 Структурные критерии предреакционного состояния.
3.3.2 Оценка влияния диффузии на связывание субстратов.
3.4 Гидролиз р-лактамных антибиотиков.
3.4.1 Параметризация пенициллина для силового поля OPLS-AA.
3.4.2 Продуктивный комплекс бензилпенициллина с ПА.
3.4.3 Связывание субстратов за пределами активного центра.
3.4.4 Механизм проникновения субстратов в активный центр.
3.4.5 Расчет кинетических параметров ферментативной реакции.
3.5 Синтез р-лактамных антибиотиков.
3.5.1 Параметризация Р-лактамных нуклеофилов.
3.5.2 Продуктивные комплексы Р-лактамных нуклеофилов (качественные результаты).
3.5.3 Структура ацилированного фермента.
3.5.4 Количественная оценка параметра нуклеофильности р.
3.5.5 Непродуктивное связывание нуклеофилов.
3.6 Гидролиз фенилацетильных производных аминокислот.
3.6.1 Общая характеристика исследуемых систем.
3.6.2 Продуктивное связывание энантиомерных субстратов.
3.6.3 Расчет констант Михаэлиса для N-фенилацетильных производных аминокислот.
3.6.4 Непродуктивное связывание N-фенилацетильных производных ароматических аминокислот.
3.6.5 Расчет каталитических констант.
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) известна как фермент, используемый в производстве р-лактамных антибиотиков. Научный интерес к ПА обусловлен уникальными каталитическими свойствами и механизмом катализа. На примере ПА из Е.соИ показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может быть использован для решения задач тонкого органического синтеза. Однако несмотря на обилие экспериментальных данных, описывающих каталитические свойства фермента, надежное понимание молекулярного механизма фермент-субстратной специфичности до сих пор отсутствует. Изучение ПА методами теоретической химии представляет значительный интерес, так как с одной стороны, может дать важную информацию о молекулярных основах механизма действия ПА, и, с другой стороны, позволит использовать эту информацию для рационального дизайиа фермента.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлось использование методов молекулярного моделирования для решения следующих задач:
- изучения конформационной лабильности ПА из Е.соП;
- исследования связывания субстрата в реакции гидролиза р-лактамных антибиотиков;
- характеристики механизма связывания нуклеофила в реакции ацильного переноса на р-лактамные нуклеофилы;
- исследования субстратной специфичности ПА из Е.соП и механизма хи-ральной дискриминации в ряду М-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов
Научная новизна. Методами молекулярной динамики (МД) впервые охарактеризованы конформационные изменения ПА и их влияние на механизм связывания субстратов и каталитические свойства фермента. С помощью молекулярной динамики и молекулярного докинга обнаружен и охарактеризован продуктивный сайт связывания пенициллина и впервые проведен анализ вклада положительно заряженных аминокислотных остатков в связывание субстрата. Предложена модель ферментативного гидролиза Р-лактамных антибиотиков, учитывающая непродуктивное связывание и конформацион-ную лабильность фермента на кинетические параметры реакции. Исследован механизм ацильного переноса на Р-лактамные нуклеофилы, катализируемого пенициллинацилазой, и выявлены факторы, влияющие на эффективность связывания нуклеофила, скорость превращения ацилфермента и накопление продуктов ацильного переноса. Впервые изучены особенности связывания энантиомеров Ы-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов пенициллинацилазой. Охарактеризована роль заряженной группы и гидрофобного радикала в хиральной дискриминации энантиомеров субстрата. Показана важность упорядоченной структуры растворителя для связывания полярных групп субстратов и альтернативных центров связывания для хиральной дискриминации субстратов. Полученные результаты позволили количественно предсказать соотношение констант Михаэлиса для ферментативной реакции гидролиза энантиомеров.
Практическая значимость работы. С помощью методов молекулярного моделирования впервые реконструированы детали каталитического механизма синтеза и гидролиза р-лактамных антибиотиков, без которых описание кинетики действия такого промыш-ленно важного фермента, как ПА, является неполным. На основе разработанных молекулярных моделей предложен способ расчета кинетических параметров ферментативной реакции, позволяющий предсказывать эффективность связывания субстрата и его каталитического превращения. Разработанная методология молекулярного моделирования предоставляет возможность изучения субстратной специфичности ПА т яШсо и является основой для рационального дизайна ПА и других промышленных гидролаз.
1 Литературный обзор
4 Основные результаты и выводы
1. Установлена роль открытой и закрытой конформацнй ПА из Е.соИ в каталитическом механизме фермента: в открытой конформации фермента облегчено связывание субстрата, в закрытой - протекание реакции.
2. В образование продуктивного комплекса ПА с БП и БПМЕ основной вклад вносят взаимодействия с остатками гидрофобного кармана, водородные связи амидной группы субстрата с остатками оксианионного центра, а также водородные связи карбонильного кислорода р-лактамного кольца с ЬЯ263 и ЬЫ388.
3. Обнаружены предпродуктивный и непродуктивный сайты связывания БП и БПМе, находящиеся за пределами активного центра ПА; энергия связывания субстрата в этих сайтах сопоставима с энергией продуктивного связывания. Учет этих комплексов необходим для количественного описания кинетики ферментативного гидролиза р-лактамных антибиотиков.
4. Основной вклад в продуктивное связывание нуклеофилов с ацилферментом вносят взаимодействия с остатками ЬЯ263 и Ь8386. Повышенная нуклеофиль-ность 7-АДЦК по сравнению с 6-АПК достигается за счет энергетически более выгодного взаимодействия с ферментом.
5. Изменение реакционной способности нуклеофилов в реакциях ацильного переноса от различных доноров ацильной группы (О-фенилглицинамида и фе-нилацетамида) обусловлено конформационным равновесием между открытой и закрытой формами ацилфермента: в открытой форме оксианионный центр менее устойчив, что приводит к снижению вероятности гидролиза при использовании О-фенилглицинамида как донора ацильной части.
6. Карбоксильная группа Ь-стереоизомеров Ы-фенилацетильных производных аминокислот образует прочные контакты с остатками Ы1263 и ЬС?23 посредством мостиковых молекул воды, которые играют определяющую роль в хи-ральной дискриминации отрицательно заряженных субстратов.
7. В связывание бокового радикала Ь-энантиомера субстрата основной вклад вносят остатки ЬР71 и аР146; мутации по данным остаткам наиболее перспективны для получения новых стереоселективных биокатализаторов. Связывание бокового радикала О-энантиомеров происходит менее специфично.
8. Для количественной интерпретации стереоселективности ПА в отношении Ы-фенилацетильных производных ароматических аминокислот необходим учет непродуктивного связывания субстратов.
1. Швядас В.К. Ферментативный синтез и модификация ß-лактамных антибиотиков и пептидов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, ВИНИТИ, 1988,7:148
2. Иммобилизованные ферменты. Изд-во МГУ, 1976, т. 2,221 -239
3. Burlingame R. Chapman P.J. Catabolism of phenylpropionic acid and its 3-hydroxy derivative by Escherichia coli. J. Bacteriol., 1983, 155:113-121
4. Sudhakaran, V.K., Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., Shewale, J.G. Molecular aspects of penicillin and cephalosporin acylases. Process Biochemistry, 1992,27:131-143.
5. Bruns W., Hoppe J., Tsai H., Brüning HJ., Maywald F., Collins J., Mayer H. Structure of the penicillin acylase gene from Escherichia coli: a periplasmic enzyme that undergoes multiple proteolytic processing. J. Mol. Appl. Genet. 1985,3:36-44.
6. Shewale J.D., Deshpande B.S., Sudhakaran V.K., Ambedkar S.S. Penicillin acylase: application and potential. Process Biochem. Int. 1990,25:97-103.
7. Kasche V., Lummer K., Nurk A., Piotraschke E., Rieks A., Stoeva S., Voelter W. Intramolecular autopro-teolysis initiates the maturation of penicillin amidase from E. Coli. Biochem. Biophys. Acta. 1999, 1433:76-86.
8. Roa A., Castillon M. P., Goble M. L., Virden R., Garcia J. L. New insights on the specificity of penicillin acylase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995,206:629-636.
9. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser А.1., Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.Y. Acad. Sei. 1996, 799:659-669.
10. Margolin A.L., Svedas V.K., Berezin I.V. Substrate specificity of penicillin amidase from E.coli. Biochim. Biophys. Acta, 1980,616:283-289.
11. Didziapetris R., Drabnig В., Schellenberger V., Jakubke H.-D., Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis. FEBSlett. 1991,287:31-33
12. Svedas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L., Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis of benzylpeni-cillin. Enzyme Microb. Technol. 1980,2:313-317.
13. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic synthesis of ß-lactam antibiotics: a thermodynamic background. Enzyme Microb. Technol. 1980,2:138-144.
14. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzyme Engineering: Future Directions. Plenum Press, NY, 1980
15. Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.T., Svedas V.K. Substrate and stereospecificity of Penicillin acylase from Escherichia coli. Materials of the International Conference "Biocatalysis-95", Suzdal, 1995: 56.
16. Guranda D.T., Savchenko M.V., Beltser A.I., Svedas V.K. Substrate and stereospecificity of penicillin acylase from E.coli. Abstracts of Int. Conf. Biocatalysis-98: Fundamentals and applications, Pushchino, Russia, 1998. p,10.
17. Клесов A.A., Швядас B.K, Галаев И.Ю. Изучение топографии активного центра пенициллинамидазы из E.coli. 2. Роль гидрофобных взаимодействий в специфичности ингибирования фермента. Биоорг. Химия. 1977,3:800-805.
18. Швядас В.К, Марголин A.JT., Клесов A.A. Ферментативный синтез антибиотиков. Перенос ацильной группы на 6-аминопенициллановую кислоту, катализируемый пенициллинамидазой из E.coli. Кинетическое рассмотрение. Биоорг. Химия, 1977,3:654-661.
19. Done S.H., Brannigan J.A., Moody Р.С.Е., Hubbard R.E. Ligand-induced conformational change in penicillin acylase. J. Mol. Biol. 1998,284:463-475.
20. Chilov G.G., Guranda D.T., Svedas V.K. Hydrophobic effect in alcohol binding by the active site of penicillin acylases. Biochemistry (Moscow), 2000,65:963-966.
21. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Дисс. канд. хим. наук. М., МГУ, 2000.
22. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill С.Р., Dodson E.J., Dodson G., Moody P.C. Penicillin acylase has a sin-gle-amino-acid catalytic centre. Nature, 1995,373:264-268.
23. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A. Crystal structure of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol. 2001, 313:139-150.
24. Shamolina Т., Svedas V.K. Reactivation of Heterodimer and Individual Subunits of Penicillin Acylase from E. coli after Inactivation in Urea. Biochemistry (Moscow). 2000,65:672-676
25. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R., Murzin A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature, 1995, 378:416-419.
26. Чилов Г.Г., Сидорова A.B., Швядас B.K. Исследование механизма каталитического действия N-концевых гидролаз методами квантово-химического моделирования. Биохимия. 2007.72:615-621.
27. Morillas М., Goble M.L., Virden R. The kinetics of acylation and deacylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic centre. Bio-chem.J. 1999,338:235-239
28. Weiner P.K., Kollman P.A. AMBER: assisted model building with energy refinement. A general program for modeling molecules and their interactions. J. Сотр. Chem. 1981.2:287-303
29. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization and dynamics calculations. J. Сотр. Chem. 1983.4:187217.
30. Jorgensen W.L., Maxwell D.S., Tirado-Rives J. Development and testing of the OPLS all-atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids. J. Am. Chem. Soc. 1996. 118:1122511236
31. Jorgensen W.L., Tirado-Rives J. The OPLS Potential Functions for Proteins. Energy Minimizations for Crystals of Cyclic Peptides and Crambin. J. Am. Chem. Soc. 1998,110:1657-1666
32. Hockney, R.W., Goel, S.P.J., Eastwood J.W. Quiet high-resolution computer models of a plasma. J Comp. Phys. 1974,14:148-158
33. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Guesteren W.F., DiNola A., Haak J.R. Molecular dynamics with coupling to an external bath. J. Chem. Phys. 1984,81:3684-3690.
34. Bekker H., Dijkstra E. J., Renardus M.K.R., Berendsen H.J.C. An Efficient, Box Shape Independent Non-Bonded Force and Virial Algorithm for Molecular Dynamics. Mol. Sim. 1995,14:137-152.
35. Berendsen H.J.C., van der Spoel. D., van Drunen R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation, Comp. Phys. Comm., 1995,91:43-56.
36. Shirts M.R., Pande V.S. Mathematical Analysis of Coupled Parallel Simulations. Phys. Rev. Letters. 2001, 86,4983-4987
37. Hiller, R., Zhou, Z.H., Adams, M.W.W., Englander, S.W. Stability and dynamics in a hyperthermophilic protein with melting temperature close to 200°C. Proc. Natnl. Acad. Sei. USA. 1997,94,11329-11322
38. Tironi I.G., Sperb R., Smith P.E., van Gunsteren W.F.A. A generalized reaction field method for molecular dynamics simulations. J. Chem. Phys. 1995,102:5451-5459.
39. Elber R., Ghosh A., Canderas A. Long Time Dynamics of Complex Systems. Acc. Chem. Res. 2002, 35:396-403.
40. Feenstra K.A., Hess B., Berendsen H.J.C. Improving efficiency of large time-scale molecular dynamics simulations of hydrogen-rich systems. J. Comp. Chem. 1999,20:786-798.
41. Hess B., Bekker H., Berendsen H.J.C., Fraaije J.G.E.M. LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. J. Comp. Chem. 1997,18:1463-1472.
42. Ryckaert J.P., Ciccotti G., Berendsen H.J.C. Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of n-alkanes. J. Comp. Phys. 1977,23:327-341.
43. Miyamoto S., KoIIman P.A. Settle: An analytical version of the SHAKE and RATTLE algorithm for rigid water models. J. Comp. Chem. 1992,13:952-962.
44. Van der Spoel D., Lindahl E., Hess B., van Buuren A.R., Apol E., Meulenhoff P.J., Tieleman D.P., Sijbers A.L.T.M., Feenstra K.A., van Drunen R., Berendsen, H.J.C. Gromacs User Manual version 3.2. 2004, www.gromacs.org.
45. Morris G.M. Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W., Belew R.K., Olson A.J. Automated docking using a Lamarkian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. J. Comp. Chem., 1998,19:1639-1662.
46. Mehler E.L., Solmajer T. Electrostatics effects in proteins: comparison of dielectric and charge models. Prot. Eng., 1991.8:903-910.
47. Goodford P.J. A computational procedure for determining energetically favourabe binding sites on biologically important macromolecules. J. Med. Chem. 1985.28:849-857.
48. Goodsell, D.S., Olson, A.J. Automated docking of substrates to proteins by simulated annealing. Prot.: Struc., Func., Gen., 1990,8:195-202.
49. Solis F.J., Wets R.J.-B. Minimization by random search techniques. Math. Oper. Res. 1981.6:19-30
50. Gohlke H., Klebe G. Approaches to the Description and Prediction of the Binding Affinity of Small-Molecule Ligands to Macromolecular Receptors. Angew. Chem. Int Ed., 2002,41:2644-2676.
51. Free Energy Calculations in Rational Drug Design. Ed.: Rami M.R., Erion M.D. Springer, 2001.
52. Shirts M.R., Pande V.S., Comparison of efficiency and bias of free energies computed by exponential averaging, the Bennett acceptance ratio, and thermodynamic integration. J. Chem. Phys., 2005,122:144107.
53. Straatsma T.P., McCammon J.A. Multiconfiguration thermodynamic integration. J. Chem. Phys., 1991, 95:1175-1178
54. Pearlman D.A., Kollman P.A., The Lag Between the Hamiltonian and the System Configuration in Free Energy Perturbation Calculations. J. Chem. Phys. 1989, 91:7831-7839
55. Hendrix D.A., Jarzynski C. J. Chem. Phys. A "fast growth" method for computing free energy differences. 2001,114:5974
56. Villa A., Mark A.E. Calculation of the Free Energy of Solvation for Neutral Analogs of Amino Acids Side Chains. J. Comp. Chem. 2002,23:548-553.
57. Liu H., Mark A.E., van Gunsteren W.F. Estimating the Relative Free Energy of Different Molecular States with Respect to a Single Reference State. J. Chem. Phys. 1996,100:9485.
58. Schafer H., van Gunsteren W.F., Mark A.E. Estimating relative free energies from a single ensemble: hydration free energies. J. Comp. Chem., 1999,20(15): 1605-1617.
59. Oostenbrink C., van Gunsteren W.F. Free energies of ligand binding for structurally diverse compounds. Proc. Nat. Acad. Sci. 2005, 102(19):6750-6754.
60. Lee F.S., Chu Z.Z., Bolger M.B., Warshel A. Calculations of antibody-antigen interactions: microscopic and semi-microscopic evaluation of the free energies of binding of phosphorylcholine analogs to McPC603. Prot. Eng. 1992,5:215-228.
61. Warshel A. Dynamics of reactions in polar solvents: semiclassical trajectory studies of electron-transfer and proton-transfer reactions. J. Phys. Chem. 1982,86:2218-2224.
62. Sham Y.Y., Chu Z.T., H. Tao, A. Warshel. Examining metods for calculations of binding free energies: LRA, LIE, PDLD-LRA, and LDLD/S-LRA calculations of ligands binding to an HIV Protease. Prot.: Struc., Func., Gen. 2000,39:393-407.
63. Aqvist J., Medina C., Samuelsson J.-E. A new method for predicting binding affinity in computer-aided drug design. Prot. Eng. 1994,7:385-391.
64. Hansson T., Marelius J., Aqvist J. Ligand binding affinity prediction by linear interaction energy methods. J. Comput. Aided Mol. Des. 1998,12:27.
65. Wall I.D., Leach A.R., Salt D.W., Ford M.G., Essex J.W. Binding constants of neuraminidase inhibitors: An investigation of the linear interaction energy method. J. Med. Chem. 1999,42:5142.
66. Carlson H.A., Jorgensen W.K. An extended linear response method for determining free energies of hydration. J. Phys. Chem. 1995,99:10667.
67. Su Y., Gallicchio E., Das K., Arnold E., Levy R.M. Linear Interaction Energy (LIE) models for ligand binding in implicit solvent: Theory and Application to the binding of NNRTIs to HIV-1 Reverse Transcriptase. J. Chem. Theory Comput., 2007,3:256-277.
68. Hermans J,. Wang L. Inclusion of loss of translational and rotational freedom in theoretical estimates of free energies of binding: application to a complex of benzene and mutant T4 lysozyme. J. Am. Chem. Soc. 1997,119:2707-2714.
69. Lee B., Richards F.M. The interpretation of protein structures: Estimation of static accessibility. J. Mol. Biol. 1971,55:379-380.
70. Hermann R.B. Theory of hydrophobic bonding. II. Correlation of hydrocarbon solubility in water with solvent cavity surface area. J. Phys. Chem. 1972,76:2754.
71. Sitkoff D., Sharp K.A., Honig B. Accurate calculation of hydration free energies using macroscopic solvent models. J. Phys. Chem. 1994,98:1978.
72. Lavigne P., Bagu J.R., Boyko R., Willard L., Holmes C.F.B., Sykes B.D. Structure-based thermodynamic analysis of the dissociation of protein phosphatase-1 catalytic subunit and microcystin-LR docked com-plexed. Prot. Sci., 2000.9:252-264.
73. Stouten P.F.W., Frommel C., Nakamura H., Sander C. An effective salvation term based on atomic occupancies for use in protein simulations. Mol. Simul., 1993,10:97-120.
74. N.A. Baker. Poisson-Boltzmann methods for biomolecular electrostatics. Methods in Enzymology. 2004. 383:94-118
75. Bashford D., Case D.A. Generalized Born models of macromolecular solvation effects. Annu. Rev. Phys. Chem. 2000. 51:129-152
76. Mehler E.L., Fuxreiter M., Simon I., Garcia-Moreno B.E. The role of hydrophobic microenvironments in modulating pKa shifts in proteins. Prot.: Struc., Func., Gen. 2002,48:283-292.
77. Li X., Hassan S.A., Mehler E.L. Long dynamics simulations of proteins using atomistic force fields and continuum representation of solvent effects: calculation of structural and dynamic properties. Proteins. 2005,60:464-484.
78. Kuhn В., Gerber P., Schulz-Gasch Т., Stahl M. Validation and use of the MM-PBSA approach for drug discovery. J. Med. Chem. 2005.48:4040-4048.
79. Petukhov M., Cregut D., Soares C.M., Serrano L. Local water bridges and protein conformational stability. Prot. Sci. 1999.8:1982-1989.
80. Bohm H.J. The development of a simple empirical scoring function to estimate the binding constant for a protein-ligand complex of known three-dimensional structure. J. Comput. Aided. Mol. Design. 1994. 8:243-256.
81. Gohlke H., Hendlich M., Klebe G. Knowledge-bases scoring function to predict protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 2000.295:337-356.
82. Mehler E.L., Guarnieri F. A self-consistent, microenvironment modulated screened coulomb potential approximation to calculate pH-dependent electrostatic effects in proteins. Biophys. J. 1999.75:3-22
83. Панченков Г.М., Лебедев В.П. Химическая кинетика и катализ. М., Химия, 1974
84. Warshel A., Levitt М., Theoretical studies of enzymic reaction: dielectric, electrostatic and steric stabilization ofthe carbonium ion in the reaction of lysozyme. J. Mol. Biol. 1976.103:227
85. Field M.J., Bash P.A., Karplus M. Combined Quantum Mechanical and Molecular Mechanical potential for molecular dynamics simulations. J. Сотр. Chem. 1990,11:700.
86. Thole B.T., van Duijnen P.T. On the quantum-mechanical treatment of solvent effects. Theor. Chim. Acta. 1979. 50:307.
87. Bakowies D., Thiel W. Hybrid models for combined Quantum Mechanical and Molecular Mechanical approaches. J. Phys. Chem. 1996.100:10580-10594.
88. Klahn M., Braun-Sand S., Rosta E., Warshel A. On possible pitfalls in ab initio QM/MM minimization approaches for studies of enzymatic reactions. J. Phys. Chem. B. 2005.109:15645-15650.
89. Aqvist J. Warshel A. Simulation of enzyme reactions using valence bond force fields and other hybrid quantum/classical approaches. Chem. Rev. 1993.93:2523-2544
90. Warshel A. Computer modeling of chemical reactions in enzymes and solutions. Wiley, NY, 1991.
91. Villa J., Warshel A. Energetics and dynamics of enzymatic reactions. J. Phys. Chem. B. 2001. 33:78877907
92. Bruice T.C., Lighstone F.C. Ground state and transition state contributions to the rates of intramolecular and enzymatic reactions. Acc. Chem. Res. 1999.32:127-136.
93. Zhang X., Bruice T.C. The proficiency of a thermophilic chorismate mutase enzyme is solely through an entropic advantage in the enzyme reaction. Proc. Nat, Acad. Sci. 2005.102:18356-18360
94. Mazumder-Shivakumar D., Bruice T.C. Molecular dynamics studies of ground state and intermediate of the hyperthermophilic indole-3-gIycerol phosphate synthase. Proc. Nat. Acad. Sci. 2004. 101:1437914384.109 http://www.gromacs.org/
95. Shmidt M.W., Baldringe K.K., Boatz J.A., Elbert S.T., Gordon M.S., Jensen J.H., Koseki S„ Matsunaga N., Nguyen K.A., Su S.J., Windus T.L. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Сотр. Chem., 1993,14:1347-1363.
96. Granovsky A.A., http://classic.chem.msu.su/gran/gamess/index.html112 http://autodock.scripps.edu/
97. Guex, N., Peitsch, M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 1997,18:2714-2723114 http://cn .expasy.org/spdbv/115 http://www.molmodel.ru
98. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 1996, 14:33-38117 http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/
99. Kim Y., Hoi W.G.J. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryI-7-aminocephalosporanic \ acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity. Chem. Biol. 2001.8:1253-1264.
100. Stroganov O.V., Chilov G.G., Svedas V.K. Force field parametrization for 6-aminopeniciIlanic acid. J. Mol. Struc (THEOCHEM), 2003, 631:117-125.
101. Буханов A.JI. Катализируемый пенициллинацилазой синтез р-лаетамньгх антибиотиков в высококонцентрированных водных системах. Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. 2005.
102. Youshko M.I., Chilov G.G., Shcherbakova Т.А., Svedas V.K. Quantitative characterization of the nucleo-phile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions. Biochim. Biophys. Acta. 2002. 1599:134-140
103. Диджяпетрис Р.И. Физико-химическое исследование реакций синтеза и гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, катализируемых пенициллинацилазой. Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. 1992.
