Катализируемый пенициллинацилазой синтез β-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
|
Буханов, Александр Леонидович
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2005
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.15
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова
Химический факультет, кафедра химической энзимологии Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского
на правах рукописи
Буханов Александр Леонидович
Катализируемый пенициллинацилазой синтез р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах
02.00.15 катализ 03.00.23 биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2005
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в отделе биокинетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.
Научные руководители: профессор, д.х.н. Швядас В.К.
к.х.н. Юшко М.И.
Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. Вржещ П.В.
с.н.с, к.х.н. Хомутов А.Р.
Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН
Защита состоится АС декабря 2005 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан /¿г ноября 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
Сакодынская И.К.
2406 - » ¿97/2
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) из Escherichia coli успешно применяется как катализатор гидролиза природного пенициллина с целью получения ядра пенициллинов 6-аминопенициллановой кислоты. В последнее время наблюдается всё возрастающий интерес к разработке биокаталитических методов получения ß-лактамных антибиотиков, в которых ПА катализирует ферментативный перенос ацильной группы активированного донора (в роли которых выступают эфиры и амиды карбоновых кислот) на ядра антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) в водной среде. В связи с этим особую актуальность приобретает задача изучения общих закономерностей катализируемого ПА переноса ацильной группы, понимание которых позволило бы разработать эффективные методы оптимизации биокаталитических технологий.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось: изучение кинетических закономерностей реакций ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил на примере синтезов ряда ß-лактамных антибиотиков, катализируемых пенициллинацилазой; исследование реакции ферментативного синтеза ß-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения; изучение влияния неорганических солей на реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; создание математической модели, адекватно описывающей процесс ферментативного переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил; разработка общих алгоритмов оптимизации процесса ферментативного синтеза ß-лактамных антибиотиков и выбор наиболее оптимальных условий синтеза ампициллина, цефалексина и амоксициллина, катализируемого пенициллинацилазой.
Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые: показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина включает стадию образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил; установлена адекватная кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил, описывающая поведение системы в широком диапазоне концентраций субстратов; качественно и количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина; показано, что параметры нуклеофильности, определяющие эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК, сохраняют свои значения при переходе от истинных растворов к кинетически пересыщенным; изучено влияние ионной силы на нуклеофильность 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, показано селективное влияние анионов неорганических солей на параметры нуклеофильности; предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения ß-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах; разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза ß-лактамных антибиотиков в высококонцентриров !работан метод
проведения ферментативных синтезов Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения и показаны преимущества данного метода перед ранее разработанными.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков с выходами, превышающими имеющиеся до сих пор в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологическом процессе биокаталитического получения ампициллина, цефалексина и амоксициллина.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом и 2-ом Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2002 и 2003 гг., Гордоновской конференции по биокатализу, Мериден, США, 2002 г., Международных конференциях по биокатализу «Биокатализ-2000» и «Биокатализ-2002», Международной конференции «Прикладной биокатализ-2002» Комо, Италия, 2002 г., 2-ой Международной конференции «Инженерия ферментативных реакций», Цавтат, Хорватия, 2005 г., на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезиса докладов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 102 ссылки. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 6 схем и 25 рисунков.
Результаты работы
Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза Р-лактамных антибиотиков
Реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков, катализируемые пенициллинацилазой, представляют собой перенос ацильной группы активированной молекулы субстрата, в роли которого выступают обычно эфиры или амиды соответствующих карбоновых кислот, на нуклеофил, роль которого выполняет ядро антибиотика. Для объяснения закономерностей протекания такого процесса ранее была предложена «минимальная» кинетическая схема (Схема 1).
Схема 1. «Минимальная» кинетическая схема
ферментативного переноса
ацшьной группы на нуклеофил. Е - свободный фермент, 5 -активированный донор ацильной
нам. 3=*ер*=^е + р части> р1 ~ первый продукт, к-4 выделяющийся при образовании
ацшфермента, — нуклеофил (ядро антибиотика), Р^- продукт гидролиза ацшфермента, Р - продукт переноса ацилъного остатка на нуклеофил (целевой антибиотик), ЕБ - комплекс фермент - субстрат, ЕА - ацилфермент, ЕАШ - комплекс ацшфермента с нуклеофшом, ЕР — комплекс фермент -продукт.
Одной из важнейших характеристик системы, определяющих эффективность ферментативного синтеза, является соотношение начальных скоростей накопления целевого антибиотика (скорость синтеза, Усинт) и продукта гидролиза активированного донора ацильной части (скорость гидролиза, Упщр).
Согласно схеме 1: гидр ^нач -, о п, где параметры (30 и у
*+ УР оп
характеризуют относительную реакционную способность нуклеофила: параметр к
р0= 4 - соотношение скоростей чсинтеза и гидролиза при низких концентрациях К*
нуклеофила, а параметр у = отражает соотношение скоростей синтеза и гидролиза при превращении комплекса ацилфермент-нуклеофил.
Анализ схемы 1 показывает, что эффективность катализируемого ПА переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил зависит от ограниченного
к /к
набора параметров: Рми=((а, р0. у, По, во), где параметр а = /---- отражает
КР / К3
специфичность пенициллинацилазы к донору ацильной части и антибиотику. Эффективность синтеза не зависит от абсолютных значений элементарных констант, а определяется значениями параметров а, (30, у и начальными концентрациями донора ацильной части и нуклеофила.
Несмотря на то, что закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил изучались ранее, имелись основания предполагать, что кинетическая схема катализируемого ПА переноса ацильной группы на добавленный нуклеофил в действительности является более сложной и для уточнения механизма ацилъного переноса на нуклеофил был проведён детальный кинетический анализ.
Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил
Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПА переноса ацильной
группы на нуклеофил
Кинетический анализ «минимальной» схемы 1 в данной работе проводился с двух сторон - со стороны синтеза целевого антибиотика и со стороны его гидролиза, катализируемого ПА. Для получения количественной характеристики влияния добавленного нуклеофила на кинетику катализируемых ПА реакций были исследованы зависимости кинетических параметров ферментативного синтеза и гидролиза ампициллина и амоксициллина от концентрации добавленного нуклеофила (6-АПК).
Кинетический анализ схемы 1 со стороны гидролиза антибиотиков, показывает, что в стационарном режиме реакция протекает в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен.
В рамках кинетической схемы 1 при гидролизе антибиотика (Р) в отсутствии донора ацильной части ([8]=0) скорость накопления продукта гидролиза Р2 описывается следующим уравнением):
к (М^ + М
' кгКг+п{к<+к>)+к_<{К +п) <и к (к,К„ + п(к4+к5)) • ш
Зависимость бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила имеет вид:
) = к2/К8(\/Рй+уп) ККМ)Р> (1//?0 + (1 + у)п) (2)
В рамках схемы 1 очевидно, что так называемая "бимолекулярная константа" (или константа специфичности) накопления продукта гидролиза Р2 является сложной нелинейной функцией от концентрации добавленного нуклеофила.
Полученные экспериментальные данные подтверждают нелинейную зависимость константы специфичности от концентрации 6-АПК (Рис. 1 и Рис.2), но, тем не менее, не описываются в рамках схемы 1. Для адекватного описания экспериментальных данных необходимо ввести в рассмотрение связывание нуклеофила со свободной формой фермента. Таким образом, схема 1 преобразуется в схему 2.
Е + Р
ЕЫи Схема 2. Кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нукпеофил с учётом связывания нуклеофила со свободной формой
фермента. Все обозначения соответствуют обозначениям на схеме I, за исключением образующегося комплекса фермент-нуклеофильного ЕИи.
В рамках кинетической схемы 2 при гидролизе антибиотика в отсутствии донора ацильной части ([8]=0) скорость накопления продукта гидролиза Р2 описывается следующим уравнением:
ЛР, " к2Кя+п(к4+к,)+к_,(К„+п)
а
ЪР
0 + +*5))
(?)
К,
К.
к,К„ + п(к4+к5)+к_<(Ка+п)
+ Р
Зависимость бимолекулярной константы накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила имеет вид:
(4)
0.010 0016 6-АПК, М
Рис.1 Зависимость обратной бимолекулярной константы скорости накопления продукта Р2 при ферментативном гидролизе
ампициллина от концентрации 6-АПК. Условия реакции рН=6.3, фосфатный буфер 0.01 М, 25° С.
Параметры аппроксимации [3=60 тМ, у=0.056, Кп,=3,8 тМ.
Рис.2 Зависимость обратной бимолекулярной скорости накопления продукта Р2 при ферментативном гидролизе амоксициллина от концентрации 6-АПК. Условия реакции рН=6.3, фосфатный буфер 0.01 М, 25° С. Параметры аппроксимации (3=72 шМ, у=0.13,Кп,=3,8 шМ.
0000 оосе 0,004 0008 0 «Ж 0010 0.012 0014 ОЛЮ
6-АПК, М т, „
Из данной зависимости, видно, что
бимолекулярная константа зависит от
ряда параметров ((30, у, к^!КР, Кп]) и концентрации нуклеофила. Параметры р0, у и
к_4/КР можно определить из независимых экспериментов, исследуя зависимость
нуклеофильности ядра р-лактамного антибиотика от его концентрации, что будет
более подробно описано позже. Таким образом, в зависимости бимолекулярной
константы накопления продукта Р2 гидролиза антибиотика от концентрации
добавленного нуклеофила остается неопределённым только один параметр К,,].
Константу связывания нуклеофила со свободной формой фермента (Кп)) можно
определить, аппроксимируя экспериментальную зависимость бимолекулярной
константы уравнением 4, предварительно подставив в него все известные
параметры (к^/КР,у, р0). Таким образом, константа Кп1=3,8 мМ была получена
аппроксимацией экспериментальных зависимостей обратной бимолекулярной
константы гидролиза ампициллина (Рис.2) и гидролиза амоксициллина (Рис.3) от
концентрации нуклеофила (6-АПК), используя ранее определённые из независимых
экспериментов параметры (к_л/КР ,у, р0).
Полученные экспериментальные данные говорят о необходимости при изучении катализируемых ПА реакций ацильного переноса на нуклеофил учитывать связывание нуклеофила со свободной формой фермента. Кроме того, экспериментально определённые значения константы связывания нуклеофила со свободной формой фермента (КЛ]) в случае ампициллина и амоксициллина одинаковы, что является подтверждением адекватности сделанного предположения.
С учётом полученных результатов был проведён кинетический анализ схемы 2 со стороны переноса ацильной группы донора на нуклеофил (синтеза антибиотика из 6-АПК). Так, в рамках кинетической схемы 2 при гидролизе донора ацильной чати в присутствии добавленного нуклеофила скорость накопления продукта гидролиза Р2 описывается следующим уравнением:
к2(к}К„+к5г,)
арг _ к,к„+п(к<+к5)+к2(к„+п)
* {\ + —)(к3К„+п(кл+к,))
К __+ 5
' кгКп + п(к< + к^ + к2(К„+п)
(5)
Зависимость бимолекулярной константы накопления продукта гидролиза Рг от концентрации нуклеофила имеет вид:
к, , 1
Г-я»\__Ра
Ки , 1
(6)
Рч
При изучении гидролиза активированных доноров (Б-ФГА и О-ФГМЭ) в присутствии нуклеофила (6-АПК) бьши получены зависимости бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила, которые не описывались в рамках уточнённой схемы 2 (Рис.3 и Рис.4). Для адекватного описания полученных экспериментальных данных необходимо ввести в рассмотрение связывание нуклеофила (N11) с фермент-субстратным
комплексом (Ев). Таким образом, схему 2 необходимо преобразовать в схему 3.
Б + Е
Е№
Схема 3. Кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофип с учетом связывания нуклеофила со , свободной формой фермента и фермент-субстратным комплексом. Все обозначения соответствуют обозначениям на схеме 1, за исключением образующихся комплексов фермент - нуклеофил ЕЫи и фермент-субстрат-нуклеофип ЕБИи.
В рамках кинетической схемы 3 скорость накопления продукта гидролиза Р2 описывается следующим уравнением:
_" я2
АР2 _ к,Кп+п(к> + к,) + кг{Кп + п) v )р.о---
евя
Л
<1 + -^-ХМГ. + »»<*4 + *5))
С »1 ____
' + +*,)+*,(*. +я)
Зависимость бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила имеет вид:
Л
{ки
—(— + уп){\ + л-^-
А, кп1
А
(8)
Рис.3 Зависимость обратной бимолекулярной константы скорости гидролиза Б-ФГА от концентрации 6-АПК. Условия реакции рН=6.3, фосфатный буфер 0.01 М, 25° С. Параметры аппроксимации р=60 шМ, у=0.056, Кп]=3,8 тМ, Кп2/Х=22 тМ. Пунктирная линия - без Кп2/Я..
0 005 0 010 0,015 0,030
6-АПК, М
Рис.4 Зависимость обратной бимолекулярной константы скорости гидролиза Р-ФГМЭ от концентрации 6-АПК. Условия реакции рН=6.3, фосфатный буфер 0.01 М, 25° С. Параметры аппроксимации (3=60 шМ, 7=0.056, Кп,=3,8 тМ, Кп2/А.=6,4 тМ. Пунктирная линия - без Кп2Д..
ОДЮ В.ЫО (
6-АПК, М
Очевидно, что зависимость бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации нуклеофила зависит от ряда параметров (ро, у, к2/К^, К„1, К112, X). Как уже отмечалось, параметры р0, у и к2/К5 определяются из независимых экспериментов по изучению зависимости нуклеофильности ядра Р-лактамного антибиотика от его концентрации. Константа связывания нуклеофила со свободной формой фермента (К„1) была определена из зависимости бимолекулярной константы накопления продукта гидролиза антибиотика Р2 от концентрации добавленного нуклеофила. Таким образом, видно, что в уравнении 8 единственным не известным параметром является сложная константа (К^А-). Данная константа является комбинацией константы связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом Кп2 и величины А, которая является отношением констант ацилирования комплексов фермент-субстрат-нуклеофил и фермент-субстрат. Константу КпгА. можно определить, аппроксимируя экспериментальную
зависимость бимолекулярной константы скорости накопления продукта гидролиза Р2 от концентрации добавленного нуклеофила уравнением 8, предварительно подставив в него все известные параметры (р0, у, к2/К5, Кп1). Константа Кп2Л, очевидно, зависит от конкретного субстрата, связанного с ферментом. Таким образом, Кп2Л. в случае О-ФГА (Рис.3) и случае О-ФГМЭ (Рис.4) равняется 22 мМ и 6,4 мМ, соответственно.
Подводя итог кинетического анализа, необходимо подчеркнуть, что при изучении катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил необходимо использовать схему 3, включающую связывание нуклеофила как со свободной формой фермента, так и с фермент-субстратным комплексом. Также необходимо подчеркнуть тот факт, что в процессе биокаталитического превращения не происходит связывания нуклеофила с комплексом фермент-продукт. Таким образом, в результате проведённого кинетического анализа была установлена более полная кинетическая схема катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил (схема 3), и количественно охарактеризовано влияние добавленного нуклеофила - определены константы Кп! и К^/А,. Результаты моделирования максимального выхода продукта (Рис.5) показывают, что использование максимально высоких концентраций донора ацильной части и нуклеофила является необходимым условием для проведения синтеза ампициллина
с высоким выходом. Рис.5 Зависимость максимальной степени конверсии 6-АПК в целевой продукт (Рми) от начальных концентраций 6-АПК и донора ацильной части. Параметры моделирования: а=2, 0о=6О, у=0.05
Данный факт неизбежно приводит к необходимости проведения синтеза в максимально концентрированных
системах. В настоящее время для повышения концентрации исходных веществ в растворе применяются различные методы. Так, большим преимуществом проведения синтезов в гетерогенных системах «раствор/осадок реагентов» при рН 6,3 является постоянная насыщающая концентрация ядра Р-лактамного антибиотика в растворе, что существенно повышает его значение нуклеофильности по сравнению с реакциями синтеза в гомогенных растворах при данном значении рН, а низкая растворимость целевого антибиотика снижает потери продукта, вызванные его непродуктивным гидролизом. Тем не менее, в ряде случаев (синтез цефалексина, амоксициллина), использование систем «раствор/осадок реагентов» не даёт ожидаемых результатов вследствие крайне ограниченной растворимости компонентов реакционной системы при данном значении рН. Для повышения действующих концентраций исходных реагентов при сохранении оптимального значения рН проведения ферментативной реакции в данной работе предложен метод проведения
2 0.6
катализируемых ПА ферментативных синтезов Р-лактамных антибиотиков с использованием так называемого эффекта кинетического пересыщения, позволяет существенно (до десятков раз) повысить концентрации исходных веществ в системе. Применение данного эффекта может открыть принципиально новые возможности синтеза тех пенициллинов и цефалоспоринов (в первую очередь таких как цефалексин и амоксициллин), биокаталитическое получение которых до настоящего времени было существенно ограничено в виду низкой эффективности процессов в насыщенных водных системах.
Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах
Эффект кинетического пересыщения
Как отмечалось ранее, для эффективного проведения катализируемого ПА ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков необходимо использовать максимальные концентрации реагентов. Предложенный метод с использованием эффекта кинетического пересыщения позволяет создавать высококонцентрированные водные системы, где действующая концентрация реагентов в несколько раз больше, чем концентрация насыщенных растворов данных соединений. Метод создания кинетически пересыщенных растворов основан на зависимости растворимости компонентов реакционной смеси от рН. Как видно из рис.6, растворимость 6-АПК возрастает при увеличении рН. Для создания кинетически пересыщенного раствора ядра антибиотика при заданном значении рН необходимо:
1 .Увеличить рН раствора до значения, при котором раствориться необходимое количество 6-АПК (Рис.6, этап 1).
2.Приготовить насыщенный раствор 6-АПК при данном рН (Рис.6, этап 2).
3.Плавно вернуть значение рН к исходному (Рис.6, этап 3).
При этом получается гомогенный раствор, в котором содержание 6-АПК
превышает её растворимость при данном рН. Такие растворы называют кинетически пересыщенными.
Рис.6 Зависимость растворимости 6-АПК от рН (по данным нашей лаборатории). Схема получения кинетически пересыщеннвх
высококонцентрированных растворов
Полученные гомогенные
кинетически пересыщенные растворы реагентов, не являются термодинамически
2,5
«2.0
с <
>¿1,5
Область
пересыщенного
раствора
Кинетически пересыщенный раствор
этап2
стабильными и со временем они распадаются на насыщенный раствор и осадок реагента (Рис.6). Распад метастабильного кинетически пересыщенного раствора требует образования зародышей, их роста и может быть кинетически заторможен. Поэтому такие растворы могут существовать довольно продолжительное время, достаточное для проведения ферментативного синтеза. На ряду с этим, в ходе ферментативного синтеза концентрации исходных веществ уменьшаются вследствие их расходования, тем самым постепенно снижается степень пересыщения раствора, что увеличивает время его существования.
При создании растворов важную роль играет чистота растворяемого вещества, так как любые нерастворимые в воде примеси являются центрами кристаллизации и ускоряют распад кинетически пересыщенного раствора. В тех случаях, когда на этапе приготовления насыщенного раствора (Рис.6, этап 2) наблюдалось его замутнение, прибегали к фильтрованию раствора от механических примесей перед дальнейшим понижением рН.
Таким образом, в ряде случаев удавалось повысить действующие концентрации реагентов в водном растворе более чем на порядок, а время существования таких кинетически пересыщенных растворов было достаточным для проведения биокаталитического превращения (Таблица 1).
Таблица 1. Максимальное кинетическое пересыщение и стабильность пересыщеиых растворов ядер антибиотиков и доноров ацильной части при катализируемом ПА ферментативном синтезе
Растворимость
Соединение Пересыщение, „¿¡^^
Насыщений Пересыщений Р*>" раствора, мин
раствор, М раствор,М
6-АПК 0.23 (0.29)" 0.7 2.4 >30
7-АДЦК 0.035 (0.04)" 0.62 15.5 >30
Б-ГФГА 0.05 (0.08)" 0.8 10.0 >30
« в присутствии 0.8 М СМИТА 6 в присутствии 0.25 М 6-АПК
Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в высококонцентрированных
водных системах
Как было показано выше, параметры нуклеофильности (р0 и у) являются важной характеристикой эффективности ферментативного синтеза. Для определения параметров нуклеофильности 6-АПК и 7-АДЦК при переходе к высококонцентрированным водным системам, было изучено соотношение
скоростей синтеза и гидролиза (Уамп/Угьфг) в широком интервале концентраций нуклеофила, включая кинетически пересыщенные растворы.
Из Рис. 7 и 8 видно, что характер зависимостей соотношения скоростей синтеза и гидролиза от концентрации нуклеофила сохраняется при переходе от истинных к пересыщенным растворам. Это означает, что значения параметров нуклефильности сохраняют постоянные значения на всём исследуемом интервале концентраций нуклеофила. Так, при увеличении действующей концентрации 6-АПК в 2.2 раза вследствие эффекта кинетического пересыщения, соотношение скоростей возрастает в 1.5 раза, что характеризует увеличение эффективности синтеза при переходе от истинных к пересыщенным растворам. Ещё больший эффект можно наблюдать в случае такого малорастворимогосоединения как 7-АДЦК: при увеличении действующей концентрации 7-АДЦК почти в 7 раз вследствие эффекта кинетического пересыщения, соотношение скоростей возрастает в 4 раза, что приводит к значительному увеличению эффективности ферментативного синтеза.
[6-апк], мм
Рис.7 Зависимость соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза катализируемого ПА синтеза ампициллина от концентрации 6-АПК. Условия эксперимента: рН 6.3,25°С
[7-адцк]. мм
Рис.8 Зависимость соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза катализируемого ПА синтеза амоксициллина от концентрации 7-АДЦК.
Условия эксперимента: рН 6.3,25°С
При проведении реакций ферментативного синтеза в высококонцентрированных водных системах существенную роль, помимо обсуждаемых выше факторов (таких как параметры нуклеофильности и концентрации реагентов), может играть влияние ионной силы и присутствие неорганических солей. Например, для поддержания постоянной рН раствора используют различные буферные растворы, которые содержат неорганические соли. Очевидно, что компоненты буферных растворов вносят дополнительный вклад в суммарную ионную силу, создаваемую компонентами реакционной смеси. К тому же, в реакционную систему неизбежно вносятся неорганические соли и кислоты при доведении рН раствора до необходимого. В целях избежания флуктуаций значений экспериментальных данных по причине различия ионной силы в серии экспериментов применяют неорганические соли для создания
постоянной ионной силы. Поэтому возникает необходимость изучения влияния ионной силы на катализируемые ПА ферментативные реакции.
Влияние анионов неорганических солей на нуклефшьность б-АПК
Обычно для поддержания постоянной ионной силы раствора используют хлорид калия. Поэтому, сначала было проведено определение параметров нуклеофильности при поддержании постоянной ионной силы, созданной добавлением соответствующего количества хлорида калия. Полученные результаты (Рис.9, СГ) существенно отличаются от обсуждённых ранее (Рис.9, без поддержания ионной силы). Соотношение скоростей синтеза и гидролиза в области пересыщенных растворов в присутствии хлорида меньше, чем при насыщенной концентрации 6-АПК без добавления солей. Это говорит о существенном ухудшении эффективности ферментативного синтеза в присутствии хлорида. Наиболее очевидным в данной ситуации являлось предположение о влиянии ионной силы на параметры нуклеофильности 6-АПК. Для проверки данного предположения было проведено определение параметров нуклеофильности 6-АПК аналогичным образом при поддержании ионной силы другими неорганическими солями (сульфатом и нитратом калия) и получен неожиданный результат - различные соли оказывали различное влияние на поведение ферментативной реакции.
Вез поддержит
в
6
г
[в-АПК], мМ
Рис.9 Зависимость соотношения скоростей синтеза и гидролиза катализируемого ПА синтеза ампициллина от концентрации 6-АПК при постоянной ионной силе,
поддерживаемой различными анионами. Условия эксперимента: рН 6.3,25°С, 1=0.9 М
Полученные результаты (Рис. 9) говорят о том, что эффект, наблюдаемый в присутствии различных солей, не может быть сведён только к влиянию ионной силы. Кроме того, использование во всех случаях солей калия исключает возможность специфического влияния катиона добавленной соли. Таким образом, во всех приведённых случаях наблюдается негативное влияние аниона, существенно снижающее эффективность синтеза. С другой стороны, факт селективного влияния анионов неорганических солей на реакцию катализируемого
ПА переноса ацильной группы на нуклеофил является принципиально новым наблюдением и говорит о потенциальной возможности связывания неорганического аниона вблизи активного центра ПА. Для проверки предположения о связывании аниона необходимо подробнее исследовать зависимость нуклеофильности 6-АПК от концентрации добавленного аниона.
Изучение зависимости нуклеофильности б-АПК от концентрации анионов
Было важно установить с какими свойствами аниона связано его селективное влияние на параметры ферментативной реакций и как сильно различаются эффекты в ряду гомологичных анионов. Для этой цели была изучена зависимость соотношения скоростей синтеза и гидролиза от концентрации анионов галогенового ряда. Из экспериментальных данных (Рис.10) видно, что даже в ряду близких по своим свойствам галоген-анионов наблюдается отчётливо выраженное селективное влияние. Вид кривых с насыщением по концентрации галоген-анионов говорит о том, что имеет место связывание аниона вблизи активного центра ПА, влияющее на одну или несколько стадий ферментативного превращения. Возможно, эффективность связывания коррелирует с ионным радиусом, т.е. с доступностью какой-то области активного центра ПА для аниона определённого размера.
Рис.10 Зависимость
соотношения скоростей
синтеза и гидролиза катализируемого ПА синтеза ампициллина от концентрации галоген-аниона. Условия эксперимента: рН 6.3, 25°С, 100 мМ 6-АПК, 100 мМ О-ФГА.
Как известно, параметр нуклеофильности является соотношением начальных скоростей синтеза и гидролиза. Влияние анионов неорганических солей на параметр нуклеофильности означает, что анионы влияют либо на скорость гидролиза, либо на скорость синтеза а мозможно и на скорости обеих реакций. Для выяснения этого вопроса было изучено влияние анионов неорганических солей на обе скорости в отдельности и показано, что анионы неорганических солей оказывают влияние, как на скорость накопления ампициллина, так и на скорость накопления продукта гидролиза (Б-ФГ). Причем, при увеличении концентрации неорганической соли в реакции ферментативного синтеза ампициллина скорость накопления целевого продукта падает, а скорость накопления продукта гидролиза активированного донора ацильной части Р2 увеличивается.
0.0 01 02 03 ОА 0.5 Об 07 0.8
Консентрация НаГ, М
В свете полученных данных очевидно, что механизм влияния анионов неорганических солей довольно сложен: анионы оказывают противоположное влияние на скорость синтеза антибиотика и скорость гидролиза активированного донора. Для более детального рассмотрения данного вопроса имеет смысл обратиться к структуре ПА.
Известно, что вблизи активного центра ПА (Рис.11) находятся положительно заряженные остатки аАг§145 и рАг§263. Предполагается, что данные аминокислотные остатки принимают непосредственное участие в связывании субстрата.
Так РАг^бЗ способен образовывать водородные связи с атомом кислорода Р-лактамного кольца антибиотика (пенициллина, ампициллина и т.д.) или нуклеофила (6-АПК, 7-АДЦК). Соответственно, образование водородных связей улучшает связывание субстрата. С другой стороны рАг^бЗ, как положительно заряженный остаток, способен на электростатические взаимодействия с отрицательно заряженными ионами. Таким образом, взаимодействие анионов неорганических солей с остатком РАг£263 может нарушать водородные связи данного аминокислотного остатка с субстратом, тем самым ухудшать связывание последнего. Таким образом, при синтезе ампициллина уменьшение скорости синтеза можно объяснить ухудшением связывания 6-АПК за счёт нарушения
принимает непосредственное участие в «переключении» фермента из «закрытой» конформации в «открытую». Так в «закрытой» конформации остаток аРЬе146 прикрывает участок связывания ¡3-
Связывание аниона вблизи активного центра ПА
неорганическими солями водородной связи остатка РАг|»263 с атомом кислорода р-лактамного кольца.
Рис.11 Структура активного центра пенициллинацилазы ео связанным в нем пенициллином в (по данным группы молекулярного моделирования отдела биокинетики НИИФХБ) и предполагаемый механизм влияния анионов на гидролиз субстрата и на стабилизацию нуклеофила в активном центре ПА.
Остаток аАг§145
лактамного ядра, а aArgl45 направлен к гидрофобному карману и образует водородную связь с остатком ßTyr27 и с атомом кислорода основной цепи ßPhe24. При «переключении» фермента в «открытую» конформацию остаток aPhel46 удаляется от гидрофобного кармана, а ctArgl45 становиться направленым в раствор и, соответственно, происходит разрыв водородных связей aArgl45 с остатком ßTyr27 и с атомом кислорода основной цепи ßPhe24. Можно предположить, что анионы неорганических солей способствуют переходу «закрытая»—»«открытая» конформация фермента путём нарушения водородных связей aArgl45 с остатком ßTyr27 и с атомом кислорода основной цепи ßPhe24, и таким образом влияют на соотношение путей синтеза и гидролиза.
Изучение влияния природы аниона на нуклеофильность б-АПК
Практически значимой задачей при проведении ферментативного синтезов Р~ лактамных антибиотиков является выявления аниона, оказывающего наименьшее негативное влияние на эффективность ферментативного синтеза. Для этого, было исследовано соотношение скоростей синтеза и гидролиза в серии стандартных экспериментов в присутствии различных солей калия. Из приведённых на рис.12 данных видно, что исследованные анионы оказывали специфическое негативное воздействие на эффективность ферментативного синтеза. Тем не менее, среди приведённых можно выделить фосфат-анион, оказывающий наименьшее негативное влияние (так, соотношение скоростей синтеза и гидролиза в присутствии эквивалентных концентраций фосфат и хлорид аниона отличается
почти в 2 раза).
2 3 4
Нуклеофильность в-АПК
Рис.12 Зависимость
соотношения скоростей синтеза и гидролиза катализируемого ПА синтеза ампициллина от природы аниона. Условия эксперимента: рН 6.3, 25°С, 100 мМ 6-АПК, 100 мМ В-ФГА, СанионИ)^ М.
Таким образом,
величины
оказываемого
изучение эффекта, различными
анионами, позволило определить неорганическую кислоту (Н3Р04), использование которой при катализируемых ПА синтезах Р-лактамных антибиотиков оказывает наименьшее негативное влияние.
Разработка и применение модели ферментативного синтеза р-лактамных
антибиотиков
Одним из важных аспектов успешного проведения ферментативного синтеза является возможность предсказания его результатов при помощи математического моделирования. В настоящее время ведётся активный поиск новых ферментов, способных эффективнее катализировать ферментативную реакцию синтеза Р-лактамных антибиотиков, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Замена одного аминокислотного остатка в структуре фермента может существенно изменить его каталитические свойства. Способность предсказывать эффективность нового фермента, основываясь на ограниченном количестве параметров, является важным шагом при его изучении и позволяет экономить время и реагенты на проведении ферментативных синтезов при различных условиях. Разработка модели катализируемого ПА ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков, адекватно описывающая экспериментальные данные, явилась одной из задач настоящей работы.
Накопление целевого продукта в ходе ферментативного переноса ацильной группы в водной среде проходит через максимум. Моделирование кривой накопления антибиотика предполагает интегрирование выражения для скорости синтеза. Решение данной задачи возможно только с помощью численного интегрирования. При этом возникает необходимость учитывать значения большого числа кинетических констант, экспериментальные значения которых точно не известны. Именно поэтому моделирование величины максимального выхода продукта от времени является довольно сложной задачей.
Ранее в нашей лаборатории на основании анализа схемы 1 был разработан метод моделирования зависимости максимального выхода целевого продукта от концентрации побочного продукта гидролиза Р2. Данный метод основан на анализе выражения отношения скоростей синтеза и гидролиза:
Как видно из уравнения 9, соотношение скоростей синтеза и гидролиза зависит от ряда параметров (а, р0> у), начальных концентраций субстратов (по, во) и текущих концентраций целевого антибиотика Р и продукта гидролиза Р2. С помощью программы МаЛСаё 11 была построена модель производящая численное интегрирование уравнения 9 и позволяющая вычислить зависимость концентрации целевого продукта Р от концентрации продукта гидролиза Р2, опираясь на экспериментально определённые параметры и эмпирические значения параметра а. В рамках схемы 1 модель достаточно точно описывала реальные катализируемые ПА ферментативные синтезы р-лактамных антибиотиков, однако при детальном кинетическом исследовании выяснилось, что подбираемые при моделировании
(«о-Р~Рг)
« А'Съ-р)
(9)
эмпирические значения параметра а не соответствуют значениям, определённым в независимом эксперименте.
Как было отмечено ранее, в схеме 1 не учитывалось связывание нуклеофила со свободной формой фермента и фермент-субстратным комплексом. Анализ более полной кинетической схемы 3 показал, что соотношение скоростей синтеза и гидролиза имеет более сложный вид (уравнение 10):
(«о-Р-Р1У
<5-
О+А>*Г*(ъ-Р))
("о-р-Рг)+Р*-
(10)
Усовершенствованная модель в рамках схемы 3 учитывает кинетически важные для эффективности синтеза стадии образования комплекса нуклеофил-фермент-субстрат (ЕвТ^и) и его дальнейшее превращение в комплекс ацилфермент-
нуклеофил (БАИи). Соответственно,-?-как раз и являлась той поправкой к
(1 + Я*/-)
экспериментально определённому значению параметра а, которая требовалась для адекватного описания экспериментальных результатов (Рис. 13). В результате модель ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков, построенная в рамках схемы 3, с хорошей точностью предсказывает максимальный выход антибиотика в реакциях синтеза, используя только экспериментально определённые параметры.
Рис.13 Моделирование синтеза ампициллина. Условия реакции: рН 6.3, фосфатный буфер 0.01 М, 25° С, 100 тМ 6-АРА, 100 тМ Б-РСА. (•^экспериментальные данные, сплошная кривая вычислена в соответстии со схемой 2 и значениями параметров Р=60 шМ, у=0.056, а=11, Кп2/Я,=22 шМ. Нижняя кривая вичислена без учёта значения Кп2А и представлена пунктирной линией.
Катализируемый ПА синтез Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах
Особенности проведения катализируемого ПА синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах
Проведение реакций ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения представляет собой весьма перспективную область исследования. Высокие концентрации исходных реагентов, оптимальные значения параметров нуклеофильности, низкая растворимость целевого антибиотика при оптимальном рН позволяют существенно повысить эффективность ферментативного синтеза по сравнению с ранее использовавшимися методами.
Важным показателем эффективности является соотношение скоростей синтеза и гидролиза (нуклеофильность). Как было показано, нуклеофильность возрастает с увеличением концентрации ядра Р-лактамного антибиотика и использование эффекта кинетического пересыщения позволяет существенно повысить действующую концентрацию нуклеофила в растворе, что в свою очередь ведёт к увеличению эффективности синтеза.
Таким образом, с учётом всех полученных результатов, можно изложить основные принципы проведения катализируемого ПА синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах:
• Создание максимально концентрированных систем с помощью эффекта кинетического пересыщения является основным шагом на пути к проведению ферментативного синтеза с максимальной эффективностью.
• Заметное ухудшение эффективности ферментативного синтеза в присутствии неорганических солей приводит к необходимости минимизировать использование последних при проведении реакций ферментативного синтеза.
Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и амоксицимина с использованием эффекта кинетического пересыщения
С учётом выводов, сделанных на основании полученных результатов, был разработан общий метод катализируемого ПА синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах. Ферментативные синтезы начинали из гомогенных максимально концентрированных растворов реагентов, создаваемых при помощи эффекта кинетического пересыщения. При этом оптимальное значение рН реакционных систем обеспечивало наиболее эффективное протекание синтетической реакции за счет повышения эффективной нуклеофильности ядер антибиотиков и подавления гидролиза образовавшегося целевого продукта. Негативное влияние неорганических анионов было сведено к минимуму за счёт использования (для поддержания рН и растворения реагентов) фосфорной кислоты, которая, как показано выше, оказывает наименьшее воздействие на эффективность синтеза. Полученные результаты говорят о высокой эффективности данного подхода во всех исследуемых реакциях.
Так, при синтезе цефалексина (Таблица 2) удалось повысить эффективную концентрацию ядра антибиотика в 20 раз, при этом выход целевого продукта составил 92%, что на 14% выше, чем лучшие данные, опубликованные в литературе. Также более чем в два раза увеличилось соотношение С/Г (соотношение концентраций антибиотика и продукта гидролиза донора ацильной части в точке максимума накопления целевого продукта), что характеризует значительное увеличение эффективности использования донора ацильной части.
Таблица 2.
Сравнение экспериментальных (выделены серым цветом) и литературных данных для ферментативного синтеза цефалексина в высококонцентрированных водных системах.
Исходная Общие начальные концентрации, М Пересыщение, раз Выход, % С/Г
система 7-АДЦК Б-ФГА 7-АДЦК 7-АДЦК Й-ФГА
ГмоСеииая, пересыщение по 7-АДЦК* о.б ,,-■•'• > И' г' - .¥•<'¿г- 6.5
Гетерогенная с осадком 7-АДЦК 0.5 0.5 - 78 65 2.4
*Условия эксперимента: рН 6.3, 25°С
Таблица 3.
Сравнение экспериментальных (выделены серым цветом) и литературных данных для ферментативного синтеза амоксициллина в высококонцентрированных водных системах.
Исходная Общие начальные концентрации, М Пересыщение, раз Выход, % С/Г
система 6-АПК 1)-ГФА 6-АПК 1)-ГФА 6-АПК О-ГФА
Гомо^ЩУ пересыщение до 6-АПК и ГМ"ФА* 0.65 . »- Л~ - г Г*, ' Ш ' ' , Л*»" ; г,4 г! щ. * 73 ! 3.2
Гетерогенная с осадком 6-АПК и!)-ГФГА 0.5 0.8 - 80 55 1.5
*Условия эксперимента: рН 6.3, 25°С
1
I
Таблица 4.
Сравнение экспериментальных (выделены серым цветом) и литературных данных для ферментативного синтеза ампициллина в ! высококонцентрированных водных системах.
Общие начальные Пересыщение, „ „.
Исходная концентрации, М раз_ньиод, /.
система
С/Г
6-АПК Э-ФГА б-АПК
6-АПК И-ФГА
Гомогенная
Ив '
* *; ¡г" ' * *'1 ** 4
Гетерогенная с осадком 0.6 6-АПК
0.9
95
63 2.3
^Условия эксперимента: рН 6.3, 25°С
В случае амоксициллина удалось существенно увеличить эффективные концентрации как ядра антибиотика, так и донора ацильной части (Таблица 3). При этом выходы как по нуклеофилу, так и по донору оказались на 11% больше по сравнению с лучшими литературными данными. Соотношение С/Г возросло более чем в 2 раза.
При синтезе ампициллина также удалось достичь существенных улучшений (Таблица 4). Хотя увеличение выходов по обоим реагентам не такое заметное, как в случаях цефалексина и амоксициллина, рассмотрение их в комплексе с соотношением С/Г говорит о существенном увеличении эффективности катализируемого ПА превращения.
Отдельно хотелось бы отметить, что повышение концентраций исходных реагентов оказывает положительный эффект не только на эффективность синтеза, но и существенно повышает скорость биокаталитического превращения, что является немаловажным, а зачастую и решающим фактором при разработке реальных технологических процессов.
Таким образом, можно с уверенностью сказать, что предложенный метод проведения катализируемого ПА синтеза р-лакатамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения реагентов имеет значительные преимущества перед используемыми раннее системами. Результаты проведенных синтезов ампициллина, амоксицилина и цефалексина наглядно демонстрируют его высокую эффективность для разработки процессов биокаталитического получения различных полусинтетических пенициллинов и цефаллоспоринов.
Основные результаты и выводы
1. Показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина включает стадию образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил. Количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина.
2. Предложена минимальная кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. Разработана математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения (3-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных системах, в высококонцентрированных водных растворах.
3. Разработана методика создания пересыщенных растворов реагентов для катализируемого ПА синтеза различных (3-лактамных антибиотиков. Показано, что кинетические закономерности, количественно характеризующие эффективность катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил, сохраняются в пересыщенных водных системах.
4. Обнаружено селективное влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК. Предложен механизм возможного связывания аниона вблизи активного центра ПА.
5. Проведены катализируемые ПА синтезы ампициллина, цефалексина и амоксициллина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения исходных реагентов. Полученные результаты показали более высокую эффективность данного метода по сравнению с известными ранее.
Список сокращений
ПА - пенициллинацилаза
6-АПК - 6-аминопенициллановая кислота
7-АДЦК - 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота * Б-ГФГА - амид Б-п-гидроксифенилглицина
Х)-ГФГ - О-п-гидроксифенилглицин
О-ФГ - Б-фенилглицин »
Э-ФГМЭ - метиловый эфир Б-фенилглицина
Б-ФГА - амид Б-фенилглицина
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
РСА - рентгеноструктурный анализ
Список публикаций
1. M.I. Youshko, Н.М. Moody, A.L. Bukhanov, W.H.J. Boosten and V.K. Svedas "Penicillin acylase-catalyzed synthesis of beta-lactam antibiotics in highly condensed aqueous systems. Beneficial impact of kinetic substrate supersaturation", Biotechnol. Bioeng. 2004,85 (3), 323-329.
2. Юшко М.И., Буханов A.JL, Швядас B.K. "Изучение связывания нуклеофила в активном центре пенициллинацилазы. Кинетический анализ", Биохимия, 2003, 68, вып. 3,405-410
3. Чилов Г.Г., Юшко М.И., Буханов А.Л., Шаповалова И.В., Швядас В.К. «Нетрадиционные пути ферментативной модификации и синтеза бета-лактамных антибиотиков», 2-ой Международный конгресс "Биотехнология - состояние и перспективы развития", Москва, ноябрь 2003, доклад, стр. 184
4. Youshko М. I., Bukhanov A.L. and К. Svedas V.K. "Study of the nucleophile binding in the penicillin acylase active center. Kinetic analysis", International conference Biocatalysis 2002: fimdamentais and applications, 2002, Proceedings, p. 152
5. Youshko M.I., Bukhanov A.L., Svedas V.K. "Kinetic study of penicillin acylase-catalyzed acyl group transfer to nucleophile" International conference "Biocatalysis-2000: fundamentals and applications", 2000, Proceedings, p. 177-178.
Подписано к печати 18. 11.05 Тираж 100 экз. Заказ № 182
ООП МГУ
к
i
i
-с
?
?
V
Ii 2 2 7 б
РНБ Русский фонд
2006-4 24712
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1 Пенициллинацилаза из Е.соН.
1.1.1 Общие свойства.
1.1.2 Структура активного центра пенициллинацилазы.
1.1.3 Механизм действия.
1.2 Ферментативный синтез р-лактампых антибиотиков.
1.2.1 Основные подходы.
1.2.1.1 Термодинамически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков.
1.2.1.2 Кинетически контролируемый синтез р-лактамных антибиотиков.
1.2.2 Кинетические закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил
1.2.3 Ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных (раствор/осадок реагентов) водных системах.
1.3 Факторы оптимизация синтеза р-лактамных антибиотиков.
1.3.1 Эволюция кинетической схемы ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков.
1.3.2 Влияние ионной силы на ферментативный синтез р-лактамных антибиотиков.
1.3.3 рН-зависимость эффективности биокаталитических процессов, катализируемых ПА.
1.3.4 Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков.
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Материалы.
2.2 Методы.
2.2.1 Определение констант специфичности (ккат /Км ) гидролиза антибиотиков и доноров ацильной части.
2.2.2 Количественная характеристика связывания нуклеофила в активном центре ПА.
2.2.3 Количественная характеристика связывания нуклеофила с фермент-субстратным комплексом
2.2.4 Анализ влияния добавленного нуклеофила на реакцию гидролиза ампициллина.
2.2.5 Изучение растворимости компонентов реакции.
2.2.6 Создание кинетически пересыщенных водных систем в реакциях ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков.
2.2.7 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина.
2.2.8 Изучение нуклеофильности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина в присутствии неорганических солей.
2.2.9 Изучение реакций ферментативного синтеза ампициллина, амоксициллина и цефалексина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения
2.2.10 Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.2.11 Математическая обработка результатов и моделирование реакций.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза р-лактамных антибиотиков.
3.2 Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил.
3.2.1 Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил.
3.2.2 Изучение влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию.
3.3 Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах.
3.3.1 Эффект кинетического пересыщения.
3.3.2 Определение параметров нуклеофильности 6-АПК в высококонцентрированных водных системах
3.3.3 Влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК.
3.3.4 Изучение зависимости нуклеофильности 6-АПК от концентрации анионов.
3.3.5 Влияние неорганических солей на скорости синтеза и гидролиза при катализируемом ПА переносе ацильной группы на 6-АПК.
3.3.6 Связывание аниона вблизи активного центра ПА.
3.3.7 Изучение влияния природы аниона на нуклеофильность 6-АПК.
3.3.8 Разработка и применение модели ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков.
3.4 Катализируемый ПА синтез р-лактамных антибиотикрв в высококонцентрированных водных системах.
3.4.1 Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и амоксициллина с использованием эффекта кинетического пересыщения.
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) из Escherichia coli несколько десятков лет успешно применяется в процессе синтеза полусинтетических Р-лактамных антибиотиков. Одним из исходных веществ для химического синтеза р-лактамных антибиотиков является ядро антибиотика, которое получают катализируемым ПА ферментативным гидролизом природных пенициллинов и цефалоспоринов. Химический синтез Р-лактамных антибиотиков включает в себя большое количество стадий (защита боковой цепи, активация карбоксильной группы, реакция ацилирования ядра Р-лактамного антибиотика , снятие защиты боковой цепи), которые проводятся в органическом растворителе.
Наряду с полусинтетическим методом в последнее время наблюдается всё возрастающий интерес к разработке полностью биокаталитических методов получения р-лактамных антибиотиков, в которых ПА катализирует ферментативный перенос ацильной группы активированного донора (в роли которых выступают эфиры и амиды карбоновых кислот) на ядра антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) в водной среде. В связи с этим, особую актуальность приобретает задача изучения общих закономерностей катализируемых ПА биокаталитических превращений с переносом ацильной группы, понимание которых позволило бы разработать эффективные методы оптимизации технологических процессов. Целью настоящей работы явилось: изучение закономерностей реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил на примере синтезов ряда Р-лактамных антибиотиков, катализируемого пенициллинацилазой; исследование реакции ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения; изучение влияния неорганических солей на реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; создание математической модели, адекватно описывающей процесс ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК; разработка общих алгоритмов оптимизации процесса ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков и выбор оптимальных условий синтеза ампициллина, цефалексина и амоксициллина, катализируемого пенициллинацилазой.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые было показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина включает стадии образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил, установлена кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил; качественно и количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина; показано, что параметры нуклеофильности, определяющие эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК, сохраняют свои значения при переходе от истинных растворов к кинетически пересыщенным; изучено влияние ионной силы на нуклеофильность 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, показано селективное влияние анионов неорганических солей на параметры нуклеофильности; предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах; разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков; разработан метод проведения ферментативных синтезов |3-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения и показаны преимущества данного метода перед ранее разработанными.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза Р-лактамных антибиотиков. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков с выходами, превышающими значения, представленные в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологических процессах биокаталитического получения ампициллина, цефалексина и амоксициллина.
1. Литературный обзор
Основные результаты и выводы
1. Показано, что катализируемая ПА реакция переноса ацильной группы на нуклеофил (6-АПК) включает стадию образования комплексов фермент-нуклеофил и фермент-субстрат-нуклеофил. Количественно охарактеризовано влияние нуклеофила на ферментативные реакции синтеза и гидролиза ампициллина.
2. Предложена минимальная кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. Разработана математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных, гетерогенных и высококонцентрированных водных системах.
3. Разработана методика создания пересыщенных растворов реагентов для катализируемого ПА синтеза различных Р-лактамных антибиотиков. Показано, что кинетические закономерности, количественно характеризующие эффективность катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил, сохраняются в пересыщенных водных системах.
4. Обнаружено селективное влияние анионов неорганических солей на нуклеофильность 6-АПК. Предложен механизм возможного связывания аниона вблизи активного центра ПА.
5. Проведены катализируемые ПА синтезы ампициллина, цефалексина и амоксициллина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения исходных реагентов. Полученные результаты показали более высокую эффективность данного метода по сравнению с известными ранее.
1., and Rauenbusch, E., Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105, Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 1974, 354, 45-53.
2. Bock, A., Wirth, R., Schumacher, G., Lang and P. Buckel. G., The penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 consists of two dissimilar subunits, FEMS Microb. Lett, 1983, 20, 135-139.
3. Oh S. J., Kim Y.-Ch., Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in E.coli. Gene. 1987, 56, 87-97.
4. Shimizu, M., Okachi, R., and Nara, T., Enzymic synthesis of cephalosporins. III. Purification and properties of penicillin acylase from Kluyvera citrophila, Agric. Biol. Chem., 1975,39, 1655-1661.
5. Barbero, J. L., Buesa, J. M., de Buitrago. G. G., Mendez, E., Perez-Aranda, A., and Garcia, J. L., Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. Gene. 1986,49,69-80.
6. Daumy, G. O., Danley, D., McColI, A. S., Apostolakos, D., and Vinick, F. J., Experimental evolution of penicillin G acylases from Escherichia coli and Proteus rettgeri, J. Bacterid., 1985, 163, 925-932.
7. Sizmann, D., Keilmann, C., and Bock. A., Primary structure requirements for the in vivo maturation of penicillin acylase from E. coli ATCC 11105, Eur. J. Biochem., 1990, 192,143-150.
8. Кочеткова, E. Ф., Бартошевич, Ю. Э., Романова H. Б., Биосинтез пенициллинацилаз, Антибиотики, 1986, 31, 729-740.
9. Lindsay C.D. and Pain R.H. Refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that results from proteolytic activation. Biochemistry. 1991, 30, 9034-9040.
10. Duggleby, H. J., Tolley, S. P., Hill, C. P., Dodson, E. J., Dodson, G., and Moody, P. С. E., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995, 373, 264-268.
11. Alkema W. B. L., Dijkhuis A-J., de Vries E., Janssen D. В., The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase, Eur. J. Biochem., 2002, 269,2093-2100.
12. Alkema W. B. L., Prins A. K., de Vries E., Janssen D. В., The role of aArgl45 and aArg263 in the active site of penecillin acylase of E.coli, Biochem. J., 2002, 365, 303309.
13. Швядас В.К., Марголин A.JL, Шерстюк С.Ф., Клесов А.А. Березин И.В. Определение абсолюьной концентрации активных центров растворимой и иммобилизированной пенициллинамидазы. ДАН. 1977, 232, 1127-1129.
14. Konecny J., Schneider A. and Sieber М. Kinetics and mechanism of acyl transfer by penicillin acylases. Biotechnol. and Bioeng. 1983,25,451-467.
15. Choi C.S., Kim J.A. and Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from E.coli ATCC 11105. J. Bact. 1992, 174, 6270-6276.
16. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R. and Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biochem. J. 1991,280, 659-662.
17. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. Москва, изд-во "Высшая школа", 1977.
18. Brannigan J.A., Dodson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R. and Murzin A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature. 1995, 378, 416-419.
19. Березин И.В., Клесов A.A., Марголин A.JL, Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: pH-зависимости константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6), 519-523.
20. Березин И.В., Клесов A.A., Марголин А.Л., Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.-Ю.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli. pH зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(5), 411-415.
21. Svedas V., Guranda D., Van Langen L., Van Rantwijk F. and Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett. 1997,417,414-418.
22. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков B.A. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы. Биохимия. 1981,46(9), 1603-1608.
23. Kaufmann, W., and Bauer, К., Enzymatische Spaltung und resynthese von penicillin, Naturwiss., 1960,47,474-475.
24. Cole, M., Penicillins and other acylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 1969, 115, 747-756.
25. Marconi, W., Bartoli, F., Cecere, F., Galli, G., and Morisi, F., Synthesis of penicillins and cephalosporins by penicillin acylase entrapped in fibres, Agr. Biol. Chem., 1975,39, 277-279.
26. Margolin, A. L., Svedas, V. K., and Berezin, I. V., Substrate specificity of penicillin amidase fromis. coli, Biochim. Biophys. Acta., 1980, 616, 283-289.
27. Stambolieva, N., Mincheva, Z., Galunsky, В., and Kalcheva, V., Penicillin amidase-catalyzed transfer of low specific acyl moiety. Synthesis of 7-benzoxazolonylacetamido desacetoxycephalosporanic acid, Enzyme Microb. Technol., 1992, 14,496-500.
28. Svedas, V. K., Margolin, A. L., and Berezin, I. V., Enzymatic synthesis of ß-lactam antibiotics: A thermodynamic background, Enzyme. Microb. Technol., 1980, 2, 138144.
29. Березин, И.В., Марголин, A.JI., Швядас, B.K., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазой, Докл. АН СССР, 1977, 235, 961-964.
30. Diender, М. В., Straathof, A. J. J., van der Wielen, L. A. M., Ras, С., Heijen, J. J., Feasibility of the thermodynamically controlled synthesis of amoxicillin, J. Mol. Catal. B: Enzymol., 1998, 5,249-253.
31. Svedas, V. K., Margolin, A. L., Borisov, I. L., and Berezin, I. V., Kinetics of enzymatic synthesis of benzylpenicillin, Enzyme Microb. Technol., 1980, 2, 313-317.
32. Березин, И.В., Клесов, A.A., Швядас, В.К., Ныс, П.С., Савицкая, Е.М., Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинацилазой, Антибиотики, 1974, 19(10), 880-887.
33. Bruggink, A., Roos, Е. С., de Vroom, Е., Penicillin acylase in the industrial production of ß-lactam antibiotics, Org. Process Res. Dev., 1998,2, 128-133.
34. Zerner, В., and Bender, M. L., The kinetic consequences of the acyl-enzyme mechanism for the reactions of spesific substrates with chymotrypsin, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3669-3673.
35. Bender, M.L., Clement, G.E., Gunter, C.R., and Kezdy, F., The kinetics of a-chymotrypsin reactions in the presence of added nucleophiles, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3697-3703.
36. Fink, A. L., and Bender, M. L., Binding sites for substrate leaving groups and added nucleophiles in papain-catalysed hydrolyses, Biochemistry, 1969, 8(12), 5109-5118.
37. Seydoux, F., Yon, J., Nucleophilic competition in enzymic hydrolytic reactions. Kinetic analysis and application to the tryptic hydrolysis of some esters, Europ. J. Biochem., 1967,3,42-56.
38. Seydoux, F., Yon, J., Nemethy, G., Hydrophobic interactions of some alcohols with acyl trypsins, Biochim. Biophys. Acta, 1969, 171, 145-156.
39. Клесов, А. А., Марголин, A. JL, Швядас, В. К., Перенос ацильной группы на 6-аминопенициллановую кислоту, катализируемый пенициллинацилазой. Кинетическое рассмотрение, Биоорг. химия, 1977, 5, 654-661.
40. Kato, К., Kinetics of acyl transfer by a-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri, Agric. Biol. Chem., 1980, 44, 1083-1088.
41. Nam, D. H., Kim, C., and Ryu, D. D. Y., Reaction kinetics of cephalexin synthesizing enzyme from Xanthomonas citri, Biotechnol. Bioeng., 1985,27, 953-960.
42. Швядас B.K., Клесов A.A. Проблемы ферментативной модификации антибиотиков. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: кинетика и механизм действия. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ. Под ред.
43. B.JI. Кретовича и И.В. Березина. Сер. биолог, химия, т. 12. М., Изд-во ВИНИТИ АН СССР,. 1978, 209-237.
44. Kasche, V., Haufler., U., Zollner, R., Kinetic studies on the mechanizm of the penicillin amidase-catalysed synthesis of ampicillin and benzylpenicillin, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1984, 365, 1435-1443.
45. Riechmann, L., and Kasche, V., Peptide synthesis catalyzed by serine proteinases chymotrypsin and trypsin, Biochim. Biophys. Acta, 1985, 830, 164-172.
46. Kasche V. Review. Mechanism and yields in enzyme catalysed equilibrium and kinetically controlled synthesis of P-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol. 1986, 8,4-16.
47. Stambolieva, N., Mincheva, Z., and Galunsky, В., Kinetic comparison of penicillin amidase catalyzed transfer of nonspecific and specific acyl moieties to 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid, Biocatal. Biotransform., 1998, 16, 225-232.
48. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., Belikov, V. M., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming acyl-enzyme intermediate: Kinetic model analysis, Biotechnol. Bioeng., 1988,32, 866-872.
49. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming an acylenzyme intermediate: Kinetic model analysis (Including hydrolysis of acylenzyme-nucleophile complex), J. Theor. Biol., 1989, 140,193-204.
50. Гололобов, M. Ю., Борисов, И. JI., Швядас, В. К., Пептидный синтез, катализируемый протеазами. Анализ кинетической модели для ферментов, действующих по ацилферментному механизму, Биохимия, 1987, 52, 584-591.
51. Gololobov, M. Yu., Petrauskas, A., Pauliukonis, R., Koschke, V., Borisov, I. L., and Svedas, V., Increased nucleophile reactivity of amino acid p-naphthylamides in a-chymotrypsin-catalyzed peptide synthesis, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041, 71-78.
52. Blinkovsky, A. M., Markaryan, A. N., Synthesis of (5-lactam antibiotics containing a-aminophenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-p-lactamide amidohydrolase, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 965-973.
53. Tougu V., Talts P., Meos H., Hage M., Aaviksaar A., Aminolysis of acyl-chymotrypsins by amino acids. Kinetic appearance of concentration effect in peptide yield enhancement by freezing, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1247, 272-276.
54. Gerisch S., Jakubke H. D., Kreuzfeld H. J., Enzymatic peptide synthesis in frozen aqueous systems: use of N-unprotected unusual acyl donors, Tetrahedron Asymmetry, 1995,6, 3039-3045.
55. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Protease-catalysed synthesis of oligopeptides in heterogeneous substrate mixtures, Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 1024-1030.
56. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Enzymatic catalysis in heterogeneous mixtures of substrates: the role of the liquid phase and the effects of "adjuvants", Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 1016-1023.
57. Gill, I., and Vulfson, E., Enzymic catalysis in heterogeneous eutectic mixtures of substrates, Tibtech., 1994, 12, 118-122.
58. Kasche, V., and Galunsky, В., Enzyme catalyzed Biotransformations in aqueous two-phase systems with precipitated substrate and/or product, Biotechnol. Bioeng., 1995,45, 161-167.
59. Youshko M.I., Van Langen L.M., De Vroom E., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. "Penicillin Acylase-Catalyzed Ampicillin Synthesis Employing a pH Gradient: a New Approach to Optimization", Biotechnol. Bioeng. 2002, 78 (5), 589593.
60. Швядас, В. К., Марголин, А. Л., Шерстюк. С. Ф., Березин. И. В., Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров, Биоорган, химия, 1977, 3, 546-553.
61. Alkema W.B.,de Vries Е., Floris R., Janssen D.B. Kinetics of enzyme acylation and deacylation in the penicillin acylase-catalyzed synthesis of p-lactam antibiotics. Eur.J.Biochem. 2003,270, 3675-3683.
62. Ospina S.,Barzana E., Ramirez O.T., Lopez-Munguia A. Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase. Enzyme and microbial technology. 1996, 19,462-469.
63. Kheirolomoom A., Ardjmand M., Fazelinia H., Zakeri A., Clarification of penicillin G acylase reaction mechanism, Process Biochemistry, 2001, 36, 1095-1101.
64. Kin M.G., Lee S.B., Effect of organic solvents on penicillin acylase-catalyzed reactions: interaction of organic solvents with enzymes, J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1996, 1, 181-190.
65. Prabhune A.A., Sivaraman H., Evidence for involvement of arginyl residue at the catalytic site of penicillin acylase from E.coli, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 173(1), 317-322.
66. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P., Hubbard R., Ligand-induced conformational change in penicillin acylase, J. Mol. Biol., 1998,284,463-475.
67. McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A., Crystal structure of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism, J. Mol. Biol., 2001, 313, 139-150.
68. Alkema W., Hensgens C., Kroezinga E., de Vries E., Janssen D., Characterization of the P-lactam binding site of penicillin acylase of E.coli by structural and site-directed mutagenesis studies, Protein Engineering, 2000,13(12), 857-863.
69. Гуранда Д.Т., Воловик Т.С., Швядас В.К. pH-зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli., Биохимия, 2004, 69(12), 1700-1705.
70. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Канд. дисс. Москва. 2000.
71. Martin J., Prieto I., Mancheno J.M., Barbero J.L. and Arche R. pH studies to elucidate the chemical mechanism of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnol. Appl. Biochem. 1993, 17,311-325.
72. Chilov G.G., Svedas V.K. Enzymatic hydrolysis of beta-lactam antibiotics at low pH in a two-phase "aqueous solution water-immiscible organic solvent" system". Can. J. Chem. 2002, 80, 699-707.
73. Ныс П.С., Савицкая E.M., Клесов A.A., Синицын А.П., Швядас В.-Ю.К., Березин И.В. Изучение пенициллинамидазы из E.coli. pH-зависимость кинетики инактивации фермента. Антибиотики. 1978,23(1), 46-50.
74. Haufler U., Wiesemann I., Ulmke R. and Kasche V. Structure, pH-stability and renaturation of free and immobilized E. coli penicillin amidase. Dechema Biotechnology Conferences 1 VCH Verlagsgesellschaft. 1988,345-350.
75. Воловик T.C. Стабильность пенициллинацилазы. Дипл. работа. Хим. ф-т МГУ, кафедра хим. энзимологии. М. 2004.
76. Berezin I.V., Klibanov A.M., Klyosov A.A., Martinek K. and Svedas V.K. The effect of ultrasound as a new method of studying conformational transitions in enzyme active sites. FEBS Lett. 1975,49(3), 325-328.
77. Yang S., Zhou L., Tang H., Pan J., Wu X., Huang H., Yuan Z. Rational design of a more stable penicillin G acylase against organic cosolvent. 2002 J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 18, 285-290.
78. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Svedas V.K., Zenin A.B., Kabanov V.A. and Berezin I.V. Preparation and properties of penicillin amidase immobilized in polyelectrolytic complexes, Biochem. Biophys. Acta, 1981, 660, 359-365.
79. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков B.A. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы, Биохимия, 1981, 46, 1603-1608.
80. Guisan J.M., Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Rossel C.M., Garcia J.L. and Tagliani A. Stabilization of heterodimeric enzyme by multipoint covalent immobilization: Penicillin G acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnol. Bioeng., 1993,42,455-464.
81. Ospina S.S., Lopez-Munguia A., Gonzalez R.L., and Quintero R. Characterization and use of a penicillin acylase biocatalyst. J. Chem. Tech. Biotechnol, 1992., 53, 205214.
82. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах. Канд. дисс. Москва. 2000.
83. Fernandez-Lafiiente R, Rosell CM and Guisan JM, The use of stabilized penicillin acylase derivatives improves the design of kinetically controlled synthesis. J Mol Catal ArChem, 1995, 101, 91-97.
84. Rosell CM, Terreni M, Fernandez-Lafuente R and Guisan JM, A criterion for the selection of monophasic solvents for enzymatic synthesis. Enzyme Microb Technol, 1998,23, 64-69.
85. Park CB, Lee SB and Ryu DDY, Penicillin acylase-catalyzed synthesis of cefazolin in water-solvent mixtures: enhancement effect of ethyl acetate and carbon tetrachloride on the synthetic yield. J Mol Catal B: Enzym, 2000, 9,275-281.
86. Illanes A and Fajardo A, Kinetically controlled synthesis of ampicillin with immobilized penicillin acylase in the presence of organic cosolvents. J Mol Catal B: Enzym, 2001, 11,587-595.
87. Dong-Zhi Wei, Liu Yang, Effects of ethylene glycol on the synthesis of ampicillin using immobilized penicillin G acylase, J Chem Technol Biotechnol, 2003, 78, 431436.
88. Aguirre C, Baeza J and Illanes A, Cosolvent effect on the synthesis of ampicillin and cephalexin with penicillin acylase. Prog Biotechnol, 1998, 15, 95-100.
89. Erarslan A, The effect of polyol compounds on the thermostability of penicillin G acylase from a mutant of Escherichia coli ATCC11105. Proc Biochem, 1995, 30, 133139.
90. Fernandez-Lafuente R, Rosell CM and Guisan JM, The presence of methanol exerts a strong and complex modulation of the synthesis of different antibiotics by immobilized penicillin G acylase. Enzyme Microb Technol, 1998,23, 305-310.
91. Kin M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalyxed synthesis of J3-lactam antibiotics in water-methanol mixtures: effect of cosolvent content and chemical nature of substrate on reaction rates and yields, J. Mol. Catalysis Brenzymatic, 1996, 1,201-211.
92. Kin M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalyxed synthesis pivampicillin: Effect of reaction variables and organic cosolvents, J. Mol. Catalysis B:enzymatic, 1996, 1, 7180.
93. Hewitt L., Kasche V., Lummer K., Lewis R.J., Structure of a slow processing precursor penicillin acylase from E. coli reveals the linker peptide blocking the active-site cleft, J. Mol. Biol., 2000,302, 887-898.
