Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Пеншщллинацилаза из Escherichia coli.

1.1.1. Общие свойства.

1.1.2. Структура активного центра и механизм действия.

1.1.3. Субстратная специфичность и область применения пенициллинацшазы.

1.2. Ферментативный синтез Р-лактамных антибиотиков.

1.2.1. Общие закономерности синтеза.

1.2.2. Методы оптимизации биокаталитического получения ß-лактамных антибиотиков.

1.2.3. Кинетические закономерности и перспективы развития.

1.3. Ферментативные реакции в гетерогенных и твердофазных системах.

1.3.1. Структура и каталитические свойства ферментов в системах с минимальным содержанием воды.

1.3.2. Особенности проведения ферментативных реакций в гетерогенных и твердофазных системах.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Титрование активных центров ПА.

2.2.2. Определение активности пенщшлинацилазы.

2.2.3. Изучение стабильности нативной и иммобилизованной пенициллинацшазы в условиях гетерогенных и твердофазных реакций

2.2.4. Изучение стабилизации нативной и иммобилизованной пенициллинацилазы в твердофазных системах в присутствии кристаллогидратов неорганических солей.

2.2.5.Изучение растворимости компонентов реакции при синтезе ампициллина.

2.2.6. Определение кинетических параметров реакции ферментативного синтеза ампициллина.

2.2.7. Определение нуклеофилъности 6-АПК в реакции синтеза ампициллина.

2.2.8. Исследование влияния уходящей группы донора ацилъной части на нуклеофилъностъ 6-АПК.

2.2.9. Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в гомогенных системах.

2.2.10. Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в гетерогенных системах.

2.2.1 ¡.Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в твердофазных системах.

2.2.12. Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2.2.13. Математическая обработка результатов и моделирование реакций.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Изучение нуклеофилъности 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина.

3.1.1. Установление механизма переноса ацилъной группы на нуклеофил, катализируемого ПА.

3.1.2.Кинетические параметры доноров ацилъной части. Зависимость нуклеофилъности 6-АПК от природы донора.

3.1.3. Изучение рН-зависимости нуклеофилъности 6-АПК.

3.2. Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в гетерогенных и твердофазных системах.

3.2. ¡.Особенностиреакции синтеза ампициллина, катализируемой пенициллинацилазой, в условиях гетерогенных систем вода-осадок реагентов".

3.2.2. Стабильность и каталитические свойства ПА в системах с низким содержанием воды.

3.2.3. Особенности ферментативного синтеза ампициллина в условиях твердофазных систем.

3.3. Анализ кинетической модели ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил.

3.3.1. Зависимость максимального выхода целевого продукта от кинетических параметров реакции.

3.3.2. Разработка кинетической модели ферментативного синтеза ампициллина в различных режимах протекания реакции.

3.4. оптимизация процесса ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой.

Актуальность проблемы. В последние годы наблюдается все возрастающий интерес к применению биокаталитических процессов в органическом синтезе. Уникальная субстратная и стереоспецифичность действия ферментов, возможность проведения реакций в «мягких» условиях без применения агрессивных органических реагентов - все это делает биокаталитические процессы чрезвычайно привлекательными для создания экологически безопасных технологических процессов. Одним из ярких примеров удачного практического применения ферментов является модификация природных [3-лактамных антибиотиков с использованием пенициллинацилазы. В последние двадцать лет в промышленности широко используется процесс биокаталитического гидролиза природных ¡3-лактамных соединений для получения ядер антибиотиков, последующая химическая модификация которых позволяет получать широкий спектр полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов. Полностью биокаталитический синтез Р-лактамных соединений существенно ограничен тем, что до настоящего времени не существует подхода, позволяющего объяснить общие закономерности ферментативного синтеза с переносом ацильной группы и разработать эффективные методы оптимизации технологических процессов.

Целью настоящей работы явилось: изучение закономерностей реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил на примере синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой; исследование реакции ферментативного синтеза ампициллина в различных системах, включая гетерогенные системы «вода-осадок реагентов» и твердофазные смеси; создание математической модели, адекватно описывающей процесс ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК, в различных режимах протекания реакции, в том числе в гетерогенных системах; разработка общих критериев оптимизации процесса ферментативного синтеза (3-лактамных антибиотиков и проведение оптимизации синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые: было показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина протекает через стадию образования ацилфермент-нуклеофильного комплекса; установлено, что природа уходящей группы субстрата не влияет на соотношение начальных скоростей синтеза и гидролиза при проведении реакции ферментативного синтеза ампициллина; найдены экспериментальные значения параметров, определяющих эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6-АПК; изучена рН-зависимость нуклеофильности 6-АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, предложены кинетические механизмы протекания реакции, позволяющие с хорошей точностью описать экспериментальные данные, а также сделать обоснованные предположения о причинах зависимости нуклеофильности 6-АПК от значения рН реакционной среды; предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения р-лактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных системах; показана способность нативной и иммобилизованной пенициллинацилазы проявлять каталитическую активность в системах с низким содержанием воды, вплоть до твердофазных смесей; разработан метод стабилизации препаратов фермента в системах с низким содержанием воды при помощи кристаллогидратов неорганических солей; разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза (3-лактамных антибиотиков.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза антибиотиков пенициллинового ряда. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез ампициллина с выходами, превышающими имеющиеся до сих пор в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологическом процессе биокаталитического получения ампициллина.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пенициллинацилаза из Escherichia coli

1.1.1. Общие свойства

Пенициллинацилаза относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз (КФ 3.5.1.11). В настоящее время установлено /1, 2, 3/, что пенициллинацилаза имеет гетеродимерную структуру и состоит из двух субъединиц (а и 3-субъединицы) различной молекулярной массы (20500 и 69000 Da, соответственно). Данные по исследованию субъединичного состава родственных пенициллинацилаз из Kluyivera citrophila /4, 5/, Proteus rettgeri 161 и Alcaligenes faecalis 111 позволяют утверждать, что все эти ферменты имеют аналогичное строение.

Пенициллинацилаза относится к немногочисленной группе белков, субъединицы которых формируются из общего полипептида-предшественника в процессе посттрансляционного созревания. Механизм процессинга пенициллинацилазы включает в себя несколько стадий /8, 9/. Вначале синтезируется предшественник - полипептид молекулярной массы 98 кОа, в структуру которого входят: сигнальный пептид, а-субъединица, эндопептид и Р-субъединица. Сигнальный пептид служит для переноса через цитоплазматическую мембрану, после чего он отщепляется и происходит расщепление предшественника на а и (3-субъединицы. Каталитически активная конформация фермента образуется в результате сворачивания субъединиц в гетеродимерную структуру /10, 11, 12/, причем центр связывания субстрата находится на Р-субъединице, тогда как а-субъединица отвечает, по всей видимости, за формирование субстратной специфичности фермента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определены кинетические параметры ферментативного гидролиза ряда субстратов, являющихся потенциальными донорами ацильной части при биокаталитическом получении (3-лактамных антибиотиков, катализируемом пенициллинацилазой. Установлено, что природа уходящей группы субстрата не влияет на эффективность переноса ацильной группы на ядро антибиотика.

2. Детально изучены кинетические закономерности реакции ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. Анализ зависимости нуклеофильности 6-АПК от ее концентрации позволяет утверждать, что реакция протекает с образованием ацилфермент-нуклеофильного комплекса.

3. Изучена рН-зависимость параметров, определяющих нуклеофильность 6-АПК. Предложены кинетические механизмы протекания реакции, позволяющие с хорошей точностью описать экспериментальные данные, а также сделать обоснованные предположения о причинах зависимости реакционной способности 6-АПК от значения рН реакционной среды.

4. Показана способность нативной и иммобилизованной пенициллинацилазы проявлять каталитическую активность в системах с низким содержанием воды, вплоть до твердофазных смесей. Разработан метод стабилизации препаратов фермента при помощи кристаллогидратов неорганических солей, позволяющий сохранять практически полную каталитическую активность в системах, где содержание воды не превышает 5% (вес.). С использованием данного метода впервые осуществлен твердофазный ферментативный синтез ампициллина.

5. Проведен кинетический анализ закономерностей процесса ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. Показано, что максимальный выход целевого антибиотика зависит только от нуклеофильности 6-АПК, соотношения реакционной способности фермента по отношению к целевому продукту и донору ацильной части, и начальных концентраций реагентов. Разработаны методы, позволяющие a priori оценить эффективность синтеза на основании имеющихся экспериментальных данных.

6. Разработан алгоритм моделирования процесса ферментативного синтеза, позволяющий описать закономерности протекания реакции не только в гомогенных, но и гетерогенных системах «вода - осадок реагентов». Показано, что проведение реакции в таких условиях позволяет существенно повысить эффективность синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой.

7. Проведена оптимизация процесса ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой. Предложены два принципиально новых метода проведения реакции, позволяющие получать целевой антибиотик с очень высоким выходом (более 97% по 6-АПК, более 70% по донору ацильной части). Показано, что при использовании полунепрерывного режима проведения реакции эффективность синтеза может быть увеличена до практически количественного выхода по 6-АПК и 85% по донору ацильной части.

1. Kutzbach, С., and Rauenbusch, Е., Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1974, 354,45-53.

2. Bock, A., Wirth, R., Schumacher, G., Lang and P. Buckel. G., The penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105 consists of two dissimilar subunits, FEMS Microb. Lett., 1983, 20, 135-139.

3. Oh S.-J., Kim Y.-Ch., Park Y.-WMin S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression inE.coli. Gene. 1987, 56, 87-97.

4. Shimizu, M., Okachi, R., and Nara, Т., Enzymic synthesis of cephalosporins. III. Purification and properties of penicillin acylase from Kluyvera citrophila, Agric. Biol. Chem., 1975, 39, 1655-1661.

5. Barbero, J. L., Buesa, J. M., de Buitrago. G. G., Mendez, E., Perez-Aranda, A., and Garcia, J. L., Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. Gene. 1986, 49, 69-80.

6. Daumy, G. O., Danley, D., McColl, A. S., Apostolakos, D., and Vinick, F. J., Experimental evolution of penicillin G acylases from Escherichia coli and Proteus rettgeri, J. Bacteriol., 1985, 163, 925-932.

7. Sizmann, D., Keilmann, C., and Bock. A., Primary structure requirements for the in vivo maturation of penicillin acylase from E. coli ATCC 11105, Eur. J. Biochem., 1990, 192, 143-150.

8. Кочеткова, E. Ф., Бартошевич, Ю. Э., Романова H. Б., Биосинтез пенициллинацилаз, Антибиотики, 1986, 31, 729-740.

9. Daumy, G. О., Danley, D., McColl. A. S., Role of Protein Subunits in Proteus rettgeri Penicillin G Acylase, J. Bacteriol., 1985, 163, 3, 1279-1281.

10. Lindsay С. D., and Pain R. G., The folding and solution conformation of penicillin G acylase, Eur. J. Biochem., 1990, 192, 133-141.

11. Lindsay C. D., and Pain R. G., Refolding and assembly of penicillin acylase, an ezyme composed of two polypeptide chains that result from proteolytic activation, Biochemistry, 1991, 30, 9034-9040.

12. Duggleby, H. J., Tolley, S. P., Hill, C. P., Dodson, E. J., Dodson, G., and Moody, P. C. E., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995, 373, 264-268.

13. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P.C.E. and Hubbard R.E. Ligand-induced conformational change in penicillin acylase. J. Mol. Biol. 1998, 284, 463-475.

14. Brannigan, J., Dodson, G., Duggleby, H. .J., Moody, P. С. E., Smith, J. L., Tomchick D. R., and Murzin. A. G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation, Nature, 1995, 378, 416-419.

15. Sakaguchi, K., and Murao, S. A new enzyme, penicillin-amidase. Preliminaries, J. Agr. Chem. Soc. Japan, 1950, 23, 411-414.

16. Huang, H. Т., Seto, T. A., and Shull, G. M., Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Applied. Microbiol. 1963, 11, 1-6.

17. Cole, M., Properties of penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli, Nature, 1964, 203, 4944, 519-520.

18. Daumy G.O., Danley D., McColl A.S., Apostolakos D. and Vinick F.J. Experimental evolution of penicillin G acylases from E.coli and Proteus rettgeri. J. Bacterid. 1985, 163(3), 925-932.

19. Van der Mey, M., and de Vroom, E., Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase, Bioorgan. Med. Chem. Lett., 1994, 4(2), 345-348.

20. Клесов А.А., Галаев И.Ю., Швядас В.К. Изучение топографии активного центра пенициллинамидазы из E.coli. 1. Кинетический анализ. Биоорг. химия. 1977, 3(5), 663-672.

21. Клесов, А. А., Швядас, В. К., Галаев, И. Ю., Изучение топографии активного центра пенициллинамидазы из Е. coli. П. Роль гидрофобных взаимодействий в специфичности ингибирования фермента, Биоорган, химия, 1977, 3, 800-805.

22. Швядас, В. К., Кинетика и механизм действия пенициллинамидазы, Дисс. канд. хим. наук. М., МГУ, 1976.

23. Швядас, В. К., Галаев, И. Ю., Березин, И. В., Оценка пределов энантиоселективности действия ферментов в реакциях превращения аминокислот и их производных, Биохимия, 1986, 51, 1490-1495.

24. Svedas, V. К., Savchenko, М. V., Beltser, A. I., and Guranda, D. F., Enantioselective Penicillin Acylase catalyzed Reactions. Factors Governing Substrate and Stereospecificity of the Enzyme, Ann. N. Y.Acad. Sci., 1996, 799, 659-669.

25. Waldmann, H., and Sebastian, D., Enzymatic protecting group techniques, Chem. Rev., 1994, 94., 911-937.

26. Waldmann H. The phenylacetyl group as enzymatically removable protecting function for peptides and carbohydrates: selective deprotection with penicillin acylase. Liebig's Annalen der Chemie. 1988, 12, 1175-1180.

27. Didziapetris, R., Drabnig, В., Schellenberger, V., Jakubke H.-D., and Svedas, V. Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis, FEBS Lett., 1991, 287, 31-33.

28. Waldmann H., Heuser A., Reidel A. Selective enzymatic deprotection of hydroxy- and amino groups in carbohydrates and nucleosides. Synlett. 1994, January, 65-67.

29. Fuganti, С. Rosell, С. М., Servi, S., Tagliani, A., and Terreni, М., Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate esters, Tetrahedron: Asymmetry, 1992, 3(3), 383-386.

30. Soloshonok, V.A., Kirilenko, A. G., Fokina, N. A., Shishkina, I. P., Galushko, S. V., Kukhar, V. P., Svedas, V. K., and Kozlova, E. V., Biocatalytic resolution of (3-fluoroalkyl-p-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry, 1994, 5 (6), 1119-1126.

31. Soloshonok V.A., Fokina N.A., Rybakova A.V., Shishkina I.P., Galushko S.V., Sorochinsky A.E. and Kukhar V.P. Biocatalytic approach to enantiomerically pure P-amino acids. Tetrahedron: Asymmetry. 1995, 6(7), 1601-1610.

32. Justiz, О. Н., Fernandez-Lafuente, R., and Guisan, J.M., One-spot chemoenzymatic synthesis of З'-functionalized сер halo sporines (cephazolin) by three consecutive biotransformations in fully aqueous medium, J.Org.Chem., 1997, 62, 9099-9106.

33. Alfani, F., Cantarella, M., Cutarella, N., Gallifuoko, A., Golini, P., Bianchi, D., Biotechnol. Lett., 1997, 19, 175.

34. Kaufmann, W., and Bauer, K., Enzymati sehe Spaltung und resynthese von penicillin, Naturwiss., I960, 47, 474-475.

35. Cole, M., Penicillins and other aeylamino compounds synthesized by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 1969, 115, 747-756.

36. Marconi, W., Bartoli, F., Cecere, F., Galli, G., and Morisi, F., Synthesis of penicillins and cephalosporins by penicillin acylase entrapped in fibres, Agr. Biol. Chem., 1975, 39, 277-279.

37. Margolin, A. L., Svedas, V. K, and Berezin, I. V., Substrate specificity of penicillin amidase from^. coli, Biochim. Biophys. Acta., 1980, 616, 283-289.

38. Stambolieva, N., Mincheva, Z., Galunsky, В., and Kalcheva, V., Penicillin amidase-catalyzed transfer of low specific acyl moiety. Synthesis of 7-benzoxazolonylacetamido desacetoxycephalosporanic acid, Enzyme Microb. Technol., 1992, 14, 496-500.

39. Svedas, V. K., Margolin, A. L., and Berezin, I. V., Enzymatic synthesis of ß-lactam antibiotics: A thermodynamic background, Enzyme. Microb. Technol., 1980, 2, 138-144.

40. Березин, И. В., Клесов, А. А., Марголин, А. Л., Ныс, П. С., Савицкая, Е. М., Швядас, В. К., Изучение пенициллинамидазы из E.coli, pH-зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина, Антибиотики, 1976, 21, 5, 411-415.

41. Березин, И.В., Марголин, A.JL, Швядас, В.К., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазой, Докл. АН СССР, 1977, 235, 961-964.

42. Diender, М. В., Straathof, A. J. J., van der Wielen, L. A. M., Ras, С., Heijen, J. J., Feasibility of the thermodynamically controlled synthesis of amoxicillin, J. Mol. Catal. B: Enzymol., 1998, 5, 249-253.

43. Семенов, А.Н. Мартинек, К., Швядас, В.К., Марголин, A.JI, Березин, И.В, Ферментативный синтез бензилпенициллина в двухфазной водноорганической системе, Докл. АН СССР, 1981, 258(5), 1124-1126.

44. Fernandez-Lafuente, R., Rossel, С. М., Guisan, J. М., Enzyme reaction engineering: synthesis of antibiotics catalysed by penicillin G acylase in the presence of organic cosolvents, Enzyme Microb. Techno!., 1991, 13, 898-905.

45. Fernandez-Lafuente, R., Alvaro, G., Blanco, R. M., and Guisan, J. M., Equilibrium controlled synthesis of cephalothin in cosolvent water systems by stabilized penicillin G acylase, Appl. Biochem. Biotechnol., 1991, 27, 277-290.

46. Fernandez-Lafuente, R. Rossel, С. M., Piatkowska, В., and Guisan, J. M., Synthesis of antibiotics (cephaloglycin) catalysed by penicillin G acylase: evaluation and optimization of different synthetic approaches, Enzyme Microb. Technol., 1996, 19, 9-14.

47. Svedas, V. K., Margolin, A. L., Borisov, I. L., and Berezin, I. V., Kinetics of enzymatic synthesis of benzylpenicillin, Enzyme Microb. Technol., 1980, 2, 313-317.

48. Березин, И.В., Клесов, A.A., Швядас, В.К., Ныс, П.С., Савицкая, Е.М., Кинетика гидролиза бензилпенициллина, катализируемого пенициллинацилазой, Антибиотики, 1974, 19(10), 880-887.

49. Bruggink, A., Roos, Е. С., de Vroom, Е., Penicillin acylase in the industrial production of P-lactam antibiotics, Org. Process Res. Dev., 1998, 2, 128-133.

50. Takanashi, Т., Yamazaki, Y, Kato, K., and Isono, M., Enzymatic synthesis of cephalosporins, J. Am. Chem. Soc., 1972, 94, 4035-4037.

51. Kato, H., Kawahara, K., Takahashi, Т., Kakinuma, A., Substrate specificity of a-amino acid ester hydrolase fromX. citri, Agric. Biol. Chem., 1980, 44, 1075-1081.

52. Penzikova, G. A., Oreshina, M. G., Kuznetsov, V. D., Singal, E. M., Levitov, M. M., and Bartoshevich, Yu. E., Acylase activity of groups of actinomycetes and bacteria, Antibiotiki, 1980, 25, 905-909.

53. Blinkovsky, A. M., Markaryan, A. N., Synthesis of P-lactam antibiotics containing a-aminophenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-P-lactamide amidohydrolase, Enzyme Microb. Technol.,1993, 15, 965-973.

54. Блинковский, A.M., Кинетика действия 0-(-)-фенилглицил-(3-лактамид-амидогидролазы в реакциях синтеза Р-лактамных антибиотиков, Дисс. канд. хим. наук. М., МГУ, 1984.

55. Kim, D. J., Byun, S. M., Purification and properties of ampicillin acylase from Pseudomonas melanogenum, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1040, 12-18.

56. Maladkar, N. K., Enzymatic production of cephalexin, Enzyme Microb. Technol., 1994, 16, 715-718.

57. Fernandez-Lafuente, R., Rossel, С. M., Guisan, J. M., The use of stabilized penicillin acylase derivatives improves the design of kinetically controlled synthesis, J. Mol. Catal. A: Chemical, 1995, 101, 91-97.

58. Koteva, K. P., Ganchev, K. D., Factors affecting the synthesis of penicillins by immobilized penicillin acylase fromis. со//, Acta Biotechnol., 1994, 1, 37-43.

59. Alvaro, G., Fernandez-Lafuente, R., Blanko, R. M., Guisan, G. M., Immobilization-stabilization of penicillin G acylase from E. coli, Appl. Biochem. Biotechnol., 1991, 26, 181-196.

60. Cole, M., Factors affecting the synthesis of ampicillin and hydroxypenicillins by the cell-bound penicillin acylase of E. coli, Biochem. J., 1969, 115, 757-764.

61. Ospina, S., Barzana, E., Ramirez, О. Т., Lopez-Munquia, A., Effect of pH in the synthesis of ampicillin by penicillin acylase, Enzyme Microb. Technol., 1996, 19, 462-469.

62. Shuster, M., Aaviksaar, A., and Jakubke, H.-D., Enzyme-catalyzed peptide synthesis in ice, Tetrahedron, 1990, 46(24), 8093-8102.

63. Langen, L. M., de Vroom, E., van Rantwijk, F., Sheldon, R., Enzymatic synthesis of P-lactam antibiotics using penicillin-G acylase in frozen media, FEBS Lett., 1999, 456, 8992.

64. Kasche, V., Ampicillin and cephalexin synthesis catalyzed by E. coli penicillin acylase. Yield increase due to substrate recycling, Biotechnol. Lett., 1985, 7, 877-882.

65. Hyun, C. K., Ghoi, J. H., Kim, J. H., and Ryu, D. D. Y, Enhancement effect of polyethylene glycol on enzymatic synthesis of cephalexin, Biotechnol. Bioeng., 1992, 41,654-658.

66. Andersson, E., and Hahn-Hagerdal, B., Enzyme action in polymer and salt solutions. I. Stability of penicillin acylase in polyethylene glycol and potassium phosphate solutions in relation to water activity, Biochim. Biophys. Acta, 1987, 912, 317-324.

67. Reslow, M., Aldercreutz, P., and Mattiasson, B., Modification of the microenviroment of enzymes in organic solvents. Subtitution of water by polar solvents, Biocatalysis, 1992, 6, 307-318.

68. Fernandez-Lafuente, R., Rossel, C. M., Guisan, J. M., The presence of methanol exerts a strong and complex modulation of the synthesis of different antibiotics by immobilized penicillin G acylase, Enzyme Microb. Technol., 1998, 23, 305-310.

69. Kim M. G., Lee S. B., Effect of organic solvents on penicillin acylase-catalyzed reactions: Interaction of organic solvents with enzymes, J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 1996, 1, 181-190.

70. Kim M. G., Lee S. B., Penicillin acylase-catalyzed synthesis of pivampicillin: Effect of reaction variables and organic cosolvents, J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 1996, 1, 71-80.

71. Diender, M. B., Straathof, A. J. J., Heijnen, J. J., Predicting enzyme catalyzed reaction equilibria in cosolvent-water mixtures as a function of pH and solvent composition, Biocatal. Biotransform., 1998, 16, 275-289.

72. Hyun, C. K., Kim, J. H., and Kim, Y. J., Effect of water activity on enzymatic synthesis of cephalexin, Biotechnol. Lett., 1989, 11, 537-540.

73. Hyun, C. K., Kim, J. H., and Ryu, D. D. Y., Enhancement effect of water activity on enzymatic synthesis of cephalexin, Biotechnol. Bioeng., 1993, 42, 800-806.

74. Ebert, C., Gardossi, L., Linda, P., Activity of immobilized penicillin amidase in toluene at controlled water activity, J. Mol. Catal. B: Enzymol., 1998, 5, 241-244.

75. Konechny, J., Sieber, M., Schneider, A., Biotechnol. Lett., 1981, 3, 507-512.

76. Kasche, V., Haufler., U., Zollner, R., Kinetic studies on the mechanism of the penicillin amidase-catalysed synthesis of ampicillin and benzylpenicillin, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1984, 365, 1435-1443.

77. Okachi, R., Hashimoto, Y., Kawamori, M., Katsumata, R., Takayama, K., and Nara, Т., Enzymatic synthesis of penicillins and cephalosporins by penicillin acylase, Enzyme Eng., 1982, 6, 81-90.

78. Nara, Т., Okachi, R., Misawa, M., Enzymatic synthesis of D(-)-alpha-aminobenzylpenicillin by Kluyvera citrophila, J. Antibiot., 1971, 24, 321-323.

79. Takahashi, Т., Kato, K., Yamazaki, Y., Isono, M., Synthesis of cephalosporins and penicillins by enzymatic acylation, Jpn. J. Antibiot., 1977, 30, S230-S238.

80. Zerner, В., and Bender, M. L., The kinetic consequences of the acyl-enzyme mechanism for the reactions of spesific substrates with chymotrypsin, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3669-3673.

81. Bender, M.L., Clement, G.E., Gunter, C.R, and Kezdy, F., The kinetics of a-chymotrypsin reactions in the presence of added nucleophiles, J.Am.Chem.Soc., 1964, 86, 3697-3703.

82. Brubacher, L. J., and Bender, M. L., J.Am.Chem.Soc., 1966, 88, 5871-5880.

83. Fink, A. L, and Bender, M. L., Binding sites for substrate leaving groups and added nucleophiles in papain-catalysed hydrolyses, Biochemistry, 1969, 8(12), 5109-5118.

84. Seydoux, F., Yon, J., Nucleophilic competition in enzymic hydrolytic reactions. Kinetic analysis and application to the tryptic hydrolysis of some esters, Europ. J. Biochem., 1967, 3, 42-56.

85. Seydoux, F., Yon, J., Nemethy, G., Hydrophobic interactions of some alcohols with acyl trypsins, Biochim. Biophys. Acta, 1969, 171, 145-156.

86. Швядас, В. К., Марголин, А. Л., Шерстюк. С. Ф., Березин. И. В., Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонилфторида: кинетический анализ и титрование активных центров, Биоорган, химия, 1977, 3, 546553.

87. Клесов, А. А., Марголин, А. Л, Швядас, В. К., Перенос ацильной группы на 6-аминопенициллановую кислоту, катализируемый пенициллинацилазой. Кинетическое рассмотрение, Биоорг. химия, 1977, 5, 654-661.

88. Kato, К., Kinetics of acyl transfer by a-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri, Agric. Biol. Chem., 1980, 44, 1083-1088.

89. Konecny, J., Schneider, A., and Sieber, M., Kinetics and mechanism of acyl transfer by penicillin acylases, Biotechnol. Bioeng., 1983, 25, 451-467.

90. Nam, D. H., Kim, C., and Ryu, D. D. Y., Reaction kinetics of cephalexin synthesizing enzyme from Xanthomonas citri, Biotechnol. Bioeng., 1985, 27, 953-960.

91. Riechmann, L., and Kasche, V., Peptide synthesis catalyzed by serine proteinases chymotrypsin and trypsin, Biochim. Biophys. Acta, 1985, 830, 164-172.

92. Kasche V. Review. Mechanism and yields in enzyme catalysed equilibrium and kinetically controlled synthesis of p-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol. 1986, 8, 4-16.

93. Stambolieva, N., Mincheva, Z., and Galunsky, В., Kinetic comparison of penicillin amidase catalyzed transfer of nonspecific and specific acyl moieties to 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid, Biocatal. Biotransform., 1998, 16, 225-232.

94. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., Belikov, V. M., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming acyl-enzyme intermediate: Kinetic model analysis, Biotechnol. Bioeng., 1988, 32, 866-872.

95. Gololobov, M. Yu., Borisov, I. L., and Svedas, V. K., Acyl group transfer by proteases forming an acylenzyme intermediate: Kinetic model analysis (Including hydrolysis of acylenzyme-nucleophile complex), J. Theor. Biol., 1989, 140, 193-204.

96. Гололобов, M. Ю., Борисов, И. Л., Швядас, В. К., Пептидный синтез, катализируемый протеазами. Анализ кинетической модели для ферментов, действующих по ацилферментному механизму, Биохимия, 1987, 52, 584-591.

97. Gololobov, М. Yu., Petrauskas, A., Pauliukonis, R., Koschke, V., Borisov, I. L., and Svedas, V., Increased nucleophile reactivity of amino acid P-naphthylamides in a-chymotrypsin-catalyzed peptide synthesis, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1041, 71-78.

98. Юшко, М.И., Изучение твердофазного ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, дипломная работа, кафедра химической энзимологии, Москва, 1995.

99. Burke, P. A., Griffin, R. G., Klibanov, А. М., Solid-state NMR asessment of enzyme active center structure under nonaqueous conditions, J. Biol. Chem., 1992, 267, 2005720064.

100. Fitzpatrick, P. A., Steinmetz, A. C. U., Ringe, D., and Klibanov, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 8653-8657.

101. Gorman, L. A. S., Dordick, J. S., Organic solvents strip water off enzymes, Biotechnol. Bioeng., 1992, 39, 392-398.

102. Schmitke J. L., Stern L. J., Klibanov A. M., The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 4250-4255.

103. Parker, M. C., Moore, B. D., and Blacker, A. J., Measuring enzyme hydration in nonpolar organic solvents using NMR, Biotechnol. Bioeng., 1995, 46, 452-458.

104. Lee, S. В., Kim, K. J., Effect of water activity on enzyme hydration and enzyme reaction rate in organic solvents, J. Ferment. Biotechnol., 1995, 79, 473-478.

105. Zaks, A., and Klibanov, A. M., The effect of water on enzyme action in organic media, J. Biol. Chem., 1988, 263, 8017-8021.

106. Yamane, Т., Kojima, Y., Ichiryu, Т., and Shimizu, S., Biocatalysis in microaqueous organic solvent, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1988, 542, 282-293

107. Klibanov AM., Why are enzymes less active in organic solvents than in water?, Trends Biotechnol., 1997, 15, 97-101.

108. Ghatorae, A. S., Guerra, M. J., Bell, G., and Hailing, P. J., Immiscible organic solvent inactivation of urease, chymotrypsin, lipase, and ribonuclease: separation of dissolved solvent and interfacial effects, Biotechnol. Bioeng., 1994, 44, 1355-1361.

109. Klibanov, A. M., Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents, Trends Biochem Sci., 1989,14, 141-144.

110. Хургин, Ю. И., Росляков, В. Я., Клячко-Гурвич, А. Л., и Бруева, Т. Р., Адсорбция паров воды а-химотрипсином и лизоцимом, Биохимия, 1972, 37, 485-492.

111. Росляков, В. Я., и Хургин, Ю. И., Изучение твердофазного гидролиза циннамоил-а-химотрипсина, Биохимия, 1972, 37, 493-497.

112. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Protease-catalysed synthesis of oligopeptides in heterogeneous substrate mixtures, Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 10241030.

113. Lopez-Fandino, R., Gill, I., Vulfson, E. N., Enzymatic catalysis in heterogeneous mixtures of substrates: the role of the liquid phase and the effects of "adjuvants", Biotechnol. Bioeng., 1994, 43, 1016-1023.

114. Gill, I., and Vulfson, E., Enzymic catalysis in heterogeneous eutectic mixtures of substrates, Tibtech., 1994, 12, 118-122.

115. Kasche, V., and Galunsky, В., Enzyme catalyzed Biotransformations in aqueous two-phase systems with precipitated substrate and/or product, Biotechnol. Bioeng., 1995, 45, 261-167.

116. Ergan, F., Trani, M., and Andre, G., Solvent free triglyceride synthesis using lipozime™ EM-20, Biotechnol. Lett., 1988, 9, 629-634.

117. Fonteyn, F., Blecker, C., Lognay, G., Marlier, M., Severin, M., Optimization of lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in solvent-free medium, Biotechnol. Lett., 1994, 16, 693-696.

118. Firooze Parvaresh, Herve Robert, Daniel Thomas, and Marie-Dominique Legoy, Gas phase transesterification reactions catalyzed by lypolytic enzymes, Biotechnol. Bioeng., 1992, 39, 467-473.

119. Хургин, Ю. И., Медведева, H. В., Росляков, В. Я., Изучение твердофазных ферментативных реакций. П. Химотрипсиновый гидролиз n-нитроанидида N-сукцинил-Е-фенилаланина, Биофизика, 1977, 22, 1010-1014.

120. Хургин, Ю. И., Максарева, Е. Ю., Изучение твердофазных ферментативных реакций. III. Необратимая инактивация а-химотрипсина бензилсульфонил фторидом, Биоорг. химия, 1991, 17, 76-80.

121. Хургин, Ю. И., Максарева, Е. Ю., Твердофазные ферментативные реакции. IV. Гидролиз Р-индол ил акр илоил-а-химотрипсина, Биоорг. Химия, 1993, 19, 961-966.

122. Максарева, Е. Ю., Хургин, Ю. И., Твердофазные ферментативные реакции. V. Сравнение каталитических свойств субтилизина и а-химотрипсина в отсутствие растворителя, Биоорг. химия, 1995, 21, 24-27.

123. Cerovsky, V., Peptide synthesis in solid state systems, Biotechnol. techniques, 1992, 6, 155-160.

124. Клесов, A.A., Андреев, B.M., Березин, И.В., Влияние промоторирования на кинетику сольволиза ацетил-а-химотрипсина под действием дополнительных нуклеофильных агентов, Биохимия, 1974, 39, 1222-1230.

125. Svedas, V., Guranda, D., van Langen, L., van Rantwijk, F., Sheldon, R., Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis, FEBS Lett., 1997, 417, 414-418.

126. Kaasgaard SG, Veitland U. 1996. Process for preparation of p-lactams utilizing a combined concentration of acylating agent plus P-lactam derivative of at least 400 mM. US 5,525,483.

127. Moody HM, Boesten WHJ. 1998. Process for preparation of ampicillin. WQ98/56946.