Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans

Бабкина, Елена Евгеньевна

Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Бабкина, Елена Евгеньевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Тула МЕСТО ЗАЩИТЫ

2006 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans»

Автореферат диссертации на тему "Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans"

На правах рукописи

Бабкина Елена Евгеньевна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МЕДИАТОРНЫХ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ ЫиСОХОВАСТЕК ОХ\ЪЛ№

02.00.04 - физическая химия 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Тула-2006

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Ковсман Евгений Павлович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Зякун Анатолий Маркович

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН .

Защита диссертации состоится 27 декабря 2006 г. в 14— часов на заседании диссертационного совета КМ 212.271.03 в ауд. 103 9-го учебного корпуса Тульского государственного университета по адресу: 300600, Тула, пр. Ленина, 92.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тульского государственного университета.

Автореферат разослан 24 ноября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета КМ 212.271.03

кандидат химических наук

Людмила Дмитриевна Асулян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биосенсоры — аналитические приборы нового поколения, совмещающие в себе идеи и достижения современной биотехнологии, физико-химических методов анализа, электронных технологий. Большинство коммерческих биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат ферменты в качестве биорецепторного элемента.

Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод — медиаторов электронного транспорта.

Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, но и с ферментами в составе бактерий. Использование целых клеток вместо ферментов в биорецепторных элементах имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментов; биосенсоры на основе целых клеток (в частности, бактерий) обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при определении суммарного содержания органических соединений (определения БПК сточных вод или суммарного содержания углеводов и спиртов в ферментационных средах); биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.

Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Для детекции легкоутилизируем ых углеводов и спиртов перспективными могут стать медиаторные биосенсоры на основе бактерий Gluconobacier oxydans, содержащих мембранлокализованные ферменты.

Электрокаталитическое окисление субстратов бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта мало изучено. Представляется актуальным исследование кинетических особенностей электрокаталитического окисления легкоутилизируемых субстратов бактериями Gluconobacier oxydans в присутствии медиаторов электронного переноса для разработки принципов создания микробных медиаторных биосенсоров.

Цель работы. Выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacier oxydans и применение этих закономерностей для разработки макета биосенсора.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Исследование возможности применения соединений различного строения, обладающих обратимыми окислительно-восстановительными свойствами, в качестве медиаторов в биосенсорах на основе целых клеток микроорганизмов G. oxydans.

2. Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных электродах.

3. Сравнение эффективности медиаторов электронного транспорта в биосенсорных системах на основе иммобилизованных бактерий G. oxydans.

4. Создание лабораторного макета амперометрического медиаторного биосенсора на основе бактерий G. oxydans. Определение рабочих параметров функционирования (рН, концентрация солей, концентрация медиатора, масса клеток на электроде) микробных биосеснсоров на основе G. oxydans и различных медиаторов переноса электронов.

5. Применение разработанного макета биосенсора для экспресс-определения БПК.

Научная новизна. Получены новые данные о возможности переноса заряда в системах «иммобилизованные бактерии G. oxydans - ферроцены и хиноны». Впервые показана возможность электрокаталитического окисления глюкозы целыми клетками G. oxydans на электродах, модифицированных ацетил ферроценом, ферроценкарбальдегидом, 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном. Предложено использовать такие системы как основу для создания безреагентных микробных биосенсоров.

Моделирование процессов, протекающих в рецепторном элементе микробного медиаторного биосенсора, позволило идентифицировать скоростьопреде-ляющую стадию биоэлектрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными на поверхности графитовых электродов бактериями G.oxydans при участии медиаторов электронного транспорта. На основе анализа процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах, в рамках механизма «пинг-понг» получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.

Выявлен эффект изменения субстратной специфичности бактерий G. oxydans при электрокаталитическом окислении углеводов и спиртов в присутствии искусственных (медиаторов) и естественного (кислорода) акцепторов электронов, который имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.

Результаты создают основы формирующегося в настоящее время нового направления медиаторных клеточных электродов и открывают новые перспективы для создания микробных биосенсоров.

Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans могут быть использованы в качестве научной основы при разработке биосенсоров на основе других микроорганизмов для детекции различных соединений.

Разработан действующий макет безреагентного амперометрического микробного медиаторного биосенсора для определения БПК, который может служить прототипом опытного образца прибора для серийного освоения.

Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -Наука XXI века» (г. Пущино Московской области) в 2002-2006 гг.; VIII Международном конгрессе по биосенсорам, 24 - 26 мая 2004 г. (г. Гранада, Испания); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) 12-15 апреля 2005 г., Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006», 25-30 июня 2006 (г. Москва), IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», 11 — 16 сентября 2006 г. (г. Томск). Исследо-

вание поддержано грантом РФФИ «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (№ 01-04-96023). По теме диссертации опубликовано 6 статей и 10 сообщений в тезисной форме.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит 50 рисунков и S таблиц. Список литературы включает 9 b источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Глава 1, Во введении кратко сформулированы цели и задачи работы. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области медиаторных микробных биосенсоров, а также кратко изложены особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans.

Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования. В работе использовали штамм Gluconobacter oxydans sbsp. industrius VKM В-1280, полученный из рабочей коллекции лаборатории биосенсоров ИБФМ РАН. В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, основанный на компьютерной обработке сигналов и позволяющий производить высокоточные измерения в на-ноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы. В исследовании применяли технику регистрации окислительных процессов с помощью медиаторных электродов, которую предложено использовать для изучения свойств иммобилизованных микробных клеток, а также ферментных систем in vivo в условиях электрокаталитического окисления субстратов. Электрохимические измерения проводили с помощью полярографической установки «1РС2000» («Кронас», Россия), интегрированной с ПК. Ток регистрировали в интервале 1 нА - 1 мА. Регистрацию вольтамперограмм проводили в трехэлектродной системе. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод с иммобилизованными клетками микроорганизмов, вспомогательным — платиновый электрод. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgCl), относительно которого представлены все значения потенциалов. Амперометрические измерения проводили в двухэлек-тродной ячейке при постоянном потенциале в цитратно-фосфатном буфере при температуре 22°С. В качестве рабочего электрода использовали угольно-пастовый электрод с иммобилизованными бактериями. Для прочной иммобилизации клеток на поверхности электрода с помощью пластикового кольца закрепляли диализную мембрану. Растворимые медиаторы вводили в буферный раствор; при использовании иммобилизованных медиаторов, их добавляли в состав угольной пасты, из которой формировали рабочий электрод. Обработку данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 8.0». Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

3.1. Оценка возможности использования некоторых соединений как медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий G. oxydans Известно, что при биоэлектрокаталитическом окислении углеводов и спиртов бактериями G. oxydans можно использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ), w-бензохинон (БХ), гексацианоферрат (III) калия (ГЦФ) в качестве медиаторов переноса электронов. Все эти соединения хорошо растворимы в воде и применяются в биосенсорных системах в составе рабочих растворов. Для создания безреагентных биосенсорных систем необходим поиск новых медиаторов электронного транспорта, нерастворимых в водных средах, но способных взаимодействовать с активными центрами ферментов бактерий.

Перспективными классами соединений, применяемыми в качестве медиаторов в биосенсорах на основе ферментов являются ферроцены и хиноны. Возможность использования таких соединений в биосенсорах на основе целых клеток только изучается.

Методом циклической вольтамперометрии была исследована возможность переноса заряда в системах «графитовые электроды, модифицированные 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном, 1,2-нафтохиноном, ферроценом, 1,Г-диметилферроценом, ацетилферроценом, ферроценкарбальдегидом -иммобилизованные бактерии G. oxydans».

Рост анодного пика на циклической вольтаперограмме в присутствии биокатализатора и субстрата (рис. 1), соответствует протеканию в системе электрокаталитического процесса, и служит критерием, показывающим принципиальную возможность использования исследуемого соединения в качестве медиатора в биосенсорах на основе бактерий G. oxydans.

SO 40 30 20 3 10

о -10 -20 -30

0 200 400 600 800 Е, мВ

Рис. 1. Вольтамперные зависимости (10 мВ/с): а - модифицированного ферроценом графитового электрода; б - модифицированного ферроценом графитового электрода с иммобилизованными бактериями G. oxydans при добавлении в измерительную кювету глюкозы (50 ммоль/л).

Установлена возможность использования в качестве медиаторов в биосенсорах на основе G. oxydans ферроцена, 1,1'-диметилферроцена, ацетилферроцена, ферроценкарбальдегида, 2,5-дибром-1,4-бензохинона, 2-метил-1,4-бензохинона. 1,2-Нафтохинон не способен взаимодействовать с мембранлокализованными ферментами бактерий G. oxydans и не является медиатором переноса электронов в системах с данными бактериями.

ферментами бактерий & охус1ат и не является медиатором переноса электронов в системах с данными бактериями.

Из вольтамперных зависимостей найдены окислительно-восстановительные потенциалы (таблица 1) для каждого из исследуемых медиаторов. Потенциалы рассчитывали по формуле Е=(Екп+Еап)/2, где Е - потенциал медиатора, Екп и Еап -потенциал катодного и анодного пиков на вольтамперограмме соответственно. Рассчитанные потенциалы представлены в таблице 1.

1 ' Таблица 1

Окислительно-восстановительные потенциалы медиаторов

Медиатор Е, мВ

2-Метил-1,4-бензохинон 80

2,5-Дибром-1,4-бензохинон 170

1, Г-Диметилферроцен 250

Ферроцен 315

Ферроценкарбальдегид 475

Ацетилферроцен 500

При введении акцепторных заместителей (альдегидная и ацетильная группа) в пентадиенильное кольцо ферроцена окислительно-восстановительный потенциал увеличивается по сравнению с потенциалом незамещенного ферроцена (ферроценкарбальдегид, ацетилферроцен), при введении донорных заместителей (метальные группы) — уменьшается (1,1'-димегилферроцен). Такая же закономерность наблюдается и для производных бензохинона.

Следует заметить, что при создании биосенсоров предпочтительнее использование медиаторов с низкими окислительно-восстановительными потенциалами, так как это позволяет свести к минимуму протекание на электроде побочных реакций окисления примесей. Поэтому ферроценкарбальдеид и ацетилферроцен далее в исследовании не применяли.

Таким образом, показана возможность использования графитовых электродов, модифицированных ферроценом (ФЦ), 1,1'-диметилферроценом (ДМФЦ), 2,5-дибром-1,4-бензохиноном (ДББХ), 2-метил-1,4-бензохиноном (МБХ) для создания безреагентных биосенсорных систем на основе бактерий 01исопоЪс1ег охуйапи.

3.2. Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих на микробных медиаторных биосенсорах

Для описания кинетических закономерностей протекающих в микробных медиаторных биосенсорах биоэлектрод представили в виде модели, учитывающей различные стадии: перенос субстрата через мембрану, взаимодействие его с ферментными системами бактериальных клеток, регенерацию фермента и медиатора (рис. 2).

Представленная модель микробного медиаторного электрода аналогична модели ферментного электрода, если упрощенно рассматривать клетки как капсулы, содержащие ферменты. Поэтому для анализа процессов, протекающих на

микробном медиаторном электроде возможно применение похода, разработанного ранее для описания ферментных биосенсоров, который позволяет по экспериментальным данным выявить лимитирующую стадию протекающих в рецептор-ном элементе биосенсора процессов.

Рис. 2. Схематическое изображение микробного медиаторного биосенсора.

Анализ модели в стационарном подобному уравнению Хейнеса:

состоянии приводит к уравнению,

1+-

К,

к' Б

О)

к' N >

_км... + 1

(2)

где Б - концентрация субстрата в кювете; Кме — константа, эквивалентная константе Михаэлиса для микробного электрода, к'5 - константа скорости массопереноса субстрата; е£ - общая концентрация фермента; Км — аналогична константе Михаэлиса для кинетики гомогенной ферментативной реакции; Ь — толщина слоя фермента.

к'мЕ — эффективная константа скорости процессов на микробном электроде (уравнение 2) определяется либо кинетикой ферментативного процесса (член, содержащий Км/ккй ), либо транспортом субстрата, через мембрану (член, с к'5).

Полученные экспериментально зависимости (рис. 3,4) генерируемого тока I микробных биосенсоров на основе растворимых (БХ, ДХФИФ, ГЦФ) и нерастворимых (ДББХ, МБХ, ФЦ, ДМФЦ) медиаторов при варьировании концентрации глюкозы были проанализированы по алгоритму для определения лимитирующей стадии.

Поток3 рассчитывали по формуле } =1/пРА, где А — площадь поверхности электрода, п - число электронов, Р - число Фарадея.

Первая стадия анализа для нахождения лимитирующей стадии процессов, протекающих на микробном электроде заключается в нахождении к ми по графику зависимости Б/] от Б. Из уравнения (1) следует при Б —> 0 данная зависимость имеет предельное значение: (Б/])„ = 1/1с*МЕ.

Далее рассчитывают параметры р и у, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в необходимом ДЛЯ ДИАЛИЗА ьиде:

р =

^ к'мЕ

Подстановка к'МЕ и р в уравнение (I) дает:

(3)

у=.

МЕ

рк'

МЕ

(4)

О 10 20

Глюкоза, мМ

БХ (8 мМ) ГЦФ (50 мМ) ДХФИФ (4 мМ)

20 40

Глюкоза, мМ

ФЦ(1,1 ммоль/г) ДМФЦ(1,8 ммоль/г) ДББХ (0,4 ммоль/г) МБХ (2,5 ммоль/г)

Рисунок 3. Зависимости генерируемого тока I от концентрации глюкозы для биосенсоров на основе бактерий (7. охус1апз и растворимых (а) и иммобилизованных (б) медиаторов. Концентрация растворимых медиаторов (добавляются в состав буферного раствора в кювете) выражена в ммоль/л, иммобилизованных (добавляются непосредственно в состав графитовой пасты, из которой формируют электрод) — в ммоль/г графитовой пасты.

Уравнение (4) предсказывает, что зависимость у от р должна быть прямолинейной. Положение прямой на графике позволяет оценить относительный вклад кинетики ферментативной реакции и транспорта через мембрану в наблюдаемое значение к'МЕ- Если значение ро (отрезок, отсекаемый на оси абсцисс) равно единице, то скоростьопределяющей стадией заведомо является транспорт субстрата через мембрану электрода. Если получается горизонтальная линия, соответствующая р0=оо, то лимитирующей является скорость ферментативной реакции.

Для микробных биосенсоров на основе всех применявшихся в исследовании медиаторов были получены зависимости у от р сходного вида, на которых можно выделить участки, соответствующие кинетическому контролю и диффузионному контролю. Типичный вид зависимости у от р представлен на рис. 4.

При переходе от низких концентраций глюкозы к высоким происходит смена лимитирующей стадии (диффузионный контроль сменяется на кинетический).

Таким образом, для электродов с растворимыми (ДХФИФ, БХ, ГЦФ) и иммобилизованными (ДББХ, МБХ, ФЦ, ДМФЦ) медиаторами было установлено, что при концентрациях глюкозы выше 2 ммоль/л протекающие в микробных

биосенсорах процессы лимитирует ферментативная реакция, при концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль функционирования биосенсора сменяется на диффузионный.

0,20 0,16

I ё

• 0,08 0,04 0,00 4-—

Л.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

1,2

Рис. 4. График для определения лимитирующей стадии для микробного биосенсора, модифицированного ферроценом.

3.3. Сравнение эффективности медиаторов Дальнейшие исследования проводили в режиме кинетического контроля и были направлены на изучение взаимодействия бактерий С. охуиат с медиаторами переноса электронов.

Предположили, что окисление субстрата мембранлокализованными дегид-рогеназами бактериальных клеток (7. охус1ат в присутствии медиаторов переноса электронов можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг» (первый субстрат - глюкоза, второй субстрат — медиатор) как представлено на схеме: к! к,

S + E„

М™ + Е„

k-i

кз

Р + Ев

к.-,

ЕМ

к4

М„ + Ел

(5)

(6)

где S и Р — субстрат и продукт; Мок и М„ — окисленная и восстановленная форма медиатора внутри бактериальной клетки соответственно; Еок и Ев — фермент, локализованный в цитоплазматической мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно; ki, к_ь к2, к3, к.3 и lcj - константы скоростей соответствующих стадий реакции.

В соответствии с приведенной схемой общее уравнение для тока электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками, основанное на механизме «пинг-понг», запишется в виде:

'-rnghcjM (7) где '-=nFAk-lE] (8)

[Е]-концентрация ферментного комплекса ш vivo на единицу площади электрода..

_ .kjk^ у _ Js_k_,+k2 и- k, k ,+k.,

k2+k4

Kc=

K+K

(10)

к„=

Oí)

k, k2+k4 k3 Ks и KM -константы Михаэлиса для субстрата и медиатора соответственно.

При условии избытка медиатора или субстрата уравнение (7) можно упростить и получить уравнения типа Михаэлиса-Ментен:

I Г К ^ 02)

при « 1 - избыток субстрата

1 = 1 =

1 + Км/[М]

Imax_

Ï+Ks/[S]

при

[S] К

^^ « 1 - избыток мeдиaтopaJ

(13)

f • ФЦ

о ДМФЦ

» ДББХ

* МБХ - ..

10 20 30 Медиатор, мМ

I 2

Медиатор, ммоль/г б

Рис. 5. Зависимости генерируемого тока I от концентрации медиаторов (при избытке глюкозы) для биосенсоров на основе бактерий G. oxydans и растворимых (а) и иммобилизованных (б) медиаторов (концентрация глюкозы: а-25 ммоль/л, 6-60 ммоль/л).

Путем обработки полученных экспериментальных зависимостей генерируемого тока I при варьировании концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора (рис. 3) и концентрации медиатора в условиях избытка глюкозы (рис. 5) по уравнениям (12) и (13) были вычислены значения Imax, Ks и Км (таблицы 2,3).

Таблица 2.

Параметры электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными бактериями G. oxydans в присутствии растворимых медиаторов переноса электронов

Медиатор Условия Imax, МКА Ks, мМ Км, мМ lmax/Ks, мкА/ммоль iruax/K-M) мкА/ммоль

ГЦФ ГЦФ 50 мМ 1,0±0,1 1,2±0,1 0,8±0,2

Глюкоза 25 мМ 1,0±0,1 3,0±0,3 0,30±0,06

ДХФИФ ДХФИФ 4мМ 2,5±0,3 3,0±0,3 0,8±0,2

Глюкоза 25 мМ 2,6±0,3 0,8±0,1 3,3±0,8

БХ БХ 8 мМ 8,1 ±0,3 10±1 0,8±0,2

Глюкоза 25 мМ 7,б±0,4 0,9±0,1 8±2

Таблица 3

Параметры электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными бактериями С7. оху<1ат в присутствии иммобилизованных медиаторов переноса электронов______

Медиатор Условия 1шах, МКА Кв, мМ Км, ммоль/г мкА/ммоль мкАхг/ммоль

ФЦ Глюкоза 60 мМ 3,5±0,3 - 0,030±0,003 - 120±20

ФЦ 1,0 ммоль/г 3,6±0,3 5,5±0,5 - 0,7±0,2 -

ДМФЦ Глюкоза 60 мМ 8,4±0,3 - 0,17±0,02 - 50±10

ДМФ 1,8 ммоль/г 8,2±0,4 10±1 - 0,8±0,2 -

ДББХ Глюкоза 60 мМ 3,7±0,3 - 0,011 ±0,001 - 370±70

ДБХ 0,4 ммоль/г 3,9±0,4 6±1 - 0,7±0,2 -

МБХ Глюкоза 60 мМ 15,1±0,8 - 0,66±0,09 - 23±5

МБХ 2,5 ммоль/г 14,5±0,9 17±2 - 0,9±0,2 -

Из уравнений (8-11) следует, что отношение 1тах/К$ не зависит от типа медиатора и характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом (14), а отношение 1тах /Км - зависит от типа медиатора и дает индекс эффективности медиатора переноса электронов (15).

= пР[Е]к,к2 1тах = пЕ[Е]к3к4

К8 (к_+ка) Км (к_3+к4)

Величины 1тах/Кз для всех медиаторов совпадают в пределах погрешности (таблицы 2,3), что подтверждает правильность принятой модели. Из анализа величин 1тах/Км (таблица 2) можно заключить, что эффективность растворимых медиаторов переноса электронов увеличивается в ряду ГЦФ<ДХФИФ<БХ. Сравнивая значения 1тах/Км для сенсоров на основе иммобилизованных медиаторов (таблица 3) видно, что эффективность иммобилизованных медиаторов увеличивается в ряду МБХ<ДМФЦ< ФЦ<ДББХ.

Таким образом, показано, что взаимодействие в системе бактериальные клетки «О. охуЛапя — глюкоза — медиатор» можно рассматривать как двухсуб-стратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Предложенный в работе подход позволяет выявлять наиболее эффективное сочетание «бактерии — медиатор», что может быть полезно при создании биосенсорных анализаторов.

3.4. Выбор рабочих параметров микробных биосенсоров Для эффективной работы биосенсорной системы необходимо подобрать оптимальные параметры её функционирования, такие как рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде. Были получены зависимости величин ответов сенсоров при варьировании перечисленных параметров. Оптимальным считали значение параметра, при котором величина ответа сенсора была максимальной. Рабочие параметры микробных медиаторных биосенсоров и данные по операционной и долговременной стабильности представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Рабочие параметры микробных медиаторных биосенсоров.

Медиатор

рН среды

Концентрация солей буферного раствора, моль/л

Масса клеток

на электроде, мкг

Операционная стабильность (стандартное отклонение, % ддя 10 измерений}__

Долговременная стабильность, суток

ФЦ

ДМФЦ

ДББХ

МБХ

6,5 7,0 7,0

0,18 0,18 0,18 0,18

200 200 200 200

23 15

3.5. Селективность микробных биосенсоров

Важной характеристикой любого анализа является его селективность. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью микроорганизмов, способом иммобилизации, и может зависеть от типа электронного акцептора.

Была изучена субстратная специфичность иммобилизованных бактерий & охудат в условиях электрокаталитического окисления субстратов (в присутствии искусственных акцепторов электронов - медиаторов переноса электронов) и в режиме естественного окисления субстратов, когда конечным акцептором электронов является кислород. Полученные данные представлены на рис. 6.

Установлено, что соотношение ответов сенсоров на углеводы и спирты зависит от типа акцептора электронов. В режиме естественного окисления биосенсоры генерировали более высокие ответы на спирты, в режиме электрокаталити-ческого окисления - на углеводы.

Наибольшие ответы медиаторные биосенсоры генерировали при введении в систему глюкозы. Менее эффективно подвергались биоэлектрокаталитическому окислению другие моносахариды (галактоза, ксилоза, манноза) и дисахарид мальтоза.

Высокие ответы медиаторных биосенсоров наблюдали на спирты нераз-ветвленного строения (за исключением метанола). Биоэлектрокаталитическое окисление разветвленных спиртов проходило менее эффективно, причем по мере уменьшения степени разветвления и удаления разветвленного конца от атома углерода с гидроксильной группой, величина ответов сенсора возрастала.

Рис. 6. Селективность биосенсоров на основе бактерий G. oxydans. (Данные приведены по отношению к ответу на глюкозу, принятому за 100%)

Величины ответов биосенсора на основе 2-метил-1,4-бензохинона на углеводы соизмеримы с ответами других медиаторных биосенсоров, а ответы на спирты - значительно ниже. Следовательно, селективность медиаторных биосенсоров можно изменять, используя медиаторы различного строения.

Таким образом, медиаторные микробные биосенсоры на основе бактерий G. oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения суммарного содержания этих веществ в анализируемых образцах, кроме того, можно рекомендовать использование медиаторных электродов для анализа сред содержащих только одно из определяемых веществ.

3.6. Экспресс-определение БПКмикробным медиаторным биосенсором

Широкий спектр окисляемых субстратов биосенсоров на основе бактерий G. oxydans позволяет применять их для оценки комплексного показателя загрязнения сточных вод — биологического потребления кислорода (БПК).

Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПКю или БПК20, соответственно), что сопряжено со значительным временем от начала анализа до получения его результата. Более оперативные методы определения БПК основаны

на использовании биосенсорных анализаторов. Альтернативой традиционному методу является применение биосенсоров, что позволяет сократить время единичного анализа до одного часа и менее.

Для создания макета микробного биосенсора в качестве медиатора был выбран ферроцен, так как он наиболее эффективно взаимодействует с ферментными системами бактерий G. oxydans (наряду с 2,5-дибром-1,4-бензохиноном), кроме того, сенсор на основе ферроцена обладает наибольшей долговременной стабильностью.

Разработан макет безреагентного медиаторного биосенсора на основе бактерий G. oxydans и ферроцена для определения БПК сточных вод. Основные характеристики разработанного макета биосенсора представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Характеристики макета биосенсора для определения БПК.

Характеристика Значение параметра

Экспрессность (время одного измерения), мин 15

Линейный диапазон зависимости ответов биосенсора от БПК5, мг/л 40-550

Операционная стабильность (относительное стандартное отклонение по 10 измерениям), % 5

Долговременная стабильность (время работы биосенсора без потери активности), сут 23

Чувствительность (тангенс угла наклона линейного участка зависимости ответов сенсора от БПКз исследуемого раствора), нАхл/мг 5

Разработанный макет безреагентного медиаторного биосенсора на основе бактерий G. oxydans можно использовать для определения БПК сточных вод предприятий пищевой и биотехнологической промышленности, содержащих углеводы и спирты.

Выводы:

1. Установлено, что 2-метил-1,4-бензохинон, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, ацетил ферроцен, ферроценкарбальдегид могут служить медиаторами переноса электронов при электрокаталитическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями G. oxydans.

2. Впервые выявлено влияние природы заместителей на медиаторные свойства хинонов и ферроценов. Показано, что введение акцепторных заместителей может ухудшить медиаторные свойства производных ферроцена и 1,4-бензохинона.

3. Проведена оценка лимитирующих стадий процессов, протекающих на микробных медиаторных электродах. Установлено, что при концентрациях глюкозы выше 2 ммоль/л протекающие в микробных биосенсорах процессы лимитирует ферментативная реакция, при концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль функционирования биосенсора сменяется на диффузионный.

4. На основе анализа в рамках механизма «пинг-понг» процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах в режиме кинетического контроля, получены ряды эффеетивности медиаторов переноса электронов: гексациано-феррат (III) калия<2,6-дихлорфенолиндофенол<«-бензохинон (для водорастворим ых медиаторов); 2-метил-1,4-бензохинон< 1,1 '-диметилферроцен<фер-роцен<2,5-дибром-1,4-бензохинон (для иммобилизованных медиаторов).

5. Найдены оптимальные параметры функционирования микробных биосеснсо-ров на основе G oxydans и различных медиаторов электронного транспорта (pH среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде). Полученные данные использованы для создании макета медиаторного биосенсора для экспресс-определения БПК.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Babkina Е., Chigrinova Е., Ponamoreva О., Alferov V., Reshetilov А. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency // EIectroanalysis.2006. Vol. 18. No. 19-20. P. 2023-2029.

2. Бабкина E.E., Понаморева O.H., Алферов B.A., Решетилов А.Н., Богдановская В.А.. Оценка эффективности водорастворимых медиаторов при биоэлектрока-талитическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями // Сенсорные системы. 2006. Т. 20., № 4. С. 329-335.

3. Понаморева О.Н., Бабкина Е.Е., Чигринова Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные медиаторные биосенсоры. // Сборник трудов Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук». 2006. T.2.C. 96-102.

4. Алферов В.А., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Российская И.В., Чубарова Е.В., Блохин И.В., Решетилов А.Н.. Эффективность медиаторов электронного транспорта при электрокаталитическом окислении субстратов иммобилизованными бактериями // Известия ТулГУ. Сер. Химия. 2004. Вып. 4. С. 104-112.

5. Алферов В.А., Понаморева О.Н., Бабкина Е.Е., Алферов C.B., Решетилов А.Н. Изучение характеристик амперометрического сенсора на основе бактерий Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофенола // Известия ТулГУ. Сер. Химия. 2004. Вып. 4. С. 126134.

6. Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В .А. Математическая модель микробного биосенсора амперометрического типа // Известия ТулГУ. Сер. Химия. 2002. Вып. 3. С. 82-89.

7. Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Каталитические характеристики мембранолокализованных ферментов бактерий Glucobacter oxydans in vivo // Тезисы докладов 6-ой Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века». - Пущино, 2002. — Т 1.С. 213-214.

8. Бабкина Е.Е. Изучение каталитической активности бактерий Gluconobacter oxydans амперометрическим методом в присутствии медиаторов электронного

транспорта //Тезисы докладов 7-ой Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». - Пущино, 2003. - С. 87-88.

9. Бабкина Е.Е., Чигринова Е.Ю. Амперометрический микробный медиаторный сенсор для детекции этанола и глюкозы // Тезисы докладов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». - Пущино, 2004 - С. 250.

Ю.Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Изучение каталитических констант ферментных систем in vivo электрохимическим методом // Катализ и сорбция в биотехнологии, химии, химических технологиях и экологии: Материалы Всероссийской заочной конференции, - Тверь: ТГТУ, - 2004. — С.9.

11 .Ponamoreva O.N., Babkina Е.Е., Alferov V.A., Reshetilov A.N.. Electrocatalytic oxidation of glucose by bacterial cells in the presence of electron transport mediators. // Biosensors 2004 Poster Program / The Eighth World Congress on Biosensors. - Granada, Spain, 2004. - P. 2.5.22.

12.Бабкина E.E., Понаморева O.H., Алферов B.A. Физико-химические закономерности функционирования микробного медиаторного безреагентного биосенсора. - Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». - Секция «Химия», т.2. М.:

2005,- С. 141.

13.Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е. Микробный электрод на основе нерастворимых медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда. // Сборник тезисов 9-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 18-22 апреля, 2005г. - Пущино, 2005. -С.368-369.

14.Chigrinova E.Yu., Babkina Е.Е., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Reshetilov A.N. Parameters of microbial sensor with ferrocenes and quinones as mediators - Book of Abstracts. International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, 25-30 June

2006, Moscow, Russia. - V. 1, 2006 - P. 292.

15.Чигринова Е.Ю., Бабкина E.E., Понаморева O.H., Алферов В.А. Эффективность функционирования медиаторов электронного транспорта в биосенсорах на основе Gluconohacter oxydons. Материалы IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Том 2. - Томск: изд-во ТПУ, 2006. - С. 443-444.

16.Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е., Петров A.A. Безреагентный биосенсор на основе бактерий Gluconohacter oxydans. II Биология - наука XXI века: 10-я Пущин-ская школа - конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущин-ского научного центра РАН (Пущино, 17-21 апреля 2006 года). Сборник тезисов. - Пущино, 2006 - С. 403-404.

Изд. лиц. ЛР № 020300 от 12.02.97. Подписано в печать 22.11.06. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 127.

Тульский государственный университет. 300600, г. Тула, просп. Ленина, 92.

Отпечатано в Издательстве ТулГУ 300600, г. Тула, ул. Болдина, 151

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Бабкина, Елена Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕДИАТОРНЫЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК.

1.1. Механизмы генерации сигнала в микробных биосенсорах.

1.2. Медиаторы, их свойства. Основные требования к медиаторам переноса электронов.

1.2.1. Ферроцен и его производные.

1.2.2. Индофенолы.

1.2.3. Комлексные соединения металлов с переменной валентностью.

1.2.4. Хиноны.

1.3. Практическое применение медиаторных биосенсоров на основе целых клеток.

1.4. Особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans и перспективы их применения в микробных сенсорах.

1.5. Мембранлокализованные глюкозо- и алкогольдегидрогеназы бактерий Gluconobacter oxydans и их применение в биосенсорах.

Введение диссертация по химии, на тему "Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans"

Биосенсоры - аналитические приборы нового поколения, совмещающие в себе идеи и достижения современной биотехнологии, физико-химических методов анализа, электронных технологий. Большинство коммерческих биосенсоров основаны на электрохимическом типе детекции и содержат ферменты в качестве биорецепторного элемента.

Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод - медиаторов электронного транспорта.

Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Для детекции легкоутилизируемых углеводов и спиртов перспективными могут стать медиаторные биосенсоры на основе бактерий Glu-conobacter oxydans, содержащих мембранлокализованные ферменты.

Электрокаталитическое окисление субстратов бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта мало изучено. Представляется актуальным исследование кинетических особенностей электрокаталитического окисления легкоутилизируемых субстратов бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов электронного переноса для разработки принципов создания микробных медиаторных биосенсоров.

Цель работы. Выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacter oxydans и применение этих закономерностей для разработки макета биосенсора.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

2. Определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных электродах.

5. Применение разработанного макета биосенсора для экспресс-определения БПК.

Научная новизна. Получены новые данные о возможности переноса заряда в системах «иммобилизованные бактерии G. oxydans - ферроцены и хиноны». Впервые показана возможность электрокаталитического окисления глюкозы целыми клетками G. oxydans на электродах, модифицированных ацетилферроценом, ферроценкарбальдегидом, 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном. Предложено использовать такие системы как основу для создания безреагентных микробных биосенсоров.

Моделирование процессов, протекающих в рецепторном элементе микробного медиаторного биосенсора, позволило идентифицировать скоростьопределяющую стадию биоэлектрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными на поверхности графитовых электродов бактериями G.oxydans при участии медиаторов электронного транспорта. На основе анализа процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах, в рамках механизма «пинг-понг» получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.

Практическая значимость работы. Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Glu-conobacter oxydans могут быть использованы при разработке биосенсоров на основе других микроорганизмов для детекции различных соединений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (г. Пущино Московской области) в 2002-2006 гг.; VIII Международном конгрессе по биосенсорам, 24 - 26 мая 2004 г. (г. Гранада, Испания); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) 12-15 апреля 2005 г., Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006», 25-30 июня 2006 (г. Москва), IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», 11-16 сентября 2006 г. (г.

Томск). Исследование поддержано грантом РФФИ «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов» (№ 01-04-96023). По теме диссертации опубликовано 6 статей и 10 сообщений в тезисной форме.

Заключение диссертации по теме "Физическая химия"

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что 2-метил- 1,4-бензохинон, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид могут служить медиаторами переноса электронов при электрокаталитическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями G. oxydans.

4. На основе анализа в рамках механизма «пинг-понг» процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах в режиме кинетического контроля, получены ряды эффективности медиаторов переноса электронов: гексацианоферрат (III) калия<2,6-дихлорфенолиндофенол<и-бензохинон (для водорастворимых медиаторов); 2-метил-1,4-бензохинон<1,1 '-диметилферроцен<фер-роцен<2,5-дибром-1,4-бензохинон (для иммобилизованных медиаторов).

5. Найдены оптимальные параметры функционирования микробных био-сеснсоров на основе G oxydans и различных медиаторов электронного транспорта (рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде). Полученные данные использованы для создании макета медиаторного биосенсора для экспресс-определения БПК.

119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных показывает, что использование в биосенсорах целых клеток в сочетании с медиаторами переноса электронов открывает широкие перспективы для детекции различных веществ. Вместе с тем исследования в данной области носят в основном прикладной характер, а протекающие в микробных медиаторных биосенсорах процессы изучены недостаточно.

Бактерии рода Gluconobacter, благодаря мембранной локализации основных ферментов катаболизма спиртов и углеводов - альдоз- и алкогольде-гидрогеназ, а также другим физиолого-биохимическим особенностям, являются удобным объектом для изучения закономерностей биоэлектрокаталити-ческого окисления субстратов в присутствии медиаторов переноса электронов в биосеснсорах.

В связи с изложенным выше, представлялось целесообразным проведение исследований, направленных на выявление кинетических закономерностей функционирования амперометрических медиаторных биосенсорных систем на основе бактерий Gluconobacter oxydans и применение выявленных закономерностей для разработки макета биосенсора. Для этого были предприняты следующие шаги:

1. На первом этапе методом циклической вольтамперометрии была изучена возможность использования некоторых малорастворимых в водных средах ферроценов и хинонов (ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохинон, 1,2-нафтохинон) в качестве медиаторов переноса электронов в биосенсорах на основе бактерий Gluconobacter oxydans. Выбор данных веществ в качестве потенциальных медиаторов был продиктован необходимостью создания безреагентных биосенсорных систем, т.к. описанные ранее в системах с бактериями Gluconobacter oxydans медиаторы (2,6-дихлорфенолиндофенол, пбензохинон, гексацианоферрат (III) калия) хорошо растворимы в воде и применяются в биосенсорных системах в составе рабочих растворов. Применение вольтамперометрического метода позволило получить новые данные о возможности переноса заряда в системах с бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии ферроцена, 1,1'-диметилферроцена, ацетилферроцена, ферроцен-карбальдегида, 2,5-дибром-1,4-бензохинона, 2-метил-1,4-бензохинона. Из полученных вольтамперных зависимостей были определены окислительно-восстановительные потенциалы исследовавшихся медиаторов. Для дальнейшей работы были отобраны четыре медиатора с низкими значениями потенциалов: ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохинон.

2. На втором этапе было проведено определение лимитирующей стадии процессов, протекающих в микробных медиаторных биосенсорах при биоэлектрокаталитическом окислении глюкозы в присутствии описанных ранее в системах с бактериями Gluconobacter oxydans и отобранных на предыдущем этапе работы медиаторов переноса электронов. Для обработки экспериментальных данных был применен алгоритм для выявления лимитирующей стадии, который позволяет путем математической обработки зависимости генерируемого биосенсором тока от концентрации субстрата определить вклад ферментативных и диффузионных процессов в значение эффективной константы скорости. Данный подход позволил выявить диапазон концентраций глюкозы (более 2 ммоль/л), в котором исследуемые биосенсоры функционируют в режиме кинетического контроля. При концентрациях глюкозы ниже 2 ммоль/л кинетический контроль сменялся на диффузионый.

3. Выявление на предыдущем этапе диапазона концентраций глюкозы, соответствующих кинетическому контролю, позволило перейти к более детальному изучению взаимодействия бактерий с медиаторами переноса электронов. Для этого взаимодействие в системе «бактерии Gluconobacter oxydans - глюкоза - медиатор» рассматривали как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что позволило охарактеризовать процесс электрокаталитического окисления глюкозы в присутствии медиаторов переноса электронов с помощью трех параметров: максимального тока электрокаталитического окисления и констант Михаэлиса по субстрату и медиатору. На основе отношения величин максимального тока к константам Михаэлиса по медиатору были построены ряды эффективности медиаторов переноса электронов.

4. Следующий этап заключался в создании лабораторного макета биосенсорной установки и определении рабочих параметров, таких как рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса бактерий на электроде, операционная и долговременная стабильность микробных медиаторных биосенсоров.

5. На пятом этапе была исследована селективность микробных биосенсоров, для этого сравнили величины ответов сенсоров на различные углеводы и спирты. Установлено, что природа медиатора переноса электронов оказывает влияние на селективность микробных биосенсоров. По результатам проведенных экспериментов был сделан вывод, что медиаторные биосенсоры на основе бактерий Gluconobacter oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения суммарного содержания этих веществ в анализируемых образцах или для анализа сред, содержащих только одно из определяемых веществ.

6. Завершающий этап исследования состоял в создании лабораторной модели медиаторного биосенсора на основе бактерий Gluconobacter oxydans для экспресс-определения комплексного показателя загрязнения сточных вод - биологического потребления кислорода. В качестве медиатора был выбран ферроцен - один из эффективных медиаторов, обеспечивающих наибольшую долговременную стабильность биосенсора. По результатам эксперимента сделали вывод, что разработанный медиаторный микробный биосенсор можно применять для определения БПК в интервале 40 - 550 мг/л.

Полученные в ходе выполнения работы результаты показали, что выявленные кинетические закономерности в сочетании с определением рабочих параметров и селективности микробных биосенсоров открывают реальную перспективу создания биосенсорных анализаторов, в частности для определения БПК.

118

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Бабкина, Елена Евгеньевна, Тула

1. Allen M.J., 'Biofuel Cells' in: "Methods in Microbiology", J.R. Norris, D.W. Ribbon (Eds.), Academic Press, New York, pp. 247-283 (1972).

2. Тарасевич M.P., Богдановская B.A., Жутаева Г.В. Электрохимические биосенсоры // Электрохимия. 1993. Т. 296. №12. С. 15541560

3. Myers C.R., Myers J.M. Localization of cytochromes to the outer membranes of anaerobically grown Shewanella putrefaciens MR-1 // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 3429-3438.

4. Kim H.J., Kim H.J., Park H.S., Hyun M.S., Chang I.S., Kim M. Kim

5. B.H. A mediator-less microbial fuel cell using a metal redusing bacterium, Shewanella putrefaciens // Enzyme and Microbial Technology 2002. V. 30. P. 145-152.

6. G.M. Delaney, H.P. Bennetto, J.R. Mason, S.D. Roller, J.L. Stirling,

7. C.F. Thurston. Electron-transfer coupling in microobial fuel cells: 1. Comparison of redox-mediator reduction rates and respiratiry rates of bacteria // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1984. V. 34B. P. 3-12.

8. Katrlik J., Svorc J., Rosenberg M., Miertus S. Whole cell amperomet-ric biosensor based on Aspergillus niger for determination of glucose with enhanced upper linearity limit // Analytica Chimica Acta 1996. V. 331. P. 225-232.

9. Heim S., Schnieder I., Binz D., Vogel A., Bilitewski U. Development of automated microbial sensor system // Biosensors & Bioelectronics 1999. V. 14. P. 187-193.

10. Svitel J., Curilla 0., Tkac J. Microbial cell-based biosensor for sensing glucose, sucrose or lactose // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. V. 27. P. 153-158

11. Subrahmanyam S., Shanmugam K., Subramanian Т. V., Murugesan M., Madhav V.M, Jeyakumar D. Development of Electrochemical Microbial Biosensor for Ethanol Based on Aspergillus niger // Elec-troanalysis. 2001. V. 13. № 11. P. 944-948.

12. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. Москва: Техносфера, 2005. 336 с.

13. Биосенсоры: основы и приложения: Пер. с англ./Под. ред. Э. Тернера, И. Карубе, Дж. Уилсона. -М:. Мир, 1992. 616 с.

14. Chaubey A., Malholtra B.D. Mediated biosensors. Review // Bio-sens.Bioelectron. 2002. V. 17. P. 441-456

15. Gorton L. Carbon past electrodes modified with enzymes, tissues and cells. Electroanalysis, 1995. V. 7. № 1. P. 23-45

16. Gorton L. Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes / GortonL. //Anal. Chim. Acta. 1991. Vol. 250. P. 203-210.

17. Fultz M.L., Durst R.A. Mediator compounds for the electrochemical study of biological redox systems: A compilation // Analytica Chimica Acta 1982. V. 140. P. 1-18

18. Перевалова Э.Г., Решетова М.Д., Гранберг К.И. // Методы эле-ментоорганической химии. Ферроцен. М: Наука, 1983, 557 стр.

19. Грин М. Металлоорганические соединения переходных металлов. М.: Мир, 1972.-456 с.

20. Tkac J., Vostiar I., Sturdik Е. Gemeiner P., Mastihuba V., Annus J. Fructose biosensor based on D-fructose dehydrogenase immobilized on a ferroccene-embedded cellulose acetate membrane // Anal. Chim. Acta 2001. V. 439. P. 39-46

21. Dicks J.M., Aston W.J., Davis G., Turner A.P.F. Mediated am-perometric biosensors for D-galactose, glycolate and L-amino acids based on a ferrocene-modified carbon paste electrode. Anal. Chim. Acta 1986. V. 218. P. 103-112.

22. Allen P.M., Hill H.A.O. Watron N.J. Surfase modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytocrome c. J.Electroanal. Chem. 1984. V. 178. P. 69-86.

23. Smolander M., Livio H.-L. Mediated amperometric determination of xylose and glucose with an immobilized aldose dehydrogenase electrode.// Biosens. Boielectron. 1992. No. 7. P. 637-643.

24. Степанов Б.И., Попов С.И. Введение в химию и технологию органических красителей, 3 изд., М: 1984. 342 с.

25. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. - 554 с.

26. Coury L.A., Oliver B.N., Egekeze J.O., Sosnof.C.S., Brumfield J.C., Buck R.P., Murray R.W. Mediated, anaerobic voltammetry of sulfite oxidase // Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 452 458

27. Wang J., Nasser N., Darnall D., Gardea-Torresdey J. Bioaccumulation and quantitation of metals at peat moss-modified electrodes // Electro-analysis. 1992. V. 4. P. 71-75.

28. Rawson D.M., Willmer A .J., Turner A.P.F. Whole-cell biosensors for enviromental monitorig. Biosensor. 1989. V. 4. P. 299-311

29. L.P. Hadjipetroul, Т. Gray-Young, M.D. Lilly. Effect of Ferricianide on Energy Production by Escherichia coli // J. gen. Microbiol. 1966. № 45. P. 479-488

30. N.J. Richardson, S. Gardner, D.M. Rawson. A chemically mediated amperometric biosensor for monitoring eubacterial respiration // Journal of Applied Bacteriology. 1991. № 70. P. 422-426.

31. J. Tkac, P. Gemeiner, J. Svitel, T. Benikovsky, E. Sturdik, V. Vala, L. Petrus, E. Hrabarova. Determination of total sugars in lignocellulose hydrolysate by a mediated Gluconobacter oxydans biosensor // Analitica Chimica Acta. 2000. № 420. P. 1-7

32. J. Tkac, I. Vostiar, Lo Gorton, P. Gemeiner, E. Sturdik. Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation // Biosensors and bio-electronics. 2003. № 18. P. 1125-1134

33. Takayama K. Biocatalyst electrode modified with whole-cells of P. denitrificans for the determination of nitrate // Bioelectrochemistry and Bioenergetics 1998.45. P. 67-72.

34. Тапака К., Vega С.A., Tamamushi R. 591-Mediating effect of ferric Cheleate conpounds in Microbial fuel cells // Bioelectrochemistry and bioenergetics. 1983. № 11. P. 13 5-143

35. Connor M.P., Wang J., Kubiak W., Smyth M.R. Tissue- and microbe-based electrochemical detectors for liquid chromatography // Anal. Chim. Acta. 1990. V.229. P.139-143

36. Tkac J., Vostiar I., Gorton Lo, Gemeiner P., Sturdik E. Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation // Biosensors and bio-electronics. 2003. № 18. P. 1125-1134

37. Tkac J., Vostiar I., Gemeiner P., Sturdik E. Monitoring of ethanol during fermentation using a microbial biosensor with enhanced selectivity // Bioelectrochemistry. 2002. № 56. P. 127-129

38. J. Tkac, P. Gemeiner, J. Svitel, T. Benikovsky, E. Sturdik, V. Vala, L. Petrus, E. Hrabarova. Determination of total sugars in lignocellulose hydrolysate by a mediated Gluconobacter oxydans biosensor // Analitica Chimica Acta. 2000. № 420. P. 1-7

39. Katrlik J., Brandsteter R., Svorc J., Rosenberg M., Miertus S. Mediator type of glucose microbial biosensor based on Aspergillus niger // Analitica Chimica Acta. 1997. № 356, P. 217-224

40. Kubiak W. W., Wang J. Yeast-based carbon paste bioelectrode for ethanol //Analitica Chimica Acta. 1989. № 221. p.43-51

41. Polak M.E., Rauson D.M., Hagget B.G.D. Redox mediated biosensor incorporating cultured fish cells for toxicity assessment // Biosensor and bioelectronics. 1966. V. 11. № 12. P.1253-1257

42. Katrlik J., Brandsteter R., Svorc J., Rosenberg M., Miertus S. Mediator type of glucose microbial biosensor based on Aspergillus niger // Analitica Chimica Acta. 1997. № 356. P. 217-224

43. Skladal P., Morozova NReshetilov., A. Amperometric biosensors for detection of phenol using chemically modified electrodes contaning immibilizid bacteria // Biosensors and Bioelectronics. 2002. № 17. P.867-873

44. Polak M.E., Rauson D.M., Hagget B.G.D. Redox mediated biosensor incorporating cultured fish cells for toxicity assessment // Biosensor and bioelectronics. 1966. V. 11. № 12. P.1253-1257

45. Yoshida N., Yano K., Morita Т., McNiven S.J., Nakamura H., Karube I. A mediator-type biosensor as a new approach to biochemical oxygen demand estimation // Analyst. 2000. № 125. P. 2280-2284

46. Yoshida N., Hoashi J., Morita Т., McNiven Scott J., Nakamura H., Karube I. Impruvement of a mediator-type biochemical oxygen demand sensor for on-site measurement // Journal of Biotechnology. 2001. №88. P. 269-275

47. Pasco N., Baronian K., Jeffries C., Hay J. Biochemical mediator demand a novel rapid alternative for measuring biochemical oxygen demand.// Appl Microbiol Biotechnol 2000. 53. P. 613-618.

48. Pasco N„ Baronian K., Jeffries C., Webber J., Hay J. MICREDOX -development of a ferricyanide-mediated rapid biochemical oxygen demand method using an immobilized Proteus vulgaris biocomponent // Biosensors and Bioelectronics. 2004. № 20. P.524-532

49. Trosok S.P., Driscoll B.T., Luong J.H.T. Mediated microbial biosensor using a novel yeast strain for wastewater BOD measurement // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. № 56. P. 550-554

50. Nishikawa S., Saka S., Karube I., Matsunaga Т., Suzuki S. Dye-coupled electrode system for the rapid determination of cell population in polluted water // Applied and Environmental Microbiology. 1982. P. 814-818

51. Han S., Li. X., Guo G., Sun Y., Yuan Z. Voltammetric measurement of microorganism population // Anal. Chim. Acta. 2000. № 405. P. 115-121.

52. Minett A.I., Barisci J.N., Wallace G.G. Coupling conduction polymers and mediated electrochemical response for the detection of Listeria.// Anal. Chim. Acta 2003. № 475. P. 37-45.

53. Ertl P., Wagner M., Corton E., Mikkelsen S.R. Rapid identification of viable Escherichia coli subspecies with an electrochemical screen-printed biosensor array // Biosens. Bioelectron. 2003. № 18. P. 907916

54. De Ley J., Frateur J. Bergey's manual of determinative bacteriology. /Eds. Buchanan H.B., Gibson V.K. Baltimor: Williams and Wilkins Co., 1974. P. 251-253; 276-278.

55. Asai K. Acetic acid bacteria: classification and biochemical activities. Baltimore: Univ. Park Press, 1968. 343 p.

56. Луста K.A., Решетилов A.H. // Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах. Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 4. С. 339-353.

57. Matsushita К, Toyama Н, Adachi О. Respiratory chains and bioenergetics of acetic acid bacteria. Adv. Microb. Physiol. 1994 V. 36. P. 247-301

58. Buchert J. A xylose-oxidizing membrane-bound aldose dehydrogenase of Gluconobacter oxydans ATTC 621 // Journal of Biotechnology 1991. V. 18. P. 103-114

59. Kulhanek M Microbial dehydrogenations of monosaccharides. // Adv. Appl. Microbiol. 1989. V.34 P. 141-181

60. Deppenmeier U., Hoffmeister M., Prust C. Biochemistry and biotech-nological applications of Gluconobacter strains Appl Microbiol. Bio-technol. 2002. V. 60. P. 233-242

61. Ameyama M., Shinagawa E., Matsushita K., Adachi 0. D-glucosedehydrogenase Gluconobacter suboxydans: solubilisation, purification and characterization. Agric. Biol. Chem. 1981. V. 45 P. 851861.

62. Ameyama M., Nonobe M., Hayashi M., Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O. Mode of binding of pyrroloquinoline quinone to apo-glucose dehydrogenase // Agric. Biol. Chem. 1985. V. 49 P. 12271231

63. Duine J.A., Jongejan J.A. Quinoproteins, Enzymes with pyrroloquinoline quinone as cofactor. // Annu. Rev. Biochem. 1989. V. 58. P. 403-426

64. Anthony C. The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenases // Int. J. Biochem. 1992. Vol. 24. No 1. P. 29-39

65. Ameyama M., Adachi O. Alcohol dehydrognase from acetic acid bac-teia, membrane-bound // Methods in Enzymology, 1982. V. 89 P. 450457

66. T. Ikeda, K. Matsuyama, D. Kobayashi, F. Matsushita. Whole-cell enzyme electrodes based on mediated bioelectrocatalysis // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. V. 56. № 8. P. 1359-1360

67. Mullen W.H., Churchose S.J., Vadgama P.N. Enzyme electrode for glucose based on quinoprotein glucose dehydrogenase // Analyst, 1985. V. 110. №9. P. 925-928

68. Cass A.E.G., Davis G., Francis G.D., Hill H.A.O. Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose// Anal. Chem. 1984. V. 56 №4. P. 667-671

69. Kitagawa Y., Kitabatake K., Kubo I., Tamiya E., Karuba I. Alcohol sensor based on membrane bound alcohol dehydrogenase // Anal. Chim. Acta 1989. V. 218 P. 61-68

70. Smolander M., Buchert J., Vikari L.// Large-scale applicable purification and characterization of a membrane bound PQQ-dependent aldose dehydrogenase //J. Biotech. 1993. V.29. P. 287-297.

71. Smolander M., Marko-Varga G., Gorton L.Aldose dehydrogenase-modified carbon paste electrodes as amperometric aldose sensors // Anal. Chim. Acta. 1995. V.302. P. 233-240.

72. Smolander M., Cooper J., Schuhmann W., Hammerle M. Determination of xylose and glucose in a flow-injection system with PQQ-dependent aldose dehydrogenase //Anal. Chim. Acta. 1993. V. 280 P.l 19-127

73. Albery W.J., Bartlett P.N. Amperometric enzyme electrodes. Part 1. Theory. J. Electroanal. Chem. 1985. V. 194. P. 211-222

74. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: Фаир-Пресс, 1999. 720 с.

75. Ввозная Н. Ф. Химия воды и микробиология. М.: Высш. школа, 1979.-361 с.

76. D'Souza S.F., Microbial biosensors. Biosensors & Bioelectronics 2001. V. 16. P. 337-353

77. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Пер. с нем. -М.:Мир, 1994. 268 е., ил.