Кинетические закономерности и регуляция ферментативного синтеза простаноидов в животных клетках тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ГОНЧАР МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И РЕГУЛЯЦИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО СИНТЕЗА ПРОСТАНОИДОВ В ЖИВОТНЫХ КЛЕТКАХ (НА ПРИМЕРЕ МАКРОФАГОВ)

02.00.15 - химическая кинетика и катализ 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

'<7

На правах рукописи

Москва-1997

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, вед.н.сотр. А.Т. Мевх кандидат химических наук, ст.н.сотр. М.Г. Сергеева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.К. Наградова доктор химических наук, вед.н.сотр. В.П. Шевченко

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится " Н " марта 1997 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 22." января 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Простаноиды - продукты окисления полиненасыщенных С20 жирных кислот - играют важную роль в регуляции многих физиологических функций, в том числе процессов воспаления и развития иммунного ответа. К настоящему времени достаточно подробно изучены биохимические механизмы синтеза простановдов на уровне основных ферментов, принимающих участие в образовании этих веществ. Однако для понимания механизмов регуляции синтеза простаноидов в организме необходимо проводить исследования на уровне целых клеток.

Одним из важных источников простановдов в организме человека и животных являются макрофаги. Эти клетки способны синтезировать разные типы простаноидов, которые могут вызывать различные биологические эффекты в зависимости от их качественного и количественного состава. Поэтому при изучении механизмов регуляции синтеза простаноидов клетками важно проведение одновременного определения всех типов простановдов.

В настоящее время активно изучается синтез простаноидов макрофагами, активированными различными агентами воспаления. Однако вопрос о способности этих клеток синтезировать простаноиды базально и возможном физиологическом значении этого процесса остается открытым. Исследования в этом направлении открывают новые возможности в понимании механизмов нарушения гомеостаза и возникновения таких заболеваний как артрит, астма, онкологические заболевания и поэтому представляют существенный интерес для медицины.

Целью работы является изучение синтеза простаноидов в макрофагах, его физиологической роли и возможности регуляции. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Поставить чувствительный и надежный метод детекции простаноидов, присутствующих в биологических объектах в виде многокомпонентной смеси. 2. Выделить из перитонеальных макрофагов мыши ключевой фермент синтеза простаноидов -простагландин (РО) Н-синтазу и сравнить свойства полученного фермента с известными свойствами фермента из везикулярных желез барана. 3. Исследовать роль арахидоновой кислоты (АК), субстрата РОН-синтазы, в регуляции синтеза простаноидов

клетками. 4. Изучить влияние основных синтезируемых макрофагами простановдов на пролиферацию лимфоцитов как физиологический процесс, происходящий при кооперации клеток разных типов. 5. Исследовать способность нестероидных противовоспалительных препаратов, классических ингибиторов РОН-синтазы, регулировать синтез простановдов макрофагами на уровне целых клеток.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнение кинетических свойств РОН-синтазы из перитонеальных макрофагов мыши и везикулярных желез барана на уровне микросомальных фракций. Выявлены особенности синтеза простаноидов макрофагами по сравнению с синтезом простаноидов микросомами. Исследована способность АК регулировать синтез простановдов в макрофагах и показано, что: зависимость синтеза простаноидов от концентрации субстрата различается для целых клеток и их микросомальных фракций; кинетика синтеза простаноидов клетками зависит от источника АК. Обнаружено, что макрофаги поддерживают соотношение концентраций синтезируемых простаноидов (РОЕ2, РОР2а и ТхВг) в условиях различной стимуляции клеток. Показано, что покоящиеся клетки в отсутствие какого-либо физиологического стимула в процессе культивирования способны синтезировать простаноиды и поддерживать их концентрацию в среде на постоянном уровне. Это свидетельствует о том, что одной из функций макрофагов может являться обеспечение постоянной эндогенной концентрации простаноидов при кооперации клеток различных типов. Изучение физиологической роли эндогенно синтезируемых простаноидов тканевыми макрофагами позволило впервые обнаружить бимодальный концентрационный эффект РСЕ2 на пролиферативную активность лимфоцитов. Исследование влияния нестероидных противовоспалительных препаратов (бруфена, анальгина, индометацина) на базальный синтез простаноидов макрофагами позволило впервые обнаружить факт активации синтеза простаноидов при действии пикомолярных концентраций этих препаратов.

Практическая значимость работы. Для определения индивидуальных простаноидов, присутствующих в биологических объектах в виде многокомпонентных смесей, оптимизирован метод

высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией производных простаноидов. При изучении физиологической роли простаноидов, синтезируемых тканевыми макрофагами, показано, что для физиологической регуляции принципиально важно изменение эндогенной концентрации PGE2 в любую сторону от базального уровня. Полученные результаты создают научные основы для выяснения механизмов ряда патологических заболеваний. Обнаружено, что классические ингибиторы синтеза простаноидов - нестероидные противовоспалительные препараты - в пикомолярных концентрациях активируют синтез простаноидов в макрофагах, что имеет важное значение для фармакологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на: -9ой Международной конференции "Prostaglandins and Related Compounds", 6-10 тоня 1994, Флоренция, Италия.

- 1ом Европейском конгрессе по фармакологии, 16-19 июня 1995, Милан, Италия.

- Международной конференции "Biocatalysis-95", 28 августа - 1 сентября 1995, Суздаль, Российская Федерация.

- 6ой Международной конференции "Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology. The Legacy of Andrey Belozersky." 18-22 декабря, 1995, Москва, Российская Федерация.

- 10ой Международной конференции "Prostaglandins and Related Compounds", 22-27 сентября 1996, Вена, Австрия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( /6g наименований). Работа изложена на fjR страницах машинописного текста, содержит 3 таблиц и 22. рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор

В обзоре литературы описаны ферменты синтеза простаноидов, изложены сведения о путях метаболизма

арахидоновой кислоты и внутриклеточных механизмах регуляции синтеза простаноидов. Обсуждается физиологическое значение биосинтеза простаноидов в организме. Отдельная глава посвящена современным методам определения простаноидов в биологических объектах.

Методическая часть

Описан метод получения флуоресцентных производных простаноидов и их последующей детекции ВЭЖХ. Приведены методики дополнительной очистки используемых реагентов. Описаны методики выделения и кинетических исследований РОН-синтазы из перитонеальных макрофагов мыши, проведения биосинтеза простаноидов препаратами микросом. Приведены методики выделения животных клеток: перитонеальных макрофагов и спленоцитов. Описана методика насыщения макрофагов меченой тритием арахидоновой кислотой. Описана методика исследования митоген-стимулированной пролиферации спленоцитов по включению в ДНК меченого тритием тимвдина. Приведены методы гомогенного и гетерогенного сцинтилляционного счета.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Оптимизация метода высокоэффективной жидкостной хроматографии флуоресцентных производных простаноидов.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детекцией флуоресцентных производных простаноидов в настоящее время является одним из наиболее информативных и точных методов определения этих физиологически активных веществ в биологических объектах. Однако проблема надежной воспроизводимости метода не решена, и поэтому ведется поиск все новых и новых флуоресцентных агентов для дериватизации простаноидов. Нами проведена оптимизация метода получения флуоресцентных производных простаноидов с использованием 4-бромометил-7-метоксикумарина (ВгММС). На рис.1 представлена схема реакции получения флуоресцентных производных простаноидов с ВгММС на примере простаглавдина Е2. Реакция проходит при 50°С в присутствии карбоната калия. Проведенные

РСЕ

4-бромоиетил-7метоксикумарин (ВгММС)

О

е..

0Н 4- ВГ—С

ОН

,сн

/

50°С

О

е..

+ НВг

он

Рис.1. Получение флуоресцентных производных простаноидов с использованием 4-бромометил-7метоксикумарина на примере РОЕ?.

нами исследования влияния света, присутствия различных органических растворителей, примесей воды и других добавок, ряда соединений, широко используемых при культивировании клеток, на эту реакцию позволило добиться хорошей воспроизводимости метода и высокой чувствительности определения простаноидов ТхВг, РвРга, 6-ке1о-РОр1а, РвЕг, РОЕ) (0.1, 2, 12, 2 и 2 нг соответственно). Использование 18-краун-6 эфира позволило решить проблему переноса карбонат-аниона в органическую фазу и повысить чувствительность определения простаноидов в 2 раза. Лучшее разделение хроматографических пиков и наиболее удобное время их выхода получено в системе ацетонитрил/вода при соотношении от 35:65 до 60:40. Опытным путем выбраны оптимальный диапазон длин волн возбуждения и эмиссии (соответственно 313 нм и 370 нм) и скорость элюирования (0,8 мл/мин). В результате проделанной работы выявлены условия, необходимые для получения хроматограмм, характеризующихся чистотой заданного диапазона спектра и хорошей воспроизводимостью для стандартных образцов. Пики,

7метоксикумарина, соответствующих индивидуальным простаноидам: ТхВг (3,3 нг; пик I); РОР^ (11,3 нг; пик 2); 6-ке{о-РОР[а (22,5 нг; пик 3); РОЕ2 (6,8 нг; пик 4); РОЕ[ (6,8 нг; пик 5). Условия: скорость элюирования 0,8 мл/мин; элюент ацетонитрил-вода, 35:65.

соответствующие индивидуальным простаноидам, имеют хорошее разрешение и удобное для анализа время удерживания (рис.2).

2. РОН-синтаза перитонеальных макрофагов мыши

Ключевым ферментом синтеза простаноидов является РОН-синтаза. Сведения о выделении и характеристиках этого фермента

из макрофагов в литературе отсутствовали. Мы выделили РОН-синтазу из перитонеальных макрофагов мыши и сравнили

кинетические свойства полученного фермента с известными свойствами фермента из классического источника - везикулярных желез барана. Получено, что значения константы Михаэлиса реакции окисления арахидоновой кислоты (АК) РОН-синтазами из двух источников практически не отличаются друг от друга и находятся в пределах значения 5*10~5 М (рис.З.а). Известным свойством РОН-синтазы из везикулярных желез барана является ингибирование активности фермента нестероидными противовоспалительными препаратами. К числу последних относится бруфен - быстрый, конкурентный, обратимый ингибитор фермента. Исследовано влияние бруфена на начальную скорость РОН-синтазной реакции. Из рис.З.б видно, что РОН-

синтаза макрофагов по чувствительности к ингибирующему действию бруфена не отличается от аналогичного фермента из везикулярных желез, значение 1С50 составляет около 20 мкМ.

Известным свойством РОН-синтазы из везикулярных желез является также необратимая инактивация фермента в процессе реакции. При малых степенях конверсии субстрата (менее 20%) кинетику накопления продукта описывает следующее экспоненциальное уравнение:

Преобразование этого уравнения в полулогарифмических координатах позволяет определить наблюдаемую константу скорости инактивации фермента в ходе реакции. Методом ВЭЖХ изучена кинетика синтеза простаноидов микросомальными фракциями макрофагов и везикулярных желез (рис.4). По

| 8

1 4

>а 2

У

___1_!._

О 20 40 60 80 100

[АК,мкМ|

Км =(5,3±0,3)"10-5М

-40 -20 0 20 40 60 80 100 VIАК. мкМ|'10!

А.% 100

75

50

25

0

50 100 150 200 250 [Бйфи, мхМ]

Рис.З. Сравнительное определение Км (а) и 1С50 бруфена (б) для фермента из перитонеальных макрофагов мыши (О) и везикулярных желез барана (О). Условия: 25°С, 50мМ Трис-НС1 буфер, рН=8.0, концентрации при определении активности: гемин - 2мкМ, адреналин - ЮОмкМ, белок - 0,12 мг/мл. За 100% принята начальная скорость ферментативной реакции (концентрация АК - 200 мкМ) в отсутствие бруфена.

/

^шс1=0.21±0,02 МШГ

к,пас1=0,17+0,02 МИН"1

о_

о

5 10 15 20 25 30 Время, мни.

а

10 15 20

Время, мин.

за

Рис.4. Полные интегральные кривые накопления РвЕг и их линеаризация в полулогарифмических координатах для микросомальных фракций фермента из перигонеальных макрофагов мыши (О) и везикулярных желез барана (О). Условия: 37°С, ЮОмМ Трис-НС1 буфер, рН=7.6, гемин -2мкМ, адреналин - ЮОмкМ, восстановленный глютатион -1мМ, АК - 0,1 мМ.

кинетике накопления РСЕ2 определены константы скорости инактивации для РСН-синтазы из обоих источников. Получено, что в пределах ошибки они совпадают (рис.4).

Таким образом, впервые проведено изучение РСН-синтазы перитонеальных макрофагов мыши и показано, что РСН-синтаза из макрофагов по кинетическим характеристикам не отличается от аналогичного фермента из везикулярных желез барана.

Постановка метода определения простаноидов в биологических объектах и исследование полученного из макрофагов фермента РСН-синтазы являлись необходимой базой для дальнейшего исследования закономерностей синтеза простаноидов клетками.

3. Роль арахидоновой кислоты - субстрата РОН-синтазы - в регуляции биосинтеза простаноидов.

Исследована зависимость синтеза простаноидов от концентрации АК для целых клеток и их микросомальных фракций. Получено, что макрофаги синтезируют три основных простаноида: РСЕг, РвРга и ТхВ2. Синтез простаноидов макрофагами имеет колоколообразную зависимость, при этом соотношение синтезируемых продуктов РСЕ2>РСр2а>ТхВ2 сохраняется практически постоянным (рис.5). Для микросомальных

120 100

it

i во

3

ъ

5? м

а"

а.

40 20 О

-is [ЛJC.MI -И|«,М|

Рис.5. Синтез простаноидов перитонеальными макрофагами мыши (а) и микросомами (б) в зависимости от концентрации арахидоновой кислоты, а: ¡снетки инкубировали в стерильных условиях при 37°С в атмосфере воздуха с 5% СО^. Время инкубации - 2 часа, б: Микросомы инкубировали при 37°С, в условиях: ЮОмМ Трис-HCl буфер, рН=7.6, гемин - 2мкМ, адреналин -ЮОмкМ, восстановленный глютатион 1мМ, белок 30 мкг/мл. Время инкубации - 30 минут. Обозначения: PGE2 (О), PGF^ (□), ТхВа (А).

фракций показано, что ТхВ2 практически не образуется, а соотношение количеств синтезируемых PGE2 и PGF2a зависит от концентрации АК (рис.5.б). При концентрациях субстрата до 10~4М наблюдается преимущественный синтез PGE2, но дальнейшее повышение концентрации АК приводит к понижению синтеза PGEj и увеличению синтеза PGF2a. Таким образом, отличием синтеза простаноидов целыми клетками от их микросомальных фракций является то, что в клетках обеспечивается сохранение соотношения синтезируемых простаноидов при изменении концентрации АК.

Для дальнейшего анализа этого явления мы сравнили синтез простаноидов макрофагами из АК, поступающей к ферменту в клетке из эндогенного и экзогенного источника. Для исследования синтеза простаноидов из эндогенной АК использовали кальций-ионофор А23187, который активирует процессы высвобождения АК из фосфолипидов клеточных мембран. В предварительных экспериментах определена оптимальная концентрация действия А23187 на высвобождение меченой тритием АК ([3Н]АК) из клеток, которая составила 5 мкМ. Для исследования синтеза

простаноидов клетками из экзогенной АК, субстрат добавляли в среду культивирования клеток, так как известно, что АК с высокой скоростью проникает через плазматическую мембрану (^д^с). В таблице 1 представлены результаты проведенного сравнительного анализа. Получено, что качественный состав синтезируемых простаноидов в условиях, обеспечивающих различное происхождение субстрата, не изменяется: клетки синтезируют 3 основных простаноида - РСЕ2, РОБза и ТхВ2. Однако в кинетике синтеза этих веществ имеются существенные отличия. Так, активный синтез простаноидов наблюдается уже в первые минуты действия А23187 и сохраняется затем в течение, по крайней мере, 2 часов. Тот уровень простаноидов, который синтезируется макрофагами уже через 5 минут активации клеток А23187, достигается при действии экзогенной АК только после 2 часов инкубации. Таким образом первой особенностью синтеза простаноидов клетками является отличие в кинетике их синтеза при использовании субстрата РОН-синтазы, поступающего к ферменту из разных источников. Полученные результаты позволяют предположить, что для РСН-синтазы в клетке предпочтителен эндогенный субстрат, высвобождаемый из

Таблица 1

Синтез простаноидов макрофагами при действии разных стимулов:

время стимул синтезируемые простаноиды

РОЕ2, нг РОР2а, нг тхвг, нг ероб, нг шё2

5 минут А23187 5 мкМ 197+12 78±26 53±3 328±13 2,53

30 минут А23187 5 мкМ 106+13 82+12 36±5 224+10 1,29

АК 10"5М 64+8 51+23 28±2 143+11 1,25

2 часа А23187 5 мкМ 115±5 96±8 40+5 251+6 1,20

АК 10"5м 120±10 86±8 70±5 276+8 1,39

клеточных фосфолипвдов. Действие А23187 приводит к резкому изменению соотношения концентраций пары РОЕ2/РОР2з через 5 минут стимуляции клеток, однако затем это соотношение восстанавливается. Проведенные исследования зависимости соотношения количеств синтезируемых клетками РОЕ2 и РОР2а при разных концентрациях АК (рис.5.а) и использовании разных источников АК (табл.1) позволили выявить вторую особенность синтеза этих веществ макрофагами, а именно: стремление поддерживать постоянным соотношение концентраций синтезируемых простаноидов. Поддержание постоянного соотношения синтезируемых макрофагами простаноидов может играть важную роль в регуляции физиологических функций, так как все эти вещества обладают множественным действием на различные клетки животных и человека, и суммарные биологические эффекты простаноидов зависят от их качественного и количественного содержания в смеси.

4. Базаяьный синтез простаноидов макрофагами и физиологическая роль этого процесса.

Исследована кинетика накопления меченых соединений в среде культивирования макрофагов, предварительно насыщенных [3Н]АК и отмытых от избытка радиоактивности с последующей полной заменой среды культивирования. Показано, что после смены среды активное высвобождение метки клетками наблюдается в течение первых 4 часов, затем устанавливается постояный уровень радиоактивности, который сохраняется, по крайней мере, еще в течение 12 часов (рис.6). Так как эти эксперименты проводили в условиях, когда клетки насыщали [3Н]АК в концентрации 3Х10"9М, которая не оказывает стимулирующего воздействия на синтез простаноидов, то наблюдаемая кинетическая зависимость выброса метки отражает физиологические процессы, происходящие в клетках базально, т.е. в отсутствие внешних стимулов. Высвобождаемая во внеклеточную среду метка может относиться как к самой АК, так и к её метаболитам, поэтому мы исследовали содержание простаноидов в среде при базальном культивировании клеток методом ВЭЖХ. Получено, что в этих условиях макрофаги синтезируют РвЕг, РСр2а и ТхВ2. Кинетика их накопления соответствует

ерш

Время, часы

Рис.6. Кинетика высвобождения [3Н1АК и ее метаболитов перитонеальными макрофагами мыши в процессе культивирования.

представленной на рис.6 кинетике выброса метки, и к 4 часам инкубации в среде культивирования макрофагов устанавливается постоянная концентрация простаноидов (см.табл.2). Таким образом, третьей особенностью синтеза простаноидов макрофагами является способность покоящихся клеток синтезировать простаноиды и затем поддерживать их концентрацию в среде на постоянном уровне. Нами выдвинуто предположение, что базальный синтез простаноидов в макрофагах может играть важную роль в регуляции физиологических функций клеточных систем. Поэтому задачей дальнейшего исследования явилось изучение возможной физиологической роли простаноидов, синтезируемых тканевыми макрофагами базально. Для этого была выбрана система клеток, получаемых из селезенки мыши (спленоциты). Спленоциты содержат и макрофаги, и лимфоциты. Стимуляция спленоцитов митогеном вызывает пролиферацию (деление) лимфоцитов, что является важной функцией иммунной системы. Известно, что сами лимфоциты не синтезируют простаноиды, но имеют к ним рецепторы. Источником простаноидов в системе клеток селезенки могут быть макрофаги. Поэтому нами определен спектр простаноидов, синтезируемых макрофагами селезенки мыши (табл.2). Получено, что эти клетки синтезируют наномолярные количества РСР23 и РвЕг- Далее нами исследовано влияние РОЕг на уровень пролиферации лимфоцитов селезенки мыши. При этом использованы концентрации простагландина как выше, так и ниже синтезируемой макрофагами

Синтез простаноицов перитонеальными макрофагами мыши и макрофагами селезенки мыши.

источник макрофагов время инкубации клеток синтезируемые простаноиды (на 1 млн.клеток)

РОЕ, РСЬЯ ТхВ? РОЕз/РОРь

перитонеальная жидкость 4 часа 310+28 нМ 250+41 нМ 129±13нМ 1,24

сшгеноцшы 12 часов 3,3±0,2нМ 3,4+0,3 нМ — 0,97

селезенки мыши. Степень пролиферации клеток оценивали по включению [3Н]тимидина в клеточную ДНК.

Предварительно была проанализирована кинетика развития пролиферации лимфоцитов и выбраны оптимальные условия исследования действия иммуномодуляторов. Определяющими параметрами развития митоген-стимулированной пролиферации клеток являются концентрация митогена и число клеток, вступающих в реакцию. Поэтому было исследовано влияние митогена конканавалина А (Кон.А) на кинетику пролиферации лимфоцитов, полученных из селезенки мыши, при действии разных концентраций митогена (от 0,1 до 10 мкг/мл) и получено, что наиболее высокая пролиферативная активность достигается при концентрации Кон.А 2,5 мкг/мл. Для дальнейших исследований выбрана концентрация митогена 2 мкг/мл, поскольку известно, что действие иммунномодулирующих агентов на пролиферацию клеток, стимулированных субоптимальными концентрациями митогена, проявляется более эффективно. Для выбора оптимального начального числа клеток нами изучена кинетика пролиферации лимфоцитов при разных начальных концентрациях клеток: от 0,5 млн/мл до 4 млн/мл. Получено, что клетки в концентрации 0,5 млн/мл практически не активируются митогеном, а при концентрациях больше 2 млн/мл проявляется различие в эффектах активации митогеном разных популяций лимфоцитов. Поэтому для дальнейших экспериментов нами была выбрана начальная концентрация клеток 1 млн/мл.

В выбранных оптимальных условиях оценки иммунномодулирующих эффектов исследовано влияние РОЕ2 на кинетику пролиферации лимфоцитов селезенки мыши (рис.7.а). Видно, что 10~7 М РОЕг во всем временном диапазоне ингибирует пролиферативную активность клеток. В то же время кинетика пролиферации клеток при действии 10~9 М РОЕ2 практически не отличается от контроля, а концентрации РвЕ2 ниже 10~9М вновь оказывают супрессирующий эффект на развитие пролиферации спленоцитов. Таким образом, впервые показано, что концентрационный эффект РОЕ2 на пролиферацию клеток имеет бимодальный характер (рис.7.б-в). Действие экзогенного РОЕ2 в концентрации 10"11-1012М и 10"7-10~8М приводит практически к одинаковому супрессирующему эффекту, а концентрация простагландина, соответствующая эндогенной - т.е. наномолярная - регулирует нормальное развитие процесса пролиферации лимфоцитов. Это явление может иметь важное значение для медицины. Так, известно, что при многих заболеваниях уровень концентрации эндогенных простаноидов меняется. Вследствие этого могут меняться и ответы иммунной системы. Действительно, при исследовании влияния предынкубации клеток с РОЕ2 на способность лимфоцитов отвечать на действие митогена получено существенное увеличение супрессирующего эффекта как высоких (10"8М), так и низких (10~и-10'12М) концентраций простагландина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что для физиологической регуляции принципиально важно изменение эндогенной концентрации РОЕ2 в любую сторону от базального уровня. Как повышение, так и понижение эндогенного уровня РйЕ2 при заболеваниях способно изменять процесс развития иммунного ответа организма.

5. Регуляция базального синтеза простаноидов в макрофагах нестероидными противовоспалительными препаратами.

Для дальнейшей характеристики роли базального синтеза простаноидов и поиска путей его регуляции нами исследовано влияние нестерокдных противовоспалительных препаратов на базальный синтез простаноидов перитонеальными макрофагами. Изучено действие бруфена в широком диапазоне его концентраций на высвобождение АК и ее метаболитов из клеток, предварительно

Сргп

концентрации РСЕ?.

• - О М (контроль) □ - 10"7М О - 1<НМ О - 10-9М Л - 10-1"М V - 10"12М

60 80 100 Время, 'ОСИ

б:

в:

48 часов пролиферации клеток

-и -13 -12 -11 -10 -8 !{(РОЕ, М|

72 часа пролиферации клеток

-Н -13 -11 -11 -1С -9 1«1РОЕ„ М|

7

Рис.7. Пролиферация лимфоцитов селезенки мыши в присутствии разных концентраций РОЕг- <Г. кинетика пролиферации клеток, б-в: зависимость пролиферации от концентрации экзогенного РвЕг в разных временных точках. Степень пролиферации оценивали по включению [3Н|тимидина в клеточную ДНК. Тимидиновый тест проводили каждые 24 часа инкубации. Концентрация конканавалина А - 2 мкг/мл, начальное число клеток - 1 млн/мл.

насыщенных [3Н]АК. Получено, что высокие концентрации бруфена ингибируют этот процесс. При этом определяемая величина Ю50 согласуется с величиной Ю50, определенной для микросомальных фракций (рис.8). В то же время пикомолярные концентрации бруфена вызывают активацию выброса метки из клеток (рис.8.а). Методом ВЭЖХ было доказано, что эта активация связана с увеличением синтеза именно простаноидов (табл.3). Для того, чтобы определить, связан ли наблюдаемый эффект активации синтеза простаноидов с регуляцией доступности АК, исследовано влияние бруфена в широком диапазоне концентраций на высвобождение меченых АК и её метаболитов макрофагами, активированными А23187 (рис. 8.6). Получено, что активация макрофагов А23187 не влияет на проявление активирующего эффекта пико молярных концентраций бруфена. Методом ВЭЖХ доказано, что наблюдаемая активация и в этом случае обусловлена увеличением синтеза простаноидов. Таким

- (Бруфен, М1

Рис. 8. Влияние бруфена в широком диапазоне концентраций на высвобождение [3Н[АК и ее метаболитов перигонеальными макрофагами мыши. Время инкубации макрофагов с бруфеном - 2 часа, а: базальный выброс метки, б: выброс метки на фоне действия А23187 (5 мкМ). За 100 % принят уровень радиоактивности в среде культивирования б отсутствие бруфена.

Влияние низких концентраций бруфена на синтез РвЕг и РОРэ^ макрофагами

Бруфен, М Уровень простаглакдинов, % *

РвЕ2 РОРь

ю-' 149±11 150±25

10-ю 154+27 175+25

10"12 315±84 320+20

ю-13 180+25 230+20

10"14 122±20 200+30

образом, получено, что обнаруженный эффект

активации синтеза

простаноидов при действии пикомолярных концетраций бруфена на нестимулированные макрофаги сохраняется и при активации клеток и, таким образом, непосредственно не связан с системой клеточной регуляции доступности АК.

Для того, чтобы определить, связан ли наблюдаемый эффект с уникальными свойствами

самого бруфена, исследовано влияние других нестероидных противовоспалительных препаратов - ингибиторов РОН-синтазы: индометацина и анальгина на синтез

простаноидов клетками. Из таблицы 4 видно, что эти

соединения отличаются друг от друга по химическому строению; значения констант ингибирования (Ю) отличаются друг от друга на порядок. Однако, нами показано, что при действии пикомолярных концентраций любого из этих препаратов наблюдается активация синтеза простаноидов. Следовательно, обнаруженный эффект активации синтеза простаноидов не связан с особенными свойствами бруфена. Таким образом, при изучении регуляции базального синтеза простаноидов макрофагами впервые показано, что классические ингибиторы РОН-синтазы в пикомолярных концентрациях активируют синтез простаноидов в макрофагах.

Эти данные позволяют предположить, что наблюдаемая активация синтеза простаноидов связана именно с регуляцией ферментативной активности РОН-синтазы. Мы исследовали влияние бруфена на кинетические характеристики

*за 100% принят уровень каждого простагландина, синтезируемого клетками в отсутствие бруфена. Время инкубации с бруфеном 2 часа.

1 - индометацин

2 - бруфен

3 - анальгин

Рис.9. Активация выброса [3Н|АК и ее метаболитов макрофагами в присутствии 10"12М нестероидных противовоспалительных препаратов.

Нестероидные противовоспалительные

препараты -ингибиторы фермента _простагландин Н-синтазы_

.0 ТХГ^х У с—а Ф а индометацин ^=(2,4+0.7)10-« М

сн, CHj 1 3 0 ^-CH^-L-CC * --' он бруфен Ki=»(l±0.1)10-5M

СН, / 3 СН; N W ^CHj—SOjNi I ° 0 анальгин К;=(9,8±2,2)10"4М

микросомального фермента PGH-синтаза, однако не обнаружили влияния пикомолярных концентраций бруфена на такие параметры как начальная скорость PGH-синтазной реакции, изменение степени конверсии АХ и процесса инактивации фермента в ходе реакции. Эти данные указывают на то, что наблюдаемая активация синтеза эндогенных простаноидов связана с PGH-синтазой, но существует только на клеточном уровне. Это может бьггь связано с индукцией синтеза этого фермента de novo. Из литературы известно, что рад физиологически активных веществ индуцирует синтез PG Н-синтазы в макрофагах уже к двум часам инкубации. Это приводит к устойчивому увеличению синтеза простаноидов в течение нескольких часов. Поэтому мы исследовали влияние пикомолярных концентраций бруфена на кинетику синтеза простаноидов в макрофагах. Получено, что максимум активирующего эффекта наблюдается при 2 часах инкубации, но к 4 часам он уже исчезает, и уровень эндогенных простаноидов восстанавливается до исходного (рис.10). Эти данные указывают на то, что наблюдаемый эффект активации синтеза простаноидов, по-видимому, не связан с синтезом белка de novo. Возможно, что PGH-синтаза находится в клетке частично в функционально неактивном состоянии, например, в комплексе с эндогенным ингибитором. Действие низких концентраций

75 -

50

0 12 3 4 Время, часы

5

в

Рис.10. Кинетика высвобождения [3Н] АК и ее метаболитов при действии 10'12М бруфеиа. За 100 % принят уровень радиоактивности в среде культивирования в отсутствие бруфена.

нестероидных противовоспалительных препаратов может быть основано на активации перехода РОН-синтазы из неактивного в активное состояние.

Таким образом, нами показано, что макрофаги в покоящемся состоянии синтезируют простановды, количество которых, с одной стороны, поддерживается на определенном уровне, с другой стороны, этот уровень может модулироваться. При этом активация синтеза простаноидов может осуществляется теми же веществами, которые в высоких концентрациях ингибируют их синтез. Установленный факт, что нестероидные противовоспалительные препараты в пикомолярных концентрациях активируют синтез простаноидов клетками является четвертой и наиболее интересной особенностью синтеза простаноидов клетками и имеет важное значение как для фундаментальных исследований закономерностей действия РОН-синтазы на уровне клеток, так и для фармакологии.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оптимизация получения флуоресцентных производных простаноидов с 4-бромометил-7-метоксикумарином и их определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предел чувствительности определения ТхВ2, РОР2а, 6-кеЮ-РОР1а, РОЕ2, РОЕ! составил 0.1, 2, 12, 2 и 2 нг соответственно. Показано, что в присутствии 18-краун-6 эфира

чувствительность определения простаноидов увеличивается.

2. Впервые проведено сравнение кинетических свойств РСН-синтазы из перитонеальных макрофагов мыши и везикулярных желез барана на уровне микросомальных фракций. Показана идентичность кинетических характеристик фермента из обоих источников по основным параметрам: Км, Ю50 для бруфена, инактивации фермента в ходе реакции (к!пас[).

3. Определено, что РСЕ2, РвЕ^ и ТхВ2 являются основными простановдами, синтезируемыми макрофагами, и исследована способность арахидоновой кислоты, субстрата РСН-синтазы, регулировать их синтез. Показано, что: зависимость синтеза простаноидов от концентрации субстрата различается для целых клеток и их микросомальных фракций; кинетика синтеза простаноидов клетками зависит от источника арахидоновой кислоты.

4. Показано, что в процессе культивирования в отсутствие внешних стимулов макрофаги способны синтезировать простановды и поддерживать их концентрацию в среде на постоянном уровне.

5. На основании исследования кинетики пролиферации лимфоцитов селезенки мыши при разных концентрациях митогена и начальной концентрации клеток выбраны оптимальные условия для оценки иммуномодулирующих эффектов простаноидов. Показано, что такими условиями являются: концентрация митогена конканавалина А - 2 мкг/мл, начальная концентрация клеток - 1 млн/мл.

6. С использованием оптимальных условий оценки иммуномодулирующих эффектов простаноидов на пролиферацию клеток впервые обнаружен бимодальный супрессирующий эффект РСЕ2 на пролиферацию лимфоцитов селезенки мыши при его концентрациях 10~8 и 10~12М. Показано, что РСЕ2 не влияет на пролиферативную активность клеток при концентрации 10~9М, соответствующей уровню РСЕ2, синтезируемому макрофагами селезенки мыши в процессе культивирования.

7. Обнаружено, что пикомолярные концентрации нестероидных противовоспалительных препаратов - классических ингибиторов РСН-синтазы - активируют синтез простаноидов в макрофагах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. M.G.Sergeeva, M.Grigorian. Z.Grishina, A.Mevkh. "The existence of low concentration effects of ibuprofen and aspirin on the immune cell responses". Abstracts of 9th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds. Florence, Italy, 1994, p.120.

2. Marina G.Sergeeva, Mariva V.Gonchar. Zoryana V.Grishina, Alevtina T.Mevkh and Sergey D.Varfolomeyev. "Low concentrations of nonsteroidal anti-inflammatory drugs affect cell functions." Life Sei., 1995, vol.56, №16, pp.PL313-319,.

3. M.G.Sergeeva, M.Y.Gonchar. Z.V.Grishina, and A.T.Mevkh. "Macrophage prostaglandin synthesis under influence of ultra-low concentrations of Ibuprofen." Abstracts of First European Congress of Pharmacology, Milan, Italy, 1995. Pharmacol.Res., 1995, vol.31-sup., p. 133.

4. Maria Gonchar. Marina Sergeeva, Victor Chistyakov. "HPLC Method with Fluorescence Detection of Cell Prostaglandin Synthesis." -Abstracts of 10th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds, Vienna, Austria, 1996. Prostagl.Leukotr.Essentl. Fatty Acids, 1996, vol.55, p.67

5. Marina Sergeeva,. Maria Gonchar. Alevtina Mevkh. "Biphasic Effects of Prostaglandin E2 on the Cell Proliferation." - Abstracts of 10th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds, Vienna, Austria, 1996. Prostagl.Leukotr.Essentl.Fatty Acids, 1996, vol.55, p.29

6. Marina G. Sergeeva, Maria V. Gonchar. Victor V. Chistyakov and Alevtina T.Mevkh. "Ultra-Low Concentrations of Ibuprofen Activate Cell Prostaglandin Synthesis." Appl.Biochem.Biotech., 1996, vol.61, №1-2

7. М.Г. Сергеева, M.B. Гонмар. Д.А. Намгаладзе, А.Т. Мевх, С.Д. Варфоломеев. "Простагландин Н-синтаза макрофагов мыши: ингибирующее и активирующее действие бруфена. - Биохимия / Biochemistry (Moscow), 1997, т.62, №3

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АК - арахидоновая кислота,

PG - простагландин, Тх - тромбоксан