Кинетика окисления жирно-кислотных компонентов липидов в присутствии ингибиторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

в ;. 5 9 1

ТОМСКИЙ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. В.В. Куйбышева

На правах рукописи УДК: 541.' 147.2 КАДОЧНИКОВА Галина Дементьеена

КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ ЖИРНО-КИСЛОТНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЛИПИДОВ В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРОВ

Q2.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученоЛ степени

кандидата химических наук

Томск - 1992

Работа выполнена' на кафедре органической химии Тюменского медицинского института

Н1УЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕОТЫ:

ВВДУЦЕЕ ПРВДЛШТИЕ:

доктор химических наук, профессор В.Н.Ушкалова

доктор химических наук, профессор Г.Л.Рыкова ".андидат химических наук, ст.научный сотрудник 'И.П.Скибцца

Томский Ордена Октябрьской революции, Ордена Трудового Красного знамени политехнический институт им. С.М.Кирова

IS92 г.

Защита диссер'*ацил состоится " /А в час. на заседании специализированного совета И 063.53.07 в Томском государственном университете имени В.В.Куйбдаера по адресу: 634010, г.Томск, лр.Ленина,Зо, ТГУ, химический факультет, 6 корпус, ауд. 325, •

С диссертацией можно ознакомиться а научной библиотеке Томского государственного университета.

ч

Автореферат разослан " /%" ¿t i jggg г<

Ученый секретарь оледиализированного. совета, -

кандидат химических наук, .

доиент В.Н.Белоусова

Общая характеристика работы

Настоящая работа посвгацена чсслсдобвдн» кинетики сзободао-раднкального окислегия 'гкирно-кислотньк компонентов липидсз з присутствии биогенных и экзогенных ингибиторов, детализации на этой основе механизма проиесса, а также решению методических вопросов онялиза радикальной,'антиэксвдштной активности природных лилидов.

Актуальность пуоблемн.'Исследование закономерностей окисления природных липидов имеет униЕерсачьное значение. Для лицевой технологии, фармагши закономерности окисления лилидов служат основой д«я прогнозирования их стабильности,'разработки способов стабилизации, анализа качества липидов и пюцег к продуктов, фармпрепаратов, Результаты исследования кинетики, механизма окисления природных .липидов в присутствии биошшюкеидачтов г синтетических ингибиторов имеют значение в медицине при разработке способов ец~ тиоксипантотеплаии- диагностик!; к коррекции лечения рада патологий.

{.Ьхашзм оослени.: липидоо во многом определяется их полинз-ипськценностью, ссставом и концентрацией биоантиокридантоо. ЕаппеЯ-шши хжрио-кксяотшш компонента!»'/, (ШК) всех природных липидов являются олеиновая, л»нолевая, линоленоБая кислоты, содержащие одну, две и три двойные евя~и соответственно. Важнейтч биоадаи-оксидантом, присутствующим во всех природных липидах, является «¿-токоферол. Для ./-токоферола в ухлеводородах установлена ш-.сокая антирадикальная активность (АРА) с константой скорости реакции обрыва цепи на пероксирадикаиах в 50-100 раз прегсгходя"\уа константу скорости аналогичны- реакииР синтетических ингибиторов, В то же время многочисленными исследованиями показана низкая анти-оксидангная активность (АОА) с/--токоферола в липидных субстратах.

Разрешение протигоречия между высокой 4РА и низкой АОА ВС -токоферола возможно на основа исследования кинетических ааконо -мерностей его действия в липидных субстратах.

Цело работы. Установление взаимосвязи между АРА, АОА

с£— токоферола, его концентрацией, скоростью инициирования и на! \сыщен-ноптыз липидных субстратов. ¡.сходя из цели работы решала ■> следующие задачи:

- исследование кинетики окисления мгтмлолеата, метиллинолеата, мстиллянолемата в зависимости от скорости и механизма »'.тшиир нания, кс.ыентр?щии -токоферола;

- сравнение АРА, АОА, механизма действия «/-токоферола и стандартного синтетического ингибитора (ионола) в различных липидных субстратах;

- разработка способов контроля АОА и радикальной активности природных липидов.

Научная новизна. Впервые установлено, что участие -токо-ферэла в реакциях обрыва цепей на пероксирадикалах ЖК липидов проявляется в узком интервале его концентраций, зависящем от скорости инициирования и ненасыдалости субстрата. Путем сравнения результатоь математического моделирования вероятной схемы механизма окисления метиллинолената в присутствии -токоферола^ и экспериментальных данных показано, что снижение АОА «¿-токоферола в ■ липвдных субстратах обусловлено его участием а реакциях продолжения цепей. Доказано, что при понюкени» скорости инициирования увеличивается в-лад реакций продолжения цепей с участием ингибитора в суммарную скорость окисления ЖКК липидов. Впервые показано, . что в природных лилидах концентрация «¿-токоферола в 100-10000 раз превосходит оптимальную, необходимую для проявления высокой АРА и АОА. Впервые определены константы скорости реакции обрыва цепей Для ионола а уятилолеате, метиллинолеате, метиллиноланате,

Разработаны пр«оритетнне способы количественного определения АОА липидов с использованием в качестве внутреннего стандарта ме-тилолеата и выделения метилолеата из смеси эфиров. Разработан приоритетгий спектрофотометрический способ контроля радикальной активности липидов крови в зависимость' от их концентрации. Дани теоретическое обоснование для раэработ! л интегрального кинетического способа контроля АОА и радикальной активности липидов.

Практическая значимость работы. Результаты теоретических исследований положены в основу разработки трех способов количественного определения АОА и радикально}! «¿пиености лялидов кроьи.

Разработаны и внедрены методические рекомендации " Анализ пероксидной активности липидов крови кинетическим и спектрофото-метричес;'мм методами" (Тюмень, 1983, Утверждены Республиканским учебно-методическим кабинетом Минздрава РСФСР от 16.06.1938) в практьлу научных, медико-биологических и клинических лабораторий

* Математическое моделирование проведено С.Я. Александровой с соавтор ам к.

Тюменского медицинского института, гор.больницы $ 2 (г.Тюмень) при диагностика и исследовании уровня СРОЛ биомембран в норме и различных патологиях, коррекции лечения биоантиоксидантами и другими методами, исследовании процессов адаптации.

Работа сходила в программу "Здоровье человека а Сибири" Сибирского' отделения АМН СССР, 1985-1990 г.г., план НИР Тюменского медицинского института с государственной регистрацией под № '01830066908.

Апройация результатов работы. Основные результаты доложены на конференциях: Всесоюзной "Проблема здоровья человека р Западно-Сибирском территориальном промышленном комплексе" ( г.Тюмень, 190?р, ), республиканской "Современные проблемм сиооргаиической химии и химии природных соединения" (г.Алма-Ата, 1984г.), региональной "Аналитика Сибири-86" (г.Красноярск, 1986г.), Всесоюзно?! "Фармакологическая коррекция гипоксических состояния" (г.Гродно, 1591г.),

Публикации. По результатам исследования опубликовано 7 научных работ, получено 3 авторских свидетельства об изобретениях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, включает введение, б глав, выводы и заключение, содержит 19 таблиц, 46 рисунков, приложение, библио -график» из 279 источников, чэ которых 124 источника - иностранной литературы.

Экспериментальная чдсгь

В работе использованы метилолеат, м'тиллинолеат, метилдино-лена, с содержанием основного продукта 97-98%, 95,97,7^ соответственно. Метилолеат получен путем переэтерификации оливкового масла в щелочной среде с последующим выделением и очисткой по оригинальной методике. Метиллинолеат, метиллиноленат получены путем этерификации линочевой, линоленовой кислот метанолом в игг-лой среде. Очистка метиллинолеата проведена методом кристаллизации с мочевиной, метилл.нолената - методом бромирсзаяия-деброми-рования. Эффективность очистки контролировали методом ГЙХ.

«¿-Токоферол (фирма " Зегш" ,<ЗРР), ионол (2,"-дитретб;-тил-4-метилфенол), инициатор 2,2-аэобисиэобутиронитрил' (АИБН), растворители (хлорбензол, ^ептан, ¿-пропансл и др.) использовали после соответствующей очистки по стандартным методикам.

Спектры липидов в гептане в области Р20-ЗС0 нм записывали на спектрофотометре СФ-26,

.¡роиесс окисления исследовали волюшметричесхи с использованием специально счонсгрунровакной установки, включающей ячейку на 5-10 мл с магнитной мешалкой, капиллярный манометр Варбурга, Окисление ыотшюлеата, ыэ т ил л ино л е ?л а, метиллиноланата в присутствие ингибиторов проводили при 60+0,2°С е растворе хлорбензола о со_гнсшегши 1:1 при разных скоростях инициирования. Иссведова-. лось аутсокисленио л инициированное окисление б присутствии (1,6-100)-10"® моль/дм^ ЛЕН. Скорость инициирования определяли па выражению: Ч - ¿'К; [Л , где Ш -концентрация инициатора;КГ константа скорости его распада; £ -сгехиометрический коэффициент, со<к£ототвущнй степени вкхода радикалов из "клетки", равный 0,95; 1,2; 1,0 для растворов мегилолеата, кетшшшолебта, метил- • лкнольната в хлорбензоле соответственно. К4- рассчитывают иэ выражения: _ 30300

к^ Т.53-Ю15 е п С"У (I)

Кинетические параметры рассчитыъали по выражениям 2 и 3, соответствующим известной схеме радикально-цепного окисления углеводородов. 7-У—- 2У

М + г IV <- М, (0)

к- ♦ ■ .(I)

яог- * ян-^кооь + Я' <2>

яо; + (3)

х>г рппч 4. (4)

я о; ЗпН ион *

Щ и» (5)

V * V (б) •

Ш) ♦ 7*Н КО' + X + Н,0 (7)

(Ш + К Г * М ' . (8)

В состветс.таии с этой схемой, при длинных непчх (У>Т), преобладании обрыва цепеР по реакции (4), скорость окисления и период торможения получают ко вьгражений (2) и (3):

, Кксип V; Т /1Ш

Выбор концентрации ингибитора определяли расчетом критической его концентрации по выражению 4, описываюцем условия пресблад ;::!<? об-скьа пепей по реакции (4) /КиШ/] У^/'МпЧ (4). Испольэо-

- У .

е

пал« конпвитрапии ингибитора вне критических.

Механизм ^ф*«зкта .¿-токоферола определяли по результатом наследования характера иэиеивш кшетичзских параметров, а также •путем сравнения кине.ичзских параметров «¿-токоферола и стандартно-гп СИ.ЧТЗП.Ч2СК0Г0 ингибитора. В качество шютнего стандарта был

2,4-дитре?.бутил-б-нагилфенол (иокод) для которого иэвест-участие только а реакциях обрыва цепей, при окислении «глевсдо-рсдог." Специальны* экспериментом был подгвергзден простой моханиам действия изпола б дипидних субстратах. Подтверждение участия ионо-ла только в реакциях обркза цепей получали спрямлением эксперимел-таг.^нык результатов в координатах а (Д в соответствии с выражением (5), гхг.ученжм после интегрирошкня выражения (2).

(5)

Ли найлону прямой в координатах л [О^ ,&С<-^)прн известных рассчитывали параметр ¡^//К^» а ПРИ известных для зфкров рассчитывали параметру К,э для ионола. Полагая/-2, рассчитали II^ для ипгола при С0^0,2°С з истилолеате, неткллкнолегтз и металлн-нолгаате, равные (2,6+0,40)-Ю4; (2,е_1_0,5С) -ТО4; (1,45и),£5) -Ю5 дм^- ыоль~?с~* соответственно. Для ионола в кумоле при 60+0,2°С известна К,, равная (2,40+0,40)-ТО4 ды?моль - с"*. Таким образом, получено подтверждений простого механизма действия различных концентраций «онояа в лилидных субстратах к слабой зависимости знапз-ниП от природы субстрата.

При участии /-токоферола только в обрыве цепей и пр_» рысо-• ком известном для него значении К^ равноч 2,6-10® дАоль"*- с"' следу?т ожидать в идентичных условиях по сравнению с конодоч:

- существенное снижение скоростей окисления;

- спрямления кинетических кривых в координатах Л ,

- соответствие экспериментальных н теоретически рассчитанных по выраиению (2) значений скоростей окисления;

- поскольку величина периода индукции, согласно вкражеш.а (3) не зависит от К^о, то при одинаковых У ,\Я<Н)и Ц' следует ожидать одинаковые периоды индукции, независимо от природы ингибитора.

Отсутствие спрямления кинетики окисления И® липидов в присутствии </. -токоферола в полулогарифмических координатах' или несоответствие теоретически рассчитанных в экспериментальных значений скоростей окисления использовано как показатель изменения механизма действия »¿-токоферола.

Подтверждением участия /-токоферола в продолжении це».ей по-

лучено путем сравнения результатов настоящей работы и математического моделирования кинетики окисления эфиров высших жирных ненасыщенных кислот в присутствии «^-токоферола, осуществленное ранее.

РЕЗУЛЬТАТЫ И .ИХ 0БСУЭДЕШ2

КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ МЕТИЛЛИНОЛЕАТА В ПРИСУТСТВИИ «¿-Т0К0ФЕР0- . ЛА К ИОНОЛА. Определенные представления о механизме действия ингибиторов могут быть получены путем исследования характера кинетических кривых. На рис. I и 2 приведены типичные результаты окисления метиллинолеата в зависимости от концентрации «¿-токоферола и ионола соответственно. Показано, что при критических концентрациях ионола окисление протекает аутоускоренно, без периода полно-, го торможения. Прч увеличении концентрации ионола появляется период полного тормокения, после которого развивается аутоускорениз и достигается предельная скорость окисления. По кинетическим кривим графическим методом рассчитан период индукции. На рис.,3 приведена линейная зависимость пепиода индукцкл окисления метиллино-леата от концентрации ионола. Проведена обработка кинетических кривые окисления метиллинолеата в присутствии ионола в соответствии с выражением 5, на рис.4 приведена линейная зависимость этих результатов в полулогарифмических координатах. Характер кинетических кривых окисления метиллинолеата в присутствии ионола свидетельствует о том, что последний участвует тслько в обрыва цепей. При гчеоких его концентрациях происходит существенное снижение скорости, соответствующей выражению 2, наблюдается период полногс торможения. Этот период тем богьие, чем выше концентрация ислола. По мере расхода ионола возрастает скорость процесса, что проявляется экспоненциальным характером кинетических кривых, спрямляющихся в.полулогарифмических координатах (рис.4). Участие ионола только в реакциях обрыва цепей подтверждается линейным характером зависимости периода индукции от его концентрации (рис.3).

По наклону прямых (рис.4) рассчитан параметр К^/УК^, а

при известном К_п равном при 60+0,2°С для метиллинолеата- 81,38

3 г Т ^ ~

дм мольбе""1 и / разном 2 рассчитана K^g для ионола в метиллинолеата равная (2,6+0,4)• 10^ дм^- моль"^- с . С использованием К^ r.j выражении 2 рассчитаны скорости окисления, которые сравнили с экспериментальными значениями скоростей, рассчитанных на начальных участках кинетических кривых. Показано достаточно хорошие совпадения этих значений в широком интервале концентраций ионола

д1'им5

о т т за? т яо г*,««*

т ь.ч т ею

Рис Л,Кинетика инициированного Рис.2 Кинетика инициированного

окисления метиллинолеата в зависимости от концентрации ионола прии{=1,6-10" моль/дм^с. 1-контроль; 2-5 -10~5; 3-7,5 -КГ5; 4-5-Ю~4}5-7,5-10-^;б-МО-3 моль/дмэ

окислс кия метиллинолеата в зависимости от концентрации Л-токоферола при 1У/=1,6-Ю-® моль/дм?с. 1-конт^эль; 2-1-Ю"5; 3-2,5-Ю"4;

4-4-10"

3-8 • 10"Аюль/дм3

<п (1- /Р

Рис.3 Зависимость периода ин- Рис.4 Кинетика инициированного дукции окисления метиллинолеата от концентрации ионола (I) и «¿-токо- ионола (I) и 1-!0-и (2), ферола (2). 5-10"° (3) мол'/дм3 Л -токоферола.

окисления метиллинолеата в присутствии 3-10 „юл'>/дм3 •.тп-5

(тпбл.Т), что таете подтверждает простор механизм его действия.

Таблица I

Характеристика инициированного окисления моткллиполеата в зависимости от концентрации ионола при Ц Л,6 чоАоль/ды^с. > 1,0-Ю"5 коль/дм3

"ЧХН! ~ ! V3 • ТО' I ! Ут

моль/дма ! моль/дм - с ! моль/дг- с !___

1-КГ5 1,7 45,0 • " 0,037

г. '

2,5 'Ю-0 2,7 10 0 0,127

5-10'5 10,1 9,0 ~1 7,5-М^ 5,7 6,0 ~1 Х.З'ЦГ4 4,0 _ 3,4

4-ГО-4 1,4 1,1 ~1

6-ХО-^ 0(9

1-Ю"3 0,42 0,45 -I

Иную кинетику наблюдаем при окислении в идентичных условиях кетилллнолегта и присутствии »¿-токоферола (рис,2). При всех исследуемых. кеиценгрео«« /-токоферола отсутствует период полного торможения при окислении штиллинолеата. Начальная скорость счисления иетиллу.нолеьта уменьшается при увеличении концентрации юкоферола от 5 -1С до коль/дм^. Но при концентрациях

токоферола 4 -Ю-4 ыэль/ды^ и выше начальные скорости окисления тем вше, чем больше его добавки. Очевидно, что наблюдается несовпадение характера влияния ионола и -токоферола на окисление ме-тшшшэлеага. Характер кинетических кривых окисления метиллкко-леата в зависимости от концентрации Л -токоферола мож?т быть объяснен участием последнего в продолжении гелей. В связи с этим отсутетяует период полного торможения, несмотря на высокую К^, наблндается увеличение начальной скорости окисления с увеличением концентрации Л -токоферола. Зависимость периода индукции окисления метиллинолеата от концентрации.¿-токоферола имеет нелинейный характер » для каэдой его концентрации период индукции ниже, чем для соответствующих концентраций ионола. Подтверждением более сложного механизма действия .¿-токоферола, чем участие только в обрыве цепей, свидетельствует нелинейный характер кинетики в полулогарифмических координатах (рис.4). Участие Л -токоферола в лродолжении цепей подтверядается более в 2-100 раз превышением эк-

сперимептальних значений скоростей окисления метиллннолеага 9 tipi сутствии «¿-токо{»рояа по сравнен»™ с теоретическ"ч |>ясчотгм по вцраяения (2),(табл.2).

Таблица 2

Характеристика ииншировакиого окисления сетичлнмолепта

п завшгаости от концентрации А -токофероле прч V; = T.G-IU"8 моль/дм3- с lX"L!1?:> 0,72-10-7моль/д>..3

Ш!1

_ноль/ам3

3-Ю

7 ■

\J IV

7,5-КГ7 I-T0'6 3-I0-6

____А

очи * 7,5-Ю"3 МО-0 2,5-ТО"5

I уэ 10/ I . моль/дм • с

V/T; W

.моль/дм • с

Vo/ V Т

5-Ю" 7,5-10

МО 2,5-10 4-Ю

6-10 8-10'

-5 -4 -4 i-4 ,-4 ,-4

3,14 6,06

4.56

3.57 3,07 а, 137 4,24 4,2 1,49 0,71 1,41 3,17 1,36 0,98 0,63 0,45

11,67 6,96 4,64 3,48 1,16 0,690 0,46 0,35 0,339 0,0696 0,046 0,035 0,0139 0,0097 0,0058 . О,00435

л,27 0,37

- I

2,64 4,12 9,?. IЯ

8,56 10,20 30,6 90,5 97,0 И2 103 ЮЗ

Подобное сравнение кинетики, механизма .действия •¿'-токоферола, ипнола в мегиллинолеате проведено при аутоокислении и инициированном окислении со скоростями инициирования равными 1,6-IU""V 4,8-Ю-^; 4,8-10"'; 1,14-10"° моль/дм3-с. При всех условиях показано участие ионола только в реакциях обрыва цепей и усложнение механизма действия ^-токоферола. При аутоокислении метиллинспеа-та, когда скорость заро^чения пепеР составляла при 60°С 4,9-10""^ моль/дм -с, уст;шовлен нелинейно возрастающий характер изменения периода индукнии от концентрации ^ -токоферола. Это объяснено регенерацией ингибитора по ^еакции:

- СН'= CH-CH(00)-CUo- +Х'----- %И + -СН=СН-СМ=СН- + О,

Период чндукции инициированного скп^пент метиллинолеата в цри-сутсиши ^-токоферола все!^а в 2-25 р^.за нижа, чем под действием ионола, а скорости в 2,5-110 раз выше расчетных. Во всех случаях кинетика окисления метшишюлеата в присутствии «¿"-токоферола на спрямляется в полулогарифмических координатах. На этом основании сделан вывод о сложном механизме действия «¿-токоферола в метиллинолеа/ге, о его участии не тлько в реакциях обрыва, но к реакциях продолжения цепей. Однако при увеличении М наблздается расширение интервала концентраций ^-токоферола при которых он участвует только в реакциях обрпа цепей, уменьшается разница между теоретическими и экспериментальными значениями периодов индукции ( Гт/ Го) и скоростей окисления. Так для концентрации <£-токоферола 1-10"^ моль/дм^ при скоростях инициирования 1,6'Ю-®; 4,3-10"®; 4,8-10"' моль/дм^-с отношение ? т/Га составляет 40; 2,7; 1,5 соответственно. То есть с увеличением скорости инициирования уменьшается вклад реакций продолжения цепей в механизм действия «¿-токоферола.

Для биологических объектов важно соотношение концентраций токоферола и 2.1СК лилидов, при котором проявляется только его АРА. .Произведенный в настоящей работе расчет показал, что концентрации ^-токоферола в природных л ил ид ах в 100-10000 раз превосходят оптимальные его концентрации. Полученные результаты позволяют пересмотреть существующее представления об оптимальных соотношениях КОЖ Липидов и биоантиоксидантов в биологических системах. По результатам настоящего исследования можно прогнозировать, что в ли-пидных субстратах линслевого типа высокая АРА и. токоферола, подавление его радикальной активности будет проявляться при соотношениях I: (15-20) •Ю*' и скорости инициирования равной 1,6-10"® моль/дм?. При увеличении скорости инициирования, что легко достигается в биологических субстратах участием ферментов, это соотношение будет уменьшаться.

КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ ЖПШШОЛЕЭДТА, МЕТИЛ0ЛЕАТА В ПРИСУТСТВИИ Л -ТОКОФЕРОЛА И ИОНОЛА. На рис. 5 приведены результаты сравнения кинетики окисления метилолеата, метиллинолеата, метиллино-лената при одинаковых концентрациях ¿-токоферола и ионола. Показано, что в метиллиноленате аффект промотирования процесса«¿-тр-коферолом усиливается. Возрастает разница между начальными скоростям.. и периодами индукции под влиянием ионола и «¿-токоферола, которые наблюдали в метилллнолеате. Этот факт евидетельотьует о

- та -

¿и™5

я? гсо

Рис.5 Кинетика инициированного окисления метиллиноленатг (1,2), метиллинолеота (3,4), мотилолеата (5,6) в присутствии г(-токоферола (1,3,5) и ионэла (2,1,6) при V/; =4,8 'ТО моль/дм3, с : 1,2- 4-Ю"3; 3,4 5,0-8-ТО-3

моль/дм .

от гот я® № '•'•"к

том, что с увеличением ненасиценности липидных субстратов возрастает вклод реакций продолжения пепеР на»¿-токофероле в кинетику процесса. Показано, что ионол в метлллиноленате участвует только в обрыве цепей, при этом кинетика спрямляется в полулогарифмических координатах. Из наклона зависимости в коор, ;ината:с л10р] ,

известном К„9 при 60°С для метиллшталената равной 2,3-10^ о т т ^ ^ ^ т т

дм° ноль • с-1 рассчитана Н^ равная (1,45+0,25)-10 дн-моль. с .

Кинетика окисленгя метнллинолената в присутствии '■¿'-токоферола при всех исследованных скоростях инициирования не спрямляется в полулогарифмических координатах, экспериментальные скорости существенно превьшают теоретически рассчитанные по выражению 2, периоды индукции всегда ниже соответствующих периодов в присутствии ионола.

Длт подтверядения существенного вкладе, реакций продолжения цепей с участием *С -токоферола в метиллинолзнате было проведено сравнение экспериментальных результатов и данных математического моделирования. В расчете кинетики окисления метиллинолената была

* Т Т

использована К,п равная 2,6-10 дм ■ моль

V П О П

с Константы скорос-

7 ' 2 Я _

тей реакций 7 и 8 равные 3 -10 , 10 дм°- моль с " соответствен

но. Получено совпадение троретически рассчитанных и эксперимен -

тальных результатов.

В метилолеате, который имеет Кр£ равную 2,24 дм"-моль"*-с"* в 100 раз меньшую чем в метиллиноленате, усложнение механизма дейстьия «С -токоферола менее наглядно сказывается на характере ки-нетигэских кривых. Окисление метилолеата в присутствии большинства добавок «¿-токоферола протекает с периодом полного торможения,

о

- и -

и увеличением концентрации добавок увеличивается период индукции. Начальная скорость окисления в присутствии «¿-токоферола ниже,' чем при соответствующих концентрациях школа (рис.5). Однако исследование других кинетических параметров свидетельствует о сложном механизме действия »¿-токоферола но только в мэтиллинолег. 1-е, метиллиноленаю, но и метилолеате. Подтверждением этому слухи','? то, что кинетики не спрямляется в полулогарифмических координатах, га-висшосзд периодов индукции окисления метглояеата при разгелс скоростях ышшшрования в зависимости от конц-ктреции «^-токоферола шлегит целинейний характер. При одинаковых концентрациях период индукции о присутствии »¿-токоферола ниже, а скорости выше, чем под действием ионола. Кинетика окисления метилолеата в присутствии ионила спрямляется б полулогарифмических координатах. По наклону прямых рассчитана К^, равнан при 60+0,2°С (2,6+0,40)-10*' Д1Г3- моль-*- с-1.

Характер действия/-токоферола в зависимости от некасцщсшос-ти афиров изучен путем сравнения периодов индукции окисления ме-. тилолеата, ыепшшнолеата, ыетиллиноланата при скорости иннцккро-ьания равной 4,8-10~^моль/дм^ с.

Сравнивали разниц)' периодов индукции окисления эфира и эфира п присутствии-добавок / -токоферола (аГ). Показано (табл.3), что в метиллииоленате период индукции при физиологических концентрациях »С -токоферопа (4-8)-10 моль/дм3 существенно нше, цом в мэтилолеате, метиллинолеате. В последних периоды индукции близки. При когшентрациях выше физиологических (4 •Ю"А?оль/дм^) в ыз-тиллиьоленате период индукции падает при переходе от метилолеата к мьтиллинолеату, метиллиноленату, но в метшшшоленаге существеннее. Очевидно, что наиболее существенное усложнение механизма действия«¿-токоферола происходит в более ненасыщенном мзтцлдино-ленате.

Таблинд 3

- Сравнение АОА «¿-токоферола в зависимости от нена-сщенкости субстрата при ^ = 4,8 •10~'модь/дм'^ с

! Метиллиноленат ! ! ¿Г 1 1 Металлинодеат ! 1 аТ~ I Метилолеат »т

4-Ю"4 11,5 35 37

8-Ю"4 30 65 65 1

4-ТО"3 35 127 190

шенйе штгодичесш вопгосое анализа ¿шюксидангкоп и радикальной активности пшгодах лигб1д0в

Результаты определения о настоящей работе огтималышх отношений л-токоферола и ККК липидов при которых проявляется тлсо- • кая АРА ингибитора, позволили разработать.кинетический способ контроля АОА природных липидов.

Выявленные закономерности изменения характера кинет: чпских кривых.б зависимости от ненасиденности лкпкдного субстрата и '/.он-центр&иии ингибиторов легли о основу разработки интегрального кинетического способа контроля АОА и радикальной а ¡давности липидов, разработан спсктрсфотометрический способ контрен радикальной активности липидоз.

Разработки максимально приближены к практике биохимических и клинических исследований, с этой целью в качестве объекта исследований использованы липиды крови и ге фракций, к разработан-' методические рекомендации для их практического использования.

способ конгголя аншоксвдшной активности липидов. Сущность

о

способа состоит в том, что пробу мзтилолеата объемом 0,5-2,5 ом^ смешивают с равный объемом хлорбензола, в пробу вродлт инициатор в количестве 0,5-4 мг/см^ раствора, пробу насыщают кислородом при температуре 60+0,2°0, затем измеряют время (поглощения 25 кислорода на I см^ метилолеата. В аналогичны), условиях окисляют пробу в присутствии 1-3 мг липидов, определяют вреип ^Чшд^ поглощения 25 мм^ кислорода на I аР метилолеата. Рассчитывают АОА липидов по отношению периодов иццукшга. Для определения оптимальных концентраций добавок липидов исследовали кинетику окисления при 60+0,2°С метилолеата ь растворе хлорбензола в соотношении 1:1 по объему в присутствии б моль/дм"3 инициатора. Использовали добавки липидов плазмы крови доноров з концентрации от 0,5 до 300 мг/см0 Показано, что все добавки липидов тормозят окисление метилолеата. С увеличением концентрации липидов эффективность торможения падает, поэтому зависимость периода индукции окисления метилолеата от концентрации липидов имеет нелинейный характер, что связано с увеличением вклада реакций продолжения чепей о участием биоантиоксидантов. В качестве рабочих выбраны ^оннентраиии, соответствующие линейному участку зависимости в

предо' гх 0,5-4 мг/см^. С испольсоегниом природных липидов разного состава показана достаточная воспроиз-Р^имость, доступность слоо-6а для использования в биогчмических лабораториях. Поскольку на воспроизводимость результатов использования способа существенное влияние оказывает степень чистоты метилолеата, нами разработан способ получения метилолеата высокой степени чистоты. Сущность способа состоит в том, что метилолеа? выделяют из смеси метиловых афиров жирных кислот оливкового масла пут*;м двукратной кристалли-зацк . из метанола а виде клатратов с мочеьяной при температуре -5°С: первая кр-сталлнэация зак.шает 10-20 мин при массовом отношении смеси эфиров:мочевины:метанола I:(I,I-I,2):(7,9-8,69); вторая кристаллизация занимает 12 часов при массовом соотношении смеси эфиров:мочевиин:метанола I:<4-5):(14,22-15,8). Выход метил-олеатр составляет 35-40$ с чистотой 97-98%.

СПОСОБ КОНТРОЛЯ РАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИПИДОВ. Сущность.способа состоит в том, что пробу 0,02-0,1 мл цельной крови, или плазмы крови, или эритроцитов гомогенизируют с 100-500-кратным избытком растворииля гептан-2-пропанол (1:1 по объему), встряхивают в течение I мин, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мчн, отбирают геп-тановый оКстракт, который фотометрируют в максимуме первой.и второй полос в области 230-260 нм. Концентрацию ПОЛ рассчитывают d единицах оптической плотности пробы при каждой длине волны на мг липидов. •

При разработке способа исследована эффективность Экстракции общих липидов крови и ее фракций Ю-КУХЮ-кратн м избытком бинарной смеси гептан-2-пропанол. Для количественного сравнения эффективности экстракции показатели общих липидоа и продуктов ПОЛ при 10-кратном избытке приняты за контроль. Эффективность экстракции контролировали по поглощению при 232 нм и концентрации общих липидов Показано, -чт. эффективность экстракции липидов возрастает в 70-100 раз при увеличении объема экстрагента от 10 до 10000-кратного избытка, лучшая воспроизводимость отмечена при экстракции 100-500-кратным избытком экстрагента.

При разработке способа исследованы также УФ-спектры многочисленных проб липидов и индивидуальных соединений. Показано, что продукты перекисного окисления проявляются при 230-240 нм в виде шпча и в области 260-280 нм в виде широкой полосы. Путем сравнения спектров липидов и индивидуальных соединений показано, что

лрл 220-240 им поглощают сопряженные диены пероксидного и непер-оксидног I типов, при 2Г)0-Г!30 им поглощают сопряженные тричны.

С использованием данного способа установлены физиологчческиз показатели радикальном активности липидов кропи человека в зависимости от возраста, проведено также определение интенсивности пе-рекисного окисления лит.дов крови при адаптации рабочие к новым климато-географи':еским условиям и режик'ам труда. Для этих исследование использовано более 300 проб крови и ее фракций.

1. На основании результатов исследовании кинетики кисления метилолеата, метиллинолеата, метиллиноленята в присутствии различных концентраций«/-токоферола, сравнения с характером влияния стандартного ингибитора в идентичных условиях установлена взаимосвязь между его АОА, АРА и ненаеыщенноотыо липидного субстрата, скорость» и мехенйзмом инициирования.

2. Показано, что ¿-токоферол во ~сех субстратах участвует не только в реакциях обрыва, но и реакциях продолжения попей. Наибольший вклад реакций продолжения нет Я с участием «¿-токоферола характерен для чаиболее ненасыщенного субстрата - метиллинолената. В метилолеате и четиллинолеате вклады этих реакций близки, В каждом субстрате установлены условия, при которых «¿-токоферол участвует только в обрыве цепей. Вклад реакций обрыва целей на ^-токофероле во всех субстратах возрастает с увеличением скорости инициирования. При скорости инициирования равной 1,6 Т0~8моль/дм^- с оптимальные соотн ' еата или метиллино-

3. Путем сравнения кинетических параметров окисления ЖКК ли-пидов и результатов математического моделирования вероятно? схомы механизма окисления метиллинолената в зависимости от концентрации /-токоферола подтверждено его участие в реакциях продолжения цепей.

4. Показано, что высокая АРА ¿-токоферола в липидных субстратах проявляется при концентрациях в 100-10000 рэз превосходящих физиологические. На основании исследования кинетики предложен новый подход при поиске способа регулирования АОА биоантиокен -дантоэ. Показана возможность регулирования активности бкоантиокси-дантов не только подбором v.x концентрации, но и путем изменен .я ско; эсти инициирования радикального окисления биосуб-лратов,

5. Проведено сравнение механизма действия, АОА ¿-токо&рела

общие вивида

леата доставляют

соответственно

и ионолг. Во всех липидных субстрата:, при исследуемых условиях окислении показано участие Фонола только ч реакциях обрыва цэпэй. Определена АРА ионола Ш^) ПР!1 60+0,2°С в метилолеате, метиллино-леате, метиллиноленате.

6. Во всех исследуемых липидных субстратах наблюдали снижение АОА «¿-токоферола по отношению к ионолу, что обусловлено его участием в продолжении цепей.

7. Результаты кинетических исследований, определение оптн -мальны. соотношений инициатора, биоантиоксидантов и ЖК липидов использованы в рапаботке трех способов анализа АОА ч радикальной активности природных липидов. Способы внедрены в практическое здравоохранение, на всех базах внедрении получен положительный аффект в повышении информативности, снижении трудоемкости и расии-реь.ш области применения.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. A.c. I051428 (СССР), МКИ3 01/33/48. Способ определения еч-тиокислительной активности липидов. Ушкалова В.Н. ,Кадочникова Г.Д. .(СССР).- К 3367314; заявл. 16.10.ISSI; опубл. БИ 1983, № 40.

2. A.c. Ни2785 (СССР), Ш3 С07с 69/58, 67/52. Способ веда-ления мзтило^еата из сыесн метиловых эфнроп ншрних кислот оливкового масла.'Ушкалова В.Н..Кадочникова Г.Д. (СССР),- № 3620957/2304; заявл. 26.04.83; опубл. БИ 1935, 23.

' 3. A.c.' 1303938 (СССР), МКИ3 01/33/48. Способ определения продуктов перекисного окисления липидов крови. Ушкалова В.Н..Кадочникова Г.Д.(СССР).- ii 3933845/28-13; I7.07.IS85; опубл. БИ 1987, № 14.

4. Ушкалова D.H.,Кадочникова Г.Д. Кинети-а окисления липидов. III,Сравнение эффективности природных и синтетических ингибиторов // Кинетика и катализ,- 1984.-T.25.-fiH,- С.794-737.

5. Ушкалова В.Н.,Кадочникова Г,Д. Воеможность подмены биоантиоксидантов синтвтк гескиыи ингибиторами при стабилизации липидов// Деп. ВИНИТИ,U.,1985.- №3(161).- C.I62.

6. Кадочникова Г,Д.,Ушкалова В.Н. .Ибрагимова С.Н, Отбор условий анализа продуктов перекисного окисления липидов кропи спектро-фотометричоским методом//деп,ВИНИТИ,М. ,1987.-И.- С. 1060,

7. Ушкалова В.Н,.Иоанидис Н,В.,Деева 3,М..Ибрагимова С,Н., Кадочникова Г.Д, Комплексный анализ радикальной активности лип и-г дов кчови спекарофотометрическим, фдооримотрическим и кинетическим методами//Лабораторное дело,-1987.-?f6.- С,446—150,

8. Ушкалова В.И..Кадочникова Г.Д. Использование параметров, характеризующих активнос'1 о переписного окисления липидов, при изучении адаптации человека к новым климато-географичесиим условиям// Бюлл.зксперим.биологии 1« медицина.-1967.-Т.51.-КЗ.-С.571-573.

9. Ушкалова В, Н. .Кадочникова Г.,Д. ,Иоанидис Н.В.,Деева З.М,. Методические аспекты исследования механизмов изменения липидов мембран при гилокоических состояниях//"Фармакологическая коррекция гипоксических состояний":Тез,докл.2оЯ Всесоюзной, ксчфэренции, Гродно, 1991.- С, 456.

10,..Кадочникова Г.Д. Кинетика, механизм окисления ж.фно-кис-лотных компонентов липидов в присутствии ингибиторов.-В кн.:Пере-кисное окисление липидов в эксперименте и в клинике.-Свердловск, 199<2.(теыплан издательства Свердловского медицинского института).

Зя*. Й7. тир. 100, отп. ООП Облетят г. Тюмень