Комплексы катионных полимеров с липидными везикулами: получение, динамические свойства и применение тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

004611922

Давыдов Дмитрий Александрович

КОМПЛЕКСЫ КАТИОННЫХ ПОЛИМЕРОВ С ЛИПИДНЫМИ ВЕЗИКУЛАМИ: ПОЛУЧЕНИЕ, ДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 8 ОКТ 2о,о

МОСКВА-2010

004611922

Работа выполнена в лаборатории синтеза и изучения свойств полимеров кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Штпльмап Михаил Исаакович доктор химических наук, профессор Литмапович Андрей Аркадьевич

Ведущая организация:

Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова» (МИТХТ им. М.В. Ломоносова).

Защита состоится 27 октября 2010 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119991, г.Москва, Ленинские горы д.1, стр.3, МГУ имени М.ВЛомоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус «А», кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова.

Автореферат разослан Я. H сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н.

Долгова А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Сферические бислойные липидные везикулы (липосомы) известны в течение более 40 лет. Устойчивый интерес исследователей и практиков к липосомам объясняется рядом соображений: хорошей биосовместимостью липидов, большим разнообразием методов их получения, простотой контроля липидного состава и размера липосом, а также возможностью приготовления смешанных липид/белковых везикул. С помощью липосом оказалось возможным моделировать строение и физико-химические свойства биологических мембран. Это обстоятельство было использовано для анализа механизма взаимодействия клеток с синтетическими водорастворимыми полимерами, в частности, полиэлектролитами.

Принципиальным является вопрос о способности адсорбированных полиэлсктролитов мигрировать между липосомами, т.е. об обратимости контакта полиэлектролит-липосома. Ответ на этот вопрос важен как с теоретической точки зрения для количественного описания формирования и поведения полимер-коллоидных комплексов, так и с практической для разработки лекарственных препаратов направленного действия на основе полимеров. Между тем, до последнего времени этот вопрос в литературе практически не обсуждался.

Известно, что адсорбция полиэлектролитов на липосомальной мембране часто сопровождается агрегацией липосом. Это существенно осложняет постановку экспериментов по межлипосомальной миграции макромолекул и интерпретацию полученных результатов. В связи с этим нами было предложено использовать (наряду с традиционными анионными липосомами) два других типа липосом: 1)«гидрофилизованные» анионные, мембрана которых была ковалентно модифицирована цепями полиоксиэтилена, и 2)трехкомпонентныс, состоявшие из цвиггер-ионного, анионного и катионного липидов. Такие липосомы не агрегируют в присутствии поликатиона, что открывает путь к экспериментальному изучению перехода макромолекул поликатиона с одной липосомы на другую.

Цель работы заключалась в изучении межлипосомальной миграции катионных полимеров, в установлении структурно-химических характеристик липосомальных мембран в контакте с поликатионами и в определении токсичности комплексов поликатион-липосома.

В работе исследованы:

а) адсорбция катионных полимеров, кватернизованных производных поли-4-винилпиридина, на поверхности традиционных анионных липосом, сформированных из

фосфатидилхолина (ФХ) и дифосфатидилглицерола (кардиолипина, КЛ2"); гидрофилизованных ФХ/КЛ2" липосом со встроенным в бислой неионогенным ПАВ -эфиром полиэтиленгликоля и цетилового спирта (Бридж 58); и трехкомпонентных электронейтральных липосом, состоявших из ФХ и взятых в равных количествах КЛ2" и дицетилдиметиламмоний бромида (ЦМАБ1+);

б) структурные перестройки в липосомальных мембранах, вызванные адсорбцией поликатиона;

в) миграция адсорбированных катионных макромолекул между липосомами;

г) токсичность комплексов поликатион-липосома, в том числе с участием липосом, наполненных противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (Доке), по отношению к клеткам и экспериментальным животным (мышам).

Научная новизна. Продемонстрировано, что адсорбция поликатиона на поверхности анионных гидрофилизованных липосом, модифицированных ковалентно пришитым ПЭГ, сопровождается образованием доменов отрицательно заряженного липида, а также изменением конформации ПЭГ. Впервые показано, что связывание поликатиона с электронейтральными липосомами, содержащими положительно и отрицательно заряженные компоненты в равном мольном соотношении, не сопровождается латеральной сегрегацией липидов. Установлено, что гидрофилизованные и электронейтральные липосомы не образуют агрегатов при связывании с поликатионом. Выявлено, что комплекс поликатион-липосома способен обмениваться макромолекулами: в случае образования агрегатов происходит частичное перераспределение звеньев (сегментов) молекул полимера между липосомами; при отсутствии агрегатов наблюдается миграция адсорбированных макромолекул между индивидуальными липосомами. Впервые показано, что модификация поликатионом поверхности гидрофилизованных липосом позволяет эффективно осуществлять доставку доксорубицина в ядра клеток, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

Практическая значимость. В ходе исследования модельной системы поликатион-липосома получены результаты, имеющие принципиальное значение для понимания механизма взаимодействия синтетических полиэлектролитов с клеточной мембраной. Описанная в работе межлипосомальная миграция поликатиона служит экспериментальным обоснованием поиска и узнавания целевых клеток биологическими активными комплексами с участием синтетических полимеров. Результаты работы и сделанные на их основе выводы позволяют прогнозировать поведение синтетических полимеров на поверхности клетки и реакцию клетки на адсорбированный полимер и должны быть приняты во вниманием при разработке смешанных полимер-липосомальных

контейнеров для транспорта биологически активных веществ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 45-ом международном микросимпозиуме "Структура и динамика макромолекулярных систем " (Чехия, Прага, 2006), 4-ой международной конференции "Наука о полимерах 21-му веку " (Россия, Москва, 2007), 8-ой международной конференции Jülich Soft Matter Days 2008 (Германия, Бонн, 2008), 22-ой международной конференции Европейского общества коллоидной химии и химии поверхности (Польша, Краков, 2008), а также на XIV, XVI и XVII-ой Международных конференциях «Ломоносов 2007, 2009 и 2010» Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатные работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 168 ссылок.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В литературном обзоре проанализированы приведенные в литературе данные о структуре липидного бислоя, способах повышения коллоидной стабильности липосом, взаимодействию катионпых полимеров с липосомами и структурным перестройкам в липидных мембранах под действием поликатионов. Описаны факторы, оказывающие влияние на проницаемость липидных мембран. Приведены примеры использования липосом в качестве носителей лекарственных препаратов; описаны свойства клеток, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования. В работе использовали следующие катионные сополимеры (в скобках указаны составы): Ы-этил-4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (9,5/0,5), П2, и М-этил-4-винилпиридиний бромид/К-цетил-4-винилпиридиний бромид/4-винилпиридин (9/0,5/0,5), П2,16. Состав сополимеров был определен методом ИК спектроскопии. Степень полимеризации обоих поликатионов была равна 600. Концентрация катионных сополимеров приведена в молях кватернизованных групп на литр раствора.

Для получения липосом использовали растворы веществ в хлороформе: цвиттер-ионного ФХ (I), анионного ЮГ2- (II), катионного ЦМАБ|+ (III), ПЭГилированного липида (IV) и 1,2-диолеоил-£п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Ы-(карбоксифлуоресцеина) (ДОФЭА-

КФ) (V) (рис. 1). В работе все эти соединения с полярной «головкой» и одним или двумя алкильными радикалами объединены термином «липид». Липосомы готовили ультразвуковой обработкой водной суспензии липидов. Мольная доля отрицательно заряженных полярных головок рассчитывалась следующим образом: у(-) = 2[КЛ2" ]/(2[КЛ2"] + [ЦМАБ"] + [ФХ]+ [ПЭГ-липид]), мольная доля положительно заряженных групп как у(+) = [ЦМАБ1+]/(2[КЛ2']+[ЦМАБ'+]+[ФХ]) и мольная доля ПЭГшшрованного липида как у(ПЭГ) = [ПЭГ-липид]/ (2[КЛ2"]+[ФХ]+[ПЭГ-липид]). В работе использованы

анионные двухкомпонентные ФХ/КЛ

липосомы

v(-)

трехкомпонентные ФХ/КЛ27ПЭГ -липид липосомы с v(-)

= 0.2, анионные у(ПЭГ) = 0.2 и

электронейтральные трехкомпонентные ФХ/КЛ2"/ЦМАБН липосомы с v(-) = v( t) = 0.2.

НзС @ H3C-N—(СИ2)2\0

ОН

H-.C

н3с \

н2с— о-р=о

Н2С- 1 -сн 1 -о©

о о

о=с с=о 1

1 1 R3

(I)

е ? о-р-о

I

0

1

сн,

I

н2с—сн

I I

0 о

1 I

о=с с=о I I R, R,

0 „

Ii е о-р-о

1

0

сн,

1

НС—сн2

I I

0 о

1 I

о=с с=о I I R, R2

(II)

6

9 Н2 О

о

II

о

(V)

н2с—о—с-II о

-С „II*

Вг

С,,1b

-N-

©

(III)

СН,

C,SH,-

Н2

с15Чз2 (IV)

Рисунок 1. Формулы использованных в работе липидов: / - яичный лецитин или фосфатидилхолин (ФХ), 11 —кардиолипин КЛг~, III - дицетилдиметиламмоний бромид (ЦМАБ*), IV - Бридж -58, V -1,2-диолеоил-5п-глицеро-3-фосфоэтанола.иин-Ы-(карбоксифлуоресцеина) (ДОФЭА-КФ)

Размер (гидродинамический диаметр) малых моноламеллярных липосом колебался

от эксперимента к эксперименту, но не выходил за пределы интервала 80-100 нм.

Электрофоретическую подвижность (ЭФП) липосом определяли методом лазерного

микроэлектрофореза. В работе использовали также методы флуоресцентной, УФ и ИК

спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и изотермической

титрационной калориметрии (НТК), кондуктометрии и потенциометрии. Воду для

6

приготовления растворов очищали двойной перегонкой с последующим последовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр для удаления крупных частиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Формирование комплексов катионного полимера с лнпосомами.

Для регистрации взаимодействия П2 с липосомами был использован метод лазерного микроэлектрофореза. Адсорбция полнкатиона сопровождается изменением поверхностного заряда липосом, что отражается на величине их ЭФП. На рис. 2а приведены зависимости ЭФП при добавлении П2 к трем типам использованных в работе липосом: ФХ/КЛ2", ФХ/КЛ27Бридж и ФХ/ЮГ/ЦМАБ1*. Для традиционных ФХ/КЛ2" липосом (кривая 1) и гидрофилизованных ФХ/КЛ2УБридж липосом (кривая 2) добавление П2 вначале приводило к уменьшению ЭФП липосом до нуля, затем происходила перезарядка поверхности частиц и, наконец, ЭФП достигала своего предельного положительного значения. В обоих случаях нейтрализация поверхностного заряда липосом достигалась при [П2эфп=о] = 2,8* Ю^М, что соответствовало концентрации отрицательно заряженного КЛ2~ в системе.

а б

Рисунок 2. Зависимость ЭФП (а) и диаметра (б) частиц комплекса П2-липосома от концентрации П2. ФХ/КЛ2' (1 и Г), ФХ/КЛ27Бридж (2 и 2') и ФХ/КЛ2'/ЦМАБ1 + (3 и У) липосомы. Суммарная концентрация липидов I мг/мл; [КЛ2] = [ЦМАБ'*] = 2,8*1(Г'М; Ш2М боратный буфер, рН 9.2.

Понижение ЭФП исходных ФХ/КЛ2"/Бридж липосом по сравнению с двухкомпонентными ФХ/КЛ2" липосомами (начальные точки на кривых 1 и 2) было связано с появлением на поверхности мембраны ПЭГ слоя и, как следствие, смещением плоскости скольжения в поверхностном слое липосом вглубь раствора.

Что касается электронейтральных ФХ/КЛ27ЦМАБН липосом, их заряд сдвигался в положительную область по мере увеличения концентрации П2 и достигал максимального значения + 1,2 (мкм/с)/(В/см) при [П2]=0,5х10 М.

Полученные результаты свидетельствовали о связывании катионного П2 со всеми исследованными липосомами: анионными ФХ/КЛ2" и ФХ/КЛ2'/Бридж и электронейтральными ФХ/КЛ2"/ЦМАБ1+.

Параллельные измерения размера (гидродинамического диаметра) частиц в суспензиях методом фотонной корреляционной спектроскопии показали наличие агрегатов только в системе «П2 + ФХ/КЛ2" липосомы» (кривая 1' на рис. 26), в двух других случаях наблюдалось лишь незначительное возрастание размера частиц после добавления П2 (кривые 2' и 3' на рис. 26). Агрегативная стабильность комплексов П2 с ФХ/КЛ2"/Бридж липосомами была обусловлена наличием гидрофильного слоя молекул ПЭГ, который препятствовал пространственному сближению липосом и, как результат, блокировал агрегацию (стерический фактор стабилизации). Стабильность электронейтральных ФХ/КЛ27ЦМАБ|+ липосом в комплексе с П2 была связана с тем, что адсорбированный поликатион придавал поверхности липосом положительный заряд, препятствовавший развитию агрегации (электростатический фактор стабилизации).

Для оценки эффективности связывания П2 с липосомами были использованы различные подходы. Для системы «П2 + ФХ/КЛ2" липосомы» мы проанализировали состав супернатантов после отделения агрегатов липосом с адсорбированным поликатионом методом центрифугирования. На рис. 3 изображена зависимость концентрации П2 в надосадочной жидкости от его общей концентрации в суспензии. Видно, что поликатион количественно связывался с липосомами вплоть до [П2] макс при больших концентрациях поликатион начинал накапливаться в

растворе (кривая 2). Полученное в ходе этого эксперимента значение [П2]макс практически совпадало с тем, которое соответствовало достижению предельного положительного значение ЭФП комплекса П2- ФХ/КЛ2" липосомы (ср. данные рис. 2а и рис. 3). При этой концентрации П2 на поверхности липосом формировался электростатический барьер, блокировавший образование новых ионных связей со свободным поликатионом.

Выше упоминалось о том, что ФХ/КЛ2"/Бридж липосомы не агрегировали в присутствии П2. Это не позволило нам использовать метод центрифугирования для оценки эффективности связывания поликатиона с гидрофилизованными липосомами. Такую оценку мы сделали, опираясь на результаты электрофорстических экспериментов, а именно, на сходство профилей ЭФП - [П2] зависимостей и совпадение нейтрализующих концентраций П2 для ФХ/КЛ2" и ФХ/КЛ2"/Бридж липосом (рис. 2а). Эти факты однозначно указывали на количественное связывание П2 с гидрофилизованными липосомами в том же интервале концентраций поликатиона, в пределах которого

наблюдалось его количественное связывание с традиционными ФХ/КЛ2' липосомами: от О

Рисунок 3. Зависимость

концентрации П2, не связанного с ФХ/КЛ2' липосомами, от его общей концентрации в суспензии. Кривая 1 калибровка поликатиона без добавления липосом, кривая 2 концентрация поликатиона в супернатанте после

центрифугирования комплексов. Суммарная концентрация липидов i мг/ли:

[KJI!'J = 2,8*10 'M; lff'M боратный буфер, pli 9,2.

В случае электронейтральных ФХ/КЛ "7ЦМАБ1* липосом данные микроэлектрофореза (кривая 3 fia рис. 2а) указывали на то, что связывание П2 с такими липосомами развивалось по крайней мере до [П2] = 0,5х Ю^М, однако не позволяли сделать вывод об эффективности взаимодействия, то есть о распределении поликатиона между липосомами и раствором. С целью ответа на этот вопрос были проведены дополнительные эксперимента с использованием метода флуоресценции. Использованный в работе П2 является эффективным тушителем флуоресценции. За его связыванием с липосомами следили по изменению интенсивности флуоресценции меченого липида (ДОФЭА-КФ), встроенного в липосомальную мембрану.

Добавление раствора П2 к суспензиям меченых традиционных ФХ/КЛ2" липосом и гидрофилизованных ФХ/КЛ27Бридж липосом приводило к уменьшению относительной интенсивности флуоресценции метки 1/10, где 1о и I - интенсивность флуоресценции метки до и после добавления поликатиона соответственно. Полученные зависимости 1/1о - [П2] для обоих типов липосом описывались одной кривой, при этом значение 1/1о линейно уменьшалось с концентрацией П2 и выходило на плато при [П2] = 1,25х 10"4M (кривые 1 и 2 на рис. 4а). Линейность зависимости 1Я0 - [П2] означала, что в области [П2] < 1,25«! О"4.M весь добавленный поликатион адсорбировался на поверхности липосом. Выше мы отмечали, что П2 связывался с ФХ/КЛ2" и ФХ/КЛ2"/Бридж липосомами в интервале [П2] < 3,5х1оЛЧ. Однако результаты флуориметрических экспериментов указывали на существенно меньший интервал концентраций поликатиона, в пределах которого он количественно связывался с обоими типами липосом. Объяснение этому состоит в том, что поликатион, адсорбированный на поверхности меченых анионных липосом, предпочтительно взаимодействовал с отрицательно заряженным флуоресцентно меченым

до 3,5x10^.

[П2] х Ю4, M

липидом. После исчерпания метки П2 продолжал связываться с липосомами за счет формирования солевых связей с молекулами КЛ2".

а б

I/L, o.e. 1Л<>. »-е.

Рисунок 4. Зависимость интенсивности флуоресценции меченых липосом от концентрации П2

(а) и зависимость интенсивности флуоресценции полученных комплексов от концентрации NaCl

(б). ФХ/КЛ1' (1 и I'), ФХ/КЛ1/Бридж <2 и 2') и ФХ/КЛ!-/ЦМАБ'* (3 и 3') липосомы. Суммарная концентрация липидов 1мг/мл, [П2] = 2*10'' (Г и 2') и 0,25 * Iff1 М (3'), Iff2 М боратный буфер, рН 9.2.

Аналогично описанному выше добавление возраставших концентраций П2 к суспензии меченых трехкомпонентных ФХ/КЛ27ЦМАБ1+ липосом вызывало линеиное уменьшение интенсивности флуоресценции метки (кривая 3 на рис. 4а), что отражало количественное связывание поликатиона в интервале [П2] < 0,25* 104М. Как и для анионных липосом, флуоресценция достигала предельного значения при концентрации П2 меньшей, чем требовалась для достижения максимального положительного значения ЭФП комплекса П2-липосома (ср. кривую 3 на рис. 4а и кривую 3 на рис. 2а). Таким образом, меченый липид играл роль «якоря» и в случае взаимодействия П2 с мечеными ФХ/КЛ2" /ЦМАБ|+ липосомами.

Добавление раствора NaCl к суспензиям комплексов П2 со всеми типами меченых липосом приводило к восстановлению интенсивности флуоресценции до исходного уровня (рис. 46), что отражало диссоциацию комплексов на исходные компоненты -липосомы и молекулы П2. Однако полное восстановление флуоресценции происходило при разных концентрациях добавленной соли: 0,12 М NaCl для комплексов П2 с ФХ/КЛ2" /ЦМАБ|+ липосомами, 0,2 М NaCl для комплексов П2 с ФХ/КЛ2"/Бридж липосомами и 0,32 М NaCl для комплексов П2 с ФХ/КЛ2" липосомами. Мы видим, что наиболее устойчивыми к действию соли оказались традиционные липосомы, сформированные из анионного и нейтрального липидов. Модификация мембраны гидрофильным

компонентом (Бридж 58) или катионным липидом приводила к потере устойчивости комплексов липосом с поликатионом в водно-солевых средах.

Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что П2 адсорбируется на поверхность липосом, что сопровождается агрегацией для традиционных ФХ/КЛ2" липосом. Введение третьего компонента Бридж-58 или ЦМАБ+ привело с одной стороны к повышению агрегативной устойчивости липосом, а с другой снизило стабильность комплексов в водно-солевых средах.

2. Структурные перестройки в липосомальиых мембранах под действием адсорбированного поликатиона.

Известно, что адсорбция катионных полимеров на поверхности анионных липосом сопровождается перераспределением липидов в липосомальной мембране. В настоящей работе за мнкрофазовым разделением в липосомальных мембранах под действием П2 следили с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Температура фазового перехода ФХ липосом лежит ниже 5°С, то есть вне температурных пределов традиционных микрокалориметров. Поэтому для калориметрических экспериментов ФХ заменяли на синтетический нейтральный ДПФХ с температурой фазового перехода Тф = 41,4°С.

Калориметрическая кривая (спектр ДСК) для ДПФХ липосом приведена на рис. 5 (кривая 1). Добавление КЛ2" к ДПФХ бислою делало фазовый переход более широким с максимумом при Тф = 39,1 "С (кривая 2). Наличие одного максимума и симметричная форма кривой плавления указывали на равномерное распределение обоих компонентов, КЛ2" и ДПФХ, в пределах каждой стороны липосомальной мембраны и между ними. Добавление П2 к суспензии КЛ2УДПФХ липосом делало пик плавления более узким и сдвигало его в область более высоких температур (кривые 3-5). При [П2] = 3,5х 104М на кривой регистрировался пик с максимум при Тф = 41,4°С (кривая 5), положение которого на температурной шкале не менялось при дальнейшем увеличении концентрации поликатиона. Таким образом, адсорбция П2 формировала в смешанной ДПФХ/КЛ2" мембране области, состоявшие только из ДПФХ, в результате количественного выделения анионного КЛ2" в отдельные кластеры при связывании с П2. Кластеры КЛ2" плавились при температуре ниже 5°С и поэтому не регистрировались с помощью использованной нами калориметрической аппаратуры.

л

20 1 зо ■ 1 40 < 50 2 «0

. . , ....... 20 30 40 50 J 60

20 30 40 50 4 60

20 ¡200 Mk-I! 30 40 А 50 5 —i 60

Рисунок 5. Калориметрические кривые для ДПФХ (1) и ДПФХ/КЛ:~ (2-5) липосом. Суммарная концентрация липидов I мг/мл; [П2] = 0 (2), 1*10* (3), 2*10 (4) и З.ЗхКГ'М (5); 1СГгМ воротный буфер, рН 9,2.

20 30 40 50 60

Температуря,

Микрофазовое разделение липидов в мембране продолжалось вплоть до [П2] = З.бхЮ^М, которая соответствовала предельному насыщению мембраны липосом адсорбированным поликатионом (ср. с кривой на рис. 3).

Спектры ДСК для бинарной системы ДПФХ/Бридж-58 с различным содержанием Бридж приведены на рис. 6а. При невысоком содержании Бридж (v (ПЭГ) < 0,2) его встраивание в липосомальную мембрану сопровождалось уменьшением площади пика и его смещением в область низких температур (кривые 2 и 3). Однако последующее повышение доли Бридж до 30 мол.% приводило к заметному уширению и сдвигу вправо пика плавления. Иными словами, бислой с у(ПЭГ) = 0,3 становился более тугоплавким, чем бислой с меньшим содержанием Бридж.

Опираясь на литературные данные о структуре липидных бислоев со встроенными ПЭГилированными компонентами, можно следующим образом интерпретировать результаты калориметрических экспериментов. При v (ПЭГ) < 0,2 ПЭГ фрагменты молекул Бридж принимают конформацию «плаща» и/или «гриба» (рис. 66-А и 66-Б). Латеральное отталкивание ПЭГ фрагментов сопровождается уменьшением плотности гидрофобной части бислоя и понижением температуры фазового перехода липосом. При повышении доли Бридж в мембране до 30 мол.% ПЭГ фрагменты приобретают конформацию «щетка» (рис. 66-В), плотность гидрофобной части бислоя повышается, и температура фазового перехода возрастает.

В спектре плавления трехкомпонентных гидрофилизованных ДПФХ/КЛ27Бридж липосом с v(-) = у(ПЭГ) = 0.2 видны два пика с максимумами при 36,4 и 40,3°С, сопоставимые с пиками плавления двух фаз: ДПФХ/КЛ2" с v(-) = 0.2 и ДПФХ/Бридж с у(ПЭГ) = 0.2 соответственно (кривая! на рис.7). Добавление П2 в концентрации

3,5хЮ^М, которая обеспечивала электростатическое связывание всех молекул КЛ2", приводило к существенным изменениям в спектре ДСК: в нем появлялись три пика а б

л

* 1 ' 20 1 30 140 л 50 1 60 2

' 1 ' 20 1 30 . 1---. 40 _ 1 50 1 60 .1

1 1 1 20 1 30 г-' 40 1 50 —1-1 60

| 200 мк1! 4

Л «плащ», сол! I» «гриб». тгшяЬгтюп)

И <<щшка»>. ЬгикЬ

20 30 40 50 60

Температурите

I

ФХ Срнда-58

Рисунок 6. Спектры ДСК для ДПФХ/Бридж липосом (а) и строение липидного бислоя при различном содержании ПЗГилированного компонента (схематическое представление) (б). V (ПЭГ) = 0 (I). 0,1 (2), 0,2 (3) и 0,3 (4). Суммарная концентрация липидов I мг/.ил; 10 !М боратный буфер, рИ 9,2.

при 39,1, 40,8 и 43,0°С (кривая 2). Первый отражал плавление бинарных ДПФХ/КЛ2" областей с небольшой долей КЛ2' , второй - областей с преимущественным содержанием ДПФХ и третий - ДПФХ/Бридж областей с долей Бридж близкой к 30 мол.%. Основная часть молекул КЛ2", связанная в комплекс с П2, плавилась при температуре ниже 5°С. Таким образом, связывание П2 с гидрофилизованными ФХ/КЛ2"/Бридж липосомами, как и в случае традиционных ФХ/КЛ"' липосом, сопровождалось микрофазовым разделением компонентов в мембране с образованием доменов, обогащенных КЛ2".

Трехкомпонентные электронейтральные ДПФХ/КЛ""/ЦМАБ+ липосомы с \'(-) = \'(+) = 0.2 характеризовались широким фазовым переходом в интервале от 28 до 43°С (кривая 3 на рис. 7). Разложение полученной калориметрической кривой на составляющие показало, что она представляла собой суперпозицию двух кривых с максимумами при 35,2 и 41,4°С. Такая форма спектра указывала на существование в смешанной ДПФХ/КЛ2" /ЦМАБ+ мембране двух микрофаз. Первая с пиком при 41.5°С состояла преимущественно из молекул нейтрального ДПФХ. Другая микрофаза, по-видимому, представляла собой набор областей (доменов) с разным соотношением анионного КЛ2' и катионного ЦМАБ+ липидов (возможно, с добавлением некоторого количества нейтрального ДПФХ).

Рисунок 7. Спектры ДСК для ФХ/KJT /Бридж липосом (1), их комплекса с П2 (2), ДПФХ/К1?~/ЦМАБ* липосом

(3) и их комплекса с П2 (4). Суммарная концентрация липидов I мг/мл; [П2] = j.5x/<rV (2) ; 1,5*10'М

(4); 10~'М боратный буфер, рИ 9,2.

Последующее добавление раствора П2 к суспензии ДПФХ/КЛ27ЦМАБ+ липосом практически не влияло на форму их спектра ДСК (кривая 4). Иными словами, связывание П2 не вызывало фазового разделения в мембране трехкомпонентных электронейтральных липосом. Причина этого заключается в следующем. Концентрирование анионных молекул КЛ2" вблизи адсорбированного поликатиона (если бы такое имело место) должно было приводить к вытеснению катионных молекул ЦМАБ+ в отдельные домены. Такая реорганизация бислоя сопровождается заметными энтропийными и энергетическими потерями, которые нельзя компенсировать энтропийным выигрышем от появления в растворе малых противоионов в результате адсорбции катионной макромолекулы на анионной липосоме. Поэтому взаимодействие поликатиона с ДПФХ/КЛ2'/ЦМАБ+ липосомами развивается как его адсорбция на поверхности с фиксированным положением отрицательных и положительных зарядов.

Таким образом, адсорбция поликатиона на поверхность липосом сопровождалась микрофазовым разделением компонентов мембраны только в случае двух типов липосом бинарных (ФХ/КЛ2 ) и «гидрофилизованных» (ФХ/КЛ2"/Бридж), причем в последнем случае процесс сопровождался переходом молекул ПЭГ из конформации «плаща» в состояние «щетка». Структурные изменения для обоих типов анионных липосом происходили вплоть до достижения концентрации П2 = 3,5х Ю^М, что соответствует полноте связывания полимера. Для нейтральных трехкомпонентных липосом адсорбция поликатиона не приводит к заметным структурным перестройкам в липидной мембране.

3. Межлипосомальная миграция поликатиона.

Миграционные эксперименты выполнялись по следующей схеме: к сформированным комплексам липосом с поликатионом добавляли новые порции липосом и следили за изменением флуоресценции метки, встроенной в липосомальную мембрану,

14

20

30 40 50

Трмир im-rvna

I

60

и/или ЭФП частиц в системе. Ключевым условием для однозначной интерпретации полученных результатов было количественное связывание поликатиона с лнпосомами как на стадии формирования комплекса, так и в ходе перераспределения поликатиона между липосомами. Выше мы показали, что в 1 мг/мл суспензиях анионных ФХ/КЛ2" и ФХ/КЛ2"/Бридж липосом полное связывание поликатиона наблюдалось при [П2] < 3,5* 10 М, в суспензии электронситральных ФХ/КЛ27ЦМАБ+ липосом той же концентрации при [П2] < 0,5* 10"\М.

Мы начали с простейшей системы, включавшей П2 и двухкомпонентные анионные ФХ/КЛ2" липосомы. Как следует из данных, представленных на рис. 26, формирование комплексов в такой системе сопровождалось агрегацией липосом. Возникает вопрос: происходит ли миграция молекул П2 между липосомами в таких агрегатах? Ответ на это вопрос был получен с помощью метода флуоресценции.

К меченым ФХ/КЛ2" липосомам был добавлен поликатион, что привело к адсорбции П2 на липосомалыюй мембране, тушению флуоресценции метки и агрегации липосом. Затем к суспензии комплекса были добавлены не содержавшие метку ФХ/КЛ2" липосомы, и через 10 минут после смешения была измерена интенсивность флуоресценции в системе. Результаты для различных концентраций немеченых ФХ/КЛ2" липосом представлены на рис. 8 (кривая 1). Видно, что по мере увеличения концентрации немеченых ФХ/КЛ2" липосом интенсивность флуоресценции метки увеличивалась, достигая предельного значения при эквимольном соотношении липидов, введенных в систему с мечеными и немечеными липосомами.

Рисунок 8. Зависимость

интенсивности флуоресценции от концентрации добавленных липосом в трехкомпонентной системе, содержащей П2, а также меченые и немеченые фх/кл2- липосомы. Кривая 1 получена добавление.м немеченых липосом к комплексу П2 с мечеными липосомами. Кривая 2 получена добавлением меченых липосом к комплексу П2 с немечеными липосомами. [П2]=1*Ш1М, /0'2М боратный буфер. рН 9.2.

2.5

Концентрация добавленных липосом, мг/мл

После этого мы повторили эксперимент, однако измешиш последовательность смешения компонентов на обратную: меченые ФХ/КЛ2" липосомы были добавлены к предварительно сформированному комплексу П2 с немечеными ФХ/КЛ"" липосомами. На рис. 8 (кривая 2) представлена зависимость интенсивности флуоресценции,

установившаяся в системе спустя 10 минут после смешения компонентов. Во всех случаях интенсивность флуоресценции оказывалась ниже таковой для исходных меченых ФХ/КЛ2" липосом, что однозначно указывало на переход части звеньев поликатиона с немеченых липосом на меченые. Важно отметить, что уровень флуоресценции, который достигался при обратном смешении компонентов, практически совпадал с результатами, полученными при прямом их смешении (кривые 1 и 2 на рис. 8), то есть не зависел от способа приготовления конечной трехкомпонентной системы.

Вместе с тем присутствие в системе довольно крупных агрегатов (размер которых в несколько раз превышал размер исходных липосом) не позволяло связать тушение флуоресценции с миграцией макромолекул поликатиона как целого между отдельными липосомами. Мы могли лишь констатировать, что включенные в агрегаты липосомы обменивались более или менее протяженными участками (сегментами) адсорбированных молекул П2.

I Ш0, о.с. 0.8

0.6

0.2 0

1

0.4

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Концентрация добавленных липосом, мг/.мл

Рисунок 9. Зависимость

интенсивности флуоресценции от концентрации добавленных липосом в трехкомпонентной системе, содержащей П2, а также меченые и немеченые ФХ/КЛ'УБридж

липосомы. Кривая I получена добавлением немеченых липосом к комплексу П2 с мечеными липосомами. Кривая 2 получена добавлением мечены-х липосом к комплексу П2 с немечеными липосомами.

[П2]=1*1а,М, Ш2М боратный ^^ буфер, рН 9,2

В отличие от ФХ/КЛ2" липосом гидрофилизованные ФХ/КЛ27Брндж липосомы не

агрегировали при взаимодействии с П2 (см. рис. 26). Для контроля миграции молекул П2

между гидрофилизованными липосомами был использован метод флуоресценции. К

суспензии меченых ФХ/КЛ/Бридж липосом был добавлен П2 в концентрации что

гарантировало исчерпывающее связывание П2. Затем к полученной суспензии были

добавлены возрастающие количества немеченых ФХ/КЛ/Бридж липосом. Однако это не

вызвало возгорания флуоресценции в системе (кривая [ рис. 9). В следующей серии

экспериментов был использован обратный порядок смешения компонентов. Зависимость

интенсивности флуоресценции от концентрации немеченых липосом представлена кривой

2 на том же рисунке. Примечательно, что она практически совпадает с кривой 1,

описывающей изменение интенсивности флуоресценции при прямом смешении

компонентов. При всех соотношениях компонентов - как при прямом, так и при обратном

16

их смешении - размер частиц в системе лишь ненамного превышал размер исходных липосом.

На первый взгляд полученные результаты указывают на одностороннюю миграцию молекул П2 в суспензии гидрофилизованных липосом: с немеченых ФХ/КЛ2"/Бридж липосом на меченые. Однако причина столь высокого сродства поликатиона к меченым липосомами не выглядит очевидной, особенно если принять во внимание отсутствие такого сродства по отношению к двухкомпонентным меченым ФХ/КЛ2" липосомам. Для прояснения ситуации мы провели миграционные эксперименты с использованием метода микроэлсктрофорсза.

В 1 мг/мл суспензию меченых ФХ/КЛ2'/Бридж липосом с ЭФП = -1,2 (мкм/с)/(В/см) был введен П2 в концентрации что привело к формированию комплекса П2-

липосома с ЭФП = +0,6 (мкм/с)/(В/см). Затем к суспензии комплекса были добавлены немеченые липосомы в концентрации 1 мг/мл, при этом ЭФП частиц в системе изменялась до -0,75 (мкм/с)/(В/см). Размер частиц в ходе эксперимента лишь незначительно превышал размер исходных

ФХ/КЛ /Бридж липосом. Полученные результаты свидетельствовали о переходе адсорбированных макромолекул поликатиона с меченых гидрофилизованных липосом на немеченые.

Несовпадение результатов флуоресцентных и электрофорстичсских экспериментов можно объяснить следующим образом. Бридж 58 является амфифильным соединением с одним алкильным радикалом и объемной полярной головкой, представленной макромолекулами ПЭГ. Встраивание Бридж в липидную мембрану должно приводить к заметному уменьшению плотности упаковки алкильных цепей в бислое и повышению скорости обменных процессов в мембранах, в том числе, и скорости межлипосомальной миграции липидов. Поэтому можно предположить, что макромолекулы П2 могут перемещаться между липосомами, будучи связанными электростатическими связями в комплекс с анионными компонентами мембраны: КЛ2~ и ДОФЭА-КФ (см. химические формулы на рис. 1). Такой способ миграции П2 не приводит к изменению интенсивности флуоресценции ДОФЭА-КФ, но сопровождается изменением ЭФП частиц в системе. И то, и другое, действительно, наблюдается в эксперименте.

Способность адсорбированного П2 мигрировать между электронейтральными ФХ/КЛ27ЦМАБ1+

липосомами была исследована методом флуоресценции по описанной выше методике с той разницей, что концентрация поликатиона была взята равной 2,5*10"5М. На рис. 10 приведены результаты миграционного эксперимента для прямого и обратного порядка смешения реагентов (кривая 1 и 2, соответственно). Видно, что интенсивность флуоресценции возрастала по мере увеличения концентрации немеченых

липосом, при этом оба способа смешения приводили к одинаковым результатам. Эти факты, а также отсутствие агрегатов в полимер-липосомальной суспензии указывали на то, что макромолекулы П2 перераспределялись между всеми индивидуальными (неагрегированными) липосомами.

[/[„. О.С.

О 0.5

I

2.5

Рисунок 10. Зависимость

интенсивности флуоресценции от концентрации добавленных

липосом в трехкомпонентной системе, содержащей П2, а также меченые и немеченые ФХ/КЛ2/ЦМАБ'* липосомы. Кривая 1 получена добавлением немеченых липосом к комплексу П2 с мечеными липосомами. Кривая 2 получена добавлением меченых липосом к комплексу П2 с немечеными липосомами.

[П2]=2,5*1(У!М, НГ'М боратный 3.5 буфер, рН 9.2

Концентрация добавленных липосом, мг/мл

Итак, по результатам проведенных экспериментов можно утверждать, что поликатион способен перемещаться с одной липосомы на другую. Если процесс развивается в агрегатах, то перераспределяются звенья макромолекулы, в случае стерически стабилизированных липосом происходит перемещение целых макромолекул, связанных в комплексе с мечеными липидами. Для трехкомпонентных электронейтральных липосом происходит миграция полимера в виде отдельных молекул.

4. Токсичность комплексов поликатион-липосома по отношению к клеткам и экспериментальным животным.

Липосомы представляют собой важную категорию наноразмерных систем, широко используемых для инкапсулирования и последующего высвобождения лекарственных веществ. Нами предложено формировать комплексы анионных липосом с катионными частицами для повышения эффективности доставки в клетки инкапсулированных в липосомы лекарств. Ожидалось, что положительный заряд, привнесенный адсорбированным поликатионом, будет способствовать повышению сродства комплекса липосома-поликатион к отрицательно заряженной клеточной мембране.

В качестве первого шага мы исследовали цитотоксичность липосом и их комплексов с поликатионом (для последних в настоящей работе используется термин «нанокапсулы»). Начиная с 90-х годов прошлого столетия наибольшее распространение в качестве липосомальных контейнеров лекарственных веществ получили ПЭГилированные липосомы. Учитывая это обстоятельство, нами были приготовлены липосомы, в мембрану

которых был встроен ПЭГилированный липид, диолеоилфосфаэтаноламин с ковалентно связанным ПЭГ (ДОФЭА-ПЭГ). Мольная доля ПЭГилированного липида в мембране у(ПЭГ) составляла 0,2. Методами микроэлектрофореза и флуоресценции было показано, что содержащие ДОФЭА-ПЭГ анионные липосомы адсорбируют П2 с той же эффективностью, как это делают описанные выше гидрофилизованные анионные липосомы со встроенным Бридж 58.

Вместе с тем выше мы показали, что в водно-солевых растворах наблюдается диссоциация комплексов П2 с ПЭГшшрованными липосомами; при физиологических значениях концентрации соли в окружающем растворе (0,15 М №С1) доля диссоциированных солевых связей поликатион-липосома составляет примерно 60% (см. рис. 46, кривая 2'). Из литературы известно, что модификация поликатиона боковыми гидрофобными группами повышает стабильность комплексов катионных полимеров с анионными липосомами в водно-солевых средах. Следуя этому подходу, был приготовлен комплекс поликатиона, несущего боковые цетильные группы (П2,16), с ФХЛСГГ'/ДОФЭА-ПЭГ липосомами, который не агрегировал и сохранял стабильность в 0,15 М растворе №С1. ФХ/КЛ27ДОФЭА-ПЭГ липосомы с у(-) = v(ПЭГ) = 0.2 и их комплексы с П2,16 были использованы в биологических экспериментах.

Для определения цитотоксичности липосом и нанокапсул (их комплексов с П2,16) был использован метод прижизненного окрашивания клеток метилтетразолевым синим. Проникший внутрь клеток краситель под действием окислительно-восстановительных ферментов окислялся до формазана, который выпадал в виде кристаллов. В погибших клетках такого превращения красителя не происходило. Чем активнее происходили процессы жизнедеятельности в клетке, тем большее количество красителя в ней накапливалось. Долю выживших (т.е. продуцирующих формазан) клеток оценивали, измеряя оптическую плотность при длине волне 550 нм, соответствовавшей максимуму поглощения формазана.

На рис. 11 представлены зависимости доли выживших клеток линии карциномы молочной железы, обладающей множественной лекарственной устойчивостью (МСР7/Л), от концентрации добавленного реагента, в качестве которого выступали липосомы (1), нанокапсулы разного состава (2-4) и катионный П2,1б (5).

Как следует из представленных на рисунке данных, максимально толерантная доза (МТД) реагентов, т.е. их концентрация, при которой наблюдалось 100%-ное выживание клеток, составляла 1 мг/мл для липосом и 0,01 мг/мл для поликатиона. Цитотоксичность нанокапсул не зависела от их состава и была близка к токсичности исходных липосом. Таким образом, иммобилизация катионного полимера на поверхности анионных липосом

не приводила к увеличению их токсического воздействия на клетки с МЛУ.

Доля выживших клеток, о.С. 1.2

Рисунок II. Выживаемость клеток линии аденокарциномы молочной железы человека, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (\ICF7/К), в присутствии липосом

(1), комплексов П2,1 б-липосома (2-4) и П2.16 (5); [П2,16] = 1,5*10'

(2), 3*1(Г4 (3) и 4*1СГ'М (4) в расчете на 1 мг/мл липосом.

0.4

0.2

0.6

0.8

1

0

0.01

0.10 I

Концентрация реагента, мг/мл

10

Липосомы, нагруженные противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (Доке), получали по стандартной методике, суть которой состояла в следующем. В водном растворе Доке способен равновесно переходить из положительно заряженной и растворимой формы в незаряженную и нерастворимую при изменении рН среды от 7 до 4. При попадании Доке в липосомы, внутренний водный объем которых содержит раствор с рН 4, происходит локальное концентрирование лекарства и резкое уменьшение интенсивности его флуоресценции. Контролируя интенсивность флуоресценции Доке, можно не только оценивать эффективность инкапсулирования препарата (долю проникшего в липосомы Доке), но и следить за кинетикой выхода лекарства из липосом в окружающий раствор или внутриклеточное пространство.

Используя описанный подход, мы показали, что загрузка Доке в исходные липосомы происходила за время смешения компонентов (липосом и лекарства). Модификация липосом катионным П2,16 снижала скорость мембранного транспорта Доке, при этом максимальная загрузка достигалась через 20 минут после добавления Доке к суспензии комплекса и мало зависела от количества связанного с липосомами поликатиона (рис. 12). Существенно, что модификация липосомальной мембраны поликатионом заметно снижала скорость спонтанного вытекания Доке из липосом во внешний раствор: уровень загрузки липосом Доке сохранялся по крайней мере в течение 7 дней.

!//„ о. с.

0.2

0.8

0.4

0.6

Рисунок 12. Зависимость

интенсивности флуоресценции Доке от времени после его добавления в суспензию комплекса П2.16 с ФХ/Ю1г7ДОФЭА-ПЭГ липосомами. Суммарная

концентрация липидов 1 мг/мл; [.П2.161 = 1,5*10(Кривая 1) и 3*104М (Кривая 2); 10'2М фосфатный буфер, рН 7,2.

0

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время, мин

В экспериментах по слиянию липосом и полимер-липосомных нанокапсул с клетками концентрации реагентов поддерживались близкими их МТД и для всех проб концентрация липидов составляла 1 мг/мл. Липосомы и нанокапсулы заполняли Доке. Для экспериментов использовали клетки линии МСР7/11. Слияние контролировали с помощью метода конфокальной лазерной микроскопии; к закрепленным на дне чашки Петри клеткам с раствором сыворотки вводили пробы липосом или нанокапсул с одинаковым содержанием Доке.

Добавление к клеткам липосом, заполненных Доке, практически не приводило к появлению яркой флуоресценции (рис. 13, 1). Замена липосомальных контейнеров на содержавшие Доке нанокапсулы сопровождалась появлением флуоресценции на поверхности клеток. Этот эффект усиливался по мере увеличения количества адсорбированного на липосомальной мембране поликатиона (рис. 13, 2, 3). Нанокапсулы с суммарным положительным поверхностным зарядом обеспечивали проникновение Доке в ядра клеток (рис. 13, 4). Таким образом, только положительно заряженные комплексы поликатион-липосома позволяли эффективно доставлять Доке в ядра клеток с МЛУ.

Для исследования токсического действия полимер-липидных нанокапсул на животных была использована следующая схема. 42 мыши были разделены на 7 групп по 6 животных в каждой группе.

Готовили 7 мг/мл суспензию липосом (образец 1) и комплексов П2,16-липосомы, которые получали смешением 7 мг/мл суспензии липосом и растворов П2,16 в концентрации 7х4,5х10"4М (образец 2) и 7хЗ,15х10"3М (образец 3). Такие концентрации поликатиона обеспечивали перезарядку липосомальной мембраны: она приобретала положительный заряд. Затем готовили липосомы и их комплексы с П2Д6 тех же составов, максимально заполненные Доке (образцы 4, 5 и 6).

Рисунок 13. Флуоресцентные микрофотографии клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека с МЛУ (MCF7/R) после добавления наполненных Доке липосом (I) и комплексов П2.16-липосома (2-4). Суммарная концентрациялипидов /мг/мл; [П2.16] = / 5x10"1 (2) 3*10" (3) и 4*10'4М(4).

По 500 мкл образцов 1, 2 и 3 одноразово внутрибрюшинно вводили животным из 1, 2 и 3 групп соответственно. Наполненные Доке наноконтейнеры (образцы 4, 5 и 6) одноразово внутрибрюшинно вводили животным из 4, 5 и 6 групп соответственно (по 500 мкл на мышь). Количество введенных препаратов соответствовало МТД доксорубицина, определенного на мышах. Животным из последней - седьмой (контрольной) группы препараты не вводили.

Животные наблюдались в течение 1 месяца после введения препаратов. Никаких видимых признаков ухудшения их состояния отмечено не было. Таким образом, гидрофобизованный поликатион, П2,16, липосомы и положительно заряженные полимер-липидные нанокапсула, в том числе заполненные доксорубицином, показали отсутствие токсичности в указанных дозах по отношению к экспериментальным животным (мышам).

выводы.

1. Показано, что катионный полимер (кватернизовааный поли-4-винилпиридин) количественно связывается с тремя типами липосом: 1)традиционными, сформированными из цвиттер-ионного ФХ и анионного КЛ2", 2) гидрофилизованными ФХ/КЛ2' липосомами со встроенными в бислой ПЭГилировашшми липидами и 3) трехкомпонентными электронейтральными липосомами, состоявшими из ФХ и взятых в равных количествах КЛ2" и катионного ЦМАБ1*. Комплексообразование поликатиона с традиционными ФХ/КЛ2" липосомами сопровождается их агрегацией, в то время как гидрофилизованныс и трсхкомпонентныс электронейтральные липосомы не образуют агрегатов при связывании с поликатионом.

2. Установлено, что адсорбция поликатиона на поверхности анионных (традиционных и ПЭГилированных) липосом вызывает микрофазовое разделение компонентов в мембране с образованием доменов, обогащенных КЛ2". В отличие от этого, взаимодействие того же поликатиона с трехкомпонентными электронейтральными липосомами развивается как адсорбция на поверхности с фиксированным положением отрицательных и положительных зарядов и не сопровождается латеральной сегрегацией липидов.

3. Обнаружено, что внутри агрегатов, сформированных ФХ/КЛ2" липосомами и молекулами поликатиона, происходит частичное перераспределение звеньев (сегментов) макромолекул между липосомами. Адсорбированные макромолекулы способны мигрировать между индивидуальными (неагрегированными) ФХ/КЛ""/ЦМАБ+ липосомами. В системе с участием ПЭГилированных липосом молекулы поликатиона перемещаются между липосомами, будучи связанными электростатическими связями в комплекс с анионными компонентами мембраны.

4. Показано, что уровень цитотоксичности комплексов поликатион-ПЭГилированная липосома близок к таковой для исходных липосом. Поученные комплексы характеризуются низким уровнем токсичности по отношению к экспериментальным животным (мышам).

5. Комплексы поликагион-ПЭГилированная липосома с суммарным положительным поверхностным зарядом обеспечивают эффективное проникновение в клетки противоопухолевого антибиотика доксорубицина.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Д. А. Давыдов, А. А. Рахнянская, В. Н. Орлов, А. В. Бычкова, А. Л. Коварский, А. А. Ярославов. Комплексы анионных липосом с катионным полимером: состав, строение и свойства. //Высокомолек. Соед. Сер. А. 2010. Т. 52. № 7. с. 1090-1101.

2. Dmitry A. Davydov, Ekaterina G. Yaroslavova, Anna A. Rakhnyanskaya, Anna A. Efimova, Yury A. Ermakov, Fredric M. Menger, Alexander A. Yaroslavov. Polymer Migration among Phospholipid Liposomes. //Langmuir. 2009. V. 25. I. 23. p. 1352813533.

3. Д.А. Давыдов, Е.Г. Ярославова, A.A. Ефимова, A.A. Ярославов. Миграция катионного полимера между липидными везикулами. //Коллоидный журнал. 2008. Т. 70. №6. с. 1-8.

4. D.A.Davydov, A.A.Efimova, A.A.Yaroslavov, F.M.Menger. Binding of polyelectrolytes to liposomes with embedded conventional and Gemini surfactants. // 45T" Microsymposium structure and dynamics of self-organized macromolecular systems 2006. Prague. Czech. Book of Abstract, p. 81.

5. Д.А.Давыдов, A.A Ефимова, A.A. Ярославов. Взаимодействие полиэлектролитов со смешанными бислойными везикулами, сформированными из природных липидов и синтетических поверхностно активных веществ. //Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Каргинской Конференции «Наука о полимерах 21-му веку». Москва. 2007. Т.2. с. 380

6. Д.Л.Давыдов, А.А Ефимова, А.А. Ярославов. Миграция молекул поликатиона между бислойными липидными везикулами. //Тезисы докладов XIV Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007». Москва. 2007. с. 96

7. D.A.Davydov, A.A.Rakhnyanskaya, N.S.Melik-Nubarov, A.A.Yaroslavov. Composition and properties of liposomes covered with synthetic polyelectrolytes. //Jiilich Soft Matter Days 2008. Bonn. Germany. Book of Abstract, p. 85.

8. D.A.Davydov, E.G.Yaroslavova, A.A.Rakhnyanskaya, A.A.Yaroslavov Dynamic properties of liposome-polyelectrolyte complexes. //22nd Conference of the European Colloid and Interface Society 2008. Cracow. Poland. Book of Abstract, p. 168

9. Д.Л.Давыдов, П.В. Горелкин, И.В. Яминский, А.А. Ярославов. Изучение формирования трехкомпонентных липидных бислоев на слюде методом атомно-силовой микроскопии. //Тезисы докладов Второй международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2008 . с. 21.

Подписано в печать 22.09.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1024 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1. Липиды.

1.1. Надмолекулярные липидные структуры.

1.2. Условия образования липидного бислоя.

2. Способы получения линосом.

3. Структура бислоя.

3.1. Упаковка ацильных хвостов в линидном бислое.

3.2. Термодинамические свойства фазовых переходов.

3.3. Структурные особенности липидов, влияющие на Тт.

3.4. Перемещения липидных молекул в пределах бислоя.

3.5. Двухкомпонентные липосомы. Фазовое распределение липидов.

3.6. Влияние двухзарядных ионов на доменообразование в двухкомпонентных липосомах.

3.7. Влияние поликатионов на доменообразование в двухкомпонентных липосомах.'.

4. Поверхностные свойства липосом.

4.1. Общие принципы коллоидной стабильности.

4.2. Структура модифицированного липидного бислоя.

4.3. Взаимодействие полиэлектролитов с противоположно заряженными липосомами.

5. Проницаемость липидных мембран.

5.1. Факторы, влияющие на проницаемость мембран.

5.2. Влияние адсорбции полиэлектролитов на скорость вытекания содержимого липосом.

5.3. Проницаемость мембран модифицированных липосом.

6. Применение липосом.

6.1. Пассивный транспорт.

6.2. Активный транспорт.

6.3. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток и способы се преодоления.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Используемые реагенты.

1.1. Фосфолипиды и ПАВ.

1.2. Полимеры.

1.3. Низкомолекулярные реагенты.

1.4. Вода.

1.5. Структурные формулы используемых соединений.

2. Объекты исследования.

2.1. Получение липосом.

3. Методы исследования.

3.1. Динамическое светорассеяние.

3.2. Электрофоретическая подвижность.

3.3. Флуориметрия.

3.4. УФ-спектроскопия.

3.5. Препаративное центрифугирование.

3.6. Потенциометрия.

3.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

3.8. Прижизненное окрашивание клеток метилтетразолевым синим.

3.9. Биологические объекты.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬ ТА ТОВ.:.

1. Адсорбция макромолекул П2 на поверхность липосом.

1.1. Полнота связывания ФХ/КЛ " липосом с П2.

1.2. Полнота связывания ФХ/КЛ2"/Бридж липосом с П2.

1.3. Нейтральные трехкомпонентные липосомы.

2. Устойчивость комплексов липосома-П2 в водно-солевых средах.

3. Структурные перестройки в липосомальных мембранах под действием адсорбированного поликатиона.

3.1. Структура ФХ/КЛ2" липосом и их комплексов с поликатионом.

3.2. Структура гидрофилизованных липосом и их комплексов с поликатионом.

3.3. Структура трехкомпонентных нейтральных (цвиттер-ионных) липосом и их комплексов с поликатионом.

4. Межлипосомальная миграция поликатиона.

4.1. Миграция П2 в суспензиях ФХ/КЛ2" липосом.

4.2. Миграция П2 в суспензиях ФХ/КЛ2"/ЦМАБ+ липосом.

4.3. Миграция П2 в суспензиях ФХ/КЛ2"/Бридж липосом.

5. Токсичность комплексов поликатион-липосома по отношению к клеткам и экспериментальным животным.

5.1. Взаимодействие ФХ/ЮГ/ДОФЭА-ПЭГ липосом с ноликатионами.

5.2. Адсорбция поликатионов на липосомы.

5.3. Определение цитотоксичности комплексов ФХ/КЛ "/ДОФЭА-ПЭГ - П2,

5.4. Загрузка липосом и комплексов липосома-П2,16 антраценовым антибиотиком.

5.5. Доставка ДОКС внутрь клеток HeLa и MCF7/R.

5.6. Токсическое действие нанокапсул на мышей.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРА ТУРЫ.

Сферические бислойные липидные везикулы (липосомы) известны в течение более 40 лет. Устойчивый интерес исследователей и практиков к липосомам объясняется рядом соображений: хорошей биосовместимостью липидов [1-4], большим разнообразием методов их получения [4-9], простотой контроля липидного состава и размера липосом [10-12], а также возможностью приготовления смешанных липид/белковых везикул [13,14].

В настоящее время липосомы активно используются по двум основным направлениям. Первое и наиболее обширное - это липосомы как контейнер для инкапсулирования и контролируемого высвобождения лекарственных веществ [13-19]. Применение липосомальных композиций разного состава на основе синтетических и природных липидов позволяет изменять структуру бислоя, что значительно влияет на свойства контейнера, такие как проницаемость к низкомолекулярным соединениям [4,5,20-38], длительная циркуляция в биологических жидкостях без разрушений [7,13-15]. Наибольший прогресс достигнут в области лечения онкологических и инфекционных заболеваний [4,5,8,13-15].

Другое значимое направление - это применение липосом в качестве удобной модели, позволяющей анализировать строение и поведение мембран клеток как в невозмущенном состоянии [30,33,39,40-44], так при взаимодействии с различными полимерами [45-51] и белками [17,23,24,41,51]. Известно, что адсорбция низкомолекулярных ионов может приводить к микрофазовому разделению липидов в пределах бислоя [52-65]. Адсорбция же поликатионов на отрицательно заряженной липидной мембране сопровождаться возрастанием скорости миграции липидов между внешним и внутренним стронами бислоя [45,51,52,65], возникновением трансмембраннной асимметрии в распределении липидов [51-53,65-69], формированием сквозных пор (каналов) в мембране [5255,66,68-70], образованием доменов одного из компонентов в пределах липидного бислоя [51,55-59,65,68-71] и других дефектов. В итоге возмущение клеточной стенки приводит к повышению проницаемости мембраны, и как следствие, к увеличению эффективности доставки препаратов в ткани живых организмов [3,4,13-15,73].

В обоих направлениях был достигнут существенный прогресс. Тем не менее, ряд вопросов остался без ответа. Один из них касается способности полимеров мигрировать между липидными бислоями. Ответ на него важен по двум причинам. Во-первых, предоставление более современной модели, позволяющей описать поиск полиэлектролитами и биоактивными коньюгатами на их основе клеток-мишеней в биологической жидкости, позволит изменять состав и архитектуру полиэлетролитов, и тем самым повысить эффективность целевой доставки лекарств в пораженные ткани. Имеющиеся представления базируются на исследованиях миграции макромолекул между частицами суспензии, в микрогелях или вдоль поверхностей различной природы. Такие модельные представления не учитывают целого ряда факторов, такие как подвижность липидов и возможность образования дополнительных гидрофобных связей [45,66,74-80]

Во-вторых, для создания наноконтейнеров из уже имеющихся липосомальных препаратов за счет простого смешение растворов полиэлектролитов и суспензии липосом. Это позволит придать контейнерам повышенную аффинность по отношению к поверхности клеток, и возможно повысить эффективность доставки препаратов. Для этого необходимо соблюдение равномерного распределения полиэлектролита между везикулами и обеспечение постоянства состава комплексов полимер-липосома. В настоящее время увеличение сродства липосом к поверхности клеток обеспечивается за счет ковалентной модификации векторами, такими как антитела, факторы роста клеток, лектины, аптамеры (РНК) и др. [7,13-15,73,76]. Другой более простой и значительно более дешевый подход связан с модификацией липосом различными полиэлектролитами [66,69].

Поэтому данная работа посвящена изучению межлипосомальной миграции катионных полимеров, установлению структурно-химических характеристик липосомальных мембран в контакте с поликатионами и определению токсичности комплексов поликатион-липосома.

ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ

1. Липиды.

Овертон в середине прошлого столетия обратил внимание на то, что вещества на границе фаз масло-вода распределяются со скоростью близкой к скорости проникновения соединений через биологические мембраны. Это наблюдение и ряд экспериментов, проведенных Ленгмюром, заложили основы для рассмотрения основополагающей роли жироподобных веществ как структурной единицы клеточной мембраны.

В дальнейшем, эксперименты по детергентному анализу биологических мембран позволили расширить представления о таком классе соединений как липиды. В основном эти соединения получают экстракцией органическими растворителями из водного раствора, после разрушения клеточных мембран.

Итак, мембранными липидами называют жирные кислоты и их фосфоро- и азотсодержащие производные [1]. Огромное разнообразие их подклассов обусловлено большим количеством функций, выполняемых липидами в биологических объектах. Тем не менее, наиболее распространенным вляются глицерофосфолипиды (рис. 1).

Фосфолипид

Лизофосфолипид

Гликозилдиа цил-глицерол

Плазмалоген

Рисунок 1. Структурные формулы некоторых классов липидов. Эти липиды содержат два остатка жирной кислоты, соединенной через сложноэфирную связь с двумя гидроксилами глицерина. К третьему гидроксилу можгут быть присоединены через остаток фосфорной кислоты алкильные производные аминов.

выводы.

1. Показано, что катионный полимер (кватернизованный поли-4-винилпиридин) количественно связывается с тремя типами липосом: 1 Традиционными, сформированными из цвиттер-ионного ФХ и анионного KJI 2) гидрофилизованными ФХ/КЛ2" липосомами со встроенными в бислой ПЭГилированными липидами и 3) трехкомпонентными электронейтральными липосомами, состоявшими из ФХ и взятых в равных количествах КЛ2" и катионного ЦМАБ|+. Комплексообразование поликатиона с традиционными ФХ/КЛ2" липосомами сопровождается их агрегацией, в то время как гидрофилизованные и трехкомпонентные электронейтральные липосомы не образуют агрегатов при связывании с поликатионом.

2. Установлено, что адсорбция поликатиона на поверхности анионных (традиционных и ПЭГилированных) липосом вызывает микрофазовое разделение компонентов в мембране с образованием доменов, обогащенных КЛ " . В отличие от этого, взаимодействие того же поликатиона с трехкомпонентными электронейтральными липосомами развивается как адсорбция на поверхности с фиксированным положением отрицательных и положительных зарядов и не сопровождается латеральной сегрегацией липидов.

3. Обнаружено, что внутри агрегатов, сформированных ФХ/КЛ2" липосомами и молекулами поликатиона, происходит частичное перераспределение звеньев (сегментов) макромолекул между липосомами.

Адсорбированные макромолекулы способны мигрировать между

2 +1 индивидуальными (неагрегированными) ФХ/КЛ "/ЦМАБ липосомами. В системе с участием ПЭГилированных липосом молекулы поликатиона перемещаются между липосомами, будучи связанными электростатическими связями в комплекс с анионными компонентами мембраны.

4. Показано, что уровень цитотоксичности комплексов поликатион-ПЭГилированная липосома близок к таковой для исходных липосом. Поученные комплексы характеризуются низким уровнем токсичности по отношению к экспериментальным животным (мышам). t

5. Комплексы поликатион-ПЭГилированная липосома с суммарным положительным поверхностным зарядом обеспечивают эффективное проникновение в клетки противоопухолевого антибиотика доксорубицина. I

1. Геннис Р. Биомембраны Молекулярные Структуры и Функции. М. Мир, 1997.

2. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Наука. 1981.

3. Holmberg К., Jonsson В., Kronberg В., Lindman В. Surfactants and Polymers in Aqueous Solution. John Wiley & Sons, Ltd. 2002.

4. R. Lipowsky, E. Sackmann. Handbook of Biological Physics Vol. I Physical Basis of Self-Organization and Function of Membranes:Physics of Vesicles. Elsevier Science B.V.1995.

5. Huang C. Studies on phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characterization// Biochemistry 1969. Vol.8. P. 344-351.

6. Deamer D.W., Uster P.S. Liposomes preparation: Methods and Mechanisms, liposomes. Marcell Dekker. New York 1983.

7. Knight C. G. Research monographs in cell and tissue physiology Vol. 7. Elsevier/North-Holland Biomedical Press. Amsterdam 1981.

8. Talsma H.; Cormmelin D. J. A. Liposomes as Drug Delivery Systems, Part I: Preparation. Pharmaceut Tech. 1992. Vol. 16. p. 96-106.

9. Lasic D.D. Spontaneous Vesiculation and Spontaneous Liposomes.// J Liposome Res. Vol.9 I. 1. 1999. p. 43-52

10. Marsh D. Studies of membrane dynamics using nitroxide spin labels // Pure & Appl.Chem. 1990. Vol.62.1. 2. p. 265-270.

11. Lamy-Freund Т., Riske K. A. The peculiar thermo-structural behavior of the anionic lipid DMPG// Chem. Phys. Lipids. 2003. Vol. 122. p. 19-32

12. Kornberg R., McConnell H. M. Lateral Diffusion of Phospholipids in a Vesicle Membrane (spin-labeled phosphatidylcholine/nuclear resonance).// Proc. Nat. Acad. Sci. 1971. Vol. 68.1. 10. p. 2564-2568

13. Drummond, D. C.; Meyer, O.; Hong, K. L.; Kirpotin, D. В.; Papahandjopoulos, D. Optimizing Liposomes for Delivery of Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors. //Pharmacol. Rev. 1999. Vol. 51.1. 4. p. 691.

14. Lasic, D. D.; Papahadjopoulos, D. Medical Applications of Liposomes', Elsevier: Amsterdam, 1998.

15. Metselaar, J. M .Liposomal targeting of glucocorticoids. A novel treatment approach for inflammatory disorders', PrintPartners Ipskamp B.V.: Amsterdam 2003

16. Christophe J.C., Muller B.K., Lamb D.C., Nolde F., Mullen K„ Brauchle C.A. New Photostable Terrylene Diimide Dye for Applications in Single Molecule Studies and Membrane Labeling. //J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128. p. 52835291.

17. Xiang T.-X., Anderson B.D. Liposomal drug transport: A molecular perspective from molecular dynamics simulations in lipid bilayers // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2006. Vol. 58. p. 1357-1378.

18. Wiener M. C., White S. H. Structure of a fluid dioleoylphosphatidylcholine bilayer determined by joint refinement of X-ray and neutron diffraction data //Biophys. J. 1992 Vol. 61. p. 434-447

19. Grant L. M., Tiberg F. Normal and Lateral Forces between Lipid Covered Solids in Solution: Correlation with Layer Packing and Structure //Biophys J. 2002. Vol. 82. p.1373-1385

20. Ganchev D. N., Hasper H. E., Breukink E., de Kruijff B. Size and Orientation of the Lipid II Headgroup as revealed by AFM Imaging // Biochemistry 2006. Vol. 45. p. 6195-6202

21. Egberts E., Marrink S-J.,Berendsen H.J.C. Molecular dynamics simulation of a phospholipid membrane //Eur. Biophys. J. 1994 Vol. 22. p.423-437

22. Guler S.D., Ghosh D. D., Pan J., Mathai J.C, Zeidel M.L., Nagle J. F., Tristram-Nagle S. Effects of ether vs. ester linkage on lipid bilayer structure and water permeability // Chem Phys Lip 2009 Vol. 160.1. 1. p.33-44

23. Sun W-J, Suter R.M., Knewtson M.A., Worthington C.R., Tristram-Nagle S, Zhang R, Nagle J.F. Order and disorder in fully hydrated unoriented bilayers of gel-phase dipalmitoylphosphatidylcholine// Phys. Rev. E. 1994. Vol. 49. 1.5. p.4665—4676

24. Sun W-J., Tristram-Nagle S., Nagle J.F. Suter R.M. Structure of Gel Phase Saturated Lecithin Bilayers:. Temperature and Chain Length Dependence// Biophys. J. 1996 Vol. 71 p. 885-891

25. Nagle J.F. Theory of lipid monolayer and bilayer phase transitions: effect of headgroup interactions. // J. Membr. Biol. 1976. Vol. 27. p. 233-250. PubMed: 940146.

26. McIntosh T.J. Differences in hydrocarbon chain tilt between hydrated phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine bilayers. A molecular packing model.// Biophys. J. 1980. Vol.29, p.237-246. PubMed: 6894871.

27. Nagle J.F, Tristram-Nagle S Structure of lipid bilayers //Biochim Biophys Acta. 2000 Vol. 1469.1. 3. p. 159-195

28. Sum A.K., Faller R., de Pablo J.J. Molecular Simulation Study of Phospholipid Bilayers and Insights of the Interactions with Disaccharides //Biophys J. 2003. Vol. 85p. 2830-2844

29. Pan J., Tristram-Nagle S., Kucverka N., Nagle J.F. Temperature Dependence of Structure, Bending Rigidity, and Bilayer Interactions of Dioleoylphosphatidylcholine Bilayers //Biophys J. 2008 Vol. 94 p. 117-124

30. Nagle J.F, Tristram-Nagle S. Structure of lipid bilayers. Part II //Biochim Biophys Acta. 2001 Vol. 1479. p. 189-211

31. Sun W-J., Tristram-Nagle S., Nagle J.F. Suter R.M. Biophysics Structure of the ripple phase in lecithin bilayers //Proc. Nat. Acad. Sci. USA (PNAS) 1996 Vol. 93, p. 7008-7012

32. Janiak M.J., Small D.M., Shipley G.G. Temperature and Compositional dependence of the structure of Hydrated Dimyristoyl Lecithin //J Biol Chem 1979 Vol. 254, No. 13, p. 6068-6078, 1979

33. Katsaras J., Tristram-Nagle S., Liu Y, Headrick R.L., Fontes E., Mason P.C., Nagle J.F. Clarification of the ripple phase of lecithin bilayers using fully hydrated, aligned samples. //Phys. Rev. E. 2000. Vol. 61. p.5668-5677

34. Matuoka S, Yao H, Kato S, Hatta I. Condition for the appearance of the metastable P,6, phase in fully hydrated phosphatidylcholines as studied by small-angle x-ray diffraction //Biophys. J. 1993. Vol. 64. p. 1456-1460

35. Woodward J.T., Zasadzinski J.A. High-Resolution Scanning Tunneling

36. Microscopy of Fully Hydrated Ripple-Phase Bilayers //Biophys. J. 1997 Vol 72. p.964-976

37. DeVido D., Dorsey J., Chan H.S., Dill K.A. Oil/water partitioning has a different thermodynamic signature when the oil solvent chains are alighned thanwhen they are amorphous// J. Phys.Chem. 1998 Vol. 102 p.7272-7279.

38. Mantsch, H.H., McElhaney R.N., Phospholipid phase transitions in model and biological membranes as studied by infrared spectroscopy //Chem. Phys. Lipids 1991. Vol. 57. p.213-226.

39. Haris, P.I. Chapman D. Does Fourier-transform infrared-spectroscopy provide useful information on protein structure//Trends Biochem Sci 1992 Vol.17, p.328-333.

40. Malukutka S., Shipley G.G. Structure and thermotropic properties of phosphatidylethanolamine and its N-methyl derivates// Biochemistry 1984. Vol.23. p. 2514-2519

41. Repakova J., Holopainen J.M., Morrow M.R., McDonald M.C., C" apkova P., Vattulaineny I. Influence of DPH on the Structure and Dynamics of a DPPC Bilayer//Biophys J. 2005. Vol. 88 p.3398-3410

42. Yaroslavov A.A., Rakhnyanskaya A.A., Yaroslavova E.G., Efimova A.A.,. Menger F.M. Polyelectrolyte-coated liposomes: Stabilization of the interfacial complexes //Adv Col Inter Sci 2008. Vol. 142 p.43-52

43. ICenworthy A. K., Simon S. A., Mcintosh T. J. Structure and Phase Behavior of Lipid Suspensions Containing Phospholipids with Covalently Attached Polyethylene glycol) //Biophys J 1995. Vol. 68. p. 1903-1920

44. Hashizaki K., Taguchi H., Saito Y., Ogawa N. Calorimetry and Cryo-Transmission Electron Microscopic Studies of PEG2000-Grafted Liposomes //Chem. Pharm. Bull. 2006. Vol. 54. p. 561—563

45. Berde C.B., Andersen H.C., Hudson B.S. A theory of the effects of head-group structure and chain unsaturation on the chain melting transition of phospholipid dispersions.// Biochemistry. 1980 Vol. 19. p.4279-93

46. John R. Silvius, Thermotropic Phase Transitions of Pure Lipids in Model Membranes and Their Modifications by Membrane Proteins, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1982

47. Anglin T.C., Conbo J.C. Lateral Pressure Dependence of the Phospholipid Transmembrane Diffusion Rate in Planar-Supported Lipid Bilayers //Biophys J 2008 Vol. 95 p. 186-193

48. Allende D., Simon S. A., Mcintosh T.J. Melittin-Induced Bilayer Leakage Depends on Lipid Material Properties: Evidence for Toroidal Pores //Biophys J. 2005 Vol. 88. p. 1828-1837

49. Sparr E., Wennerstrom H. Responding Phospholipid Membranes—Interplay between Hydration and Permeability //Biophys J. 2001 Vol.81 p. 1014-1028

50. London E. How principles of domain formation in model membranes may explain ambiguities concerning lipid raft formation in cells //Biochim Biophys Acta 2005 Vol. 1746. p. 203-220

51. Manosroi A., Wongtrakul P., Manosroi J., Sakai H., Sugawara F., Yuasa M., Abe M. Characterization of vesicles prepared with various non-ionic surfactants mixed with cholesterol //Col Surf B: Biointerfaces 2003 Vol.30, p. 129-138

52. Goni F.M., Alonso A., Bagatolli L.A.,. Brown R.E., Marsh D., Prieto M., Thewalt J.L. Phase diagrams of lipid mixtures relevant to the study of membrane rafts //Biochim Biophys Acta 2008. Vol. 1781. p. 665-684

53. Volodkin D.M., Ball V., Voegel J-C., Mohwald H., Dimova R., Marchi-Artzner V. Control of the interaction between membranes or vesicles: Adhesion, fusion and release of dyes //Col Sur A: Physicochem. Eng. Aspects 2007. Vol. 303. p.89-96

54. Pokorny A., Almeida P.F.F., Melo E.C.C, Vaz W.L.C. Kinetics of Amphiphile Association with Two-Phase Lipid Bilayer Vesicles //Biophys J 2000. Vol. 78. p. 267-280

55. Leventis R., Gagne J., Fuller N., Rand R.P., Silvius J.R. Divalent cation induced fusion and lipid lateral segregation in phosphatidylcholine-phosphatidic acid vesicles.// Biochemistry 1986. Vol. 25. p. 6978-87.

56. Silvius J.R. Calcium-induced lipid phase separations and interactions ofphosphatidylcholine/anionic phospholipid vesicles. Fluorescence studies using carbazole-labeled and brominated phospholipids. //Biochemistry. 1990. Vol. 29. p.2930-8.

57. Di Giovanni J., Iborra C., Maulet Y., Leveque C., El Far O., Seagar M. Calcium-dependent regulation of SNARE-mediated membrane fusion by calmodulin. //J Biol Chem. 2010 Vol. 285. p. 23665-23675

58. Tae-Young Y., Xiaobind L., Jiajie D., Lee S-M.,Taekjip H., Shin Y-K. Complexin and Ca2+ stimulate SNARE-mediated membrane fusion //Nat Struct Mol Biol. 2008 Vol. 15.1. 7. p.707-713.

59. Connell E., Giniatullina A., Lai-Kee-Him J., Brisson A.B., Davletov B. Cross-linking of Phospholipid Membranes is a Conserved Property of Calcium-sensitive Synaptotagmins //J Mol Biol. 2008. Vol. 380.1. 1. p. 42-50.

60. Antunes F.E., Marques A.F., Miguel M.G., Lindman B. Polymer-vesicle association //Adv Col Inter Sci 2009. Vol. 147-148. p. 18-35

61. Antunes F.E., Brito R.O.,Marques E.F., Lindman B.,Miguel.M. Mechanisms behind the faceting of catanionic vesicles by polycations: chain crystallization and segregation. // J Phys Chem В 2007. Vol. 111. p.l 16.

62. Yaroslavov A.A., Kiseliova E.A., Udalykh O.Yu., Kabanov V.A. Conventional and Gemini Surfactants Embedded within Bilayer Membranes: Contrasting Behavior //Langmuir 1998. Vol. 14. p.5160.

63. Pedersen T.b., Kaasgaard Т., Jensen M., Frokjaer S., Mouritsen O., Jorgense K. Phase Behavior and Nanoscale Structure of Phospholipid Membranes Incorporated with Acylated C14-Peptides //Biophys J. 2005 Vol. 89 1.4. p. 2494-2503

64. Derjaguin В. V., Muller V. M., Toporov Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles //J. Col Inter Sci. 1975. Vol.53, p. 314-325

65. Verwey E. J. W., Overbeek J. Th. J. Theory of stability ofliophobic colloids. Elsevier, Amsterdam- New York 1948.

66. Lasic D.D. Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times //Biochim Biophys Acta. 1991 Vol. 1070. p. 187192.

67. Bordi F., Cametti C. Salt-induced aggregation in cationic liposome aqueous suspensions resulting in multi-step self-assembling complexes//Coll. Surf. B: Biointerfaces, 2002. Vol. 26. p.341-350rd

68. Hiemenz P. C., Rajagopalan R. Principles of colloid and surface chemistry, 3 Ed., Marcel Dekker, New York 1997

69. I Ieurtault В., Saulnier P., Pech B. Interfacial stability of lipid nanocapsules // Coll. Surf. B: Biointerfaces. 2003 Vol. 30. p. 225-235

70. Needham D, Mcintosh T.J., Lasic D.D. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. //Biochim Biophys Acta. 1992 Vol. 1108. p.40-48

71. Tirosh O., Barenholz Y., Katzhendler J., Priev A. Hydration of Polyethylene Glycol-Grafted Liposomes. //Biophys J. 1998. Vol. 74. p. 1371-1379

72. Dipalmitoylphosphatidylcholine Studied by Spectrophotometry and Spin-Label Electron Spin Resonance. //Biophys J. 2000. Vol. 78 p. 1420-1430

73. Sybachin, A.V.; Efimova, A. A.; Litmanovich, E. A.; Menger, F. M.; Yaroslavov, A. A. Complexationof polycations to anionic liposomes: Composition and structure of interfacial complexes. //Langmuir. 2007. Vol: 23. p. 10034.

74. Sriwongsitanont S., Ueno M. pH-Dependent Coordination of Metal-Lisinopril Complex Investigated by Attenuated Total Reflection/Fourier Transform Infrared Spectroscopy // Chem Pharmaceut Bull. 2002. Vol. 50. p. 1238-1244.

75. Tirosh O. Barenholz Y., Katzhendler J., Priev A. Hydration of Polyethylene Glycol-Grafted Liposomes // Biophys J. 1998. Vol. 74. p. 1371.

76. Kenworthy A. K., Simon S. A., Mcintosh T. J. Structure and Phase Behavior of Lipid Suspensions Containing Phospholipids with Covalently Attached Polyethylene glycol) // Biophys J. 1995. Vol. 68. p. 1903.

77. Ceh В., Winterhalter M., Frederik P. M., Stealth® liposomes: from theory to product // Adv. Drug Deliv Rev. 1997. Vol. 24. p. 165.

78. Tribet С, Vial OF. Complexation of integral membrane proteins by phosphorylcholine-based amphipols //Soft Matter 2008. Vol. 4. p.68

79. Kabanov V.A., Yaroslavov A.A. What happens to negatively charged lipid vesicles upon interacting with polycation species? //J Control Release 2002. Vol. 78. p.267

80. Mizusaki M, Morishima Y, Winnik F.M. An assessment by fluorescencespectroscopy of the stability of polyanions/positively charged liposome systems in the presence of polycations//Polymer 2001. Vol. 42. p. 5615.

81. Polozova A, Winnik FM. Mechanism of the interaction of hydrophobically-modified poly-(N-isopropylacrylamides) with liposomes. //Biochim Biophys Acta 1997. Vol. 1326. p. 213.

82. Boon J.M., Smith B.D. Facilitated phosphatidylcholine flip-flop across erythrocyte membranes using low molecular weight synthetic translocases. // J Am Chem Soc 2001. Vol. 123. p. 6221.

83. Bordi F., Cametti C., Sennato S., Diociaiuti M. Direct Evidence of Multicompartment Aggregates in Polyelectrolyte-Charged Liposome Complexes // Biophys J. 2006 Vol. 91. p. 1513-1520.

84. Bordi F, Cametti C, Sennato S, Truzzolillo D. Strong repulsive interactions in polyelectrolyte-liposome clusters close to the isoelectric point: a sign of an arrested state.//Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2007. Vol. 76 p. 2026.

85. Yaroslavov A.A., Kiseliova E.A., Udalykh O.Yu., Kabanov V.A., Ermakov Yu. A., Azov V.A., Menger F.M. Conventional and Gemini Surfactants Embeddedwithin Bilayer Membranes: Contrasting Behavior//Chem. Eur. J. 2001. Vol. 7. p. 4835.

86. Leontiadou H., Mark A.E., Marrink S.J. Molecular dynamics simulations of hydrophilic pores in lipid bilayers// Biophys. J. 2004. Vol. 86. p.2156-2164.

87. Vries A.H., Mark A.E., Marrink S.J., Molecular dynamics simulation of the spontaneous formation of a small DPPC vesicle in water in atomistic detail//J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. p. 4488-4489

88. Wimley W.C., Thompson Т.Е., Exchange and flip-flop of dimyristoylphosphatidylcholine in liquid- crystalline, gel, and two-component, two-phase large unilamellar vesicles //Biochemistry 1990 Vol. 29. p. 1296-1303

89. Deamer D.W, Bramhall J. Permeability of lipid bilayers to water and ionic solutes // Chem. Phys. Lipids 1986. Vol. 40. p. 167-188

90. Chakrabarti A.C., Deamer D.W., Permeability of lipid bilayers to amino acids and phosphate // Biochim. Biophys. Acta 1992. Vol. 1111. p. 171-177

91. Xiang T-X, Anderson B.D. Liposomal drug transport: A molecular perspective from molecular dynamics simulations in lipid bilayers //Adv Drug Del Rev 2006 Vol. 58 p. 1357-1378

92. Kouichi Y., Masayoshi N., Ken-Ichiro G., Takeshi K. A model for self-sustained potential oscillation of lipid bilayers membranes induced by the gel-liquid crystal phase transitions //Biophys J 1993 Vol 64 1461-1475

93. Bordi F., Cametti C., A. Naglieri Responding Phospholipid Membranes— Interplay between Hydration and Permeability //Biophys J 2001 Vol. 81. p. 1014— 1028

94. Betz G., Aeppli A., Menshutina N., Leuenberger H. In vivo comparison of various liposome formulations for cosmetic application // Int J Pharm 2005 Vol. 296. p. 44-54

95. Cevc G. Lipid vesicles and other colloids as drug carriers on the skin //Adv Drug Del Rev 2004 Vol. 56. p. 675- 711

96. Elsayed M.A., Abdallah O.Y., Naggar V.F., Khalafallah N.M. Lipid vesicles for skin delivery of drugs: Reviewing three decades of research //Int J Pharm 2007 Vol. 332. p. 1-16

97. Deryckel A.S.L., de Witte P.A.M. Liposomes for photodynamic therapy //Adv Drug Del Rev 2004 Vol. 56. p. 17- 30

98. Drummond D.C., Meyer O., Hong K.L., Kirpotin D.B., Papahandjopoulos D. Liposomes for Delivery of DOX to Solid Tumors // J Pharmacol Exp Therapeut. 1999. Vol. 51. p. 691.

99. Kitaeva M.V., Melik-Nubarov N.S., Menger F.M., Yaroslavov A.A. Membrane transport of a polyacid-tied doxorubicin //Langmuir. 2004 Vol. 20. p. 6796.

100. Taguchi H., Sakai H., Abe M., Saito Y. Carboxyfluorescein Leakage from Poly(ethylene glycol)-Grafted Liposomes Induced by the Interaction with Serum // Chem. Pharm. Bull. 2006 Vol. 54 p. 80

101. Hashizaki K., Itoh C., Sakai H., Ogawa N. Effects of Poly(ethylene glycol) (PEG) Chain Length of PEG-Lipid on the Permeability of Liposomal Bilayer Membranes //Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51. p. 815-820

102. Tirosh O., Barenholz Y., Katzhendler J., Priev A. Hydration of Polyethylene Glycol-Grafted Liposomes. //Biophys J. 1998. Vol. 74. p. 1371-137

103. Silvander M., Bergstrand N., Edwards K. Linkage identity is a major factor in determining the effect of PEG-ylated surfactants on permeability of phosphatidylcholine liposomes // Chem Phys Lipids 2003 Vol. 126. p.77-83

104. Zhang X., The study of methotrexate thermal-sensitive liposomes preparedfrom nature lipid, Shenyang. 2000.

105. Storm, G.; Crommelin, D.J.A. Liposomes: quo vadis? //PSTT 1998. Vol. 1. p. 19-31.

106. Gregoriadis, G.; Florence, A.T. Liposomes in Drug Delivery: Clinical, Diagnostic and Ophthalmic Potential //Drugs. 1993 Vol. 45. p. 15-28

107. Janknegt R. Liposomal formulations of cytotoxic drugs. //Support. Care Cancer 1996. Vol. 4. p. 298-304

108. Boswell G.W., Buell D., Bekersky, I. AmBisome (liposomal amphotericin В): a comparative review. // J. Clin. Pharmacol. 1998. Vol. 38. p. 583-592.

109. Ayyagari A.L., Zhang X., Ghaghada K.B., Annapragada А., Ни X., Bellamkonda R.V. Long-Circulating Liposomal Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging //Magn Reson Med. 2006 Vol. 55. p. 1023-1029.

110. Woodle M.C., Engbers C.M., Zalipsky S. New amphipatic polymer-lipid conjugates forming long-circulating reticuloendothelial system-evading liposomes. //Bioconjug. Chem., 1994. Vol. 5. p. 493-496

111. Harrington K.J. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. //Clin Cancer Res. 2001. Vol.7, p. 243-254.

112. Northfelt D.W. Doxorubicin encapsulated in liposomes containing surface-bound polyethylene glycol: pharmacokinetics, tumor localization, and safety in patients with AIDS-related Kaposi's sarcoma. //J Clin Pharmacol. 1996. Vol. 36. p. 55-63.

113. Vermehren C., Jorgensen K., Schiffelers R., Frokjaer S. Activity of mammalian secreted phospholipase A(2) from inflammatory peritoneal fluid towards PEG-liposomes. Early indications. //Int. J. Pharm. 2001. Vol. 214. p. 93-98.

114. Vermehren C., Jorgensen K., Frokjaer S. Influence of lipopolymer concentration on liposome degradation and blood clearance. // Int. J. Pharm. 1999 Vol. 183. p. 13-16.

115. Buiting A.M., Van Rooijen N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. //J. Drug Target. 1994. Vol. 2. p. 357-362.

116. Schmidt-Weber C.B.; Rittig, M.; Buchner E.; Hauser I.; Schmidt I.; Palombo-Kinne E.; Emmrich F.; Kinne R.W. Apoptotic cell death in activated monocytesfollowing incorporation of clodronate-liposomes. // J. Leukoc. Biol. 1996 Vol. 60. p.230-244.

117. Yuan F.; Leunig M.; Huang S.K.; Berk D.A.; Papahadjopoulos D.; Jain R.K. Microvascular Permeability and Interstitial Penetration of Sterically Stabilized (Stealth) Liposomes in a Human Tumor Xenograft //Cancer Res. 1994 Vol. 54. p.3352-3356

118. Wu N.Z.; Da D.; Rudoll T.L.; Needham D.; Whorton A.R.; Dewhirst M.W. Increased Microvascular Permeability Contributes to Preferential Accumulation of Stealth 1 Liposomes in Tumor Tissue// Cancer Res. 1993. Vol. 53. p. 3765-3770.

119. Wu N.Z.; Braun, R.D.; Gaber, M.H.; Lin, G.M.; Ong, E.T.; Shan, S.; Papahadjopoulos, D.; Dewhirst, M.W. Simultaneous measurement of liposome extravasation and content release in tumors.// Microcirculation 1997. Vol. 4. p. 83101

120. Baru, M.; Nahum, O.; Jaaro, H.; Sha'anani, J.; Nur, I. Lysosome-disrupting peptide increases the efficiency of in-vivo gene transfer.by liposome-encapsulated DNA.//J. Drug Target. 1998 Vol. 6. p. 191-199.

121. Mizuguchi H.; Nakagawa Т.; Nakanishi M.; Imazu S.; Nakagawa S.; Efficient gene transfer into mammalian cells using fusogenic liposome. //T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 218. p.402-407

122. Torchillin V.P. Affinity liposomes in vivo: factors influencing target accumulation.//J. Mol. Recognition 1996. Vol. 9. p.335-346.

123. Laverman P.; Boerman O.C.; Oyen W.J.; Dams E.T.; Storm G.; Corstens F.H. Liposomes for scintigraphic detection of infection and inflammation // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1999 Vol. 37. p.225-235.

124. Schwarze S.R.; Dowdy S.F. In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. //Trends Pharmacol. Sci. 2000. Vol. 21. p. 45-48.

125. Luqmani Y.A. Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy. //Med Princ Pract 2005. Vol. 14. p. 35-48.

126. Stavrovskaya A.A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells. //Biochemistry 2000. Vol. 65. p. 95-106.

127. Dean M., Hamon Y., Chimini G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. //J Lipid Res 2001. Vol. 42. p. 1007-1017.

128. Gottesman M.M., Fojo Т., Bates S.E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. //Nat Rev Cancer 2002. Vol. 2. p. 48-58.

129. Ambudkar S.V., Dey S., Hrycyna C.A., Ramachandra M., Pastan I., Gottesman M.M. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. //Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999. Vol. 39. p. 361-398.

130. Germann U.A., Pastan I., Gottesman M.M. P-glycoproteins: mediators of multidrug resistance. //Semin Cell Biol 1993. Vol. 4. p.63-76.

131. Priebe W., Van N.T., Burke T.G., Perez-Soler R. Removal of the basic center from doxorubicin partially overcomes multidrug resistance and decreases cardiotoxicity. //Anticancer Drugs 1993 Vol. 4. p.37-48.

132. Garnier-Suillerot A., Marbeuf-Gueye C., Salerno M., Loetchutinat C., Fokt I., Krawczyk M. Analysis of drug transport kinetics in multidrug-resistant cells: implications for drug action. //Curr Med Chem 2001. Vol. 8. p.51-64.

133. Leonard G.D., Polgar O., Bates S.E. ABC transporters and inhibitors: new targets, new agents. //Curr Opin Investig Drugs 2002 Vol. 3. p.l652-1659.

134. Thomas H., Coley H.M. Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein. //Cancer Control 2003 Vol. 10. p. 159-165

135. Yaroslavov A.A., Kul'kov V.E., Polinsky A.S., Baibakov B.A.,. Kabanov V.A A polycation causes migration of negatively charged phospholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane //FEBS Letters 1994 Vol. 340. p. 121123

136. Izumrudov V.A., Savitskii A.P., Bakeev K.N., Zezin A.B., Kabanov V.A A fluorescence quenching study of interpolyelectrolyte reactions .// Makromol. Chem., Rapid Commun. 1984. Vol. 5. p. 709-714.

137. Pardakhty A., Varshosaz J., Rouholamini A. In vitro study of polyoxyethylene alkyl ether niosomes for delivery of insulin. // Int J Pharm. 2007. Vol. 328. p. 130— 141

138. Feitosa E., Jansson J., Lindman B. The effect of chain length on the melting temperature and size of dialkyldimethylammonium bromide vesicles. // Chem Phys Lipids. 2006. Vol. 142. p. 128-132

139. Sobral C. N., Soto M.A., Carmona-Ribeiro A.M. Characterization of DODAB/DPPC vesicles. // Chem Phys Lipids. 2008 Vol. 152. p. 38

140. Brito R.O., Marques E.F. Neat DODAB vesicles: Effect of sonication time on the phase transition thermodynamic parameters and its relation with incomplete chain freezing.// Chem Phys Lipids. 2005. Vol. 137. p.l 8

141. Mayer L.D., Bally M.B., Cullis P.R., Wilson S.L. Emerman J.T. Comparison of free and liposome encapsulated doxorubicin tumor drug uptake and antitumorefficacy in the SCI 15 murine mammary tumor// Cancer lett 1990 Vol. 53. p. 18390

142. Horic Т., Ono K., Nishi H., Kimura T. Acute doxorubicin cardiotoxicity is associated with miR-146a-induced inhibition of the neuregulin-ErbB pathway. // Cardiovasc Res 2010. Vol. 87. p. 656