Конформационная подвижность трипептидных гормонов по данным двумерной спектроскопии ЯМР и ее связь с нейротропной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

¡О

с\>

ест С,'; О

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ им.А.В.БОГАТСКОГО

со

I—

а.

на правах рукописи

ГОРБАТШ ВИТАЛИИ ЯКОВЛЕВИЧ

УДК 577.322:591.145-546:543.422.2

ИНФОРМАЦИОННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ ТРИПЕПТВДНЫХ ГОРМОНОВ ПО ДАННЫМ ДВУМЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР И ЕЕ СВЯЗЬ С НЕИРОТРОПНОИ АКТИВНОСТЬЮ

02.00.10. - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ОДЕССА - 1995

Работа выполнена в Физико-химическом институте им.А.В.Богатского HAH Украины

Научный руководитель: доктор химических, наук,

профессор Ю.Е.Шапиро

Официальные опоненты: доктор химических наук,

профессор А.Г.Юрченко кандидат химических наук, научный сотрудник О.В.Севастьянов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

и нефтехимии HAH Украины

Защита состоится "ЛС" декабря 1995 г. в //) час, на засе дании специализированного совета Д05.14.02 при Физико-химическо институте им.А.В.Богатского HAH Украины (270080, г.Одесса, Черно морская дорога, 86)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Физико химического института им.А.В.Богатского HAH Украины

Автореферат разослан "/<£" ноября 1995 г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат химических наук Л-^у — Л.А.Литвинова

Актуальность телы. Широкое распространение олигопептидов в природе, их разнообразные физиологические функции, возможность проведения химических модификаций делает этот класс биологических молекул благодатным при изучении связи "структура-активность". Знание пространственного строения молекул природных и синтетических олигопептидов необходимо для исследования молекулярных механизмов узнавания, стимулирования, регуляции, т.е. для определения именно тех факторов, которые обусловливают взаимодействие пептидных биорегуляторов с их биологической мишенью. В принципе наиболее прямой подход мог бы заключаться в непосредственном изучении гормон-рецепторных комплексов современными физико-химическими методами. Однако рецепторы, даже если их удается выделить в изолированном виде, не всегда сохраняют свои свойства. В то же время понимание молекулярных механизмов передачи биологической информации может быть достигнуто изучением структурных и динамических свойств целенаправленно синтезированных и отобранных аналогов гормонов. Применение спектроскопии ЯМР к решению этих задач отмечено значительными успехами, что связано с развитием за последнее десятилетие многоимпульсных двумерных методик. В результате объем и качество информации о структуре молекул в растворе, полученной методами двумерной спектроскопии ЯМР, сопоставимы с получаемыми методом рентгеноструктурного анализа.

Целью работ было установление структурных особенностей аналогов меланостатина (МХР) и тиролиберина (ТКН), которые обусловливают их антидепрессивную или антиамнестическую активность.

Научная новизна исследований заключается в том, что

- предложен комплексный метод поиска " биологически активной конформации" пептидов, основанный на методиках двумерной спектроскопии ЯМР;

- выбраны "биологически активные конформации" в растворе для аналогов мгр и тан;

- показано, что при физическом моделировании взаимодействия аналогов мгр и биологической мишени с помощью обращенных мицелл АОТ "биологически активная конформация" стабилизируется на границе раздела фаз вода/ПАВ;

- выполнено предварительное картирование активного центра биологической мишени аналогов МЕР;

- объяснен обнаруженный при малых дозах реверсивный эффект антидепрессивной активности (АДА) аналогов М1Р.

Практическое значение работ состоит в том, что на основании найденной связи "структура-активность" для аналогов мгр и тин было предложено синтезировать модельные циклические дапептиды и пептидо-миметики, у которых "биологически активная конформация" реверсивного поворота закреплена ковалентной связью. Действительно, среди синтезированных циклических пептидомиметиков при биологических испытаниях были обнаруаены соединения, обладающие большей антидепрессивной или антиамнестической активностью, чем мгр, TRH и их линейные аналоги. Это позволяет использовать предложенные подходы для вне экспериментального скрининга нейролептиков новых поколений.

На защиту выносятся:

1. Стратегия поиска "биологически активной конформации" пептидов методами двумерной спектроскопии ЯМР, физического и математического моделирования.

2. "Биологически активная конформация" реверсивного поворота аналогов MIF и TRH, которая реализуется как в растворе в ДМСО, так и на границе раздела фаз вода/ПАВ.

3. Топография активного центра биологической мишени аналогов мгр, обладающих антидепрессивной активностью.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 9th International Symposium on Surfactants in Solution (Varna-1992), 28th Colloquium Speotrosoopioum Internationale (York-1993), 13th American Peptide Symposium (Edmonton-1993), 9th Russia-Germany Symposium on Chemistry of Peptides and Proteins (PuBhohino-1994), Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов (Рига-1990), 8 Всесоюзном симпозиуме по мекмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Новосибирск-1990), 1 Всесоюзной конференции по теоретической органической химии (Волгоград-1991), 6 Съезде фармакологов Украины (Харьков-1990), 9 Всесоюзной конференции "Химическая информатика" (Черноголовка-1992), Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" (Москва-1992), Научно-практической конференции "Лекарственные средства Украины, синтез, научные исследования, производство, реализация" (Харьков-1992), Всесоюзных, республиканских и региональных конференциях молодых ученых и специалистов (Москва-1990, Киев-1990, Донецк-1991, Одесса-1991,1992). На конкурсе молодых ученых (1992г.) работа была удостоена премии им.А.В.Богатского.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ.

Структура и объел работы. Диссертация изложена на 183 стр. ма-

шинописного текста, содержит 23 рис. и 24 табл. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 129 ссылок.

Экспериментальные результаты получены лично автором или при его непосредственном участии. Теоретические результаты получены совместно с соавторами работ. При этом автор участвовал в постановке задачи и обсуждении результатов. Большинство расчетов в гл.З выполнено В.Е.Кузьминым, Л.П.Тригуб и М.Ю.Горбачевым.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение конфорлациашой тюОвижности молекул леланостжина, ящюлиберина и их аналогов летодаш двумерной спектроскопии ЯМР.

Методами двумерной спектроскопии ЯМР 1Н определена пространственная структура МГР (I), TRH (711) и их аналогов (11-71, 7III-XII):

Ф, S Ф2 Ф2 J Ф3 р>-9-о— ш-э-сн-э-с— ш-э-сн2— о

NH | %l ^

i: rj= t-gty- (мп?)

НС1 i 2

CH0 11: R1= СбН5"

III: R1= n-N02C6H4-17: r|= n-hocgh4-

7: R1= n-NH2(CH2)3CONHC6H4- X: Glp-Gln-Abu-NH2

71: R1= n-NH2C6H4- о =NH %_

711: Glp-His-Pro-NH2 (TEH) 2 ^cO-Gln-Abu-It,

7III: Glp-Gln-Pro-m^ AX1- Ъ-% ¿

IX: Glp-Glu(NHCH(CH3)CHgAr)-Fro-NH2

4

Отнесение сигналов в одномерных спектрах ЯМР Н растворов аналогов MIF и TRH в ДМСО проводили с использованием двумерных спин-корреляционных спектров cosy (рис.1,а). Значения вицинальных констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) 3JNa и 3Jap найдены из спектров cosy и Q-J-корреляционных спектров. На основании зависимостей Карплуса-Быстрова для КССВ 3JNa и 3Jaр от торсионных углов <р и х1 было вычислено несколько значений этих углов. Для отбора тех углов, которые реализуются в растворе, были использованы межпротонные расстояния между сближенными фрагментами, взаимодействующими по диполь-дипольному механизму. В двумерных кросс-релаксационных спектрах noesy (рис.1,6) эти взаимодействия (d-контакты) проявляются в виде кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Значения ЯЭО,

1

найденные из интенсивностей кросс-пиков, шестой степени мекпротонного расстояния

обратно пропорциональны

Эти эксперименты позволили также выполнить оценку торсионных углов ф и

Известно, что энергетически выгодными конформациями MIF являются конформации реверсивного поворота - р-изгибы I и II рода, стабилизированные внутримолекулярной водородной связью (ВМВС) нн2...0=0 Рто. Конформации Pj и Pjj различаются значениями торсионных углов (|>2 и фа1у- Для молекулы mif в кристалле характерна кон-формация Pjj.

Рис.1. Спектр ЯМР 1Н (вверху) и двумерные COSY (а) и NOESY (<5) спектры раствора 0,05 моль/л аналога [Туг2] MIF в ДМС0-й6 при 30'С. На двумерных спектрах указаны протон-протонные J-связи и d-контакты

I- ю.о

-I---1-1-1---1-i—1-1-1—.-1—|—г-

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 м.Д.

На основании зависимости Карплуса-Быстрова получены значения торсионных углов <pg % -90, -145° и <pGly й ±25°4 для аналогов Mir в растворе в ДМСО. В случае канонических конформаций ßj и ßjj угол <р2

принимает значение, близкое к -60°. Увеличение <pg по модулю вызывает искажение конформации р-изгиба и увеличивает вероятность разрыва ВМВС. При этом становится возможным свободное вращение вокруг связей (Са-С0)2 и (N-oa)Gly. Однако a-протоны Gly дают сигналы в виде вырожденных мультиплетов, что может говорить о заторможенности вращения вокруг связей этого остатка. По программе panic произведен расчет спиновой системы протонов остатка Gly. На основании зависимости геминальной КССВ 2Ja,a„ от торсионного угла ф для остатка Gly были определены значения углов (|>01у = ±25°, которые соответствуют конформациям Pj и Pjj.

В спектрах ЯМР 1Н пептидов II-VI в ДМСО наблюдается магнитная неэквивалентность p-протонов второго аминокислотного остатка (рис.1). Анализ молекулярных моделей показал, что причиной магнитной неэквивалентности может быть близость карбонильной группы второго остатка, что возможно только в случае конформации Pjj.

Действительно, d-контакты в спектре noesy (рис.1,6) между протоном ж Gly и протонами второго остатка и реализующиеся при этом торсионные углы = 55° и 180* (табл.1) соответствуют конформации Pjj. Рассчитанные расстояния между протонами ГО и a-н, р-н второго остатка, ш второго и третьего остатков позволили отобрать одно из двух значений угла й -90°. В спектре noisy есть d-контакты Pro a-н - NHg1^, которые возможны только при конформации реверсивного поворота. Наличие el-контактов между протонами nh^" и протонами, ближайшими к СО-группе Pro, говорит о возможности образования ВМВС мевду этими фрагментами молекулы. Образование такой ВМВС подтверждают данные релаксометрии на ядрах С. Действительно, минимальные значения времени Т^ ядер углерода вблизи группы nh2 указывают на ограничение подвижности этого фрагмента. Такое же заключение было сделано на основании магнитной неэквивалентности а-прото-нов Gly. Отсюда следует, что аналоги МГР в ДМСО обладают преимущественной конформацией р1Г, стабилизированной ВМВС NHg""...0=С Pro.

Замена Ьеи на Phe слабо влияет на значения торсионных углов и не изменяет конформации Pjj молекулы пептида. При введении в п-положение фенильного кольца Phe различных заместителей возрастают значения ^^ для второго остатка, а, следовательно, увеличивается значение что приводит к искажению конформации Pjj. Методами множественной линейной регрессии получены корреляционные уравнения, связывающие АДА аналогов MIF со значениями КССВ второго и третьего

Таблица 1

Межпротонные расстояния, полученные по данным ШЕЭУ, и соответствующие им значения торсионных углов ф{, фí и х{ молекулы Н01-Рго-Туг-01у-ш2 (1 моль/л, 303 К)

<3 - Контакт

Раствор пептида в воде

Раствор в ДМСО

пептида

Водный раствор пептида, инкапсулированный обращенной мицеллой АОТ

d, А торсионный угол d, А Торсионный угол а, А торсионный угол

Pro а-н Pro р-н - Туг NH - Туг NH 2,3 ** Ф1 = 80° 2,4 2,5; 3,1 V бо; 180° * 2,7; 3,4 Ф1= 165°

Туг а-н Туг р-н Gly NH - Туг NH - Туг NH - Туг NH 2,9 2,4 ф2= -80' 2 -160° 2,9 2,5; 2,8 3.1 ф2= -94° 3,0 2,5 3,8 Ф2= -94°

Gly NH -Gly NH Gly NH - Туг а-Н - Туг NH Туг р-Н 2,4 ф2= 180° 2,6 3,1 3,1; 2,9 ф2= 55°, 180° 2,6 3,8 3,1 Ф2= * 180°

Туг p-H Туг p-H Gly NH - -Туг а-Н - Туг NH Туг р-Н 2,4 2,4 й-±29: ^ ±134' 2,8; 2,6 2,5; 2,8 3,1; 2,9 * -33° 2,5 2,5 3,1 xb±35: * ±130°

Туг S-H -Туг Р-Н 2,3 £...... . 1 %2= 90 2,5; 2,5 4- 90° 2,6 %\= 90°

Gly а-Н - Gly NH 2,4 Ф3= ±25° 2,6 ф3= ±25° 2,6 ф3= ±25°

**>

Кросс-пик скрыт сигналом воды. Прочерк означает отсутствие ¿-контактов.

оз

I

остатков. Найдено, что наибольшим значением АДА обладают именно те соединения, у которых конформация Pjj наименее искажена. С увеличением этого искажения активность падает. Так, аналог VI, у которого р-изгиб II рода наиболее искажен, был почти не активен во всем интервале изученных доз. Поэтому имеет смысл говорить о существовании "биологически активной конформации" Pjj у MIF и его аналогов.

В водном растворе у аналогов МП1 наблюдается слебопольный сдвиг сигналов карбонильных груш в спектре ЯМР 13С, который можно объяснить разрывом ВМВС вследствие гидратации этих групп. Разрыв ШВС подтверждается селективным увеличением времени Т^ ядер углерода Gly. При этом (^-контакты в спектре noesy и межпротонные расстояния (табл.1) соответствуют развернутой конформации молекулы. Следовательно, необходимо установить причины возможной стабилизации конформации Pjj в водной среде вблизи активного центра мишени, на реализацию которой указывают биологические испытания. Для этого использовано физико-химическое моделирование биологической мишени пептидов с помощью обращенных мицелл Аэрозоля ОТ (диоктилсульфосук-цинат натрия, АОТ), инкапсулирующих водный раствор трипептида 17.

В отличие от водного раствора, в спектре NOESY пептида в мицелле (рис.2,б) есть d-контакты характерные для конформации Pjj и аналогичные найденным для раствора в ДМСО (табл.1). На реализацию реверсивного поворота указывают ¿-контакты Pro р"-н - NHg. Сближенность этих фрагментов говорит об увеличении населенности свернутых конформаций молекул пептида в водной полости мицеллы и возможном образовании ВМВС NH™"...о=с Pro, что согласуется с данными релак-сометрии на ядрах углерода. Кроме того, анализ времен релаксации Т^ пептида в ДМСО, в воде и в мицелле указывает на адсорбцию молекул пептида на поверхности мицеллы.

Действительно, в спектре noesy наблюдаются кросс-пики между протонами Р'-Н Pro и Cl'H или СЗ.З'Н^ АОТ (рис.2,а), которые свидетельствуют о большом числе ci-контактов между протонами главной цепи пептида и протонами молекулы АОТ, ближайшими к полярным группам и ориентированными в водную фазу. Присутствие интенсивных кросс-пиков между протонами воды и S-протонами Pro указывает на расположение пептида вблизи штерновского слоя мицеллы.

Кросс-пики мезду протонами р-Н Туг и Cl'H АОТ (рис.2,a), a также между ароматическими протонами Туг и ClHg, СЗ.ЗЧ^, С4,4'Н АОТ (рис.2,б) говорят о том, что фенильное кольцо действует как

гидрофобный якорь при адсорбции молекулы пептида на внутренней поверхности мицеллы. На основании значений ЯЭО рассчитаны межпротонные расстояния между сближенными фрагментами молекул пептида и АОТ. На рис.3 изображена модель адсорбции пептида, которая построена в соответствии с вышеупомянутыми ¿-контактами и соответствующими им расстояниями.

скиты дот сз'н,

«1

1-

СГН I СЗН, С1Н, _1_Ц_*__|_1

1 о

од» ,о,° -о/"*

„—®-0 Ъ' @ © *о 9

Р./-СН

.Р.5-СН,

1 ш,

60.

СЗ'Н2 СИГНАЛЫ ДОТ

С1'Н |сЗН2 С1Н2 С4.4'Н СН2

Т.£-СН Т. 5-сн

-С. NN Т, NN

м. Л. В 7 6 5 4 3 2 1 С02

Рис.2. Фазочувствительный спектр шебу водного раствора пептида [Туг2]ЮТ (1 моль/л), инкапсулированного обращенными мицеллами АОТ ЦНзОШАОТ] = 18,5 моль/моль, [АОТ]/[пептид] = 3 моль/моль): а -область = 0,7*4,7 м.д., (¿2 = 0,7-5-4,7 м.д.; 0 - область ш1 = 6,7*8,7 м.д., ¡¿2 = 0,7*8,7 м.д. Аминокислотные остатки обозначены их однобуквенными кодами.

- 11 -Pro-Туг-Glu- NH2

ной мицеллы.

Можно дать различные объяснения стабилизации "биологически активной конформации". Одно из них - энергетическая стабильность этой конформации в иммобилизованной на границе раздела фаз воде, специфические свойства которой подобны свойствам ДМСО. С другой стороны, молекулярная адсорбция на границе раздела фаз мембрана/вода может содействовать стабилизации "биологически активной конформации".

Тиролиберин, подобно мгр, проявляет антидепрессивную активность и обладает антиамнестическим действием. С целью выявления элементов подобия их конформаций, которые могут обусловливать одинаковые свойства, представляется важным изучение конформационных особенностей TRH и его аналогов.

Среди изученных нами аналогов тш выявлены пептиды, обладающие высокой антиамнестической активностью, сопоставимой с эффектом известного ноотропного препарата пирацетама, но в значительно меньших дозах. Для выяснения изменений пространственной структуры TRH, которые могли бы привести к увеличению антиамнестической активности, методами двумерной спектроскопии ЯМР 1Н определены предпочтительные конформации в растворе ДМСО-dg тиролиберина и его аналогов VIII-XII, подобно тому, как это было сделано для аналогов мер. Значения торсионных углов аналогов trh приведены в табл.2.

В спектрах ЯМР ^-Н соединений VIII и IX сигналы от протонов NH, а-н Gin, а-н, Q-H и ш2 Pro имеют две компонеты с соотношением интегральных интенсивностей 0,8:0,2, которые соответствуют транс- и

цис-изомерам относительно пептидной связи х-Рго. Подобная изомерия пептидной связи наблюдается у TRH. Действительно, в фазочувстви-тельном спектре noesy (рис.4) есть кросс-пики между компонентами сигналов протонов кн, а-н остатка Gin. Причем знак этих кросс-пиков совпадает со знаком диагональных пиков, что указывает на их обменный характер. Следовательно, для молекул соединений VIII и IX в ДМСО-dg наблюдается равновесие между двумя формами с цис- и транс-пептидной связью х-Рго. Значение свободной энергии активации, рассчитанное по уравнению Эйринга на основании данных динамического ЯМР, для соединения VIII составило 57,1 КДЖ/М0ЛЬ-

Таблица 2

Значения торсионных углов <р, ф и х аминокислотных остатков тан и его аналогов в быбо-<36 , определенные по данным шезу

Торсионный угол VII VIII IX X XI XII

<Р1 120 120 120 120 120 120

Ф1 -30;180 б0;1б0 -60;180 60; 180 60; 180 60; 180

ф2 -89;-152 -88;-152 49;71 -93;-147 -93;-147 -93;-147

0;170 120 20;130 80; 160 120 120

d ±125 ±126 20; 90 ±35;±130 ±35;±130 ±35;±130

4 0;180 ±60; 180 * « ±60 ±60

ь - - - ±25 ±30 ±20

ь 0 0 0 - - -

А - - - 30;±130 ±60; 180 ±60; 180

х2э - - ±60; 180 ±60; 180 ±60; 180

А - - - -120 -120 -120

*^Торсионный угол не определен из-за наложения сигналов.

Из анализа межпротонных расстояний следует, что у соединения VIII торсионный угол фд = 0° (табл.2). При транс-пептидной связи Gin-Pro и фд = 0е наблюдается сближенность протонов NH^" Pro с атомом кислорода а-СО Gin. В случае цис-пептидной связи Gin-Pro при найденных торсионных углах ерь = -88', ф^ = 120°, ф^ = 0' возможно образование ВМВС NH^".. .о=С(?х Gip, о чем свидетельствуют ¿-контакты в спектре noesy (рис.4) мевду протонами цис-Pro и а-Н Glp. При этом конформация молекулы соединения VIII представляет собой

реверсивный поворот.

По уравнению Аррениуса оценены значения энергий этих ВМВС на основании температурных зависимостей времен релаксации Т^ подвижных протонов. Для протонов NH2 Pro получены наибольшие значения энергий активации. Причем для молекул с цис-связью х-Рго энергия активации

IJJ

протонов NHg составила 24,3 кДж/моль, а с транс-пептидной связью -20,1 кДж/моль.

4.0 -г,

5.0

6.0

7.0 -

8.0 -

м.Д.

-pQ,<*-H •Р.ОС-Н

— q.0c-h

cis-Pro trans-Pro

Q, NH2 anti

anti/trans Р» anti/cis

ÏQ, NHP syn

syn/trans

_p. nh2

■pQ, NH NH

syn/cis

cis-Pro trans-Pro

4.0

CO,

Рис.4. Фазочувствительный спектр NOISY (область üj^ = 3,9*8,5 м.д., (jg = 3,9-Î-8,5 м.д.) раствора 0,05 моль/л аналога [Gin2]ТОТ в ДМСО-dg при 30'С.

Полученные экспериментальные данные о конформационных состояниях молекулы соединения FUI хорошо согласуются с результатами теоретического конформационного анализа, проведенного с помощью алгоритма Эллинджера ММ2.

Как видно из табл.2, торсионный угол ф^ у соединения IX принимает положительные значения, в отличие от этих углов для остальных соединений. Поэтому у молекул соединения IX не реализуется конфор-мация реверсивного поворота, как для соединения VIII. Однако моделирование молекулярных структур показало, что для соединения IX при

торсионных углах cpg = 49', Ф2 = i30°. ф3 = 0°. W3 = 180' реализуется псевдоциклическая конформация с ВМВС мевду протоном MHg и атомом кислорода о-СО Glp. В пользу существования этой ВМВС говорят d-контакты в спектре noesy между протонами мн2-группы и протонами НН остатка Glu, мн, а-н, ß"-H остатка Glp.

В спектрах noesy соединений X, XI, XII есть ¿-контакты между протонами NH остатка Abu и протонами Gin а-Н, Abu а-Н, 7~Н и NH2, которые возможны при торсионных углах ср^ = -93°, ^ = 120', cpg = 30°, %з = 60°, = 60°, %з = -120° и конформации реверсивного поворота. При угле = 60° и тех же остальных углах возможны d-контакты, присутствующие в спектре noesy, между протонами nhg"* и одним из ß-протонов (G^) первого остатка. Эти d-контакты указывают на сближенность NH2-протонов с группой a-co Glp (С1-СО №о) и возможную стабилизацию конформации реверсивного поворота ВМВС между протонами nh2w и атомом кислорода С=0-группы первого остатка.

Ранее Петерсоном было высказано предположение о том, что тан при взаимодействии с рецептором принимает конформацию реверсивного поворота, стабилизированную ВМВС Pro NH2...o=cca Glp. Для аналогов ТйН VIII-XII, как следует из изложенного выше, конформация такого типа реализуется непосредственно в растворе ДМСО-dg. Поскольку значительные структурные изменения в аналогах по сравнению с самим ти-ролиберином привели к возрастанию антиамнестической активности и стабилизации конформации реверсивного поворота, можно предположить, что присутствие такой конформации является важным фактором, определяющим антиамнестическую активность аналогов тан.

Для ковалентного закрепления конформации реверсивного поворота было предложено синтезировать ряд модельных циклических дипептидов и пептидомиметиков, имитирующих "биологически активную конформацию" аналогов ЫХР и тен. Структура синтезированных циклодипептидов доказана методами спектроскопии ЯМР %, С и масс-спектрометрии.

Изучение биологической активности всех соединений проводили по тесту Порсолта для выявления антидепрессивных свойств и по тесту условного рефлекса пассивного избегания для выявления антиамнестической активности. Обнаруженная у ряда циклических пептидомиметиков высокая биологическая активность подтверждает предположение о важной роли конформации реверсивного поворота у аналогов мгр и тан при проявлении ими активности.

2. Возлохности колпытерной хилш щи изучении связи

"струтура-ашхивностъ" в ряду аналогов леланостсшта Структурные особенности молекул непосредственно связаны с их электронным строением. Учитывая тот факт, что групповые электроотрицательности заместителей по Полингу пропорциональны их орбитальным электроотрицательностям, определенным в шкале Малликена, а последние пропорциональны энергии ВЗМО соответствующих R^, был проведен квантовохимический расчет методом ОГОО/2 электронной структуры заместителей R^ в молекулах пептидов I-VI. Результаты расчетов свидетельствуют об электронном влиянии бокового заместителя второго остатка на АДА аналогов MIF. Получены корреляционные уравнения (1) и (2), связывающие АДА с энергиями ВЗМО и НСМО заместителя R^:

АДА(%) = 17,55-1п(-1 - 10,275) (1)

АМ(%) = 3,748-Е - 27,832, (2)

где I и Е - энергии ВЗМО и НСМО, соответственно. Значения АДА, рассчитанные по уравнениям (1) и (2), даны в табл.3.

Таблица 3

Значения АДА аналогов MIP, рассчитанные на основании энергий ВЗМО (доза 0,01 мг/кг) и НСМО (доза 0,001 мг/кг)

Соеди- I, эВ АДА* % Е, ЭВ АДА, %

нение Рассчит. по ур.(1) Экспер. Рассчит. по ур.(2) экспер.

I -15,237 28,1 29,6 6,987 -1,6 -1,8

II -13,846 22,3 23,0 3,894 -13,2 -10,6

III -12,897 16,9 16,4 0,808 -24,8 -25,2

17 -12,189 11,4 -1,2 9,664 8,4 8,2

V -11,723 6,5 1,6 3,256 -15,6 -17,3

VI -10,901 -8,2 -6,3 7,062 -1,4 -1,6

Е aíkohtp_e д{оп

'АДА =-100%, где Ai - периоды иммобилизации

2 AíK0HTP

животных (с) в контроле (контр.) и опыте (оп.).

При уменьшении дозы пептидов I-7I от 0,01 мг/кг к 0,001 мг/кг наблюдался реверсивный эффект АДА, возникновение которого можно объяснить на основе расчета электронной структуры заместителей R^. Действительно, при низких дозах возможно перераспределение электронной плотности на всей молекуле, включая и атомы заместителя и^ (в приближении метода МО). Таким образом, в рассчитанных модельных

системах R^-H избыточная электронная плотность должна поступить на ранее вакантную НСМО атома углерода С-* с энергией Е, частично заселив ее. Тогда значение АДА при дозе 0,001 мг/кг должно уже будет коррелировать не с величиной I, как это имело место при дозе 0,01 мг/кг, а с величиной Е.

Для выяснения топографии активного центра биологической мишени аналогов MIF, обладающих АДА, методами численного гармонического анализа построена система базисных конформаций (БК), позволяющая классифицировать конформационное многообразие молекул пептидов. В методе В.Е.Кузьмина каждая недекартова координата рассматривается как параметр формы, а их полный набор - как значения дискретной функции. Разложение этой функции в ряд Фурье дает набор БК, отражающий реальную конформацию.

Вклада различных БК в реальные конформации молекул аналогов Ml? использованы в качестве дескрипторов при анализе связи "структура-антидепрессивная активность". Детальный анализ влияния предложенных структурных параметров на АДА позволил построить уравнения линейной регрессии, в которых отражена связь вкладов БК в реальную конформацию молекул с величиной активности. Полученные уравнения свидетельствуют о том, что "биологически активной конформацией" молекул аналогов MIF действительно является конформация Pjj. Увеличению активности способствует также наличие гидрофобного бокового заместителя во втором аминокислотном остатке пептидной цепи.

Кроме того, анализ связи активности со вкладами БК различных параметров формы (выпуклости, сферичности, апланарности) позволил предположить связывание пептида биологической мишенью по трем фрагментам: С*0, С30 и амидному NHg. Браслетоподобная молекула пептида размещается в щели активного центра и фиксируется гидрофобным боковым радикалом второго остатка.

ВЫВОДЫ

1. Методами двумерной спектроскопии ЯМР 1Н показано, что для аналогов мгр в растворе ДМСО предпочтительной конформацией является конформация р-изгиба II рода. Для аналогов тш в ДМСО также реализуется конформация реверсивного поворота. В водном растворе аналоги МП" приобретают развернутую подвижную конформацию.

2. Методами двумерной спектроскопии ЯМР 1Н и релаксометрии на ядрах 13С показано, что при физическом моделировании биологической мишени с помощью обращенных мицелл АОТ конформация Pjj аналогов

MIP стабилизируется на границе раздела фаз вода/ПАВ. При этом ароматическое кольцо второго аминокислотного остатка встраивается в межмолекулярную полость, которая образуется в гидрофобной области вблизи полярных групп при упаковке изооктильных фрагментов АОТ, а главная цепь пептида располагается вблизи штерновско-го слоя мицеллы.

3. Методами множественной линейной регрессии найдено, что искажение конформации Pjj у аналогов ми1 приводит к снижению их антидепрессивной активности. В то же время наличие гидрофобного бокового заместителя в пептидной цепи способствует увеличению активности.

4. На основании анализа связи АДА аналогов МГР со вкладами базисных конформаций различных параметров формы и с липофильностыо молекул сделано предположение о топографии активного центра биологической мишени, содержащего гидрофобную полость и способного связывать пептид по трем фрагментам: Pro1 с=о, Gly3 с=о и амидному nh2.

5. Природа обнаруженного при малых дозах реверсивного эффекта АДА аналогов MIP объяснена перераспределением электронной плотности на ту МО бокового заместителя, в которую АО атома углерода С^ второго аминокислотного остатка дает наибольший вклад (НСМО).

6. Полученные данные о том, что "биологически активной конформаци-ей" для аналогов mif и trh является конформация реверсивного поворота подтверждены на основании изучения биологической активности модельных циклических дипептидов и пептидомиметиков, воспроизводящих посредством ковалентного связывания активную кон-формацию.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Modification of MSH release-inhibiting hormone / A.A.Mazurov, S.A.Andronati, V.M.Kabanov, N.I.Sokolenko, M.G.Rokaohinekaya, Yu.S.Shapiro, V.Ya.Gorbatyuk // Collect. Czeoh. Chem. Commun. -1990. - V.55, N10. - P.2555-2561.

2. Конформационные особенности биологически активных аналогов ме-ланостатина / Ю.Е.Шапиро, В.Я.Горбатюк, В.М.Кабанов и др. // Биоорган, химия. - 1990. - Т.16, N12. - С.1607-1617.

3. Конформационный анализ биологически активных аналогов тиролибе-рина методами двумерной спектроскопии ЯМР/В.Я.Горбатюк, Ю.Е.Шапиро, А.А.Мазуров и др.// Биоорган, химия. - 1992.- Т.18, N2. -

С. 235-251.

4. Shapiro Yu.E., Gorbatyuk V.Ya. Confonnation adjustment of peptides to the mioellar Burfaoe// Abstracts of the 9th International Symposium on Surfaotante in Solution. June 10-15, 1992, Varna, Bulgaria. P.77.

5. Новые геометрические дескрипторы пространственной формы молекул для анализа влияния структуры на биологическую активность три-пептидов / Л.П.Тригуб, В.Е.Кузьмин, А.А.Мазуров, Ю.Е.Шапиро,

B.Я.Горбатюк// Российская научная конференция "Создание лекарственных препаратов" Тезисы докл. 26-30 октября, 1992, Москва.

C.44-45.

6. Shapiro Yu.E., Gorbatyuk Y.Ya. Choioe of the bioaotive conformation of short peptides with aid of 2D-NMR // Abstraots of the 28th Colloquium SpeotroBoopioum Internationale. June 29-July 4, 1993, York, UK. WL 3-4.

7. Стабилизация конформации Pro-Tyr-Gly-NH2 - аналога меланостати-на - на поверхности мицеллы/Ю.Е.Шапиро, В.Я.Горбатюк, А.А.Мазуров и др.//Теорет. и эксперим. химия.- 1993.-Т.29, N1.-С.74-80.

8. Влияние второго аминокислотного остатка на антидепрессивную активность аналогов меланостатина / Ю.Е.Шапиро, М.Ю.Горбачев, В.Я.Горбатюк и др. // Теорет. и эксперим. химия. - 1993.- Т.29, N3. - С.255-259.

9. Фрагментарная подвижность молекул в обращенных мицеллах Аэрозоля ОТ в м-октане, инкапсулирующих а-химотрипсин или альбумин / Ю.Е.Шапиро, В.Я.Горбатюк, А.В.Левашов, Н.Л.Клячко // Биологич. мембраны. - 1993. - Т.10, N3. - С.293-305.

10. Stabilization of the Peptide Conformation on the Mioellar Sur-faoe/Yu.E.Shapiro, V.Ya.Gorbatyuk, A.A.Mazurov et al.//Analyst. - 1994. - V.119, N4. - P.647-652.

11. Formation of heterooyolio compounds in synthesis of thyroliberin analogs/S.A.Andronati, A.A.Mazurov, T.I.Korotenko, A.I.Dy-adenko, Shapiro Yu.E., V.Ya.Gorbatyuk, A.V.Mazepa// Abetraots of the 9th Russia-Germany Symposium on Chemistry of Peptides and Proteine. June 10-15, 1994, Pushohino, Ruseia. P.4.

12. Параметры формы молекул пептидов как дескрипторы при решении -задач QSAR / В.Е.Кузьмин, Л.П.Тригуб, Ю.Е.Шапиро, А.А.Мазуров,

В.В.Позигун, В.Я.Горбатюк, С.А.Андронати // Ж. структ. химии. -1995. - Т.36, JB3. - С.Б09-517.

Горбатюк В.Я. Конформац1йна рухом!сть тршептидних гормон!в за даними двом!рно! спектроскоп!i ЯМР та !! зв'язок з нейротропною активн!стю.

Дисертац!я на здобуття вченого степеня кандидата х!м!чних наук по спец!альност1 02.00.10. - б!оорган!чна х!м!я, х!м1я природних 1 ф!з!олог!чно активних речовин, Ф1зико-х1м1чний !нститут 1м.0.В.Бо-гатського НАН Укра1ни, Одеса, 1995.

Захищаеться 26 наукових роб!т, як! м!стять результати вивчення кон-формац!йних особливостей аналог!в меланостатину та тирол!берину 1 зв'язку "структура-активн1сть". Методами двом1рно! спектроскоп!1 ЯМР (COSY, NOiSY, S-J-спектроскоп!1), ф!зичного (за допомогою обер-нених м!цел АОТ) 1 математичного моделювання рецепторного зв'язу-вання показано, що "б!олог!чно активною конформац!ею" вивчених три-пептид!в в конформац!я реверсивного повороту. Отриман! результати п!дтверджен! б!олог!чними досл!дженнями цикл!чних пептидом!метик!в, в!дтворюючих конформац!ю реверсивного повороту через ковалентне зв'язування.

Gorbatyuk V.Ya. The oonformational mobility of the tripeptide hormones according to the data of two-dimensional Nlffi-speotrosoopy and ite relationship with the neurotropic aotivity. TheBis is presented for the candidate's degree of the ohemioal Boienoes by the speciality 02.00.10 - bioorganio ohemietry, chemie-try of natural and physiological aotive compounds, A.V.Bogatsky Phyeioo-Chemioal Institute of the National Aoademy of Soienoee of Ukraine, Odessa, 1995.

26 soientifio publications are defended, where the results of investigation of oonformational features of the melanoetatin and thyroliberin analogues and "struoture-aotivity" relationships have been reported. Two-dimensional NMR (COSY, NOESY, S-J-speotroBcopy), physioal (with the aid of reversed mioelles AOT) and mathematical modeling of reoeptor binding have been used to establish that conformation of the reversive turn ie the "biologioally aotive conformation" of the studied tripeptides. The obtained results have been confirmed by biologioal tests of the cyolio peptide-mimetioB reproducing conformation of the reversive turn by the use of oovalent binding.

Ключевые слова: меланостатин, тиролиберин, двумерная спектроскопия ЯМР, конформация реверсивного поворота, обращенные мицеллы АОТ, "структура-активность".

Подписано к печати 03.11.95г. Формат 60x84 1/16. Объем 0,7 уч.изд.л. 1,0 п.л. Заказ Я 48. Тираж 100 экз. Полигарфическое предприятие ЧП (ул.Ришельевская 28, ОЦНТИ, каб.905, тел.22-28-58)