Конформационные изменения молекулы ДНК при взаимодействии с координационными соединениями платины и серебра тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

ЧжанЦюши Ф^гО^^

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ ДНК ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КООРДИНАЦИОННЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

ПЛАТИНЫ И СЕРЕБРА

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

г 9 АПР 2015

Санкт-Петербург

2015

005568330

005568330

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Касьяненко Нина Анатольевна

доктор физико-математических наук, профессор кафедры молекулярной биофизики и физики полимеров Санкт-Петербургского государственного университета

Нечипуренко Юрий Дмитриевич

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г. Москва

Киипер Альберт Иванович

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высокомолекулярных соединений Российской академии наук, г. Санкт-Петербург

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 18 июня 2015 г. В 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.232.33 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 198504, г. Санкт-Петербург, Петродворец, ул. Ульяновская 1, физический факультет СПбГУ, малый конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте spbu.ru

Автореферат диссертации разослан / ¿4' 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к. ф.-м. н.:

Д 212.232.33,.--" /

' пбляничко А. М.

<

и

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Борьба со злокачественными новообразованиями является одной из актуальных задач медицины. Благоприятный исход при лечении таких заболеваний в значительной степени зависит от эффективности противоопухолевых препаратов. Первый препарат из числа координационных соединений платины цисплатин (цис-диамминдихлорплатина (II), цис-ДДП) и в настоящее время широко используется при лечении целого ряда опухолей (половых органов, головы и шеи, мочевого пузыря, почечной лоханки, молочной железы, кожи, легкого, JIOP-органов, желудочно-кишечного тракта, а также нейробластомы, лимфогранулематоза, лимфомы, меланомы, саркомы). Несмотря на признанную эффективность и широкий спектр действия препарата, его применение существенно ограничивает высокая токсичность. Это обстоятельство заставляет вести поиск новых противоопухолевых средств среди комплексов платины и металлов платиновой группы. Синтез координационных соединений, содержащих два комплексообразующих иона (двуядерных соединений), является одним из направлений разработки новых препаратов. Фармакологическое действие соединений платины основано на предотвращении деления клеток путем образования комплексов с молекулой ДНК, поэтому изучение взаимодействия новых координационных соединений платины с макромолекулой в растворе широко применяется для определения молекулярного механизма их действия. В диссертационной работе рассматривается три новых двуядерных соединения платины.

Координационные соединения металлов интересны не только в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов. Они могут быть использованы и для создания наноструктур на основе ДНК, которые представляют интерес для развития новых технологий. Их способность образовывать координационные связи с молекулой ДНК позволяет «пришивать» к ДНК нужные лиганды, входящие в координационную сферу иона-комплексообразователя. В работе изучается взаимодействие молекулы ДНК с координационным соединением серебра, содержащим фенантролиновые лиганды. Соединения серебра известны своей антимикробной, противовирусной и каталитической активностью. Комплексы металлов с фенантролином способны к самоассоциации в растворе с образованием различных супрамолекулярных структур. Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы диссертационной работы.

Практическая значимость работы. Изучаемые в работе соединения являются потенциальными лекарственными препаратами. Сравнение действия исследуемых образцов с известным противоопухолевым препаратом цис-ДДП на молекулярном уровне позволяет выявить характерные особенности биологической активности комплексных соединений и осуществить предварительный отбор наиболее перспективных препаратов для их дальнейшего тестирования in vivo. Комплексообразование молекулы ДНК с координационным соединением серебра с фенантролиновыми лигандами с последующей металлизацией структур дает возможность получать нов^е

системы с уникальными свойствами, которые могут найти применение в нанофотонике, наноэлектронике.

Целью диссертационной работы являлось изучение комплексообразования молекулы ДНК с рядом двуядерных координационных соединений платины и соединением серебра в растворе для определения молекулярных моделей взаимодействия.

В работе решаются следующие задачи:

• Проводится сопоставление комплексообразования ДНК с новыми соединениями платины и хорошо изученным прераратом цис-ДДП.

• Изучается результат связывания с макромолекулой соединений платины с одинаковыми лигандами, но различным строением, а также одинаковых по строению соединений с модифицированным лигандом.

• Рассматривается возможность связывания соединения серебра с фенантролином с молекулой ДНК в растворе с последующей металлизацией полученных структур.

• Сравнивается влияние на конформацию молекулы ДНК серебра в ионной форме и в составе координационного соединения с фенантролином.

Научная новизна проведенных исследований заключается в том, что большинство используемых в работе соединений (за исключением цис-ДДП) относится к новым препаратам. В работе впервые получены данные о взаимодействии этих соединений с молекулой ДНК. Проведено сравнение способов связывания макромолекулы с известными препаратами этого класса. Впервые продемонстрирована возможность образования комплексов молекулы ДНК с координационным соединением серебра, содержащим фенантролиновые лиганды, с последующей металлизацией макромолекулы.

Положения, выносимые на защиту:

• Биядерные координационные соединения платины с общим лигандом (тетразолом или метилтетразолом) образуют комплексы с молекулой ДНК в растворе в условиях малой ионной силы. При больших концентрациях поддерживающего электролита взаимодействие не реализуется, что указывает на важную роль электростатических взаимодействий в связывании.

• Все используемые координационные соединения платины, как и известный противоопухолевый препарат цисплатин, связываются с азотистыми основаниями ДНК, причем во взаимодействии двуядерных соединений платины с макромолекулой участвует только один атом платины.

• Хотя комплексообразование изучаемых биядерных координационных соединений платины с ДНК и вызывает такие же изменения на уровне третичной структуры макромолекулы, как и цисплатин, характер их связывания с макромолекулой иной - оно не сопровождается формированием координационной связи.

• Образующиеся комплексы биядерных препаратов платины с макромолекулой располагаются в ее большой бороздке. Они не приводят к существенному искажению геометрии спирали и не препятствуют

связыванию других лигандов, специфично взаимодействующих с ДНК по малой бороздке.

• Замена общего лиганда тетразола на метилтетразол в составе двуядерного соединения платины, так же как и введение двух общих лигандов вместо одного, не приводит к существенному изменению связывания бидентатного соединения с ДНК. Замена пятичленного гетероцикла на шестичленный, как и введение длинной связывающей цепочки в состав соединения, существенно меняет характер взаимодействия препаратов с ДНК.

• Координационное соединение серебра с фенантролином (Ag-Phen) образует координационную связь с ДНК с участием атома N7 гуанина. Освобождающийся фенантролин также связывается с макромолекулой.

• Металлизация ДНК в растворе после образования ее комплексов с Ag-Phen приводит к образованию наночастиц серебра.

• Металлизация ДНК на подложке после образования ее комплексов с серебром в ионной форме (при использовании нитрата серебра) и с координационным соединением серебра с фенантролином приводит к образованию принципиально разных структур.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на международных и всероссийских симпозиумах и конференциях: 9th European Biophysics Congress, Lisboa, Portugal, 2013; 6 Всероссийской Каргинской Конференции «Полимеры-2014», Москва, 2014; XII International Conference on Nanostructured Materials, Moscow, 2014; XVII симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Владимир, 2014; 8th International Symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems, St.-Petersburg, 2014; Quantitative imaging and spectroscopy in neuroscience, St.- Petersburg, 2012.

Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении экспериментов, в обработке полученных данных, участии в обсуждении результатов и подготовке публикаций по теме исследований, в написании и оформлении работы. Спектры люминесценции получены совместно с Бакулевым В.М., часть данных, полученных методом динамического двойного лучепреломления, - с аспирантом Алексеевым Г.В. Металлизация ДНК проводилась совместно со студентом Толстыко Е. А., изучение связывания ДНК с тетразолом - совместно со студенткой Борисовой И. В.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и содержит 120 страниц, 64 рисунка, 3 таблицы. Список использованных источников включает 119 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении сформулированы цели и задачи работы, обоснована ее актуальность, раскрыты научная новизна и практическая значимость проведенных исследований.

В главе 1 содержится описание структуры ДНК, рассматриваются возможные модели связывания координационных соединений платины с этой макромолекулой, анализируются различные способы металлизации ДНК с использованием ионов серебра в растворе.

В главе 2 кратко изложены основы методов исследования, использованных в работе: низкоградиентной визкозиметрии, динамического двойного лучепреломления (ДЛТТ), УФ спектрофотометр™, кругового дихроизма (КД), флуоресценции, приведены характеристики материалов. Использовали коммерческий препарат тимусной ДНК (Sigma) М=107Да, соединения платины: цис-ДДП, биядерные препараты, обозначенные как Pt-1, Pt-2, Pt-3 и препарат серебра с фенантролином Ag-Phen. Для сравнения в работе использовали препарат цис-ДДП и биядерные соединения Pt-4 и Pt-5. Соединения платины были синтезированы в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии к.х.н Яковлевым К.И., a Ag-Phen - в Санкт-Петербургском технологическом институте д.х.н Демидовым В.Н.

HjN

(Г-Н)

\ / И

НзН^ N (Г-Н)

Ч^3 / \

N1%

съ

h3n ,<Т-н) уш, К

/ \ / \ Н3Н а а гшз

Pt-1

Нз'\ /\J\

и.

/Ч

н,н а

/ \ с/ ин3

СНз

а

Pt-2 МТ

H3N (МГ-Н)

/Ч

h3n а ст

\ /

да

NH3

"О-

Я

h3n а

Pt-4

Т(тетразол) цис-ДДП Ag-Phen

Рис. 1. Структура используемых в работе соединений.

В главе 3 представлены экспериментальные результаты и их обсуждение. В первом разделе главы рассмотрено комплексообразование ДНК с тремя новыми биядерными соединениями платины Pt-1, Pt-2 и Pt-З. Все измерения проводили через сутки после приготовления комплексов для надежного формирования координационной связи платины с ДНК. Показано, что свободные лиганды тетразол (Т) и метилтетразол (МТ), входящие в состав соединений, не связываются с ДНК в растворе. Исследования проводили в 0,005 М NaCl, так как при больших концентрациях NaCl соединения платины не связываются с ДНК. Биядерные соединения платины имеют полосу поглощения, частично перекрывающуюся со спектром поглощения ДНК (рис. 2, а). Полагая, что их хромофоры не участвуют в комплексообразовании, вычисляли спектры поглощения ДНК в комплексах, которые изменяются с ростом концентрации Pt-1, Pt-2 и Pt-З сходным образом и имеют общие черты с наблюдаемыми при связывании ДНК с цис-ДДП, для которой (рис. 2 б) отчетливо виден батохромный сдвиг полосы и гипохромный эффект при малых C(Pt), характерный для связывания платины с атомом N7 гуанина.

Увеличение поглощения с ростом С(Р^ (рис. 2 в) связано с нарушением стэкинг-взаимодействия оснований ДНК и также указывает на их участие в связывании.

3 4 5

QRJxItf, М

а) б)

Рис. 2. Спектры поглощения ДНК в комплексе с Pt-2 (а), цис-ДДП (б) и зависимость относительного изменения амплитуды максимума полосы от концентрации соединений в растворах ДНК в 0,005 М NaCl (в). С(ДНК)=0,0025%.

Отсутствие взаимодействия Pt-1, Pt-2, Pt-З и цис-ДДП с ДНК в IM NaCl показывает, что электростатические взаимодействия играют важную роль при образовании комплексов. Так как биядерные соединения - электролитные комплексы, они хорошо растворимы в воде. После диссоциации хлора они приобретают положительный заряд +2 (Pt-1) или +1 (Pt-2 и Pt-З). При замещении атомов хлора на молекулу воды в координационной сфере платины заряд комплексных ионов Pt-2 и Pt-З может увеличиться до +3. Следовательно, они привлекаются к отрицательно заряженным фосфатам. Спектры КД ДНК в присутствии трех биядерных соединений платины изменяются сходным образом (рис. 3), но они отличаются от данных для комплексов ДНК с цис-ДДП. Рис. 3 (д) демонстрирует, что одинаковое падение As достигается при использовании в два раза больших концентраций Pt-1, Pt-2, Pt-З по сравнению с результатом действия ранее изученного соединения Pt-4 сходного состава (см. рис. 1), связывающегося с ДНК через два атома платины (Молек. Биол., 2002, 36, 1-8). Можно заключить, что в комплексообразовании Pt-1, Pt-2, Pt-З с ДНК участвует один атом платины, причем это связывание существенно отличается от наблюдаемого для цис-ДДП, образующей с ДНК две координационные связи. При этом каждый из двух атомов хлора в цис-положении последовательно замещается на воду и гетероциклический азот основания ДНК. Рассмотренные выше спектральные данные показали, что хотя связывание Pt-1, Pt-2, Pt-З с ДНК, по-видимому, также происходит в большой бороздке, при этом может образоваться только одна координационная связь ДНК с одним атомом платины в составе соединений.

Интересно отметить, что результатом связывания Pt-1, Pt-2, Pt-З с ДНК является примерно одинаковое изменение спектральных характеристик макромолекулы, тогда как, согласно структуре, соединение Pt-З не может образовать ни одной координационной связи с ДНК. Сходство в действии

препаратов проявляется также и при использовании гидродинамических методов исследования, которые могут дать информацию о состоянии третичной структуры ДНК.

Ае 2

1

О

-1

-2

C(Pt-1), 105М — 0(1) — 0.3(2) -0.8(3)

AS] C(Pt-2), 105М о-0(1) <—0.8(2) 2.0(3) .3.5(4)

220 240 260 280 300 Я., ПГП 220 240 260 280 300^, nm

С X 10 , М

Рис. 3. Спектры КД ДНК в комплексах с Pt-1 (а), Pt-2 (б), цис-ДЦП (в) и относительное изменение амплитуды положительного максимума с ростом С (г).

На рисунке 4 приведены результаты изучения комплексов ДНК с соединениями платины методами низкоградиентной вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления. Относительное изменение приведенной вязкости растворов ДНК одной и той же концентрации в 0, 005 М NaCl с ростом содержания биядерных соединений (рис, 4 а) показывает, что связывание приводит к уменьшению размеров молекулярного клубка, причем все три соединения влияют на этот параметр сходным образом. Аналогичный результат был получен при исследовании оптической анизотропии молекулы ДНК в комплексах с используемыми соединениями. Полученные в работе данные позволили построить зависимость относительного изменения оптической анизотропии статистического сегмента ДНК с ростом концентрации соединений платины в растворе (рис. 4 б). Так как этот параметр может уменьшаться как в результате падения персистентной длины ДНК, так и вследствие уменьшения (по абсолютной величине) средней разности поляризуемостей пары оснований ДНК вдоль оси спирали и перпендикулярно ей, причину падения сегментной анизотропии однозначно определить невозможно. Вместе с тем, уменьшение персистентной длины ДНК согласуется с результатом вискозиметрических исследований. Интересно

отметить, что полученные данные указывают на сходство в изменении конформационных параметров ДНК при связывании биядерных соединений платины и цис-ДДП, комплекс с которой провоцирует появление изгибов двойной спирали. Падение вязкости может быть также результатом изменения полиэлектролитного набухания макромолекулы из-за ее связывания с комплексными ионами с зарядом 2+.

(с*! -а;) («1 -«:)п

1.0-1

0.5-

0.0-1

РМ Р1-2 Р(-3

б)

0.0-^—■—.—■—-----—

0 2 4 6 СхЮ5, М

0 2 4 Ь СхЮ , М

Рис. 4. Зависимость относительного изменения приведенной вязкости растворов ДНК (а) и оптической анизотропии статистического

сегмента макромолекулы (б) от концентрации РЫ, Р1:-2, П-З в растворе ДНК (0,008%) в 0,005 М КаС1.. На рис (в) приведены такие же данные для растворов ДНК с цис-ДДП.

Как известно, образование координационной связи платины с ДНК по энергии сходно с образованием ковалентной связи. В отличие от равновесного связывания соединений с макромолекулой в растворе, которое зависит от соотношения концентраций свободных и связанных лигандов, координационная связь не нарушается при изменении такого соотношения в процессе эксперимента, так как для ее формирования необходимо длительное время. Следующий эксперимент позволил определить характер связывания соединений с ДНК. Измерения поводили через сутки после приготовления базового раствора ДНК с выбранным соединением платины в 0,005 М ШС1, который разбавляли двумя способами для получения концентрационной зависимости приведенной вязкости (процедура, необходимая для определения характеристической вязкости ДНК). Разбавление с использованием 0,005 М №С1 обеспечивало постоянство отношения концентраций препарата и ДНК, разбавление с использованием раствора препарата той же концентрации, что и в базовом растворе, обеспечивало неизменность концентрации платины.

И в том, и в другом случае намеренно нарушается соотношение между фракциями связанных с ДНК и свободных лигандов, что не влияет на изучаемую зависимость при формировании координационной связи (как это наблюдается для цис-ДДП). При равновесном связывании зависимость искажается, что исключает корректную экстраполяцию к С (ДНК) = 0, необходимую для определения характеристической вязкости ДНК.

(л-1)/С, сЛ/д

C(Pt)/C(DNA)=const

120 90 60 30 0

0.000 0.003 (V1)/C, dl/g

120

Pt-1 R-2 R-3

120 90 60 зон

80-

40

0.006 C(DNA), %

(nr-1)/c, dl/g

C(Pt)=const

в Pt-1

в Pt-2

А Pt-3

0

0.000

0.003

0.006 C(DNA), %

Рис. 5. Концентрационная зависимость приведенной вязкости растворов от концентрации ДНК при разбавлении с использованием 0,005 М NaCl (а) и растворов Pt-1, Pt-2 и Pt-З в 0,005 MNaCI (б). Так и с же данные для ДНК с Ag-Phen (в). 0.006 C(DNA),%

таких экспериментов для изучаемых соединений

0.005М NaN03 2.0x10"5 М Ag-Phen

В)

0.000 0.003 Результаты

показывают (рис. 5), что координационная связь не образуется. Корректная экстраполяция зависимости к С(ДНК) = 0 невозможна, что объясняет отсутствие в работе значений характеристической вязкости ДНК для ее комплексов с новыми соединениями. При использовании соединения Ag-Phen результат подтверждает образование координационной связи.

Изучение протонирования ДНК, при котором изменяется спектр КД ДНК, и которое, как и связывание цис-ДДП, осуществляется по позиции N7 гуанина, показало, что при образовании комплекса ДНК с РМ, Рг-2, Р1- 3, в отличие от цис-ДДП, протонирование ДНК все же происходит (рис. 6), то есть эти соединения не образуют координационной связи с Югуанина, хотя они и могут локализоваться вблизи этой группы в большой бороздке.

Изучение конкуренции за место связывания на ДНК между РМ, 14-2, РьЗ и цис-ДДП показало: цис-ДДП и любое из биядерных соединений не мешают связываться друг другу (см. рис.7, а).

Спектры люминесценции соединения БАР1 при двух длинах волн возбуждения (340 и 420 нм) и регистрации (460 и 560 нм) позволяют разделить два типа его связывания с ДНК. Эксперимент показал (рис. 7 б, в), что комплексообразование ДНК с биядерными соединениями мешает внешнему (электростатическому) связыванию БАР1 с ДНК (спектр 1(420/560)), тогда как более сильное связывание ОАР1 по малой бороздке с малым числом сайтов связывания и с высоким квантовым выходом флуоресценции (спектр

1(340/460)) остается практически неизменным. При этом порядок добавления компонентов в раствор ДНК практически не влияет на результат. Заметим, что цис-ДДП хоть и влияет, но не препятствует связыванию БАИ ни по малой бороздке, ни электростатически.

1 п

Де 1 4.5 V.47

0,005 М N301

а) -2

240

260

280

300

220

240

260

280

300

X, нм

ОМА

ОМА, рН 4,3 (ОМА+И-2), рН 4,3

Рис. 6. Спектры КД ДНК в 0,005 М №С1 при разных рН (значения даны на рисунках) для свободной ДНК (а), комплексов с цис-ДДП (рН от 4,1 до 4,86), С(Р0=5хЮ"5М (б) и Рь2, С=1,5х10"5 М (в).

240

260

280

300

Х,НМ

ОЫА

ОЫА+С^-ООР ОЫА+РМ

ОМА+СН>-ООР + РМ ОМА+РИ + С^-ООР

ш.2000 о

-1-1000

220

з 400СН

х

а-

§■ 3000-1

0

О)

о.

200СН

-В-

1 юан

I-х

240

280

X, пт

(ОМА+ОАР1)+ цис-ДДП (ОМА-ЮАР1)+Р1-2 (ОМА+цис-ДЦП)+ОАР1 (□МА+Р1-2)+0АР1

(СЖ+ШР1)+Р1-2 (СТ№Н4*>Д0П)+С№1

В)

400

500

600

\ пт

Рис.7. Результат исследования конкуренции за место связывания на ДНК между цис-ДДП и РМ (а) и между ОАР1 и Р1-2 (б,в). Длина волны возбуждения люминесценции 340 нм (б) и 420 нм (в). Порядок добавления соединений указан на рисунке.

500

600

РЫ, Р^З блокируют фосфаты ДНК, что мешает связыванию ОАР1 с участием электростатических сил. Однако, располагаясь со стороны большой бороздки, они не препятствуют связыванию БАР1 по малой бороздке ДНК. Аналогичные эксперименты с использованием этидиума бромида (ЕВ) показали (рис. 8), что добавление цис-ДДП к комплексу ЕВ-ДНК смещает только длинноволновую полосу в спектре возбуждения связанного ЕВ, а вторая полоса в спектре возбуждения и спектр испускания не меняются.

Рис. 8. Спектры возбуждения и испускания люминесценции ЭБ в комплексе с ДНК (г=0,033) с добавлением и без добавления цис-ДДП (а) и Р1-2 (б). С(ЭБ)=5х10"7 М, С(Р1)=4х10"5 М. Порядок добавления компонентов указан на рисунках.

Связывание цис-ДДП с ДНК не мешает последующей интеркаляции ЕВ, но приводит к тушению его люминесценции (связывание цис-ДДП искажает спираль ДНК и уменьшает количество связанного ЕВ). Добавление П-2 к комплексам ЕВ-ДНК приводит к выходу ЕВ в раствор, что следует из сравнения соответствующих спектров со спектром свободного ЕВ (рис. 8 б). Немного отличаются только первые полосы в спектре возбуждения. Квантовый выход люминесценции также более близок к наблюдаемому для свободного ЕВ, чем для красителя, связанного посредством интеркаляции. Совокупность данных указывает, что биядерные соединения платины связываются с молекулой ДНК при малой ионной силе раствора. Комплексы локализованы в большой бороздке ДНК. Они взаимодействуют и с основаниями, и с фосфатами, но координационной связи с ДНК не образуют. В связывании участвует один атом платины. Поэтому замена тетразолового лиганда на метилтетразол или введение второго общего лиганда не оказывает влияния на характер взаимодействия препаратов с ДНК.

Второй раздел главы 3 посвящен сравнению взаимодействия молекулы ДНК с Ag-Phen (рис. 1) и ионами серебра, а также металлизации полученных структур. А§-РЬеп в водном растворе диссоциирует с образованием комплексного иона с зарядом +1, который электростатически взаимодействует с ДНК, как и А§+ при использовании нитрата серебра. Способность А§+ к образованию координационной связи позволяет формировать такую связь с наиболее доступной группой оснований - N7 гуанина, о чем свидетельствует вид спектров поглощения ДНК (рис. 9 а). Полоса поглощения А§-РЬеп пересекается со спектром поглощения ДНК, однако вычисленные спектры

10

дают представление об изменении спектральных свойств компонентов, свидетельствующем, как и спектры КД, о разнице во взаимодействии Ag+ и Ag-Phen с ДНК. Рассмотрение взаимодействия ДНК с лигандом Phen и смесью Phen и Ag+ показало, что в растворе происходит своего рода «сборка» комплексов на макромолекуле (см. спектры КД на рис. 9 б).

-DNA QAq-Phen)x10s, М

- DNA+Ag+ '■■"._ Ае . ^0.5

- (DNA+Ag-Phen)-Ag-Phen -(DNA+Phen)-Phen -Ag-Phen

- Phen

-5

а) _10

240

270 300

X, nm

300 320 X,nm

—'—DNA -O- DNA+AgN03 —Д— Phen -<l—Ag(Phen) —DNA+Ag(Phen) DNA+Phen+AgNO DNA+AgN03+Phen DNA+Phen

240 260 280 300 x, nm

поглощения (а) и КД (б)

Рис. 9. Спектры _ . . ,

ДНК в комплексе с Ag+ и Ag-Phen, с лигандом РЬеп, и при взаимодействии с РЬеп и Ag+ одновременно. На рис. в) и г) приведены спектры КД ДНК в растворе при разных концентрациях соединения Ag-Phen (в) иAgNOз(г). 300 320 Концентрации приведена на рисунках

X, пт

Вид спектров КД комплексов ДНК с Ag-Phen и комплексов,

образующихся в результате взаимодействия ДНК в растворе с фенантролином (РЬеп) и Ag+ сходен. Он указывает на образование достаточно регулярной структуры лигандов относительно спирали ДНК. Необычный вид спектров КД ДНК в комплексе с Ag+ может свидетельствовать об образовании координационной связи серебра с основаниями ДНК, существенно влияющей на хиральность макромолекулы. При образовании комплекса Ag-Phen с ДНК часть молекул фенантролина может выйти в раствор и вступить во взаимодействие с ДНК, о чем могут свидетельствовать данные на рис. 10 а. Увеличение вязкости растворов ДНК может быть результатом интеркаляции фенантролина.

Мы провели металлизацию ДНК путем восстановления серебра до металлического состояния с помощью боргидрида натрия. Результат проверяли по появлению пика плазмонного резонанса наночастиц серебра (НЧ) с макс. 380-400 нм (рис. 10, б). -о- 1

2 4 6 8 10

С(согтрошс1)х105, М

400 450 X, НМ

Рис. 10. Относительное изменение приведенной вязкости растворов ДНК (а) от концентрации Ag-Phen, РЬеп и AgNOз и плазмонный пик наночастиц серебра, формируемых в растворе ДНК через 1 мин. (2) и 75 мин. (4) после восстановления А£+, связанных с ДНК; после добавления готовых НЧ в раствор ДНК (3), вычисленный пик для НЧ, восстановленных на ДНК (5), полученный вычитанием спектра (2) из спектра (4), полоса для НЧ без ДНК (6) и результат восстановления серебра в комплексе ДНК с А§-РЬеп (7).

При добавлении ДНК в раствор НЧ (для них максимум 383 нм) видно небольшое красное смещение (пик 386 нм). При восстановлении серебра, предварительно связанного с ДНК, через минуту после добавления восстановителя интенсивность пика (388 нм) мала, а через 75 минут она становится равной наблюдаемой для предыдущей системы с батохромным сдвигом полосы. Происходит медленное восстановление координационно связанного с ДНК серебра. Вычисленный спектр 5 для такой фракции (пик 395 нм) также представлен на рисунке 10 б. При восстановлении серебра после связывания Ag-Phen с макромолекулой пик полосы (394 нм) указывает, что восстановление серебра происходит преимущественно на ДНК. СЭМ изображения таких структур на кремниевой подложке (рис. 11) показывает, что происходит формирование ДНК-фибрилл (темные нити), на периферии которых видно восстановленное серебро (светлые реплики). По-видимому, Ag-Phen способствует образованию межмолекулярных связей ДНК, чем можно объяснить и наблюдаемое поведение вязкости соответствующих растворов (рис. 10 а).

ПН

(¡Р м л Г И ■ ■

Я 4 •VI ■ ■ . . ' ' . ■ "

V

. -

Яшу^И

11.

СЭМ

А§-РЬет на

кремниевой подложке после восстановления серебра (см. спектр 7 на рис. 10). Риска -200 нм

ДНЯ ;

;

а..........■

^ННИИи

¡за

«в:

I

Заключение диссертации содержит выводы, формулированные по

результатам работы:

1. Показано, что все три новых соединения платины связываются с молекулой ДНК в условиях малой ионной силы, а при больших концентрациях соли взаимодействия нет, что указывает на важную роль электростатических взаимодействий в образовании комплексов.

2. Все три соединения платины связываются с азотистыми основаниями ДНК. Во взаимодействии участвует только один атом платины.

3. Комплексообразование трех изучаемых препаратов с ДНК вызывает примерно такое же падение объема и оптической анизотропии макромолекулы, как и цисплатин, но характер связывания для них иной.

4. В отличие от цисплатина, связывание трех соединений с ДНК не сопровождается формированием координационной связи, хотя соединения Рг-2 и Р<:-3 локализованы в большой бороздке ДНК и взаимодействуют с группой N7 гуанина.

5. Связывание биядерных соединений платины осуществляется с помощью электростатических взаимодействия с фосфатными группами ДНК. При этом комплексообразование не препятствует связыванию других лигандов по малой бороздке макромолекулы.

6. Замена тетразола на метилтетразол не приводит к существенному изменению связывания бидентатного соединения триаминового типа с ДНК. Замена пятичленного гетероцикла на шестичленный, как и введение длинной связывающей цепочки в состав соединения существенно меняет характер взаимодействия препаратов с ДНК.

7. Соединение с двумя тетразоловыми лигандами вызывает сходное изменение конформационных параметров с ДНК, но не участвует в связывании с N7 гуанина в большой бороздке макромолекулы.

8. Соединение Ag-Phen взаимодействует с ДНК, образуя с ней координационную связь в большой бороздке. Освободившийся при этом фенантролин также связывается с молекулой ДНК.

9. Конформационные изменения ДНК при связывании с соединением Ag-Phen в растворе отличаются от реализуемых при ее взаимодействии с ионами серебра.

10. Металлизация комплексов ДНК с фенантролином в растворе приводит к образованию наночастиц серебра.

11. Металлизация комплексов ДНК с Ag-Phen на подложке приводит к образованию структур, в которых фибриллы ДНК частично покрыты слоем серебра.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

• Касьяненко Н.А., Варшавский М.С., Zhang Qiushi, Алексеев Г.А., Бакулев В.М. К вопросу о металлизации ДНК в растворе // Вестник СпбГУ, Сер. 4, Т. 1 (59), 2014, Вып. 4, 498-508.

• В.М. Бакулев, З.В. Ревегук, Zhang Qiushi, Н.А. Касьяненко, Люминесценция комплексов DAPI-ДНК при разных ионных силах раствора // Вестник СпбГУ Сер. 4, Т. 1 (59), 2014, Вып. 4, 491-497.

• N. Kasyanenko, L. Lysyakova, Z. Qiushi, G. Alexeev, Z. Reveguk. Gene vectors with the inclusion of anticancer drugs and metal nanoparticles. In: Book of Abstracts of 9th European Biophysics Congress, 2013, Lisboa, Portugal, X« 253, P-297.

Касьяненко H.A., Лысякова Л.А., Соколов П.А., Ревегук З.В., Zhang Qiushi. Многокомпонентные системы на основе ДНК. Формирование, изучение, возможности использования в новых технологиях. 6 Всеросс. Каргинская конф. «Полимеры - 2014» Т. I Тезисы приглашенных и устных докладов, Москва 2014. 145.

N. Kasyanenko, P. Sokolov, Z. Reveguk, G. Alekseev, Z. Qiushi, V. Bakulev. DNA metallization in solution and on surface. XII International Conference on Nanostructured Materials (NANO 2014) July 13-18, 2014 Moscow, Russia. http://www.nano2014.org/thesis/view/3931.

Qiushi Zhang, К.И. Яковлев, Н.А. Касьяненко. Соединения платины моно- и биядерного типа и их взаимодействие с ДНК. XVII Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 23-27 июня 2014 года, Владимир.

N.A. Kasyanenko, L.A. Lysiakova, Q. Zhang, G.V. Alexeev, I.N. Unksov. Conformational and phase transitions in DNA solutions with charged compounds. In Book of Abstracts of 8th International Symposium Molecular Order and Mobility in Polymer Systems. St. Petersburg, June 2 - 6, 2014, 0-53

Подписано к печати 06.04.2015. Формат 60x84 '/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,0. Тираж 130 экз. Заказ 6175 .

Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии Института химии СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-4043,428-6919