Конъюгаты сополиметров малеинового ангидрида с аминами. Структура и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт Нефтехимического Синтеза им, А.В.Топчиева

На правах рукописи

ГОРШКОВА арина Юрьевн;

¡СОИ ЫОГЛТЫ СОПОЛИМЕРОВ МЛЛЕИНОВОГО АНГИДРИДА С ЛМШ1ЛМИ. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА.

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединении.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-1996

Работа выполнена в Инсппуге нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН

Научные руководители:

Научный консультант:

доктор химических наук Л.Л. Стойкая кандидат химических наук О.Б. Семёнов, доктор химических наук, профессор Б.А. Крендель.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Л.И. Валуев

докюр химических наук, профессор И.М. Паписов

Ведущая организация:

Инсгитут высокомолекулярных соединений РАН

Зашита диссертации состоится "¿У- 1996 г. в "/Юч'йсаъ

на заседании специализированного Совета К 002. 78. 0! при Институте нефтехимического синтеза им. А-В.Тончиева РАН по адресу: 117912, ГСП-1, Москва В-71, Ленинский проспект, д. 29.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан

■ ЪО^ декады

1996 т.

"Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

Э.А. Волнина

Общая характерногика работы

Актуальность работ ы. Диссертационная работа посвящена ¡пучешно фшшсо-химических свойств сополимера диштилового эфира с малеиновым ангидридом (ДИВЭМА), взаимодействию его с первичными аминами и созданию на основе выявленных закономерностей макромолекулярных транспортных форм противоопухолевых антибиотиков - аптрапиклинов, изучению их структуры и свойств. Лшра-шисдины являются одним га наиболее активных средств химиотерапии рака, однако для них характерна высокая кардиотоксичногть, что не позволяет полностью использовать их противоопухолевую активность и ограничивает широкое клиническое применение. Актуальность работы определяется необходимостью создания нового поколения противоопухолевых препаратов, сочетающих гакие свойства, как длительность действия, высокая эффективность и низкая токсичность.

Исследования последних лет показали, что применение макромолекулярнот подхода, Jvc. создание коныогатов лекарственных препаратов с полимерными носителями является одним из перспективных путей решения .этой задачи. При правильном выборе носителя и типа связи между носителем и лекарственным препаратом возможно осуществление направленного транспорта препарата в клетки опухоли, uro должно привести к повышению эффективности его действия и позволит снизить токсичность.

Выбор в качестве полимера-носителя ДИВЭМА определяется тем, что он обладает собственной биологической активностью, в том числе противоопухолевой и противовирусной, индуцирует выработку интерферона, активирует макрофаги. Можно было ожидать, что иммуностимулирующее действие полимера позволит скомпенсировать угнетение иммунитета, вызываемое противоопухолевыми антибиотиками.

Ранее в лаборатории исследования фшико-хнмнчеешх свойств полимеров ИНХС им.А.В.Топчиева были получены конъюгаты аптрапиклинов с сополимерами малеинового ангидрида, превосходящие по противоопухолевой активности действие свободных антибиотиков при значительно меньшей токсичности.

Однако не были исследованы свойства полученных систем, их стабильность, природа связи антибиотиков с полимером.

Основная цель работы заключалась в исследовании физико-химических свойств ДИВЭМА. изучении его юаимодейсгаия с первичными аминами и на

основании выявленных закономерностей получении макромолекулярных транспортных форм антрациклинов с регулируемой скоростью отщепления антибиотика и изучении их свойств.

Научная новизна работы определяется тем, что впервые проведено систематическое исследование физико-химических свойств ДИВЭМА:

- изучена химическая структура сополимера;

- изучен гидролиз в растворах и показано, что в ходе гидролиза формируются Н-связанные ассоциаты кислотных групп, определяющие протекание полимеранало-гичных превращений сополимера:

- впервые для ДИВЭМА разработан метод определения молекулярно-массовых характеристик в водных растворах без предварительной модификации сополимера;

- на модельных системах изучено взаимодействие ДИВЭМА с первичными аминами (в ацетоне) и показано, что продуктом реакции являются Н-связанные ионные комплексы;

- показано, что именно этот тип связи в макромолекулярных транспортных системах антрациклинов позволяет достигать оптимальной, с точки зрения биологической активности, стабильности систем;

- получены системы с регулируемой скоростью отщешюния антибиотиков и показано, что, изменяя гидрофобность системы, можно регулировать в широких пределах скорость отщепления лекарственного препарата;

- изучена взаимосвязь структуры конъюгатов с их физико-химическими и биологическими свойствами. Установлено, что в водных растворах макромолекулы конъюгатов структурированы и имеют большую компактность по сравнению с исходным полимером за счет взаимодействий гидрофобных фрагментов (антибиотика или алифатических аминов);

- изучена стабильность макромолекулярных транспортных форм антрациклинов и показано, что в условиях, близких к физиологическим, они достаточно гидролитически устойчивы.

Практическая ценность работы состоит в том, что в результате проведенных исследований получены макромолекулярные транспортные формы антрациклинов, обладающие большей активностью, чем применяемые в клинике низкомолекулярные препараты, при существенно меньшей токсичности. Полученные полимерные конъюгаты обладают более широким противоопухолевым действием, а именно, макромолекулярные системы активны на моделях солидных опухолей, для которых

не зафиксировано действие антрацшслинов, а также на моделях, резистентных к этому классу лекарственных препаратов. В настоящее время полученные макромо-лекулярные транспортные формы антрациютинов проходят предклшшческие испытания в Онкологическом Научном Центре РАМН.

Кроме того, получен ряд фундаментальных данных о строении и свойствах ДИВЭМА: изучен гидр о л in сополимера, его структура, молекулярно-массовые характеристики, закономерности взаимодействия с первичными аминами в ацетоне и структура продуктов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" ( Звенигород, 1991), 8-м Совещании по проблеме "Комплексы с переносом заряда и ион-радикальные соли" КОМИ С - 94 ( Москва, 1994 ), 8-th NCI-EORTC Symposium "New drugs in cancer therapy" ( Amsterdam, 1994 ), 3-rd internatioai Symposium "Polymer for Advanced Technologies" ( Pisa, 1995), 2-nd International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" ( Saint-Petersburg, 1996 ), 3-м Российском Национальном конгрессе "Человек н лекарство" ( Москва, 1996 ), а также научных конференциях ИПХС им. А.В.Топчиева РАН в 1990,1993,1994 годах.

Публикации. Основное содержание работы изложено в И печатных работах.

Объем ¡i структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( f 6Ониименопаnuil). Работа изложена на границах машинописного текста, иллюстрирована 3é рисунками, со-держитз^^таблиц.

Основное содержание работы Структура, физико-химические свойства и молекулярно-массовые характеристики

ДИВЭМА.

"Судьбу" транспортной системы в организме (длительность циркуляции, распределение по органам и тканям) определяют такие физико-химические свойства полимеров-носителей, как гилрофобность, молекулярная масса, молекулярно-массовое распределение, микроструктура полимерной цепи, структура в растворах, подверженность биодеструкции и др. Эти же свойства определяют проявление соб-

стенной биологической активности полимеров, в частности, биологически активных полианионов.

Однако, специфика полиэлектролитов проявляется в том, что в растворах практически все их свойства определяются взаимодействием заряженных групп между собой, а также с окружающими их низкомолекулярными ионами. Для слабых полиэлектролитов такие взаимодействия зависят от степени ионизации макромолекулы.

Наличие в макромолекулах полиэлектролитов групп разной природы обуславливает возможность возникновения различных взаимодействий (электростатических, гидрофобных, водородных связей, а также их различных сочетаний), что определяет повышенную склонность цепей полиэлектролитов к кон-формационным изменениям при изменении условий (рН, температуры, природы растворителя). Особенности поведения полиэлектролитов в растворах осложняют их исследование современными физико-химическими методами, поскольку требуется разработка специальных подходов и методик.

Объект исследования данной работы - ДИВЭМА, проявляющий в растворах свойства полиэлектролитов, широко исследован с точки зрения его биологической активности, однако физико-химические свойства ДИВЭМА изучены мало.

Исследование структуры ДИВЭМА спектральными методами. Состав звена ДИВЭМА и наличие циклической структуры подтверждены данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектросконии и не вызывают сомнений. Однако относительно размера кислородсодержащего цикла в звене сополимера в литературе имеются противоречивые сведения. Общепризнанной считается структура с шесгичленным циклом (1). В тоже время при синтезе ДИВЭМА в хлороформе было показано образование пятичлениого кислородсодержащего цикла (II), а при получении сополимера в смеси сероуглерода с ацетоном - образование как пяти-, так и шес-тичленных структур.

I II

Структура ДИВЭМЛ, полученного и ацетоне с использованием в качестве регулятора цепи тетрагпдрофурана (ТГФ), позволяющего получать сополимер с заданными молекулярными массами, ранее не исследовалась.

Таким образом, до настоящего времени вопрос о структуре ДИВЭМЛ и ее зависимости от растворителя оставался открытым.

Структуру ДИВЭМЛ, полученного » растворителях разной природы и полярности (хлороформе и ацетоне), изучали методами ЯМР и ИК-фурье спектроскопии.

ИК-фурье систры образцов ДИВЭМЛ, полученных нами в разных раствори 1елях - хлороформе и ацетоне, качественно совпадают и различаются только количеелвом карбоксильных групп, появляющихся вследствие гидролиза ДИВЭМЛ (получить абсолютно сухой полимер практически не удается). Следовательно, сополимеры, образующиеся в растворителях существенно разной полярности, имеют одну и ту же структуру и отличаются только степенью гидролиза.

По ИК-спектрам без колебательного расчета невозможно достоверно определить размер кислородсодержащего цикла в звене ДИВЭМЛ. Однозначный вывод о размере цикла можно было сделать лишь на основании анализа данных Я МР 13 С-с! 1ек троскошш1.

Спектры ЯМР |3С образцов ДИВЭМЛ, полученных в хлороформе и ацетоне (рис. 1), содержат 6 основных пиков, которые, по литературным данным, могут быть

Рис.! ЯМРпС-спсктры (часюга 50,3 МГц) растворов в дсйтсроанотоне образцов ДИВЭМЛ, полученных в хлороформе (а) и в ацетоне (б).

о г несены следующим образом: Л (29,74 м.д.) - метиленовые углероды, Б (44,0 м.д.), В (50,4 м.д.) и 1" (54,0 м.д.) - ушерод, соединенный с карбоксильной группой, Д (77,5 м.д.) - метиловый углерод, соединенный с кислородом, Е (171,3 м.д.) и Ж

' Исследования методом ЯМР спектроскопии выполнены п лаборатории фнзико-химических и аналитических методов исследования полимеров 1ШИПМ под руководством д.х.к.,проф. И.Я.Слоиима

(173,8 м.д.) - карбонильные утлероды. Однако отнесение пиков не дает информации о размере кислородсодержащего цикла. В то же время анализ положения, вида и количества пиков карбонильных угяеродов позволяет оценить размеры цикла. Действительно, если звено ДИВЭМА содержит 6-членный кислородсодержащий цикл, то окружение малеинового ангидрида, находящегося в основной цепи, различно: с одной стороны группа СШ, а с другой СН. В этом случае в ЯМР-спектре должно наблюдаться не менее двух пиков, относящихся к карбонильным углеро-дам. Поскольку ДИВЭМА имеет состав 1:2, его звено содержит еще один ангидридный цикл с иным окружением карбонильных углеродов. Следовательно, число пиков карбонильных углеродов в ЯМР ,3С-спектре ДИВЭМА, содержащего 6-членный никл, должно быть заведомо больше двух. Реально в спектре наблюдается лишь два пика, относящихся к карбонильным углеродам, т.е. звено ДИВЭМА содержит преимущественно симметричный 5-членный цикл. ЯМР-спектры образцов ДИВЭМА. полученных в хлороформе и ацетоне, полностью совпадают, что позволяет сделать вывод об идентичности структуры ДИВЭМА, образующегося в растворителях существенно разной полярности. Таким образом, с нашей точки зрения, общепринятое мнение о б-членной "пирановой" структуре сополимера, образующегося в полярном растворителе, в частности ацетоне, является ошибочным.

Изучение кинетики пиролиза ДИВЭМА в воде и его стабильности в ацетоне.

Звено ДИВЭМА содержит два ангидридных цикла, которые легко вступают в различные реакции, в том числе подвергаются гидролизу. Данные о стабильности ангидридных циклов ДИВЭМА в растворах в литературе отсутствовали.

Чтобы оценить скорость гидролиза ангидридных циклов ДИВЭМА в водных растворах при комнатной температуре, методом ИК-фурье спектроскопии2 была снята кинетика накопления карбоксильных групп. В исходном сополимере присутствуют преимущественно ( 97,5-98,0 %) ангидридные циклы ( ¡860 и 1773 см1) ( сухой образец - таблетка с КВг), в полностью гидролизованном сополимере -карбоксильные группы (1720 см'1). Практически все кислотные группы связаны Н-связями в линейные полнассоциаты, о чем свидетельствует положение полосы валентных колебаний карбонила (1720 см1).

г Все ИК-спектральные исследования выполнены в лаборатории модификации полимеров ИНХС РАН под руководством д.х.н. Т.Л.Лебедевоп

Па рис.2а представлена кинетическая кривая накопления СООН-групп, полученная из данных ИК-фурье спектров. Исследовать малые степени гидролиза ДИВЭМЛ в воде не удалось, поскольку при временах гидролиза, меньших 2 ч., система оставалась гетерофачпой. Иегидроли зонанпый полимер в воде не растворяется, для сто растворения при комнатной температуре требуется около 2 ч. За это время ангидридные циклы успевают гидролнзоваться па 56% .

соон,% loo -

60

ísti/О

20

м

50

160 180 Время, ч

120 180 Время, ч

['ис.2 .Кинетическая кривая цидролиза ДИВЭМЛ в воде (а) и се полулогарифмическая анаморфоза (б)

Кинетическая крипая накопления карбоксильных групп в полулогарифмических координа тах представлена на рис.26. В ходе гидролиза эффективная константа скорости уменьшается вплоть до ~ 80% -ной конверсии ангидридных циклон, после чего константа не меняется, и кинетика гидролиза описывается уравнением первого порядка. При этом значение эффективной константы со-

с гавляет 1,4 х 10 Г> ceic'.

,С II

СИ

О-НО

C=0-IJ0—cv

о-но

III

о-но

сн,-

но—с с=о ^ /

оно

у о

При определении стабильности ангидридных циклов в ацегоне наблюдали малые степени гидролиза ангидридных циклов ДИВЭМЛ (-10-15%), при которых IV

основным структурным образованием карбоксильных групп являются внутримолекулярные димеры (1732 и 1632 см1). Когда ДИВЭМЛ гндролпзован на 30%,»

О

нем преобладают полиассоциаты карбоксильных групп ( III), а димеры (IV) уже практически не идентифицируются.

Образование Н-связанных ассоциатов карбоксильных, групп должно проявляться в УФ-спектрах, поскольку как в димерах, так и в тетрамерах возможно возникновение делокализации электронов. Это было показано при исследовании электронных спектров растворов ДИВЭМА в ацетоне, содержащем разное количество воды ( от 0,1 до 5 мае. %) и в осушенном ацетоне (0,1 мас.%) во времени. В дифференциальных спектрах сополимера присутствуют две основные полосы: 209 и 323 нм. Известно, что поглощение в области 209-210 им относится как к ангидридным циклам, так и кислотным группам. Интерес представляла полоса 323 нм, интенсивность которой с ростом содержания воды в ацетоне, сначала увешиивалась, а затем уменьшалась - на порядок при соотношении ДИВЭМА:Н20, равном 1:10. В спектрах сополимера в осушенном ацетоне оптическая плотность при 323 нм возрастала вдвое через 20 мин. выдержки растворов, а через 2ч- эта полоса исчезала; в спектрах водных растворов ДИВЭМА полоса 323 нм отсутствует. Максимум поглощения при 323 нм был зафиксирован для сополимера гидролизовашюго на ~ 12-15% ( по данным ИК). Кроме того, независимо от влажности растворителя, в спектрах фиксируется ряд полос малой интенсивности: 333, 400, 514 нм. Макималь-ное поглощение при 333 им наблюдали при'эквимольном соотношении

Таблица 1. Стабильность ангидридных циклов ДИВЭМА.

Растворитель Количество гидролизе ванных ангидридных, циклов, % прн временах гидролиза 5* мин 120 мин

Вода 2,5 " 56

Ацетон неосушенный (Сшо>0,22 моль/л) 18 85

Ацетон остшенный (Сшо= 0,044 моль/л) 12 28

* - время растворения ДИВЭМА в ацетоне

** - результат получен при экстраполяции к нулю кривой рис.2а.

ДИВЭМЛ:! ЬО. Сопоставление УФ- и ИК- данных позволяет отнести полосу 323 им к димерам карбоксильных групп, а полосу 333 им - к Н-связанньш полиассоциа-там карбоксильных групп.

Изучение стабильности ангидридных циклов в воде и ацетоне в зависимости от степени его осушки показало, что в ацетоне происходит ускорение гидролиза ангидридных циклов по сравнению с гидролизом в воде (табл.1), причем в ацетоне уменьшение концентрации воды ~ в 5 раз приводит к уменьшению скорости гидролиза всего в 1,5 раза, т.е. в ацетоне кЛф гидролиза тем больше, чем меньше в нем воды. Вероятно, это объясняется различиями в структуре ассоциатов вода, возникающими при изменении ее содержания в ацетоне. Чтобы молекула поды могла участвовать в гидролизе, она должна быть свободна, т.е. необходимо приложить энергию дчя разрушения соответствующих ассоциатов:

в воде II) О ...Н-О-Н ...01Ь - 46,8 кДж/моль

в ацетоне 1Ь О ...Н-О-Н ...0(СН з) г ~ 34,7 кДж/моль

(С ню =0,22 моль/л)

а ацетоне (С!Ь )> О ...Н-О-Н ...0(СНз) г ~ 22,6 кДж/моль

(С иго <0,05 моль/л)

Из приведенных данных видно,что протоноакцепторныи растворитель ацетон как бы "активирует" воду. Наблюдаемая при 120 мин. эксперимента кажущаяся стабилизация ангидридных циклов в осушенном ацетоне, по-видимому, обусловлена недостатком в нем воды для более полного пиролиза, т.к. имеющейся воды (0,044 моль/л при степени осушки ацетона до остаточного содержания воды 0,1 мас.% ) хватает только, чтобы гидролизовать не более 30? о ангидридных циклов ДИВЭМА (при концентрации ДИВЭМЛ в ацетоне 0,075моль/л).

Таким образом, при полном растворении (-5 мин.) ДИВЭМЛ уже гидролизом» приблизительно на 10-12 % даже в осушенном растворителе; протекание гидролиза сополимера сопровождается образованием Н-связанных ассоциатов карбоксильных групп разного типа - димеров и полиассоциатов, в полностью гидролизо-ванном ДИВЭМА все кислотные группы связаны в полиассоциаты.

Специфика ДИВЭМА, заключающаяся в возможности образования Н-связанных полиассоциатов кислотных групп, определяет ряд его кислотно-основных свойств (например, значения рКо , превышающие значение этой величины для других сополимеров малсинового ангидрида) и обуславливает вид кривых потенциометричеекого титроваиия. Для ДИВЭМА не наблюдается двухстадийного

титрования, характерного для сополимеров малеинового ангидрида и обусловленного образованием Н-связанных димеров диссоциированных и недиссоциирован-ных кислотных фупп, поскольку в полностью гидролизованном ДИВЭМА присутствуют только полиассоциагы кислотных групп.

Исследование молекулнрно-массовых характеристик ДИВЭМА методом гель-проникающей хроматографии (111Х). Молекулярно-массовые характеристики (ММХ) полимеров являются одним из факторов, определяющих их собственную биологическую активность и ряд свойств макромолекулярных транспортных систем на их основе. Зависимость биологической активности от ММХ ДИВЭМА (противовирусный эффект ДИВЭМА проявляется с М > 30000; противоопухолевая активность сохраняется для фракций с М< 10000; общая токсичность возрастает с М ~ 50000) обусловливает необходимость определения не только средних М, но и распределения по молекулярным массам (ММР), поскольку для синтетических полимеров характерно наличие опредедешюго, часто довольно широкого ММР.

Предпринятые ранее попытки исследования ММХ ДИВЭМА методом ГПХ как в водной среде, так и в органических растворителях были неудачными. Определить ММХ ДИВЭМА удалось лишь после исчерпывающего метилирования сополимера. Однако предварительное проведение полимераналогичных превращений может искажать ММХ исходного ДИВЭМА. Задача определения ММХ ДИВЭМА без проведения его предварительной модификации до настоящего времени оставалась нерешенной.

Результаты изучения гидролиза сополимера и его кислотно-основных свойств позволили нам решить задачу определения ММХ ДИВЭМА в водных средах методом ПIX. Для этого необходимо было провести оптимизацию условий анализа по компонентам: составу сополимера, составу элюента, выбрать максимально инертный из коммерчески доступных сорбент.

Оптимизация свойств сополимера. ДИВЭМА - полиангидрид; известно, что ангидридные циклы легко гндролизуются, и этим определяется возможность возникновения неоднородности по составу. Получить абсолютно сухой полимер, содержащий только ангидридные циклы, практически не удается ( данные ТГА и ИК-фурье). Соотношение кислотных и ангидридных групп в сополимере определяет его взаимодействие с сорбентом и, следовательно, ГПХ-поведение, поскольку гидродинамический объем становится функцией не только молекулярной массы, но и содержания кислотных групп, т.е. необходимо либо контролировать это соотнопге-

!!

нне, либо работать с полимером, содержащим только один тип групп. Поскольку кислотная форма сополимера более устойчива и не подвержена спонтанным изменениям при изменении влажности, целесообразно работать с полностью гидролизо-ваиным сополимером.

Выбор злюента. Электростатические взаимодействия полиэлектролитов, а также их конформация определяются степенью ионизации ионогепных 1руип (а), которая, в свою очередь, зависит от рН растворителя и его ионной силы. Максимальная однородность по степени ионизации для поликислот может быть достигнута в двух крайних случаях: при значениях рН < рКо, когда диссоциация кислотных групп практически полностью подавлена; и при значениях рН выше точки эквивалентности поликислоты, когда макромолекулы полностью ионизованы, т.е. при а = 0 и а = 1. Нами был выбран второй случай достижения однородное™ по степени ионизации - рН выше точки эквивалентности.

Методом потенциометрического титрования были определены значения рКг, и рН точки эквивалентности образцов ДИВЭМА разног"! молекулярной массы при различных концентрациях фонового электролита. Как и ожидалось, значение рН точки эквивалентности ДИВЭМА не зависит от его молекулярной массы. В качестве рабочего было выбрано рН = 10,3, а элюентом- боратный буфер с этим значением рН.

выбор сорбента. Сорбент должен удовлетворять следующим требованиям: минимальное число активных групп на поверхности, устойчивость в щелочных средах, высокая эффективность. Для анализа ДИВЭМА в качестве сорбента был выбран ТЭК Р\У §е1, поскольку он характеризуется широким диапазоном устойчивости по рН (2 12) и достаточно низким содержанием остаточных карбоксильных групп.

ГИХ-анализ ДИВЭМА. При анализе ДИВЭМА в боратном буфере с рН = 10,3 (рис.За) было установлено проявление неэксклюзионных эффектов: высокомолекулярные фракции полимера исключались из колонок без деления, образны со средними и низкими М„ ( 13000 и 4100) имели бимодальное распределение. Причина этого заключается в наличии на поверхности сорбента остаточных карбоксильных групп, определяющих проявление электростатических взаимодействий (исключение без деления) и перераспределение полимера между подвижной и стационарной фазой в результате возникновения Доппановской солевой экеклюзии.

Дли ус гранения нежсклюзиопиых эффектов и элюеит добавляли пизкомоле-кулярш.ш электролит - ЫаО. При концентрации К'аС1 в элюенте, равной 0,2 моль/л, пеэкслюзпопные эффекты подавлены (рис.Зб). Использовать более высокие концентрации соли пежекпедык), поскольку возможно возникновение вязкостных эффектов.

а

з/ \

/А\

ю 11 12 13 14 16 1в 17 10 10

У.т! ....... ~ " -. V >Г " " ."'

Гис.З. Хроматограммы образцов ДМВЭМА различных молекулярных масс, ]- Мп = 4100, 2 - Мп = 13000 и 3 -Мп=59000. Условия анализа: элюеит боратный буфер рН = Ю,3, содержащий (а) - 0; (б) - 0,2М ЫаС1: система колонок Т8К-Сс1 ЗОООР\У, Т8К-Се1 5500Р\У с предколонкой -О-ТБК Р\У; скорость потока 1мл/мин; рефрактометрический детектор .

Корректность выбранных условии анализа была подтверждена оценкой воспроизводимое т результатов.

Таким образом, выбранные нами условия проведения анализа можно рассматривать как условия разделения макромолекул по эксклюзионпому механизму.

В табл. 2 представлены данные о влиянии условий синтеза на ММХ образцов ДИВЭМА, полученных при разных условиях синтеза. Но данным ГПХ ( табл.2, рис.Зб.) все исследованные образцы ДИВЭМА, независимо от условий получения, имеют достаточно широкое ММР. Однако при проведении синтеза ДИВЭМА в ацетоне образуется сополимер с более узким ММР, по сравнению с синтезом его в хлороформе. Проведение синтеза ДИВЭМА, в присутствии в реакционной смсси регулятора цепи - 'ГГФ позволяет получать сополимер с заданными молекулярными массами, при этом введение регулятора цепи не исключает образования высокомолекулярных фракций, но позволяет уменьшить их содержание в полимере, что очень важно для биологической активности ДИВЭМА, т.к. проявление токсичности связано, в основном, с наличием фракций с М> 50000.

Таким образом, изучение физпко-химичсскнх. свойств ДИВЭМА позволило впервые разработать метод ГПХ-апаяиза его ММХ без предварительной модификации сополимера. Предложенная стратегия выбора условий анализа может быть использована для других сополимеров малепнового ангидрида.

Таблица 2. Влияние условий синтеза на ММХ ДИВЭМА*.

Среда ТГФ, Мп" М Мп"" Мм*" М\у/Мп

синтеза мас.%

хлороформ 0 34 ООО - 15 050 560 700 37.0

ацетон 0 59 ООО"** 0,62 20 650 388 850 18,8

ацетон 1 10 100 0,32 И 200 139 800 12,5

5 8 500 - 7 300 74 900 10,2

20 4 650 0,15 4 800 43 800 9,2

* - определены в боратном буфере (рН= 10,3), содержащем 0,2 М КаС1 " - данные осмомстрии получены в ацетоне

"* - данные ГПХ (по калибровке, подученной с использванием набора

ПЭГиПЭО стандартов). "" - определено методом эбулноскопии в ацетоне

Синтез иакромолекулпрных транспортных форм антрациклинов на основе ДИВЭМА.

Изучение взаимодействия ДИВЭМА с первичными аминами. Одним из способов создания макромолекулярных транспортных форм лекарственных препаратов является проведение химической модификации полимера-ноентеля, т.е. присоединение лекарственных вешеств к заранее выбраному полимеру. Полпмераналогич-иые превращения сополимеров МА обычно рассматривают как реакции ангидрид-пых циклов и полагают, что при взаимодействии, например, ДИВЭМА с первич-

иыми аминами образуйся амидная связь. Наличие этой связи доказывали присутствием в ИК-спсктрах продуктов реакции полосы 1640 см1.

Однако, как показано выше, даже в специально осушенном ацетоне "сухой" сополимер (2-3% кпслотнмх групп по данным ТГА) успевает гняролизоваться при растворении приблизительно па 10-15%. Следовательно, в сополимере наряду с ангидридными циклами всегда присутствуют карбоксильные группы, что необходимо учитывать при проведении полимерапалогичных превращений ДИВЭМА, по-

В ИК-ciieicipe реакционной смеси ДИВЭМА с ДА в ацетоне, начиная с соотношения компонентов, равного 1 : 0,1, появляются полосы 1640 см 1 и 1550 см-1, интенсивность которых растет с увеличением содержания амина в системе, причем интенсивность полосы 1640 см-1 меньше, чем 1550 см-1 при всех изученных соотношениях компонентов. Наблюдаемое соотношение интенсивостей полос не отвечай литературным данным по ИК-спектрам вторичных амидов [полоса 1640 см-1 (Амид 1 ) обычно интенсивнее полосы 1550 см-' (Амид II)]. Кроме того, для вторичных амидов характерно наличие в спектрах полосы в области 1200-1300 см-1 (Амид III). Имеющаяся в исходном ДИВЭМА интенсивная полоса 1221 см1, которую можно отнести как к колебаниям ангидридного цикла, так и к колебаниям СООН-групп, с ростом концентрации амина уменьшается до практически полного исчезновения при соотношении ДА:ДИВЭМА, равном 4:1. Т.е. образования амидной связи при взаимодействии ДИВЭМА с ДА в данных условиях не происходит. Подтверждением присутствия в продуктах реакции карбокенлат-иона является наличие в ИК-спектрах в области 1420-1390 см-' полосы поглощения, интенсивность которой растет с увеличением концентрации амина. Это означает, что полоса 1640 см-1 может

О

ОН

скольку состав возможных продуктов расширяется и идентификация по одной полосе 1640 см-' становится неоднозначной. Поскольку рубомишш имеет достаточно сложную структуру (V), взаимодействие ДИВЭМА с первичными аминами изучали спектральными методами на примере модельной реакции с дециламином (ДА).'

быть ошессна к иоглошсшии аммонийного катиона, а 1550 см-' - к карбоксплат-мону, связанных сильными 11-связями ( 3300, 2500 и 1950 см-1).

В УФ-спекграх модельной системы ДИВЭМА-ДА, компоненты которой не имеют собственных полос в длинноволновой области спектра, появляются две группы полос (полосы переноса заряда), причем положение одних с ростом копнет рации амина в реакционной смеси (от 0,1 до 10 мольных долей) смещается в коротковолновую область (361-327), а положение других - 448 нм ( появляется при мольной доле амина 0,5) п 5(4 нм ( при 0,87) не зависит от концентрации амина в системе. Появление полос 448 и 514 нм хорошо коррелирует с наблюдаемым при смешении немодно бесцветных растворов компонентов желтым окрашиванием реакционной смеси.

Совокупность экспериментальных фактов указывает на формирование в системе Н-связаиных ионных комплексов, в которых происходит перенос заряда. Анион и катион в зависимости от соотношения компонентов могут иметь различную структуру:

/Л © /н

0=С С-0И-0=С с-^ОП—Л

Х0Н / чон,/е ■ Г1

5-

АпА

/\ а и

VI (>•• I!

Iе ®)<

о-< -н

VIII

VII

и

к—А —н-

I

I

н

IX

н

•Ж—к I

н

(35

Подтверждением образования Н-сзязанных пенных комплексов являются спектральные данные об изменениях, происходящие в системе при нагревании (в массе) и смещении проголитпческого равновесия при промывке в хорошем для амина раствори теле - хлороформе.

Таким образом, при взаимодействии ДИВЭМА с первичными аминами в ацетоне при комнатной температуре происходит образование И-связанных ионных комплексов разного состава и стабильности.

Результаты исследования модельных комплексов ДА с ДИВЭМА позволили нам предположить, что природа связывания антибиотика с полимером в коныога-

5

К)

гах ДИВЭМА-рубомицпн также имеет ионный характер. Конъюгаты ДИВЭМЛ с рубомицином получат в ацетоне при комнатной температуре, ход реакции контролировали методом 'ГСХ. Содержание рубомицниа в копъюгате определяли по данным УФ-енектроскопни (по поглощению при длине волны 480 им) и по данным элементного анализа. В ИК-спсктрах конъюгатов (рнс.4) независимо от содержания рубомицниа появляет ся широкая полоса 1560 елг1, интенсивность которой растет с ростом содержания ашибиотика в коныотате.

рода связывания антибиотика с полимером, действительно, имеет ионный характер, вопреки сложившемуся в литературе мнению об образовании ампдпой связи. Такой тип связи 13 конъюгатах ДИВЭМЛ с аптрациклинами позволяет объяснить свойства этих, систем, например, стабильность и предположить, что в физических смесях реагентов в растворителях, в которых возможны реакции обмена, будут образовываться подобные комплексы. Так, в водном растворе физической смеси ДИВЭМА и солянокислой соли рубомицниа (4,5 мол.%), действительно, проходит реакция обмена, что подтверждает ИК-фурье спектр полученного продукта, который практически не отличается от спектра соответствующего конъюгата. При этом полученный продукт, как показали биологические испытания в экспериментах на живот-пых, обладает противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью соответ-

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что при получении конъюгатов в описанных условиях при-

Полоса 1640 см0 появляется в виде плеча существенно меньшей интенсивности, чем полоса 1560 см-1. Одновременно уменьшается интенсивность полос 1855 и 1780 см-1, характерных для колебаний у(С=0) ангидридных

циклов, и растет интенсивность полосы 1725 см1, относящейся к полиассоциатам карбоксильных ipynri.

Рмс.б ИК-(|)урье спектры твердых образцов: ДИВЭМА (1), конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин с содержанием рубомицииа соответственно I (2), 4,5(3), и 10,4 (4) мол.%; солянокислой солнру бомицнна (5) и его основной формы (6).

Воляовоэ число, см-

ствующпх конъюгагов. Интересно, что факт проявления противоопухолевой активности физических смесей антрациклинов с ДИВЭМА фиксировали и ранее, однако, объяснить не могли.

Синтез чакромолекулприых транспортных систем с рмулируеион скоростью отщепления рубоминипа и модельных копыогатов ДИВЭМА различной гидрофоб-ности. Известно, что биологическая активность веществ наряду с другими факторами во многом определяется пх относительной гидрофобностью. Можно было ожидать, что изменение гшхрофобности ДИВЭМА путем присоединения гидрофобных блоков позволит улучшить его биологические характеристики, а введение гидрофобных блоков в состав копъюгатов ДИВЭМА-рубомицин - получить системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотика вследствие изменения конформации полимерных цепей в растворах.

В качестве модификаторов были выбраны алифатические амины с данной цепи от трех до десяти томов углерода и полнэтиленгликоли (ПЭГ) разной молекулярной массы: 300, 600, 1000. Гидрофобность системы определялась длиной углеводородной цепочки и количеством присоединенных боковых групп.

Грсхкомпонентные системы ДИВЭМЛ-рубомицин-модификатор получали иугем последовательных полимераналогичных превращений.

Для изучения влияния гидрофобное™ сополимера на его биологическую активность, а также для исследования свойств трехкомпонешных систем были также синтезированы модельные системы ДИВЭМА-амин и ДИВЭМА-ПЭГ.

Взаимодействие ДИВЭМА с аминами носит количественный характер до соотношений ДИВЭМА:амин, равного 1:2, однако больше 2-х молекул амина на звено ДИВЭМА связать с полимером не удается. При взаимодействии конъюгагов ДИВЭМА-рубомицин с аминами увеличение концентрации амина в реакционной смеси приводит к росту содержания его в продукте, но количественного взаимодействия не наблюдается, по-видимому, вследствие проявления стерических затруднений.

Степень модификации ДИВЭМА ЛЭГами зависит от молекулярной массы ПЭГ, причем для ПЭГ 300 максимальная степень модификации не более 8% мол., для ПЭГ1000 - 2-1-3 %. Для конъюгагов ДИВЭМА-рубомицин степень модификации ПЭГ не превышает 4,5 мол.% .

Исследование свойств микром олс кули р пых трапспортиых систем ДИВЭМА-

рубомицин.

Исследование структуры полимерных конъюгатов в растворах Для исследования состояния конъюгатов ДИВЭМА в растворах были выбраны простые и доступные методы, позволяющие качественно оценить свойства растворов конъюгатов: УФ-спектроскопия, определение поверхностного натяжения, метод солюбили-зации.

Спектральные характеристики конъюгатов ДИВЭМА-рубомиции (форма пика, концентрационная зависимость кажущегося коэффициента зкетинкции) свидетельствуют об ассоциации рубомнцина в составе конъюгатов даже при низких концентрациях в растворе, а характер концентрационной зависимости кажущегося коэффициента эксгипкцяи позволяет предположить, что в растворах конъюгатов происходит структурирование с образованием, по-видимому, внутримолекулярных мицелл.

Водные растворы ДИВЭМА-рубомицин и модельных систем ДИВЭМА-амин проявляют значительную поверхностную активность. Увеличение гидрофобное™ системы как за счет увеличения количества, так и удлинения липофильной цепи, приводит к более эффективному снижению поверхностного натяжения.

Исследование солюбшшзации водонерастворимого красителя ( Судан III) в растворах модельных систем ДИВЭМА -модификатор обнаружило факт перераспределения его между твердой и жидкой фазами, что свидетельствует об образовании мицеллярной структуры. Эффективность солюбилизации увеличивается с ростом гидрофобности системы. Доказательством образования внутримолекулярных мицелл является постоянство отношения количества солюбилизированного красителя к единице массы полимера при увеличении концентрации последнего в растворах.

Таким образом, на основании результатов изучения свойств растворов конъюгатов ДИВЭМА -рубомицин и модельных систем ДИВЭМА-модификатор можно полагать, что в водных растворах эти системы структурированы и образуют внутримолекулярные мицеллы.

Изучение стабильности полимерных конъюгатов рубомнцина. Анализ литературы показывает, что для проявления противоопухолего действия полимерных форм антрациклиноп в клетках-мишенях должно происходить расщепление связи

полимер-антибиотик. В то же время стабильность системы в кровотоке - необходимое условие обеспечения специфичности ее действия. Для достижения эффективности и специфичности действия макромолекулярпых транспортных форм антра-цпклннов необходимо получать системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотиков.

Данные о свойствах водных растворов коньюгагов ДИВЭМА-рубомицин и модельных конъюгатов ДИВЭМА позволили предположить, что скорость отщепления рубомицииа от полимера можно вариировать, изменяя структуру полимера в растворе за счет изменения его гидрофобносш.

Стабильность полученных нами конъюгатов ДИВЭМА при разных условиях была изучена методом ВЭЖХ. В условиях, моделирующих физиологические (фосфатный буфер рН=7,2, содержащий 0,9М ЫаС1, Т=37*С), стабильность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин определяется содержанием антибиотика в системе: увеличивается с ростом его содержания. Молекулярная масса полимера не оказывает влияния на стабильность конъюгатов.

Известно, что опухолевые ткани отличаются более низкими значениями рН на 0,5-1,0) по сравнению со здоровыми тканями. Эту особенность можно использовать для повышения селективности, создавая системы с рН-чувствительной связью.

В соответствии с этим была изучена стабильность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин в кислых средах. Показано, что скорость отщепления рубомицииа от полимера при рН=6.2 ~ в 3,5 раза выше, чем при физиологических условиях. Можно ожидать, что полученные нами конъюгаты будут обладать некоторой специфичностью действия, выделяя антибиотик более эффективно в опухолевых тканях.

При физиологических условиях стабильность трехкомпонентных систем ДИВЭМА- рубомицин-модификатор определяется их гидрофобностью. Для систем ДИВЭМА- рубомицип- дециламин введение и увеличение содержания дециламина в системе приводит к закономерному снижению скорости отщепления рубомицииа (рис.5а). Стабильность конъюгатов, модифицированных ПЭГ разной молекулярной массы, зависит от длины цепи ПЭГ (рис.5б).

Так, при равном содержании рубомицииа в коныогатах для систем, содержащих короткие цепочки- ПЭГ 600, п= 18, скорость отщепления рубомицииа оказалась выше, чем для конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин, а для длинных - ПЭГ 1000,

Л)

п=33, существенно ниже, что объясняется, по-видимому, различием в конформащш макромолекул конъюгатов.

5-

—1—

200

Рис.5я. Стабильность конъюгатов ДИВЭ.МА-рубомицин (I), модифицированных дециламином (2-4) при физиологических условиях; содержание ( мол.%): рубомицина ( 1-4) -1,4; дециламниа 2-6,5; 3-12; 4 - 42.

Рис.56. Стабильность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин (1), модифицированных ПЭГ разной молекулярной массы; содержание (мол. %) ; рубомицина (1-3) - 1,6; ПЭГ 600 (3) - 3,2: ПЭГ 1000 (2) - 1.7.

Таким образом, стабильность макромолекулярных транспортных форм ан-грацшсцинов на основс ДИВЭМА обусловлена структурой макромолекул конъ-югагов в растворах, а именно возможностью мицеллообразования. Образование и стабильность таких мицеллярных структур определяется условиями, в которых возможно возникновение и стабилизация гидрофобных взаимодействий. Изменяя структуру полимера в растворе, можно получать макромолскулярныс зранспортпые формы антрациклинов с регулируемой скоростью отщепления антибиотиков.

Биологическая активность коныогатпв ДИВЭ.УТА.

Противоопухолевая активность конъюгатов ДИВЭМА-рубошшин была изучена в Онкологическом Научном Центре РАМН в эсперимоттах на животных на ряде моделей. Показано, что конъюгаты обладают большей широтой терапевтического действия, проявляют высокую цитотоксическую активность и низкую токсичность по сравнению со свободным антибиотиком (для конъюгата. содержащего 13,5 мае. % рубошщина, Ы)я) = 300 мг/кг, для рубомнцнна Ш™ = 5,1 мг/кг). Выявлен диапазон оптимального содержания рубомицина в конътогатах - 7-18 мас.%. Установлена значительная активность конъюгатов в отношении плотных опухолей -меланомы В16 и карциномы легкого Льюиса. На модели карциномы Лыоиса при внутрибрюшинном введении конъюгатов показано значительное снижение частоты метастазирования в легкие ( ~ на 70% по сравнению с контролем), что заслуживает внимания, поскольку данная опухоль резистентна к химиотерапии.

Иммунологические характеристики конъюгатов изучены в МИИОИ нм.А.П.Герцена МЗ РФ. Установлено, что действие конъюгатов ДИВЭМА-амин на гуморальный иммунитет зависит от гидрофобности системы: конъюгаты с нропил-и бутияамином стимулировали гуморальный иммунный ответ в большей степени, чем сам сополимер; увеличение длины гидрофобной цепочки приводит к снижению этого эффекта. Все препараты достоверно стимулировали клеточный иммунитет. Показано, что конъюгаты ДИВЭМА-рубомицин не только не оказывали иммуно-дспрессивного действия на экспериментальных животных, но и вызывали стимуляцию иммунитета и сохраняют ннтерферониндуцирующее действие ДИВЭМА ( при внугрибюшинном введении титр интерферона в крови экспериментальных животных составлял 320 ед/мл).

Полученные данные свидетельствуют о перспективности конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин, т.к. иммунологические нарушения, возникающие при химиотерапии, часто оказывают определяющее влияние на течение и исход заболевания.

Вывода

1. Спектральными методами изучена структура ДИВЭМА; показано, что при синтезе в ацетоне и хлороформе образуется сополимер с симметричной пя-тичленной структурой кислородсодержащего цикла.

2. Изучен гидролиз ДИВЭМА и его стабильность в ацетоне; показано, что гидролиз сополимера сопровождается образованием Н-связанных ассоциатов кислотных групп, наличие которых определяет ряд свойств сополимера.

3. Впервые разработай метод определения молекулярно-массовых характеристик ДИВЭМА в водных средах, не требующий проведения его предварительной модификации.

4. Изучено взаимодействие ДИВЭМА с первичными аминами в ацетоне; показано, что в данных условиях образуются Н-связанные ионные комплексы разного состава и стабильности. Ионный характер связи в коиъюгатах ДИВЭМА-рубомицин определяет стабильность этих систем.

5. Показано, что изменяя структуру коньюгатов ДИВЭМА-рубомицин в растворах путем изменения их гидрофобности, можно получать системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотика.

6. Установлено, что конъюгатьг ДИВЭМА-рубомицин обладают большей противоопухолевой активностью при существенно меньшей токсичности по сравнению со свободным антибиотиком, "работают" на резистентных моделях опухолей и не проявляют имыунодепресивного действия.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Козлов A.M., Горшкова М.Ю., Стоцкая Л.Л., Кренцеяь Б.А., Козловский М.М. Модификация биологического действия рубошшина путем его иммобилизации на полимерном носителе. - сб. Химиотерапия опухолей в СССР, Москва, 199i, вы п. 57, с. 57-64.

2. Горшкова М.Ю., Кренцель Б.А., Козлов A.M. Модификация биологического действия рубомицина путем его иммобилизации на полимерном носителе. " Синтетические полимеры медицинского назначения", IX Всесоюзн. сим.: Тез. докл. - Звенигород, 1991, с. 79.

3. Сухин Г.М., Печерских Е.В., Стоцкая Л.Л., Горшкова М.Ю. Иммунологическое действие рубомицина, связанного с полимерным носителем. - сб. Химиотерапия опухолей в СССР, Москва, 1992, вып. 58-59, с. 113-120.

4. Kozlov A.M., Gorshkova M.Yu., Stotskaya L.L., Krentsel B.A., Bulychev Yu. N. Antitumor and antimetastatic activity of conjugates of rubomycin and copolymers of divinyl ester and ma'ieic anhydride. 8-th NCI-EORTC Symp. on New Drugs in Cancer Therapy: Abstr. - Amsterdam, 1994, p. 136.

5. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Л., Стоцкая Л.Л. Роль комплексов с переносом зарядов в реакции сополимеров малеинового ангидрида с аминами. "Комплексы с переносом зарядов и ион-радикальные соли ( КОМИС-94)", VHI Совет. : Тез. докл. - Москва, 1994, с.8.

6. Stotskaya L.L., Gorshkova M.Yu., Lebedeva T.L. Structure of DIVEMA-rubomycin conjugates. Spectroscopic study. Biological activity. 3rd Int. Symp. on Polymers for Advanced Technologies (TAT'95): Abstr. - Pisa, 1995, p.276.

7. Сухин Г.М., Печерских E.B., Саранцева О. С., Горшкова М.Ю. Стоцкая Л.Л. Влияние шшофнльных производных сополимера днвинилового эфира с ма-леиновым ангидридом на иммунокомнетентные клетки. - Вопросы медицинской химии, 1995, т.41, Хсб, с.50-53.

8. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Л., Червнна Л.В., Стоцкая Л.Л. Кинетика гидролиза сополимера днвинилового эфира с малеиновым ангидридом в воде и его стабильность в ацетоне. - Высокомолек.соед., 1995, т. 37А, №10, с.1653-1658.

9. Gorshkova M.Yu., Tebedeva T.L., Stotskaya L.L. Behavior of copolymers of divinyl ester and maleic anhydride in water and acetone solutions. - 2nd. Int. Symp. "Molecular order and mobility in polymer systems" : Abstr. - St.-Petersburg, 1996, p.031

10. Горшкова М.Ю., Лебедева Т.Л., Стоцкая Л.Л. Тип связи в продуктах взаимодействия первичных аминов с сополимером днвинилового эфира и малеинового ангидрида. - Изв. Академии Наук, сер.хим.,1996, № 7, с. 1719-1725.

11. Стоцкая Л.Л., Горшкова М.Ю., Козлов А.М. Малотоксичные противоопухолевые препараты на основе рубомицина и сополимеров малеинового ангид-