Коньюгаты сополимеров малеинового ангидрида с аминами. Структура и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт Нефтехимического Синтеза им. А.В.Топчиева

На нравах рукописи

ГОРШКОВА Марина Юрьевна

КОНЪГОГАТЫ СОПОЛИМЕРОВ МАЛЕИНОВОГО АНГИДРИДА С АМИНААШ. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА.

02.00.06 - Химия высокомолекулярных, соединений.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени калдндаш химических наук

Москва-1996

Работа выполнена в И псину ic нефтехимического синтеза им. А.Б.Топчиева РАН

Научный руководи гели:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор химических на)« Л.Л. Стоцкая кандидат химических наук О.Б. Семёнов, доктор химических паук, профессор Б.Л. Кренцель.

доктор химических наук, профессор Л.И. Валуев

доктор химических наук, профессор И.М. Паиисов

Ведущая организация: Институт высокомолекулярных

соединений РАН

Защита диссертации состоится " СкТЯ й1996 г. в /О часов на заседании специализированного Совета К 002. 78.01 при Институте нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН по адресу: 117912, ГСП-1, Москва В-71, Ленинский проспект, д. 29.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан

-зо" 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук Э.А. Волнина

Общая хнрактерпсгика работы

Актуальность работы. Диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств сополимера дивинилового эфира с малсиповым ангидридом (ДИВЭМА), взаимодействию его с первичными 'аминами и созданию на основе выявленных закономерностей макрочолехулярных транаюртых форм противоопухолевых антибиотиков - антрациклинов, изучению их ефуктуры и свойств. Аитра-ииклины являются одним из наиболее активных средств химиотерапии рака, однако для них характерна высокая карлно токсичность. что не позволяет полностью использовать их прогнвоопухолевую активность и ограничивает широкое клиническое применение. Актуальность работы определяется необходимостью создания нового поколения противоопухолевых препаратов, сочетающих такие свойства, как длительность действия, высокая эффективность и низкая токсичность.

Исследования последних лет показали, то применение макромолекуяярнсн о подхода, т.е. создание конъгогатюя лекарственных препаратов с полимерными носителями является одним из перспективных путей решения этой задачи. При правильном выборе носителя и типа связи между носителем и лекарственным препаратом возможно осуществление направленного транспорта препарата в клетки опухоли, •по должно привести к повышению оффоаивности его действия и позволит снизить токсичность.

Выбор в качестве полимера-носителя ДИВЭМА определяется тем, что он обладает собственной биологической акт ивноетыо, в том числе противоопухолевой и противовирусной, индуцирует выработку интерферона, активирует макрофаги. Можно было ожидать, что иммуностимулирующее действие полимера позволит скомпенсировать угнетение иммунитета, вызываемое противоопухолевыми антибиотиками.

Ранее в лаборатории исследования физико-химических свойств полимеров ИНХС им.Л.В.'Гончиева были получены копыогаты шпрациклииов с сополимерами малеинопого ангидрида, превосходящие по противоопухолевой активности действие свободных антибиотиков при значительно меньшей токсичности.

Однако не были исследованы свойства полученных систем, их стабильность, природа связи антибиотиков с полимером.

OcnoBiiasi цель работы заключалась в исследовании физико-химических С30ЙСТ2 ДНВЭМЛ. изучении его ьзаимодейстзия с первичными аминами и .ча

основании выявленных закономерностей получении макромолекулярных транспортных форм антрациклииов с регулируемой скоростью отщепления антибиотика и изучении их свойств.

Научная новизна работы определяется тем, чго впервые проведено систематическое исследование физико-химичсских свойств ДИВЭМА:

- изучена химическая структура сополимера;

- изучен гидролиз в растворах и показано, что в ходе гидролиза формируюгея Н-связанные ассоциаты кислотных групп, определяющие протекание иолимеранало-гичных превращений сополимера:

- впервые для ДИВЭМА. разработан метод определения молекулярно-массовых характеристик в водных растворах без предварительной модификации сополимера;

- на модельных системах изучено взаимодействие ДИВЭМА с первичными аминами (в ацетоне) и показано, что продуктом реакции являются Н-связанныс ионные комплексы;

- показано, что именно этот тип связи в макромолекулярных транспортных системах антрапиклипов позволяет достигать оптимальной, с точки зрения биологической активности, стабильности систем;

- получены системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотиков к показано, что, изменяя гидрофобность системы, можно регулировать в широких пределах скорость отщепления лекарственного препарата;

- изучена взаимосвязь структуры коныогатов с их физико-химическими и биологическими "свойствами. Установлено, что в водных растворах макромолекулы конь-югатов структурированы и имеют большую компактность по сравнению с исходным полимером за счет взаимодействий гидрофобных фрагментов (антибиотика или алифатических аминов);

- изучена стабильность макромолекулярных транснортиых форм антрациклииов и показано, что в условиях, близких к физиологическим, они достаточно гидролитически устойчивы.

Практическая ценност ь работы состоит в том, что в результате проведенных исследований получены макромолекулярные транспортные формы антрациклииов, обладающие большей активностью, чем применяемые в клинике низкомолекулярные препараты, при существенно меньшей токсичности. Полученные полимерные конъюгаты обладают более широким противоопухолевым действием, а именно, макромолекулярные системы активны на моделях солидных опухолей, для которых

нс зафиксировано действие антрациклинов, а также на моделях, резистентных к этому классу лекарственных препаратов. В настоящее время полученные макромо-лекулярные транспортные формы антрациклинов проходят предклииические испытания в Онкологическом Научном Центре РАМН.

Кроме юго, получен ряд фундаментальных данных о строении и свойствах ДИВЭМА: изучен гидролиз сополимера, его структура, молекулярно-массовые характеристики, закономерности взаимодействия с первичными аминами в ацетоне и с груктура продуктов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались н обсуждались на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры меднцинско! о назначения"' ( Звенигород, 1991), 8-м Совещании по проблеме "Комплексы с переносом заряда и ион-радикальные соли" КОМИС - 94 ( Москва, 1994 ), 8-th NCI-EORTC Symposium "New drugs in cancer therapy" ( Amsterdam, 1994 ), 3-rd Internatioai Symposium "Polymer for Advanced Technologies" ( Pisa, 1995), 2-nd International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" ( Saint-Petersburg, 1996 ), 3-м Российском Национальном конгрессе "Человек и лекаре reo" ( Москва, 1996 ), а также научных конференциях ИНХС им. А.В.Тончнева РАИ в 1990,1993,1994 годах.

Публикации. Основное содержание работы изложено в 11 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, постановки задачи, экспериментальной часта, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы i/б 'О наименований). Работа изложена на т страницах машинописного текста, иллюстрирована 39_ рисунками, содержит таблиц.

Основное содержание работы Структура, физико-химические свойс та н молекулярио-массопие характеристики

ДИПХМА.

"Судьбу" транспортной системы в организме (длительность циркуляции, распределение по органам и тканям) определяют такие физико-химические свойства полимеров-носителей, как гидрофобность, молекулярная масса, молекулярно-массовое распределение, микроструктура полимерной цепи, структура в растворах, подверженность биодеструкшш и др. Эш же свойства определяют проявление соб-

ственной биологической активности полимеров, в частности, биологически активных иолианионов.

Однако, специфика полиэлекгролитов проявляется в том, что в растворах практически все их свойства определяются взаимодействием заряженных групп между собой, а также с окружающими их низкомолекулярными ионами. Для слабых полиэлектролитов такие взаимодействия зависят от степени ионизации макромолекулы.

Наличие в макромолекулах полиэлектролитов групп разной природы обус-лавливаег возможность возникновения различных взаимодействии

(электростатических, гидрофобных, водородных связей, а также их различных сочетаний), что определяет повышенную склонность цепей полиэлектролитов к кон-формационным изменениям при изменении условий (рН, температуры, природы растворителя). Особенности поведения полиэлектролитов в растворах осложняют их исследование современными физико-химическими методами, поскольку требуется разработка специальных подходов и методик.

Объект исследования данной работы - ДИВЭМА, проявляющий в растворах свойства полшлектролигов, широко исследован с точки зрения его биологической активности, однако физико-химические свойства ДИВЭМА изучены мало.

Исследование структуры ДИВЭМА спектральными методами. Состав звена ДИВЭМА и наличие циклической структуры подтверждены данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскошш и не вызывают сомнений. Однако относительно размера кислородсодержащего цикла в звене сополимера в литературе имеются противоречивые сведения. Общепризнанной считается структура с шесгичленным циклом (I). В тоже время при синтезе ДИВЭМА в хлороформе было показано образование пя гичленного кислородсодержащего цикла (II), а при получении сополимера в смеси сероуглерода с ацетоном - образование как пяти-, так и шес-тичленных структур.

I II

Структура ДИВЭМЛ, полученного в ацетоне с использованием в качестве регулятора цепи теграгпдрофурана (ТГФ), позволяющего получать сополимер с заданными молекулярными массами, ранее по исследовалась.

Таким образом, до настоящего времени вопрос о структуре ДИВЭМЛ и ее зависимости от растворителя оставался открытым.

Структуру ДИВЭМЛ, полученного в растворителях разной природы н полярности (хлороформе и ацетоне), изучали методами ЯМР и ИК-фурье спектроскопии.

ИК-фурье спектры образцов ДИВЭМЛ, полученных памп в разных раствори Iелях - хлороформе и ацетоне, качественно совпадают и различаются только количеством карбоксильных групп, появляющихся вследствие гидролиза ДИВЭМЛ (получить абсолютно сухой полимер практически не удается). Следовательно, сополимеры, образующиеся в растворителях существенно разной полярности, имеют одну и ту же структуру и 01 дичаю Iся только степенью гидролиза.

По ИК-сиектрам без колебательного расчета невозможно достоверно определить размер кислородсодержащего цикла в звене ДИВЭМЛ. Однозначный вывод о размере цикла можно было сделать лишь па основании анализа данных ЯМР "С-спеклроскошш1.

Спеюры ЯМР ,3С образцов ДИВЭМЛ, полученных в хлороформе и ацетоне (рис.I), содержат 6 основных пиков, которые, по литературным данным, могут бы п.

X Е

ц

А,

Т Е

я о и , вВ , </в Хин. сдСиг, м4

« 20

180

А

К Г\\

во

Липецка?0 ПА.

Рис.! ЯМР"С'-сгюк1 ры (часюга 511.3 МГц) растпорон н деитероацетопе обратноп ДИВЭМЛ, порученных в хлороформе (а) и в ацетоне (б).

опк'сены следующим образом: Л (29,74 м.д.) - метнленовые углероды, Б (44,0 м.д.), В (50,4 м.д.) и Г (54,0 м.д.) - углерод, соединенный с карбоксильной группой, Д (77,5 м.д.) - мешповьш углерод, соединенный с кислородом, Е (171,3 м.д.) и Ж

1 Исследования меюдом ЯМР спектроскопии выполнены в лаборатории физико-химических и ана-лпгическш меюдов исследования полимерен НИНПМ подруководством д.х.к.,проф. П.Я.Слонима

(173,8 м.д.) - карбонильные углероды. Однако отнесение пиков не дает информации о размере кислородсодержащего цикла. В то же время анализ положения, вида и количества пиков карбонильных углеродов позволяет оценить размеры цикла. Действительно, если звено ДИВЭМА содержит 6-членный кислородсодержащий цикл, то окружение ыалеинового ангидрида, находящегося в основной цепи, различно: с одной стороны группа СШ, а с другой СН. В этом случае в ЯМР-спектре должно наблюдаться не менее двух пиков, относящихся к карбонильным углеро-дам. Поскольку ДИВЭМА имеет состав 1:2, его звено содержит еще один ангидридный цикл с иным окружением карбонильных углеродов. Следовательно, число пиков карбонильных углеродов в ЯМР 13С-сиектре ДИВЭМА, содержащего 6-членный цикл, должно быть заведомо больше двух. Реально в спектре наблюдается лишь два пика, относящихся к карбонильным углеродам, т.е. звено ДИВЭМА содержит преимущественно симметричный 5-членный цикл. ЯМР-спектры образцов ДИВЭМА, полученных в хлороформе и ацетоне, полностью совпадают, что позволяет сделать вывод об идентичности структуры ДИВЭМА, образующегося в растворителях существенно разной полярности. Таким образом, с нашей точки зрения, общепринятое мнение о 6-членной "пирановон" структуре сополимера, образующегося в полярном растворителе, в частности ацетоне, является ошибочным.

Изучение кинетики гидролиза ДИВЭМА в воде и его стабильности в am: i one.

Звено ДИВЭМА содержит два ангидридных цикла, которые легко вступают в различные реакции, в том числе подвергаются гидролизу. Данные о стабильности ангидридных циклов ДИВЭМА в растворах в литературе отсутствовали.

Чтобы оценить скорость гидролиза ангидридных циклов ДИВЭМА в водных растворах при комнатной температуре, методом ИК-фурье спектроскопии2 была снята кинетика накопления карбоксильных групп. В исходном сополимере присутствуют преимущественно ( 97,5-98,0 %) ангидридные циклы (I860 и 1773 см1) ( сухой образец - таблетка с КВг), в полностью гидролизованном сополимере -карбоксильные группы (1720 см-1). Практически все кислотные группы связаны Н-связями в линейные иолиассоциаты, о чем свидетельствует положение полосы валентных колебаний карбонила (1720 см !).

2 Все ИК-спектральлые исследования выполнены в лаборатории модификации полимеров ИНХС РАН под руководством д.х.н. Т.Л.Дсбедсвой

На рис.2а представлена кинетическая кривая накопления СООН-групп, полученная из данных ИК-фурье спектров. Исследовать малые степени гидролиза ДИВЭМЛ в воде не удалось, поскольку при временах гидролиза, меньших 2 ч., система оставалась гегерофазнои. На идролиюканнып полимер в воде не растворяется, для его pací ворсин» при комнатной температуре требует ся около 2 ч. За это время аш ндрндные циклы успевают гидролнзоваться на 56% .

соон, % i оо -

60

ы

zf

-г

lgíl/<■■>

1.0

0.5 к*

(6)

30

50

160 180 Время, ч

60

120 180 Время, ч

Рис.2 .Кинетическая кршшя гидролиза ДИВЭМЛ в поде (я) и се полулогарифмическая анаморфоза (6)

Кинетическая кривая накопления карбоксильных групп в полулогарифмических коордшимах представлена на рис.26. В ходе гидролиза эффективная константа скорости уменьшается вплоть до - 80% -ной конверсии ангидридных циклов, мосле чего коиснниа не меняется, и кинетика гидролиза описывается уравнением первого порядка. При этом значение эффективной константы со-

ставляет 1,4 х НН'сег1.

ХС1!

СН,-

по-

-СИ,-

<>-0

О НО О - но

0--Н0

11ри определении стабильности ангидридных циклов в ацетоне наблюдали малью степени гидролиза ангидридных, циклов ДИВЭМА (-10-15%), при которых IV

основным структурным образованием карбоксильных групп являются внутримолекулярные димеры (1732 и 1632 cvr1). Когда ДИВЭМЛ гпдролизован па 30%, в

1.5

нем преобладают полиассоциаты карбоксильных групп ( III), а димеры (IV) уже практически не идентифицируются.

Образование Н-связанных ассоциатов карбоксильных групп должно проявляться в УФ-спектрах, поскольку как в димсрах, так и в тетрамерах возможно возникновение делокализацин электронов. Это было показано при исследовании электронных спектров растворов ДИВЭМА в ацетоне, содержащем разное количество воды ( от 0,1 до 5 мае. %) и в осушенном ацетоне (0,1 мас.%) во времени. В дифференциальных спектр.ах сополимера присутствуют две основные полосы: 209 и 323 нм. Известно, что поглощение в области 209-210 им относится как к ангидридным циклам, так и кислотным группам. Интерес представляла полоса 323 нм, интенсивность которой с ростом содержания воды в ацетоне, сначала увеличивалась, а затем уменьшалась ~ на порядок при соотношении ДИВЭМАгНгО, равном 1:10. В спектрах сополимера в осушенном ацетоне оптическая плотность при 323 нм возрастала вдвое через 20 мин. выдержки растворов, а через 2 ч - эта полоса исчезала; в спектрах водных растворов ДИВЭМА полоса 323 нм отсутствует. Максимум поглощения при 323 нм был зафиксирован для сополимера гидролизованного на ~ 12-15% ( по данным ИК). Кроме того, независимо от влажности растворителя, в спектрах фиксируется ряд полос малой интенсивности: 333, 400, 514 нм. Макималь-ное поглощение при 333 нм наблюдали приэквимольном соотношении

Таблица 1. Стабильность ангидридных циклов ДИВЭМА.

Растворитель Количество гидролизованных ангидридных циклов, % при временах гидролиза 5* мин 120 мин

Вода 2,5 " 56

Ацетон неосушенный (Сп=о>0,22 моль/л) 18 85

Ацетон осушенный (Сню= 0,044 моль/л) 12 28

- время растворения ДНВЭМЛ в ацетоне " - результат получен при экстраполяции к нулю кривой рис. 7:1.

ДИВЭМЛ:Н;0. Сопоставление УФ- и ИК- данных позволяет о шести полосу 323 им к димерам карбоксильных групп, а полосу 333 им - к Н-связанным полиассопиа-там карбоксильных групп.

Изучение стабильности ангидридных циклов в воде и ацетоне в зависимости от степени его осушки показало, что в ацетоне происходит ускорение гидролиза ангидридных циклов по сравнению с гидролизом в воде (табл.!), причем в ацетоне уменьшение концентрации воды ~ в 5 раз приводит к уменьшению скорости гидролиза всего в 1,5 раза, т.е. в ацетоне кЛф гидролиза тем больше, чем меньше в нем воды. Вероятно, это объясняется различиями в структуре асеоциатов вода, возникающими при изменении ее содержания в ацетоне. Чтобы молекула воды могла участвовать в гидролизе, она должна быть свободна, т.е. необходимо приложить энергию для разрушения соответствующих асеоциатов:

вводе 1Ь О ...П-О-Н ...О 11: - 46,8 кДж/моль

в ацетоне Нз О ...Н-О-11 ...0(С11 ч) > ~ 34,7 кДж/моль

(С л-о =0,:2 моль/л)

я ацетоне (С1Ь Ь О ...П-О-11 ...0(СП,) 2 ~ 22.6 кДж/моль

(С п о <0,05 моль/л)

Из приведенных данных видно,что прогоноакцепторный растворитель ацетон как бы "активирует" воду. Наблюдаемая при 120 мин. эксперимента кажущаяся стабилизация ангидридных циклов в осушенном ацетоне, по-видимому, обусловлена недостатком в нем воды для более полного гидролиза. т.к. имеющейся воды ( 0,044 моль/л при степени осушки ацетона до остаточного содержания воды 0,1 мас.% ) хватает только, чтобы гидролизовать не более 30};. ангидридных циклов ДИВЭМА (при концентрации ДИВЭМЛ в ацегоне 0,075моль/л).

Таким образом, при полном растворении (-5 мин.) ДИВЭМЛ уже гидро.ти-зован приблизительно на 10-12 % даже в осушенном растворителе; протекание гидролиза сополимера сопровождается образованием Н-связанных асеоциатов карбоксильных групп разного типа - димеров и полиассоциатов, в полиостью гадролизеванном ДИВЭМЛ все кислотные группы связаны в полиасеоциаты.

Специфика ДИВЭМА, заключающаяся в возможности образования Н-связанных полиассоциатов кислотных групп, определяет ряд его кислотно-основных свойств (например, значения рК.о, превышающие значение этой величины для других сополимеров маленнового ангидрнда) и обуславливает вид кривых потенциометрического тифоьаиия. Для ДИВЭМА не наблюдается двухстадийного

титрования, характерного для сополимеров маленнового ангидрида и обусловленного образованием Н-связанных димеров диссоци1фоваш!ых и недиссоциирован-ных кислотных фупп, поскольку в полностью гидролизованном ДИВЭМА присутствуют только полиассоциагы кислотных групп.

Исследование молекулярно-массовых характеристик ДИВЭМА методом гель-проникающей хроматографии (I ИХ). Молекулярно-массовые характеристики (ММХ) полимеров являются одним из факторов, определяющих их собственную биологическуго активность и ряд свойств макромолекулярных транспортных систем на их основе. Зависимость биологической активности от ММХ ДИВЭМА (противовирусный эффект ДИВЭМА проявляется с М > 30000; противоопухолевая активность сохраняется для фракций с М< 10000; общая токсичность возрастает с М ~ 50000) обусловливает необходимость определения не только средних М, но и распределения по молекулярным массам (ММР), поскольку для синтетических полимеров характерно наличие определенного, часто довольно широкого ММР.

Предпринятые ранее попытки исследования ММХ ДИВЭМА методом ГПХ как в водной среде, гак и в органических растворителях были неудачными. Определить ММХ ДИВЭМА удалось лишь после исчерпывающего метилирования сополимера. Однако предварительное проведение полимераналогичных превращений может искажать ММХ исходного ДИВЭМА. Задача определения ММХ ДИВЭМА без проведения его предварительной модификации до настоящего времени оставалась нерешенной.

Результаты изучения гидролиза сополимера и его кислотно-основных свойств позволили нам решить задачу определении ММХ ДИВЭМА в водных средах методом ГПХ. Для этого необходимо было провести оптимизацию условий анализа но компонентам: составу сополимера, составу элгоепта, выбрать максимально инертный из коммерчески доступных сорбент.

Оптимизации свойств сополимера. ДИВЭМА - полиангидрид; известно, что ангидридные циклы легко гидролизуются, и этим определяется возможность возникновения неоднородности по составу. Получить абсолютно сухой полимер, содержащий только ангидридные циклы, практически не удается ( данные ТГА и ИК-фурье). Соотношение кислотных и ангидридных групп в сополимере определяет его взаимодействие с сорбентом и, следовательно, ГПХ-поведение, поскольку гидродинамический объем становится функцией не только молекулярной массы, но и содержания кислотных групп, т.е. необходимо либо контролировать это соотноше-

ние, либо работать с полимером, содержащим только один тип групп. Поскольку кислотная форма сополимера более устойчива и не подвержена спонтанным изменениям при изменении влажности, целесообразно работать с полностью гидролизо-ванным сополимером.

Выбор элюешпа. Электростатические взаимодействия полнэлектролитов, а также их конформация определяются степенью ионизации ноногенных ipynn (а), которая, в свою очередь, зависит от рН растворителя и его ионной силы. Максимальна» однородность по степени ионизации для поликислот может быть достигнута в двух крайних случаях: при значениях рН < рКо, когда диссоциация кислотных групп практически полностью подавлена; и при значениях рН выше точки эквивалентности поликислоты, когда макромолекулы полностью ионизованы, т.е. при а = 0 и а = 1. Нами был выбран второй случай достижения однородности по степени ионизации - рН выше точки эквивалентности.

Методом потенциометрического титрования были определены значения рКз и рН т очки эквивалентности образцов ДИВЭМА разной молекулярной массы при различных концентрациях фонового электролита. Как и ожидалось, значение рН точки эквивалентности ДИВЭМА не зависит от его молекулярной массы. В качестве рабочего было выбрано рН - 10,3, а элюентом- боратный буфер с этим значением рН.

Выбор сорбента. Сорбент должен удовлетворять следующим требованиям: минимальное число активных групп на поверхности, усчойчивость в щелочных средах. высокая эффективность. Для анализа ДИВЭМА в качестве сорбента был выбран TSK PW gel, поскольку он характеризуется широким диапазоном устойчивости по рН (2 н 12) и достаточно низким содержанием остаточных карбоксильных групп.

П1Х-ана:ич ДИВЭМА. При анализе ДИВЭМА в боратном буфере с рН = 10,3 (рие.За) было установлено проявление неэксклюзионных эффектов: высокомолекулярные фракции полимера исключались из колонок без деления, образцы со средними и низкими Мп ( 13000 и 4100) имели бимодальное распределение. Причина этого заключается в наличии на поверхности сорбента остаточных карбоксильных групп, определяющих проявление электростатических взаимодействий (исключение без деления) и перераспределение полимера между подвижной и eia-шюнарной фазой в результате возникновения Донпановской солевой экпешзии.

Для ус гранения пеэксклюзнонпых эффектов в элюеит добавляли пизкомоле-куляриый электролит - ЫаО. При концентрации 1\'аС1 в элюенте, равной 0,2 моль/л, псэкслюзиопные эффекты подпилены (рие.Зб). Использовать более высокие концентрации соли нежелательно, поскольку возможно возпнкновспне вязкостных эффектов.

1'ис.З. Хромаюграммы образцов Д И ЮМА различных молекулярных масс, 1- Мп = 4100, 2 - Мл = 13000 н 3 -Мп=59000. Условия анализа: элюсит боратный буфер рН=10,3, содержащий (а) - 0; (б) - 0,2М N¡10; система колонок ТЗК-Сс1 3000Р\\', ТЭК-СЫ 5500Р\У с предколонкой -О-ТЙК Р\У; скорость потока 1мл/мин; рефрактометрический детектор .

Корректность выбранных условий анализа была подтверждена оценкой воспроизводимости результатов.

Таким образом, выбранные нами условия проведения анализа можно рас-смат ривать как условия разделения макромолекул по эксклюзнонному механизму.

В табл. 2 представлены данные о влиянии условий синтеза на ММХ образцов Д И ВЭМА, полученных при разных условиях синтеза. Поданным ГПХ (табл.2, рие.Зб.) все исследованные образцы ДИВЭМА, независимо от условий получения, имеют достаточно широкое ММР. Однако при проведении синтеза ДИВЭМА в ацетоне образуется сополимер с более узким ММР, по сравнению с синтезом сто в хлороформе. Проведение синтеза ДИВЭМА, в присутствии в реакционной смеси регуля тора цепи - ТГФ позволяет получать сополимер с заданными молекулярными массами, при этом введение регулятора цепи не исключает образования высокомолекулярных фракции, но позволяет уменьшить нх содержание в полимере, что очень важно для биологической активности ДИВЭМА, т.к. проявление токсичности связано, в основном, с наличием фракций с М> 50000.

Таким образом, изучение физико-химических свойств ДИВЭМА позволило впервые разработать метод ГПХ-анализа его ММХ без предварительной модификации сополимера. Предложенная стратегия выбора условий анализа может быть использована для других сополимеров малеинового ангидрида.

Таблица 2. Влияние условии синтеза на ММХ ДИВЗМА*

Среда синтеза 'ГГФ, мас.% Мп" И Мп'" Миг"* М\у/Мп

хлороформ 0 34 ООО - 15 050 560 700 37.0

ацетон 0 59 ООО"" 0,62 20 650 388 850 18.8

ацетон 1 ¡0 100 0,32 11 200 139 800 12,5

5 8 500 - 7 300 74 900 10,2

20 4 650 0,15 4 800 43 800 9,2

' - определены в борнтном буфере (рН=)0,3), содержащем 0,2 М КаС1 " - данные осмометрии подучены в ацетоне

"' - данные ГПХ (по калибровке, полученной с исполъзванием набора

ПЭГ и ПЭО стандартов). "" - определено методом обулноскопип в ацетоне

Синтез макромолекулярных »раиспортных форм .штраииклшт» наосцопс ДИВЭМА.

Изучение взаимодействия ДИВЭМА с первичными аминами. Одним из способов создания макромолекулярных транспортных форм лекарственных препаратов является проведение химической модификации полимера-носителя, т.е. присоединение лекарственных вешеств к заранее выбраному полимеру. Полнмераналогич-иые превращения сополимеров МА обычно рассматривают как реакции ангидрид-пых циклов и полагают, что при взаимодействии, например, ДИВЭМА с первнч-

пыми аминами образуется амняпая связь. Наличие этой связи доказывали присутствием в ИК-спектрах продуктов реакции полосы 1640 см1.

Однако, как показано выше, даже в специально осушенном ацетоне "сухой" сополимер (2-3% кислотных групп по данным ТГА) успевает гндролизоваться при растворении приблизительно на 10-15%. Следовательно, в сополимере наряду с ангидридными циклами всегда присутствуют карбоксильные группы, что необходимо учитывать при проведении полимераналогнчных превращений ДИВЭМА, по-

В ИК-сиектре реакционной смеси ДИВЭМА с ДА в ацетоне, начиная с соотношения компонентов, равного 1 : 0,1, появляются полосы 1640 см-' и 1550 см1, интенсивность которых растет с увеличением содержания амина в системе, причем интенсивность полосы 1640 см-' меньше, чем 1550 см-1 при всех изученных соотношениях компонентов. Наблюдаемое соотношение интенснвостей полос не отвечает ли i ера турным данным по ИК-спектрам вторичных амидов [полоса 1640 см-1 (Амид 1 ) обычно интенсивнее полосы 1550 см-' (Амид И)]. Кроме того, для вторичных амидов характерно наличие в спектрах полосы в области 1200-1300 см-1 (Амид lil). Имеющаяся в исходном ДИВЭМА интенсивная полоса 1221 см ', которую можно отнести как к колебаниям ангидридного цикла, так и к колебаниям СООН-групн, с ростом концентрации амина уменьшается до практически полного исчезновения при соотношении ДА:ДИВЭМА, равном 4:1. Т.е. образования амидной связи при взаимодействии ДИВЭМА с ДА в данных условиях не происходит. Подтверждением присутствия в продуктах реакции карбокенлат-иона является наличие в ИК-сиектрах в области 1420-1390 см-1 полосы поглощения, интенсивность которой растет с увеличением концентрации амина. Это означает, что полоса 1640 см-' может

О

ОН

скольку состав возможных продуктов расширяется и идентификация по одной полосе 1640 см-' становится неоднозначной. Поскольку рубомищш имеет достаточно сложную структуру (V), взаимодействие ДИВЭМА с первичными аминами изучали спектральными методами на примере модельной реакции с децилашшом (ДА).

быть отнесена к поглощению аммонийного катиона, а 1550 см-' - к карбоксилат-попу, пинанных сильными Н-связями ( 3300, 2500 и 1950 см-').

В УФ-спекграх модельной системы ДИВЭМА-ДА, компоненты которой не имеют собственных понос в длинноволновой области спектра, появляются две 1 руины полос (полосы переноса заряда), причем положение одних с ростом концентрации амина и реакционной смеси (от 0,1 до 10 мольных долей) смещается в коротковолновую область (301-327), а положение других - 44В им ( появляется при мольной доле ампиа 0,5) и 514 им ( нрп 0,87) не зависит от концентрации амина в системе. Появление полос 448 и 514 нм хорошо коррелирует с наблюдаемым при смешении исходно бесцветных растворов компонентов желтым окрашиванием реакционной смеси.

Совокупность экспериментальных фактов указывает на формирование в системе Н-связанных ионных комплексов, в коюрых происходит перенос заряда. Анион и катион в зависимости от соотношения компонентов могут иметь различную структуру:

О

О—С

\ // 011 о

11

VI

()••• я

Ф ®к

о-, -н

VIII

Г с с /гЬ /л.

[ 0 оп о р _

'и © л( N / \ я и

VII

II н

I I

К——к

н

и

©

Подтверждением образования Н-сзязапиых ионных комплексов являются спектральные данные об изменениях, происходящих в системе при нагревании (в массе) и смешении иротолптпческого равновесия при промывке в хорошем для амина растворителе - хлороформе.

Таким образом, при взаимодействии ДИВЭМА с первичными аминами в анетоне при комнатной температуре происходит образование Н-связанных ионных комплексов разного состава и стабильности.

Результаты исследования модельных комплексов ДА с ДИВЭМА позволяли нам предположить, что природа связывания антибиотика с полимером в конъюта-

тух ДИВЭМА-рубомицпн также имеет ионный характер. Коиъюгаты ДИВЭМА с рубо.мицшюм получали в ацетоне при комнатной температуре, ход реакции контролировали методом 'ГСХ. Содержание рубомицина в конъгогате определяли по данным УФ-снектроекопни (по поглощению при длине волны 480 им) и по данным элементного анализа. В ИК-спсктрах конъюгаюв (рис.4) независимо от содержания рубомицина появляется широкая полоса 1560 см1, интенсивность которой растете ростом содержания антибиотика в коныогаге.

рода связывания антибиотика с полимером, действительно, имеет ионный характер, вопреки сложившемуся в литературе мнению об образовании амидпой связи. Такой тип связи в конъюгатах ДИВЭМА с антрациклинами позволяет объяснить свойства этих систем, например, стабильность и предположить, что в физических смесях реаг ентов в растворит елях, в которых возможны реакции обмена, будут образовываться подобные комплексы. Так, в водном растворе физической смеси ДИВЭМА и солянокислой соли рубомицина (4,5 мол.%), действительно, проходит реакция обмена, что подтверждает ИК-фурье спектр полученного продукта, который практически не отлнчае]Ся от спектра соответствующего конъюгага. При этом полученный продукт, как показали биологические испытания в экспериментах на животных, обладает противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью соответ-

Рлс.6 ИК-фурье спектры твердых образцов: ДИВЭМА (I), коиъюгатов ДИЮМА-рубомицип с содержанием рубомицина соответственно I (2), 4,5(3), и И),4 (4) мол.%; солянокислой солиру бомнцнна (5) и его основной формы (6).

Полоса 1640 см-' появляется в виде плеча существенно меньшей интенсивности, чем полоса 1560 см4. Одновременно уменьшается интенсивность полос 1855 и 1780 см1, характерных для колебаний v(C=0) ангидридных циклов, и растет интенсивность полосы 1725 см4, относящейся к полиассоциатам карбоксильных ipynn.

Ma основании полученных результатов можно сделать вывод, что при получении коиъюгатов в описанных условиях при-

сгвующих конъюгатов. Интересно, что факт проявления противоопухолевой активности физических смесей антрациклинов с ДИВЭМА фиксировали и ранее, однако, объяснить не могли.

Синтез макромолекулярнмх транспортных систем с регулируемой скорое гыо отщепления рубочишша и модельных конъюгатов ДИЮМА различной гидрофоб-ноети. Известно, что биологическая активность веществ наряду с другими факторами во многом определяется их относительной гидрофобностью. Можно было ожидать, что изменение птдрофобностн ДИВЭМА путем присоединения гидрофобных блоков позволит улучшить его биологические характеристики, а введение гидрофобных блоков в состав конъюгатов ДИВЭМЛ-рубомицин - получить системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотика вследствие изменения конформации полимерных цепей в растворах.

В качестве модификаторов были выбраны алифатические амины с длиной цепи от трех до десяти атомов углерода и полнэтиленглнколи (ПЭГ) разной молекулярной массы: 300. 600, 1000. Гидрофобность системы определялась длиной углеводородной цепочки и количеством присоединенных боковых групп.

Грехкомпонентные системы ДИВЭМА-рубомицин-модифшсатор получали пугем последовательных полимераналогичных превращений.

Для изучения влияния гидрофобности сополимера на его биологическую активность, а также для исследования свойств трехкомпонептных систем были также синтезированы модельные системы ДИВЭМА-амин и ДИВЭМА-ПЭГ.

Взаимодействие ДИВЭМА с аминами носит количественный характер до соотношений ДИВЭМА:амин, равного 1:2, однако больше 2-х молекул амина на звено ДИВЭМА связать с полимером не удается. При взаимодействии конъюгатов ДИВЭМЛ-рубомицин с аминами увеличение концентрации амина в реакционной смеси приводит к росту содержания его в продукте, но количественного взаимодействия не наблюдается, по-видимому, вел еде I ли е проявления стерических затруднений.

Степень модификации ДИВЭМА ПЭГами зависит от молекулярной массы ПЭГ, причем для ПЭГ 300 максимальная степень модификации не более 8% мол., для ПЭГ1000 - 2-ьЗ % Для конъюгатов ДИВЭМЛ-рубомицин степень модификации ПЭГ не превышает 4,5 мол.% .

Исследование свойств макромолекулирных транспортных систем ДИВЭМА-

рубомнцин.

Исследование структуры полимерных конъюгатов в растворах. Для исследования состояния конъюгатов ДИВЗМА в растворах были выбраны простые и доступные методы, позволяющие качественно оценить свойства растворов конъюгатов: УФ-шектроскогшя, определение поверхностного натяжения, метод солюбили-зацин.

Спектральные характеристики конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин (форма пика, концентрационная зависимость кажущегося коэффициента экстинкции) свидетельствуют об ассоциации рубомицнна в составе конъюгатов даже при низких концентрациях в растворе, а характер концентрационной зависимости кажущегося коэффициента экстинкции позволяет предположить, что в растворах конъюгатов происходит структурирование с образованием, по-видимому, внутримолекулярных мицелл.

Водные растворы ДИВЭМА-рубомицин и модельных систем ДИВЭМА-амин проявляют значительную поверхностную активность. Увеличение гидрофобное! и системы как за счет увеличения количества, так и удлинения липофильной цепи, приводит к более эффективному снижению поверхностного натяжения.

Исследование сошобшшзации водонерастворимого красителя ( Судан III) в растворах модельных систем ДИВЭМА -модификатор обнаружило факт перераспределения его между твердой и жидкой фазами, что свидетельствует об образовании мицеялярной структуры. Эффективность солтобилизации увеличивается с ростом гидрофобности системы. Доказательством образования внутримолекулярных мицелл является постоянство отношения количества солюбилизированного красителя к единице массы полимера при увеличении концентрации последнего в растворах.

Таким образом, на основании результатов изучения свойств растворов конъюгатов ДИВЭМА -рубомицин и модельных систем ДИВЭМА-модификатор можно полагать, что в водных растворах эти системы структурированы и образуют внутримолекулярные мицеллы.

Изучение стабильности полимерных конъюгатов рубомицииа. Анализ литературы показывает, что для проявления противоопухолего действия полимерных форм антрациклинов в клетках-мишенях должно происходить расщепление связи

полимер-антибиотик. В то же время стабильность системы в кровотоке - необходимое условие обеспечения специфичности ее действия. Для достижения эффективности и специфичности действия макромолехулярных транспортных форм антра-циюпшов необходимо получать системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотиков.

Данные о свойствах водных растворов конъмгатов ДИВЭМЛ-рубоминин и модельных конъюгатов ДИВЭМА позволили предположить, что скорость отщепления рубомишша от полимера можно вуринровать, изменяя структуру полимера в растворе за счет изменения его гидрофобноетп.

Стабильность полученных нами конъюгатов ДИВЭМА при разных условиях была изучена методом ВЭЖХ. В условиях, моделирующих физиологические (фосфатный буфер рН=7,2, содержащий 0,9М №С1, Т=37*С), стабилт.ность конъюгатов ДИЮМА-рубомицин определяется содержанием антибиотика в системе: увеличивается с ростом его содержания. Молекулярная масса полимера не оказывает влияния на стабильность конъюгатов.

Известно, что опухолевые ткани отличаются более низкими значениями рН (~ на 0,5-1,0) по сравнению со здоровыми тканями. Эту особенность можно использовать для повышения селективности, создавая системы с рН-чувствительпой связью.

В соответствии с этим была изучена стабильность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицпн в кислых средах. Показано, что скорость отщепления рубомицпна от полимера при рН=6,2 ~ в 3,5 раза выше, чем при физиологических условиях. Можно ожидать, что полученные нами конъюгаты будут обладать некоторой специфичностью действия, выделяя антибиотик более эффективно в опухолевых тканях.

При физиологических условиях стабильность трехкомпонентных систем ДИВЭМА- рубомицнн-моднфнкатор определяется их гидрофобиостью. Для систем ДИВЭМА- рубомищш- дециламин введение и увеличение содержания дециламина в системе приводит к закономерному снижению скорости отщепления рубомлцина (рис.5а). Стабильность конъюгатов, модифицированных ПЭГ разной молекулярной массы, зависит от длины цепи ПЭГ (рие.5б).

Так, при равном содержании рубомицина в конъюгатах ,хтя систем, содержащих короткие цепочки- ПЭГ 600, п=18, скорость отщепления рубомицина оказалась выше, чем для конъюгатов ДИВЭМЛ-рубомицин, а для длинных - ПЭГ 1000,

л=33, существенно ниже, что объясняется, по-видимому, различием в конформацни макромолекул конъюгатов.

Е^ал^ча:.

Рис.5а. Стабильность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицнн (I), модифицированных децнламином (2-4) при физиол01 нческих условиях; содержание ( мол.0,о): рубомицина ( 1-4 )-1,4; децнлзмина 2 - 6,5; 12: 4 - 42.

—I—

200

в»«^ над.

эоо

Рис.56. Стабильность конькматов ДИВЭМЛ-руСомицин (1), модифицированных ПЭГ разной молекулярной массы; содержание (мол. %): рубомицина (1-3) - 1,6; ПЭГ 60(1 О) - 3.2: ПЭГ 1000 (2) - 1,7.

Таким образом, стабильность макромолекулярных транспортных форм ан-грацикцинов на основе ДИВЭМА обусловлена структурой макромолекул конъюгатов в растворах, а именно возможностью мицеллообразования. Образование и стабильность таких мицелляриых структур определяется условиями, в которых возможно возникновение и стабилизация гидрофобных взаимодействий. Изменяя структуру полимера в растворе, можно получать макромолекуляриые транспортные формы антращгклинов с регулируемой скоростью отщепления антибиотиков.

Биологическая активность конъюгатов ДИВ')УГ\.

Противоопухолевая активность конъюгатов ДИВЭМА-рубомицнн была изучена в Онкологическом Научном Центре РАМН в эснериментах па животных на ряде моделей. Показано, что конъюгаты обладают большей широтой терапевтического действия, проявляют высокую цито токсическую активность и низкую токсичность по сравнению со свободным антибиотиком (для конъюгата. содержащего 13,5 мае. % рубомицина, ЬОя> = 300 мг/кг, для рубомицина Ь05ц = 5,1 мг/кг). Выявлен диапазон оптимального содержания рубомицина в конъюгатах - 7-18 мас.%. Установлена значительная активности» ксятъюгатов в отношении плотных опухолей -меланомы В16 и карциномы легкого Льюиса. На модели карциномы .Чыоиса при внутрнбрюшинном введении конъюгатов показано значительное снижение частоты метастазировання в лс! кие ( ~ па 70% по сравнению с контролем), что заслуживает внимания, поскольку данная опухоль резистентна к химиотерапии.

Иммунологические характеристики конъюгатов изучены в МПИОИ им.А.11.Герцена МЗ РФ. Установлено, что действие конъюгатов ДИВЭМ А-амин на гуморальный иммунитет зависит от гидрофобности системы: конъюгаты с пронил-и бутиламином стимулировали гуморальный иммунный ответ в большей степени, чем сам сополимер; увеличение длины гидрофобной цепочки приводит к снижению этого эффекта. Все препараты достоверно стимулировали клеточный иммунитет. Показано, что конъюгаты ДИВЭМА-рубомицин не только не оказывали нммуно-дспрессивного действия на экспериментальных животных, но и вызывали стимуляцию иммунитета и сохраняют интерферошшдуцируюшес действие ДИВЭМА ( при внутрибюшинном введении титр интерферона в крови экспериментальных животных составлял 320 ед/мл).

Полученные данные свидетельствуют о перспективности конъюгатов ДИВЭМА-рубомнцин, т.к. иммунологические нарушения, возникающие при химиотерапии, часто оказывают определяющее влияние на течение и исход заболевания.

Выводы

1. Спектральными методами изучена структура ДИВЭМЛ; показано, что при синтезе в ацетоне и хлороформе образуется сополимер с симметричной пя-тичленной структурой кислородсодержащего цикла.

2. Изучен гидролиз ДИВЭМА и его стабильность в ацетоне; показано, что гидролиз сополимера сопровождается образованием Н-связаниых ассоциатов кислотных групп, наличие которых определяет ряд свойств сополимера.

3. Впервые разработан метод определения молекулярно-массовых характеристик ДИВЭМА. в водных средах, не требующий проведения его предварительной модификации.

4. Изучено взаимодействие ДИВЭМЛ с первичными аминами в ацетоне; показано, что в данных условиях образуются Н-связапные ионные комплексы разного состава и стабильности. Ионный характер связи в конгюгатах ДИВЭМА-рубомицнн определяет стабильность этих систем.

5. Показано, что изменяя структуру конъюгатов ДИВЭМА-рубомицин в растворах путем изменения их гидрофобности, можно получать системы с регулируемой скоростью отщепления антибиотика.

6. Установлено, что конъюгаты ДИВЭМА-рубомицин обладают большей противоопухолевой активностью при существенно меньшей токсичности по сравнению со свободным антибиотиком, "работают" на резистентных моделях опухолей и не проявляют иммунодепресивного действия.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Козлов A.M., Горшкова М.Ю., Стоцкая Л.Л., Кренцель Б.А., Козловский М.М. Модификация биологического действия рубомицина путем его иммобилизации на полимерном носителе. - сб. Химиотерапия опухолей в СССР, Москва, 199i, вып. 57, с. 57-64.