Лазерная интерференционная микроскопия морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

Игнатьев Павел Сергеевич

ЛАЗЕРНАЯ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ МОРФОЛОГИИ И ДИНАМИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Специальность 01.04.21 - «Лазерная физика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2011

2 !> 20;1

4841162

Работа выполнена в лаборатории Светоиндуцированных фазовых переходов Учреждения Российской академии наук Института общей физики им. А.М. Прохорова.

Научный руководитель: доктор физ.-мат. наук, профессор

БУНКИН Николай Федорович

Официальные оппоненты: , ,

* доктор физ.-мат. наук, профессор

АВАКЯНЦ Лев Павлович

кандидат физ.-мат. наук ЗАХАРОВ Станислав Дмитриевич

Ведущая организация: Московский инженерно-физический

институт (Национальный исследовательский ядерный университет)

Защита состоится" IS - ¿scr/i ггл 2011 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д -002.063.01 при Институте общей физики им. A.M. Прохорова РАН адресу: г Москва, ул. Вавилова 38, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей физики им. A.M. Прохорова РАН.

Автореферат разослан " ¿¿f " j^e^hCf/nA 20 [£_г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Маслов И.А.

.......^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Современный уровень развития оптоэлектроники и вычислительной техники позволяет создавать и успешно внедрять новые инструменты исследования биологических объектов. Последние достижения в области компьютерной микроскопии и томографии [1,2] в сочетании с автоматизированными системами распознавания образов широко используются в качестве диагностических инструментов в клинической практике. Основная задача современных методов микроскопии - поиск корреляции между функциональным состоянием отдельной клетки и физическими параметрами ее органелл. Ее решение будет иметь фундаментальное значение для понимания внутриклеточной динамики, а также откроет перспективу разработки новых методов диагностики в молекулярной медицине. Практически важными приложениями таких методов являются скрининг биологически активных соединений и экспресс-диагностика ряда заболеваний на клеточном уровне.

Для решения подобных задач требуются методы, позволяющие проводить количественную оценку метаболических процессов в реальном времени на отдельных клетках или клеточных органеллах. В настоящее время для анализа динамических процессов в клетке используются методы атомно-силовой микроскопии [3], однако вследствие инвазивности экспериментов применение подобных методов для исследования клеток мягких тканей ограничено. Использование современных методов высокоскоростной конфокальной микроскопии [4] при исследовании быстрых динамических процессов также ограничено вследствие низкого пространственного и временного разрешения. Методы флуоресцентной микроскопии [5] требуют применения красителей, которые способны

вносить экспериментальные артефакты и воздействовать на метаболические процессы.

Наиболее перспективными оказываются методы интерференционной лазерной микроскопии, такие как когерентная фазовая микроскопия [6], динамическая фазовая микроскопия [7], оптическая когерентная томография [2] и модуляционная интерференционная лазерная микроскопия [8], которые позволяют осуществлять неинвазивные исследования клеточной морфологии и динамики со сверхвысоким пространственным разрешением.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было развитие методов интерференционной лазерной микроскопии как новой методологической базы для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Предполагалось показать, что использование последних достижений оптоэлектроники позволяет увеличивать быстродействие существующих методов микроскопии при сохранении возможности сверхвысокого разрешения. Результатом работы должны быть реализованные в экспериментальных установках усовершенствованные методы интерференционной лазерной микроскопии (локальная динамическая и модуляционная интерференционная микроскопия), адаптированные для исследования фазовой микроморфологии и внутриклеточной динамики биологических объектов в реальном масштабе времени. Предметом исследования выбраны эритроциты и лимфоциты человека, нервные волокна лягушки, опухолевые клетки и пчелиные споры т.к. их исследования актуальны для биофизики и клинической практики.

Основные задачи работы:

1. Показать, что реализация метода локальной динамической лазерной микроскопии позволит в реальном времени регистрировать внутриклеточные динамические процессы с частотами до 30 Гц;

2. Показать, что применение ИК-лазеров (^=875 нм, ширина линии АХ =0.5 нм) в качестве источников когерентного излучения для интерференционной микроскопии позволить минимизировать степень воздействия лазера на изучаемый объект;

3. Показать, что реализация нового алгоритма расчета фазы методом модуляционной интерференционной лазерной микроскопии позволит увеличить быстродействие экспериментальной установки до 200 кадров в секунду при сохранении возможности сверхвысокого пространственного разрешения.

4. Разработать программное обеспечение для регистрации обработки и анализа динамических процессов в реальном времени;

5. Провести апробацию методов локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии на биологических объектах и показать эффективность их применения для решения ряда исследовательских и диагностических задач;

Методы исследования

Исследования, отраженные в диссертационной работе осуществлялись следующими методами:

- Когерентная фазовая лазерная микроскопия;

- Динамическая фазовая лазерная микроскопия;

- Локальная динамическая лазерная микроскопия;

- Модуляционная интерференционная лазерная микроскопия.

Суть перечисленных методов изложена в 1 и 2 главах диссертационной работы.

Научная новизна

Научная новизна работы заключается в том, что разработанные и использованные автором методы (локальная динамическая и модуляционная интерференционная лазерная микроскопия) позволяют, в отличие от известных [3-5], проводить неинвазивные исследования морфологии и динамики нативных биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением. Предлагаемые автором методы исследования биообъектов позволяют на порядок сократить время исследований, расширить возможности методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии при исследовании внутриклеточной динамики, что отразится на увеличении эффективности применения этих методов для диагностических задач.

Практическая ценность работы

Данные, полученные при исследовании морфологии и динамики внутриклеточных процессов, позволяют судить о функциональном состоянии различных биологических объектов, что может быть использовано для экспресс-диагностики клеточных патологий на ранней стадии развития.

Результаты исследования активации лимфоцитов методом когерентной фазовой лазерной микроскопии успешно применяются для диагностики криза отторжения в трансплантологии в МОНИКИ им • Владимирского.

Реализация и внедрение результатов работы

По результатам работы разработана и утверждена методика оценки жизнеспособности микроспоридий рода Nosema методом лазерной интерференционной микроскопии.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 26 научных работ, 11 из которых опубликованы в журналах, входящих в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: Information technologies in modern Life (Bonn 2007), International Conference on Laser Applications in Life Sciences в 2007 и 2010 годах (LALS-2007 и LALS-2010), III Троицкая конференция «Медицинская Физика и Инновации в Медицине (Троицк 2008), V International Optical Congress "Optics - XXI Century" Topical Meeting on Opto informatics (St. Petersburg 2008); Международная научная конференция МИРЭА Intermatic (Москва 2008), Международный форум Высокие технологии XXI века (Москва 2008, 2009), Международный форум по нанотехнологиям Роснанофорум (Москва 2008, 2009), Московская региональная научно-практическая конференция Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва 2009,2010);

Личный вклад автора

Усовершенствованный при непосредственном участии автора научно-методический аппарат позволяет исследовать морфологию и динамику биообъектов в реальном времени, тем самым расширить возможности методов при исследовании отклика объекта на внешнее воздействие.

Выявленные автором закономерности изменения морфологии и характера внутриклеточных динамических процессов биообъектов при внешних воздействиях позволяют сделать вывод об эффективности применения методов локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии для оценки функционального состояния широкого круга биологических объектов.

Достоверность результатов

Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается отработанными методиками проведения измерений и обработки результатов, а также авторитетом рецензентов, соавторов, консультантов и научных руководителей выполненных работ.

Структура и объем диссертации

Объем работы составляет 184 страницы текста из них 101 рисунок и 160 ссылок на литературу. Диссертация разделена на введение, 3 главы, заключение и библиографический список.

Основные положения, вносимые на защиту

1. Предлагаемые автором методы локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии могут быть использованы для неинвазивного исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.

2. Ввиду относительной простоты и приемлемой точности получаемых результатов методы локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния биологических объектов по ряду морфологических параметров;

3. Результаты проведенных исследований позволяют утверждать что:

- Метод локальной динамической лазерной микроскопии позволяет исследовать внутриклеточные процессы биообъектов в реальном времени и, в частности, оценивать их функциональное состояние.

- Фазовая толщина биологических объектов, регистрируемая методами локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии, является объективным

количественным параметром, отражающим функциональное состояние биологических объектов.

Основное содержание работы

Во введении кратко обоснована актуальность научной проблемы, описано состояние проблемы в настоящее время, обозначены цели и задачи исследования, приведены сведения о публикации результатов диссертационных исследований автора и краткие сведения о внедрении результатов исследования.

В первой главе отражен анализ известного научно-методического аппарата и выявлена необходимость его совершенствования. Описаны основные методы лазерной микроскопии, использующиеся для анализа динамики внутриклеточных процессов в биологических объектах, приведены основные результаты работ по обозначенной тематике. В качестве наиболее перспективных выделены методы интерференционной лазерной микроскопии и показаны достижения в области исследования морфологии и динамики внутриклеточных процессов. На примере методов когерентной фазовой микроскопии и оптической когерентной томографии изложены основные принципы интерференционной микроскопии. В завершении первой главы сформулированы основные выводы и частные задачи исследования:

1. Рассмотренные в главе 1 методы лазерной микроскопии могут использоваться только для узкого класса биообъектов т.к. не обеспечивают оптимального сочетания высокой разрешающей способности, количественного характера получаемой информации и неинвазивности исследования.

2. В особую группу выделяются методы лазерной интерференционной микроскопии [2, 6-8], которые оказываются наиболее универсальными и позволяют получать количественные нормированные на

длину волны данные о морфометрических и динамических параметрах биообъектов со сверхвысоким пространственным разрешением.

Во второй главе приведены описания методов локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии, приведены описания экспериментальных установок, на которых выполнялась работа. Рассмотрены основные вопросы достижения сверхвысокого разрешения. На упрощенной дифракционной модели сверхразрешения показана возможность регистрации фазового сдвига двух точечных источников внутри пятна Эйри. Показаны основные преимущества и недостатки описанных методов, а также перспективы их развития.

Метод локальной динамической лазерной микроскопии

Суть метода локальной динамической лазерной микроскопии (ЛДЛМ) заключается в регистрации в реальном времени флуктуаций фазовой толщины объекта в произвольной точке (точках) его фазового или амплитудного изображения. Основной целью реализации метода является регистрация отклика биообъекта на воздействие ингибиторов в виде изменения его фазовой толщины [7].

Блок-схема макета экспериментальной установки представлена на рисунке 1. В качестве фотоприемной системы был использован модуль, состоящий из 32-х канального фотоприёмника (фотодиодной линейки) и многоканальной платы АЦП, который позволил осуществить многоканальной параллельной ввод интерференционных сигналов для их последующей обработки.

В качестве источника когерентного излучения света был использован полупроводниковый лазерный модуль с длиной волны 875 нм и шириной линии =0.5 нм, оптимальный в задачах неинвазивного контроля.

ц~^Воспроизведени€ ф, ■ Т . звука

! Моду потоп

ИК Лазер Вз1 В!2 Л

[=!•» А- Ш ¿р

и

/

.1. \У '1 г,

Рисунок 1 - Схема экспериментальной установки (а). IV - источник белого света (диод), Вз1, ВьЗ - ИК фильтры, Вя2 - светоделитель, 5 - измеряемый объект, 01, 02 - микрообъективы ЗОх, РТ-фазовый модулятор. Диаграмма определения набега фазы АФ(х,1) в объектном плече интерферометра методом временных интервалов (б).

Набег фазы АФ(х,0, в приближении геометрической оптики линейно связанный с оптической разностью хода (ОРХ) АИ(хлучей в интерферометре, измеряется методом временных интервалов. Суть метода заключается в следующем: при модуляции фазы опорного плеча интерферометра по линейно-периодическому закону (рисунок 1 (б)) на выходе фотоприемника будет наблюдаться квазипериодический сигнал 1Р0, форма которого зависит от разности фаз интерферирующих лучей. Измерение набега фазы сводится к измерению длительности импульса (временного интервала) за период модуляции. Временной интервал формируется от старта опорного сигнала до первого пересечения нуля интерференционного сигнал.

Следует отметить, что при определении сдвига фазы для каждой точки освещенность проходит через максимум производной (рисунок 1 (б)). Такой метод определяет фазу непосредственно и обладает максимальным для данного уровня шумов пространственным разрешением.

Такая техника по существу использует информацию с большого числа интерферограмм, которые создаются в ходе модуляции, но эта информация берется только с тех участков интерферограмм, которые наиболее устойчивы к влиянию шума на координатную привязку. Попутно решается вопрос о редукции объема информации, которая поступает на дальнейшие этапы вычислений.

Интерпретация фазовых изображений Ah(x,t) основана на общепринятом представлении объекта в виде оптической пространственно неоднородной среды с показателем преломления n(x,z,t) в ограниченной области пространства [6,7]. Измеряемая величина Ah в приближении геометрической оптики для тонкой, прозрачной и пространственно неоднородной среды (например, клетки) зависит, от ее физической толщины Я и от рефрактерности - разности показателей преломления <n(x,z,t)> и внешней среды щ [5].

Щх, 0 = г, 0 - «0 (1)

В случае однородной среды выражение (1) принимает вид:

Ah(x,t) = Н(п(х)-п0) (2)

На рисунке 2 приведено фазовое изображение сине-зеленой водоросли Anabaena Variabilis, на которой при использовании метода локальной динамической лазерной микроскопии удалось обнаружить метаболически активные области в области нуклеоида и микроплазмадесмы. Флуктуации фазовой толщины в области нуклеоида имели амплитуду 10 нм с частотой »1.8 Гц.

О 1.0 Z.0 3.0 4.0 5,0 X, мкм

p. «Ль___

i Тв is 20 » jS is ад '' i'- ssN о ) г s * s t, сек f, Гц

Рисунок 2 - Фазовое изображение цианобактерии Anabaena Variabilis (а), профиль фазовой толщины (б) и флуктуации фазовой толщины (в), и спектр флуктуаций (г) регистрируемые методом локальной динамической лазерной микроскопии

Метод модуляционной интерференционной лазерной микроскопии

В основу оригинального метода модуляционной интерференционной лазерной микроскопии (МИЛМ) положен принцип измерения локальных фаз промодулированной объектом световой волны [8]. Учет фаз и контроль поляризации позволяет достичь непревзойденно высокого пространственного разрешения (0,1 нм по вертикали и 15-150 нм в плоскости образца). Уникальной особенностью МИЛМ является принципиально новый алгоритм вычисления фазы отраженного от объекта волнового фронта, сочетающий в себе быстродействие методов фазовых шагов [2] и сверхразрешение фазометрических методов (метод временных интервалов) [6,7]. К настоящему моменту быстродействие МИЛМ составляет 3 кадра в секунду при размере кадра 1280x1024 пикселей и до 200 кадров в секунду при размере кадра 128x128 пикселей. Ожидается, что с переходом на USB 3.0 интерфейс быстродействие увеличится в несколько раз.

Вычисление набега фазы АФ(х,у) осуществляется модифицированным методом фазовых шагов [9]

Регистрируемую на фотоприемнике интерфергорамму можно представить в виде:

/(*, У) = /, (*, у) + /2 (х, у) + 2^1г(х,у)1г(х,у) + ДФ(х, у)) (3)

где 1(х,у) - регистрируемое с помощью камеры распределение интенсивности интерференционной картины; 1/(х,у) /¿(х,^-интенсивности предметного и опорного каналов; /0 - частота полос; ЛФ(х,у) - фазовый набег (ОРХ) на исследуемом объекте, являющейся искомой величиной.

Обозначим А{х,у)-1л(х,у) + 1г{х,у) и В(х,у) = 2^7,(х,у)12(х,у) и перепишем (3) в виде:

1(х,у) = А(х,у) + В(х,у) со8(2^0* + ДФ(х,у)) (4)

Для нахождения функции АФ(х,у) требуется решить уравнение (4), т.е. перейти к решению четырех уравнений, для различных значений фазового сдвига Шс1 (N=0,1,2,3), к = 2к / Я Д- длина волны излучения

1(х, у) = А(х, у) + В(х, у) соч(2^0х + ДФ(х, у) + ЛГЫ) (5)

параметры А(х,у), В(х,у), с! и АФ(х,у) выступают как неизвестные.

Фазовый сдвиг с/ вносится с помощью закрепленного на пьезокерамике зеркала в опорном плече интерферометра.

В результате имеется система из 4-х уравнений:

70 (х, у) = А(х, у) + В(х, у) ссЦ ДФ(х, >')) ^ /, (х, у) = А(х, у) + В(х, у) ссЦ ДФ(х, у + Ы)) /2 (х, у) = А(х, у) + В(х, у) С05(ЛФ(х, у + 2Ы)) (6) /З(л;,д>,0 = А(х,у) + В(х,у)со5(&Ф(х,у + ЗЫ(1)))

Искомая величина разности фаз определяется следующим образом:

ДФ((х, у) = arctg

,/[(/,-/2) + (/0-J3(f0)]-[3(/1-/2)-(J0-/3(?0)

1,+12-10~13(10)

(7)

Где 13(1о) - мгновенное значение интенсивности, определяемое временем экспозиции фотоприемника.

При таком варианте расчета ошибка расчета разности фаз в точках изображения 1(х,у) с минимальной интенсивностью уменьшается за счет регистрации переменной составляющей интерференционного сигнала по аналогии с описанным выше методом временных интервалов. Точки стояния (сдвиг) и закона перемещения опорного зеркала также выбираются исходя из минимизации ошибки определения разности фаз.

Рисунок 3 - Оптическая схема лазерного канала МИЛМ-310. L-лазер, 1/2 WP - полуволновая пластика, PBS - поляризующий светоделитель, BS1, BS2 — светоделитель, 01, 02 - микрообъективы, Ml,М2 — поворотные зеркала, PMI, РМ2 - система управления поляризацией, Т— проекционная

Оптическая схема лазерного канала представляет собой модификацию интерферометра Маха-Цандера с фазовым модулятором в опорном плече. В качестве источника когерентного излучения используется вторая гармоника твердотельного ШгУУОд лазера А. = 532 нм, преобразование осуществлялось на кристалле КОР.

0°

РМ

система, D - фотоприемная матрица

Характеристики лазера ЬСМ-Б-! 11-20 (Лазер экспорт, Россия):

- Длина волны лазерного излучения

- Мощность лазерного излучения ...

- Поперечная мода......................

- Продольные моды.....................

- Ширина спектральной линии......

- Длина когерентности.................

532 нм

.20 мВт

ТЕМ,»

одна продольная мода

..............0,00001 нм

................... >50 м

Управление поляризацией осуществляется при помощи автоматизированных устройств управления поляризацией модуляторов (РМ), позволяющих не только вращать плоскости поляризации объектного и опорного лучей интерферометра, но и изменять тип поляризации на эллиптическую или круговую. Для анализа образцов, обладающих оптической активностью, перед камерой Б устанавливается анализатор.

В работах [8,9] показано, что разрешение методов интерференционной микроскопии превосходит разрешение амплитудных методов, ограниченных известным критерием Рэлея. Латеральное разрешение (в плоскости Х,У) объектнозависимо т.е. зависит от фазового контраста измеряемого объекта и техники его исследования. Экспериментально полученная величина латерального разрешения МИЛМ меняется от 15 нм до 150 нм.

При описании вопросов метрологического обеспечения МИЛМ, в частности вопросов калибровки следует рассмотреть два направления: первое - калибровка по высоте, второе - калибровка поля зрения. Как и в любом другом интерференционном лазерном микроскопе в качестве эталона вертикального смещения выступает длина волны лазерного излучения, в нашем случае это длина волны стабилизированного одночастотного лазера, определенная с точностью 0,05 нм (532,25±0,05 нм). Следовательно, ошибка измерения высоты составляет 0,05 нм. В качестве иллюстрации приведено

изображение эталонной ступеньки высотой 3.5 нм (Рисунок 4), используемой в качестве стандарта высоты, изготовленный на фирме КЬА-Тепког.

Рисунок 4 - Изображение эталонной ступеньки высотой 3,5 нм полученное на МИЛМ (а), профиль ступеньки(б).

Измеренная на МИЛМ высота ступеньки 3.5 нм четко согласуется с паспортом образца.

Калибровка поля зрения МИЛМ производится при помощи тестовых дифракционных решеток 2400 лин/мм, при этом погрешность измерений определяется линейными размерами изображения приходящегося на единичный пиксель фотоприемной матрицы, что для 100 кратного объектива составляет 7 нм.

Дифракционная модель сверхразрешения

На примере простой дифракционной модели показано, что в случае фазовых измерений существует принципиальная возможность достижения сверхрэлеевского разрешения.

Распределение поля 1Дг) для двух монохроматических точечных источников, излучение которых имеет одинаковые амплитуды, но отличается постоянным сдвигом фаз имеет вид.

а

х, цт

0 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0

U(r) = C

' Jj&cír-d)) t Jx{2n(r + d))^

(8)

2яг(г - с/) 2яг(г + d)

Здесь - функция Бесселя, a 2d - расстояние между источниками, измеренное в единицах длин волн.

Функция фазы значений d соответствующих точкам

внутри пятна Эйри показан на рисунке 5. .

Из рисунка 5 видно, что возможность

о

разрешения двух точечных источников при фазовых измерениях определяется * тем, можем ли заметить наклон фазовой кривой внутри пятна Эйри. Проблема состоит в том, что чем ближе эти источники

■У /

\ \ \ PHASE / / , ' INTENSITY NOISK

— -----__ X

06D65 D.SL8 ОБОЙ 0.В1 0 6105 / PHASE ^ 0^45___ÜJ13

Рисунок 5 - Вид фазовой кривой ^(xid,^) внутри пятна Эйри.

расположены друг к другу и чем меньше различаются их фазы, тем меньше наклон этой кривой в центре пятна, где наибольшая интенсивность света. А возрастает этот наклон ближе к краям пятна, где интенсивность падает до нуля. (Рисунок 5) Выводы:

Описанные во второй главе лазерные микроскопы представляют собой эффективный измерительный комплекс, способный решать широкий круг задач по исследованию биологических объектов. Приборы взаимно дополняют друг друга и позволяют получать комплексную информацию об оптических и динамических свойствах исследуемого объекта.

Достигнутые технические характеристики (разрешение, быстродействие) значительно превосходят известные аналоги.

18

Третья глава посвящена экспериментальному обоснованию возможностей методов лазерной интерференционной микроскопии. В этом разделе приведены основные методики и результаты исследования морфологии и динамики различных биологических объектов. Показано, что методы локальной динамической и модуляционной интерференционной лазерной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния клеток крови, нейронов, спор и опухолевых клеток по ряду морфологических признаков и характеру динамических процессов.

В разделе, посвященном исследованию активации лимфоцитов, показано, что методы лазерной интерференционной микроскопии позволяют выявлять изменения фазовых параметров клеток, связанные непосредственно с их активацией [10].

Показано, что лимфоциты в норме имеют фазовую толщину 0 2 %,„« 8 ,0

ДЬ=220±30 нм, диаметр 6,5±0,3 мкм Рисунок 6 " Топ°грамма и

п ¿ч тт фазовый профиль лимфоцита в

(См. Рисунок 6). При активации г ^ ^

, , нормального (а, б) и

лимфоцитов фитогемаглютенином г 4 7

., активированного (в, г)

(ФГА) происходит уменьшение их г '

фазовой толщины до величины АЬ=110±30 нм при неизменном диаметре, а

внутри ядрышка становятся видны многочисленные фибриллярные центры

(ФЦ) (Рисунок 4 в). Следовательно, фазовая толщина лимфоцита является

универсальным количественным параметром, отражающим степень

активации клетки. Результаты исследования успешно применяются в

медицине диагностики отторжения трансплантата.

I ¡¡¡¡¡¡¡В 1

Ь, пт

2 4 в 8 10 12 1« Х.цт

I........ АГ>1 . I Л/ г

ЛЬ \ и

В разделе, посвященном исследованию оксигенирования эритроцитов, показано, что отношение фазовых толщин (форм-фактор) ц = ЛИг/Дй, в различных участках профиля позволяет оценить степень оксигенирования. Для эритроцитов в норме максимум распределения ц располагался в районе 0,3, при оксигенировании клеток максимум распределения смещался в область отрицательных значений до -1,0, что свидетельствует

о возникновении устойчивой газовой фракции по свойствам напоминающей бабстонные

кластеры, описанные в работе [12]. В качестве контрольных экспериментов проведены

измерения эритроцитов при действии угарного газа. Эксперимент показал отсутствие газовой фракции даже после восстановления кислородом.

Исследование спонтанной бабстонного кластера (а) и частицы самоорганизации газовых коллоидного кварца (б), профили кластера

микропузырей в жидкости и частицы кварца (в) и результат методом модуляционной

интерференционной лазерной

0 2 4 6 8 10 12 14

Х,мп-|

Рисунок 7 - Фазовые изображения (а) (в) и профили фазовой толщины (б) (г) нормального и оксигенированного эритроцитов соответственно

ври

тш

: щшшщ

¿V

8 10 12 X. мкм

Рисунок 8 - Фазовые портреты

моделирования (г)

микроскопии показало, что в тонких слоях глубоко очищенной воды и водных растворов электролитов в жидкости спонтанно возникают частицы микронного масштаба. Измерения оптической плотности таких частиц позволяют утверждать, что сами частицы могут быть связаны с газовыми микропузырьками. Получены данные о типе распределения рассеивающих частиц, его ширине и максимуме были использованы при математическом моделировании на основе матрицы светорассеяния. Результат математического моделирования [11] позволяет утверждать, что наблюдаемые частицы - бабстонный кластер из частиц, размером 90-120 нм.

Исследование динамики нервных волокон методом модуляционной интерференционной лазерной микроскопии, показало, что техника двойного вейвлет преобразования позволяет выявить ритмические флуктуации фазовой толщины клетки. Обнаружены ритмические изменения показателя преломления 1,0, 0,3 и 0,8 Гц в районе границы перехвата Ранвье. Подтверждено наличие ритма 1,0 Гц обнаруженного в нейронах [13] связанного с активностью К+ каналов Обнаружена повторяющаяся ритмическая компонента 1,5 Гц (предположительно

движение ворсинок

швановской клетки).

Нестационарность

ритмических компонентов объяснятся тем, что процессы, происходящие в клетке, взаимодействуют друг с

О 20 40 60 80 100 120 Т(тр. ч

Рисунок 9 - Спектрограмма флуктуаций оптической плотности в точке скан линии, соответствующей границе перехвата Ранвье.

другом, в результате чего амплитуды и частоты некоторых ритмов модулируются другими низкочастотными ритмами.

Заключение

Полученные в ходе работы данные, свидетельствуют об

эффективности применения методов локальной динамической и

модуляционной интерференционной лазерной микроскопии для интерактивного анализа морфологии и локальных динамических процессов в

живых микроорганизмах в реальном времени с целью оценки их функционального состояния.

Основные результаты работы

1. Показано, что быстродействие методов лазерной интерференционной микроскопии может быть увеличено до 60 кадров в секунду (для ДДМ) и до 3-200 кадров в секунду (для МИМ), что позволяет исследовать динамические процессы биологических объектов в реальном времени;

2. Показано, что фазовая толщина лимфоцита при его активации снижается с 220 до 100 нм, т.е. эта характеристика является объективным количественным параметром, отражающим степень активации клетки;

3. Показано, что форм-фактор ц эритроцитов позволяет количественно различать эритроциты по степени их оксигенирования (0.33 для нормальных и -1.0 для оксигенированных);

4. В глубоко очищенной воде и в растворе ИаС1 с концентрацией С = 0.01 М обнаружены спонтанно возникающие частицы микронного размера, обладающие признаками бабстонных кластеров.

5. При исследовании нервных волокон подтвердили наличие ритмических изменений показателя преломления на частотах 1.0, 0.3 и 0.8 Гц в районе границы перехвата Ранвье, описанных в [14], обнаружили

повторяющуюся ритмическую компоненту 1,5 Гц (предположительно движение ворсинок швановской клетки), подтвердили наличие ритма 1,0 Гц обнаруженного в нейронах [16] связанного с активностью К+ каналов.

Список литературы:

1. Т. Shimobaba, Y. Sato, J. Miura, M. Takenouchi, Т. Ito, Real-time digital holographic microscopy using the graphic processing unit // Optics Express, Vol. 16, Issue 16, pp. 11776-1178,(2004).

2. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. // Microscopy and Analysis, 87,19-21,(2004).

3. Pelling, A. E., Sehati, S., Gralla, E. В., Valentine, J. S., Gimzewski, J.K., Local Nanomechanical Motion of the Cell Wall of Saccharomyces cerevisiae // Science 304,1147 (2004).

4. T. Collier, P Shen, В Pradier, Kung-Bin Sung, Near Real Time Confocal Microscopy of Amelanotic Tissue: Dynamics of Aceto-Whitening Enable Nuclear Segmentation 2000 // Optics express, Vol. 6, No. 2.

5. Derrick R. Chou, Bradley A. Bower, and Adam Wax, Low-cost, scalable laser scanning module for real-time reflectance and fluorescence confocal microscopy //Applied Optics, Vol. 44, Issue 11, pp. 2013-2018

6. Тычинский В,П., Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук, 171, 6: 649-662, (2001).

7. Тычинский В.П., Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой? // УФН;177(5): 535-552, (2007)

8. V. A. Andreev, К. V. Indukaev, The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy // Journal of Russian Laser Research, V. 24, 220236, (2003).

9. Лопарев A.B., Игнатьев П.С., Индукаев K.B, Осипов П.А., Мазалов И.Н., Козырев А.В., Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований // Измерительная техника, № 11, 60-64, (2009).

10. Игнатьев П.С, Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Василенко И.А., Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной Фазовой Микроскопии // Альманах клинической медицины V.4, 65-67, (2008).

11. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, А. V. Shkirin, P. S. Ignat'ev, К. V. Indukaev, Study of nanostructure of highly purified water by measuring scattering matrix elements of laser radiation // Phys Wave Phen, 16:4,243, (2008).

12. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, A.B. Rubin, E Mosekilde, O.V. Sosnovtseva, Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt.,13 (3)

13.Cohen, L. В., Keynes, R. D. & Hille, В., Light scattering and birefringence changes during nerve activity // Nature 218,438-441,(1968).

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Лопарев А.В, Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Осипов П.А., Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований // Измерительная техника, № 11, 60-64, (2009).

2. Игнатьев П.С, Лопарев А.В., Индукаев К.В., Осипов П.А., Исследование оптических свойств наноструктур методом модуляционной интерференционной микроскопии // Оптический журнал, №1,26-31, (2011).

3. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, Phasemodulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt.,13 (3).

4. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, N.N. Rodionova, A.I. Yusipovich, P.S. Ignatyev, Non-Invasive Study of Live Nerve Fibers using Laser Interference Microscopy // Phil. Trans. Roy. Soc. A, 366,3463-3481,(2008).

5. N. F. Bunkin, К. V. Indukaev, P. S. Ignat'ev, Spontaneous self-organization of microbubbles in a liquid // JETP, 104:3,486, (2007).

6. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, A. V. Shkirin, P. S. Ignat'ev, К. V. Indukaev, Study of nanostructure of highly purified water by measuring scattering matrix elements of laser radiation // Physics of Wave Phenomena, 16:4, 243. (2008).

7. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, V. Shkirin, P. S. Ignatiev, К. V. Indukaev, Nanoscale structure of dissolved air bubbles in water as studied by measuring the elements of the scattering matrix // The Journal of Chemical Physics,130,1, (2009).

8. Бункин Н.Ф., Суязов H.B., Шкирин A.B., Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Определение микроструктуры газовых пузырьков в глубоко очищенной воде по измерениям элементов матрицы рассеяния лазерного излучения // Квантовая Электроника, Том 39, № 4, 367-381, (2009).

9. Бункин Н.Ф., Суязов Н.В., Шкирин А.В., Игнатьев А.С., Индукаев К.В., Кластерная структура стабильных нанопузырей растворенного газа в глубоко очищенной воде // ЖЭТФ, Том 135, Вып. 5, стр. 917, (2009).

10. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Игнатьев П.С., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Растровый метод локализации динамических областей клетки // Российские нанотехнологии, №6,54-59, (2007).

Н.Тычинский В.П., Кретушев А.В., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В., Иванов А.Б., Игнатьев П.С., Филиппова Н.А., Снижение фазовой толщины - характерная реакция ядрышек на токсические воздействия при исследовании методом когерентной фазовой микроскопии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, №4,5-17, (2007).

12. Сохликов А.Б., Игнатьев П.С., Определение жизнеспособности микроспоридий рода Nozema Apis методом Модуляционной Интерференционной микроскопии // Пчеловодство. №6, (2008)

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N00510 от 01.12.99 г. Подписано в печать 16.02.2011 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 057. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ВЫСОКОСКОРОСТНЫХ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ.

1.1 Атомно-силовая микроскопия локальных наномеханических колебаний клеточной стенки хлебопекарных дрожжей.

1.2 Трехмерная флуоресцентная микроскопия многофотонного возбуждения для исследования динамики эритроцитов.

1.3 Высокоскоростная конфокальная микроскопия медленных изменений морфологии кардиомиоцитов и клеток НеЬа.

1.4 Лазерная интерференционной микроскопии как альтернатива традиционным методам оптической микроскопии.

1.4.1 Гильберт-фазовая микроскопия динамики эритроцитов.

1.4.2. Оптическая когерентная томография клеток крови.

1.4.3 Динамическая микрофотометрия фликкера эритроцитов.

1.4.4 Когерентная фазовая микроскопия динамики биологических объектов.

1.4.5 Модуляционная интерференционная микроскопия внутриклеточных и мембранных процессов в нейронах.

ГЛАВА 2. РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ МОРФОЛОГИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДИНАМИКИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.

2.1 Метод локальной динамической микроскопии для регистрации внутриклеточной динамики в реальном времени.

2.1.1. Модуляционный метод воспроизведения низкочастотных флуктуаций фазовой толщины.

2.1.2. Программное обеспечение метода локальной динамической микроскопии.

2.2 Новое поколение высокоскоростных модуляционных интерференционных микроскопов МИМ для исследования биологических объектов.

2.3 К вопросу о разрешении в интерференционной микроскопии.

2.3.1. Дифракционная модель сверхразрешения.

2.3.2 Метод топологических фаз.

2.3.3. Компенсационный метод измерения фазы.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРОБОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛОКАЛЬНОЙ ДИНАМИЧЕСКОЙ И МОДУЛЯЦИОННОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

3.1 Исследование активации лимфоцитов.

3.2 Исследование изменений в морфологии эритроцитов при оксигенировании.

3.3 Определение жизнеспособности спор Nozema Apis методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.4 Исследование спонтанной самоорганизации газовых микропузырей в жидкости методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.5 Локализация «голосов» эритроцитов.

3.6 Исследование динамики нервных волокон методом модуляционной интерференционной микроскопии.

3.7 НСТ-116 Интерактивный диалог с клеткой.

Современный уровень развития оптической электроники и вычислительной техники позволяет создавать и успешно внедрять новые инструменты исследования биологических объектов. Последние достижения в области компьютерной микроскопии и томографии [1-7] в сочетании с автоматизированными системами распознавания образов широко используются в качестве исследовательских и диагностических инструментов в биологии и медицине.

Исследования корреляции между функциональным состоянием отдельной клетки и физическими параметрами ее органелл является одной из актуальных проблем биологии [8-10]. Ее решение будет иметь фундаментальное значение для понимания внутриклеточной динамики, а также откроет перспективу разработки новых методов диагностики в молекулярной медицине. Практически важными приложениями таких методов являются скрининг биологически активных соединений и экспресс-диагностика ряда заболеваний на клеточном уровне [11].

Исследования в области динамики внутриклеточных процессов, таких как кинетика молекулярных моторов [12], кооперативные явления в мембранах и ферментных комплексах [13] и т.п. стимулировали дальнейший прогресс в развитии новых методов «прижизненной» микроскопии. Возникла острая необходимость регистрации динамических процессов в реальном времени.

В настоящее время для анализа динамических процессов в биологических объектах используются методы атомно-силовой микроскопии [14-17], однако вследствие инвазивности экспериментов 5 применение подобных методов для исследования клеток мягких тканей ограничено.

Использование современных методов высокоскоростной конфокальной микроскопии при [19-22] исследовании быстрых (более 10 Гц) динамических процессов также ограничено вследствие низкого пространственного и временного разрешения.

Значительных результатов в исследовании внутриклеточных процессов удалось достичь, используя метод флуоресцентной микроскопии [18]. При известных ограничениях и некой степени инвазивности этот метод позволяет получить количественную информацию о пространственно-временных флуктуациях мембранного потенциала. Однако ощутимых результатов в решении задач диагностики функциональных состояний субклеточной системы, метод традиционной флуоресцентной микроскопии не даёт. Это объясняется, в первую очередь, отсутствием механизма абсолютной нормировки интенсивности флуоресценции, а также сравнительно низкой чувствительностью и малым временным разрешением, которые ограничены в данном методе.

Наиболее перспективными оказываются методы интерференционной микроскопии, такие как когерентная фазовая [33] и динамическая фазовая [37] микроскопия, которые позволяют осуществлять неинвазивные исследования клеточной морфологии и динамики со сверхвысоким пространственным разрешением. Метод динамической фазовой микроскопии оказался весьма универсальным инструментом, охватывающим широкий класс биообъектов и регистрирующим динамические процессы с частотами от 0,05 до 500 Гц. Кроме того, высокое пространственное разрешение прибора, позволяет исследовать динамику отдельных органелл клетки.

В процессе реализации методов динамической фазовой микроскопии была выявлена непригодность классического критерия Релея в фазовых изображениях и возможность сверхразрешения [35].

Применение этих методов в биофизике позволило исследовать пространственно-временные флуктуации в органеллах клеток и поучить ряд принципиально новых научных результатов [38-46].

Целью настоящей работы было развитие методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии интерференционной микроскопии как новой методологической базы для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Следовало показать, что использование достижений оптической электроники позволяет увеличивать быстродействие существующих методов микроскопии для исследования динамики биообъектов в реальном времени. Результатом исследования должна быть новая информация о корреляции фазовой микроморфологии и внутриклеточной динамики с функциональным состоянием биологических объектов.

Предметом исследования были выбраны эритроциты и лимфоциты человека, нервные волокна лягушки, опухолевые клетки и пчелиные споры. Такой спектр объектов не случаен и объясняется желанием расширить возможности метода при исследовании широкого круга биологических объектов; кроме того, подобные исследования представляют актуальность для медицины, биофизики и ветеринарии.

Основные задачи работы:

1. Разработать набор дополнительных модулей к экспериментальной установке для реализации метода локальной динамической микроскопии;

2. Разработать современное программное обеспечение для регистрации обработки и анализа динамических процессов в реальном времени;

3. Реализовать модуляционный метод воспроизведения низкочастотных флуктуаций фазовой толщины;

4. Провести апробацию методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии на биологических объектах и сделать следующие эксперименты:

- Исследовать зависимость морфологии и характера динамических процессов в эритроцитах от степени их оксигенирования;

- Исследовать изменение морфологии лимфоцитов при их активации;

- Исследовать действие метаболических ингибиторов на опухолевые клетки НСТ-116;

- Исследовать различия в морфологии нормальных и инактивированных спор Nosema Apis;

- Определить параметры газовых микропузырей, спонтанно возникающих в водных средах;

- Показать, что применение техники Wavelet анализа позволяет выявлять нестационарные динамические процессы в нервных волокнах;

- Дать биофизическую интерпретацию полученным результатам. Краткая аннотация содержания работы:

Во введении кратко обоснована актуальность научной проблемы, описано состояние проблемы в настоящее время, обозначены цели и задачи исследования, приведены сведения о публикации результатов диссертационных исследований автора и краткие сведения о внедрении результатов исследования.

В первой главе отражен анализ известного научно-методического аппарата для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени и показана необходимость его совершенствования. Описаны основные методы, использующиеся для анализа клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов в биологических объектах, приведены основные результаты работ по обозначенной тематике. В качестве наиболее перспективных выделены методы интерференционной микроскопии и показаны достижения этих методов в области исследования клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов. В завершении первой главы сформулированы основные выводы и частные задачи исследования.

Во второй главе приведены описания методов локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, приведены описания экспериментальных установок, на которых выполнялась работа. Рассмотрено программное обеспечение, разработанное для исследования биологических объектов в реальном времени. Показаны основные преимущества и недостатки описанных методов, а также перспективы их развития.

Третья глава посвящена экспериментальному обоснованию научных результатов работы. В этом разделе приведены основные методики и результаты исследования морфологии и динамики различных биологических объектов. Показано, что методы локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния клеток крови, нейронов, спор и опухолевых клеток по ряду морфологических признаков и динамических характеристик.

В заключении формулируются выводы по основным научным результатам исследования, подчеркиваются элементы новизны и вклада, вносимого автором, приводятся сведения об апробации результатов и опубликовании основных материалов диссертационных исследований, отмечаются вопросы, которые не удалось решить, и которые могут служить предметом дальнейших исследований.

Основные положения, вносимые на защиту

1. Предлагаемый автором приборно-методический комплекс может быть использован для неинвазивного исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.

2. Ввиду относительной простоты и приемлемой точности получаемых результатов методы когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния биологических объектов по ряду морфологических параметров;

3. Результаты проведенных исследований позволяют утверждать что:

- Метод локальной динамической микроскопии позволяет исследовать внутриклеточные процессы биообъектов в реальном времени, что позволяет оценивать их функциональное состояние.

- Фазовая толщина биологических объектов, регистрируемая методами локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, является объективным количественным параметром, отражающим функциональное состояние ряда биологических объектов.

Краткие сведения о публикации результатов диссертационной работы

По результатам диссертационной работы автором опубликовано 26 научных работы, 12 из которых входят в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты диссертационной работы доложены на 10 научно-практических конференциях, 7 из которых международные.

Сведения о внедрении результатов исследования

По результатам диссертационной работы разработаны методические указания по определению жизнеспособности микроспоридий рода Нозема методом лазерной интерференционной микроскопии.

Благодарности

Научному руководителю Бункину Н.Ф. за помощь в организации работ по теме диссертации, консультанту по спец. части Индукаеву К.В. за помощь в модификации экспериментальной установки, консультанту по биологической части Вышенской Т.В. за помощь в проведении экспериментов и интерпретации результатов, сотрудникам кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. Ломоносова и лично профессору Максимову Г.В. за помощь в подготовке экспериментов и биофизической интерпретации полученных результатов, сотрудникам Академической группы Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Владимирского за помощь в приготовлении образцов лимфоцитов, руководству ООО «Лаборатории Амфора» за предоставленный для исследований микроскоп МИМ-310.

Основные результаты работы

1. Показано, что метод локальной динамической микроскопии позволяет исследовать динамические процессы биологических объектов в реальном времени;

2. Показано, что фазовая толщина лимфоцита является объективным количественным параметром, отражающим степень активации клетки;

3. Показано, что форм фактор jul эритроцитов позволяет количественно различать эритроциты по степени их оксигенирования;

4. Показано, что методы лазерной интерференционной микроскопии позволяют в реальном времени оценивать жизнеспособность спор Nozema apis по ряду морфометрических признаков;

5. В глубоко очищенной воде и в растворе NaCl с концентрацией С = 0.01 М обнаружены спонтанно возникающие частицы микронного размера, обладающие признаками бабстонов или бабстонных кластеров.

6. На стенках эритроцита обнаружены температурно-зависимые фолуктуации фазовой толщины на частотах 2.5-2.8 Гц, вызванные поперечными колебаниями самого эритроцита;

7. При исследовании нервных волокон подтвердили наличие ритмических изменений показателя преломления на частотах 1.0, 0.3 и 0.8 Гц в районе границы перехвата Ранвье, описанных в [124-128], обнаружили повторяющуюся ритмическую компоненту 1,5 Гц (предположительно движение ворсинок швановской клетки), подтвердили наличие ритма 1,0 Гц обнаруженного в нейронах [123] связанного с активностью К+ каналов.

8. На границе ядрышка клеток НСТ-116 обнаружены локальные флуктуации фазовой толщины на частотах 2.5 - 3.0 Гц, вызванные предположительно синтезом прерибосом

Научная новизна работы заключается в том, что разработанные и использованные в настоящей работе методы (Локальная динамическая и Модуляционная интерференционная микроскопия) позволяют проводить неинвазивные исследования морфологии и динамики живых биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.

Автором диссертации была доработана экспериментальная установка для регистрации динамических процессов в реальном времени, разработано программное обеспечение для регистрации и обработки динамических процессов в реальном времени, реализован модуляционный метод звукового воспроизведения низкочастотных флуктуаций ОРХ, выполнена серия экспериментов по апробации метода для исследования динамических процессов в биологических объектах.

Полученные в ходе работы результаты применяются для клинической диагностики иммунных нарушений, а также для оценки жизнеспособности спор Nosema Apis.

По теме диссертации опубликовано 23 научных работы, 10 из которых опубликованы в журналах, входящих в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях.

В настоящей работе автору не в полной мере удалось достичь желаемых технических характеристик с использованием достижений оптической электроники и элементной базы. Автором показано, что при использовании современных оптико-электронных компонентов быстродействие и чувствительность метода локальной динамической микроскопии могут быть улучшены как минимум в 5 раз.

В ближайшее время планируется провести серию экспериментов по исследованию динамики стимулированных нейронов и нервных волокон, исследовать взаимодействие бабстонных кластеров с переменным электрическим полем, а также провести исследования морфологии биообъектов в реальном времени с использованием техники автоматического распознавания образов

Заключение

Полученные в ходе работы данные, свидетельствуют о перспективности применения методов локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии для интерактивного анализа морфологии и локальных метаболических процессов в живых микроорганизмах с целью оценки их функционального состояния.

Разработанные экспериментальные установки и программно-методическое обеспечение позволяют в реальном времени исследовать морфологию и динамику широкого класса биологических объектов.

Показана возможность биофизической интерпретации данных и применимость метода для биоскрининга медицинских препаратов.

1. B. Brehm-Stecher, E. Johnson, Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications // Microbiology and Molecular Biology Review.-2004. 68. P. 538-559.

2. Yasuaki Naito, Akio Toh-e and Hiro-o Hamaguchi. In vivo time-resolved Raman imaging of a spontaneous death process of a single budding yeast cell// J. Raman Spectrosc.-2005 36. P/ 837-839.

3. D. Carl, B. Kemper, G. Wernicke, G. von Bally. Parameter-optimized digital holographic microscope for high-resolution living-cell analysis // Appl. 0pt.-2004. 43. P. 6536-6544.

4. M. Lazebnik, D. Marks, K. Potgier, R. Gillete, S. Boppart. Functional optical coherence tomography for detecting neural activity through scattering changes // Opt. Lett. 28(14): P. 1218-1220.

5. G. Vishnyakov, G. Levin, V. Minaev, V. Pickalov, A. Likharev, Tomographic interference microscopy of living cells // Europ. J. of Microscopy and Analysis.-2004. 87. P. 19-21.

6. Kleinfeld, A. Laporta, Detection of action potentials in vitro by changes in refractive index // In: Light scattering in neural tissue function, Eds D. Rector and J. George, Humana Press Inc. (2003).

7. Y. Huang, T. Karashima, M. Yamamoto, T. Ogura, H. Hamaguchi. Raman spectroscopic signature of life in a living yeast cell. // J. Raman Spectrosc.-2004. 35. P. 525-526.

8. В. Rappaz, P. Marquet, E. Cuche, Y. Emery, C. Depeursinge, P. Magistretti. Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cell with digital holographic microscopy.// Optics Express.-2005.13 (23). P. 9361-9373.

9. C.A. Пикин. Структурные превращения в жидких кристаллах, //Наука, Москва, 1981.

10. Lu Н.Р., Xun L., Xie X.S. Single-molecule enzymatic dynamics // Science. 1998. Vol. 282. P. 1877-1882.

11. Mehta A. D., Rief M., Spudich J. A., Smith D. A., Simmons R. M. Single-Molecule Biomechanics with Optical Methods // Science. -1999. Vol. 283. P. 1689-1695.

12. Pelling A. E., Sehati, S., Gralla, E. В., Valentine, J. S., and Gimzewski, J.K. Local Nanomechanical Motion of the Cell Wall of Saccharomyces cerevisiae. // Science.-2004. 304, P. 1147.

13. Pelling A. E., Sehati, S., Gralla, E. B. and Gimzewski, J. K. Time Dependence of the Frequency and Amplitude of the Local Nanomechanical Motion of Yeast// Nanomedicine.-2005. 1.P.178.

14. Pelling, A. E., Veraitch, F. S., Chu, C., Nicholls, В. M., Hemsley, A., Mason, C. and Horton, M. A. Mapping correlated membrane pulsations and fluctuations in human cells // J. Molecular Recognit. 2007.

15. Haupt, B. J., Pelling, A. E. and Horton, M. A. Integrated Confocal and Scanning Probe Microscopy for Biomedical Research // TheScientificWorldJOURNAL.-2006. 6. P. 1609.

16. David M. Grant, J. McGinty, E. J. McGhee, T. D. Bunney, D. M. Owen. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events //Optics Express.-2006. Vol. 15. Issue 24. P. 15656-15673.

17. Derrick R. Chou, Bradley A. Bower, and Adam Wax, Low-cost, scalable laser scanning module for real-time reflectance and fluorescence confocal microscopy//Applied Optics. Vol. 44. Issue 11. P. 2013-2018.

18. M. Straub, S. W. Hell. Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precision using a multifocal multiphoton microscope//App. Phys. Lett.-1998. 73. P. 1769-1771.

19. T. Collier, P Shen, В Pradier, Kung-Bin Sung. Near Real Time Confocal Microscopy of Amelanotic Tissue: Dynamics of Aceto-Whitening Enable Nuclear Segmentation 2000 // Optics express. Vol. 6. No. 2.

20. T. Tanaami, S. Otsuki, N. Tomosada, Y. Kosugi, M. Shimizu, and H. Ishida. High-Speed 1-Frame/ms Scanning Confocal Microscope with a Microlens and Nipkow Disks // Appl. 0pt.-2002. 41. P. 4704-4708.

21. T. Ikeda, G. Popescu, R.R. Dasari. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems // Opt. Lett.-2005. 30.10. P. 1165-1168.

22. N. Lue, G. Popescu, T. Ikeda, R. Dasari, K. Badizadegan, M. Feld. Live cell refractometry using microfluidic devices // Opt. Lett. 31(18). P. 2759-2761.

23. Y. Park, G. Popescu, K. Badizadegan, R. Dasari, M. Feld. Diffraction phase and fluorescence microscopy // Opt. Expr.-2006 14(18). P. 8263-8268.

24. Popescu G., Badizadegan K., Dasari R.R., Feld M.S. Observation of dynamic subdomains in red blood cells // J. Biomed. Opt. 2006. V. 11. № 4. P. 040503.

25. Вест Ч. Топографическая интерферометрия // M.: Мир, 1982.-С.504.

26. Метелин В.Б., Минаев B.JL, Валов A.JL, Конрадов А.А., Василенко И.А., Бабакова С.В. Компьютерная фазовоинтерференционная микроскопия в биологии и медицине // Сборник научных трудов. -2003.- г.Красноярск.

27. Левин Г.Г., Ковалев А.А., Минаев В.Л., Сухоруков К.А. Оценка точности измерения сухой массы клетки на автоматизированном интерференционном микроскопе // Измерительная техника.- 2004.- С.62-67.

28. Левин Г.Г., Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н. Когерентные осцилляции состояния молекул белка в живых клетках // Цитология. — 2005. Т.47. №4. С.348-356.

29. Власов Н.Г. Получение изображений на основе использования когерентных свойств зондирующего излучения. // ЖНПФ,- 1999. Т.4. №5. С.67-74.

30. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. Tomographic interference microscopy of living cells //Microscopy and Analysis.-2004. 87.p. 19-21.

31. Carol J. Cogswell, Kieran G.Larkin, Hanno U. Klemm. Fluorescence microtomography: Multi-angle image acquisition and 3D digital reconstruction // Proc. SPIE.- 1996.- V.2655.- P.109-115.

32. Кононенко B.JI. Фликкер эритроцитов. 1. Обзор теории и методов регистрации // Биол. мембраны. -2009. Т. 26. № 5. С. 352-369.

33. Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. Когерентное и некогерентное оптическое зондирование динамических флуктуаций формы эритроцитов // Изв. РАН. Сер. физическая.- 1999. Т. 63. № 6. С. 1166— 1172.

34. Кононенко В.Л., Шимкус Я.К. Спонтанные и вынужденные колебания клеточной мембраны нормальных эритроцитов человека: отсутствие резонансных частот в области 0.03-500 Гц // Биол. мембраны. -2000. Т. 17. № 3. С. 289-301.

35. Kononenko V.L. Flicker spectroscopy of erythrocytes: a comparative study of several theoretical models // Proc. SPIE. -1994. V. 2082. P. 236-247.

36. Кононенко В.Л. Соотношение регулярности и хаотичности в динамике индивидуальных эритроцитов: Дис. д-ра физ.-мат. наук. М.: ИБХФ РАН, 2007. С. 288.

37. Kononenko V.L. Dielectro-deformations and flicker of erythrocytes: fundamental aspects of medical diagnostics applications // Proc. SPIE. -2002. V. 4707. P. 134-143.

38. Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия внутриклеточных процессов // Успехи физических наук,- 2001. 171. 6. С.649-662.

39. Лопарев А.В., Кретушев А.В., Тычинский В.П. Когерентная фазовая микроскопия: новый метод идентификации внутриклеточных структур по их оптическим и морфометрическим параметрам// Биофизика. 53. 2. С. 299-304.

40. В. П. Тычинский. Сверхразрешение и сингулярности в фазовых изображениях//УФН.-2008. 178.11. С. 1205-1214.

41. А.В. Кретушев, В.П. Тычинский. Сверхразрешение в сингулярных точках фазовых изображений // Кв. Электроника.-2002. 32.1. С. 66-70.

42. Тычинский В.П. Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой? // УФН.- 2007.177. С. 535-552.

43. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya T.V., Tikhonov A.N. A dynamic phase microscopy study of optical characteristics of individual chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta.-2004. 1665. C. 57-64.

44. Tychinsky V.P., Kretushev A.V., Vyshenskaya Т. V., Tikhonov A.N. Coherent phase microscopy in cell biology: visualization of metabolic states // Biochim. Biophys. Acta.-2005. 1708. C. 362-366.

45. Тычинский В.П., Д. Вайсс, Вышенская Т.В., Ягужинский Л.С., Никандров С.Л. Кооперативные процессы в митохондриях: регистрация методом динамической фазовой микроскопии // Биофизика. 45(5). С. 870-877.

46. Тычинский В.ПКретушев., А.В., Клемяшов И.В., Вышенская Т.В., Штиль А.А., Зацепина О.В. Когерентная фазовая микроскопия -новый подход к исследованию физиологического состояния ядрышка// ДАН.-2005. 405(4). С. 432-436.

47. Tychinsky V. P., Kretushev A.V. , Klemyashov I.V., Reshetov I.V., Vyshenskaja T.V., Shtil A.A. The nucleolus and cellular stress: analysis by coherent phase microscopy, Tech. Proc. of the 2006 // Nanotechnology Confer. Boston, V. 2 (2006).

48. Tychinsky V. P., On superresolution of phase objects. // Opt. Comm.-1989. 74(1,2). C. 41-45.

49. Тычинский В.П., Тавров A.B., Шепельский Д.О., Щучкин А.Г., Экспериментальное подтверждение возможности сверхразрешения фазовых объектов // Письма в ЖЭТФ.-1991. 17(22) С. 80-83.

50. Vishnyakov G.N., Levin G.G, Minaev V.L., Pickalov V.V., Likhachev A.V. // Microscopy and Analysis.-2004. 87.P. 19-21.

51. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, A.B. et al. Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt. 2007. Vol. 3. № 13.

52. Максимов Г.В. Регистрация методом ДФМ характерных частот флуктуаций фазовой высоты участков миелинового нервного волокна в покое и при стимуляции // Биофизика.-2002. 47. 2 С. 345-351.

53. Ерохова JI.A., Новиков С.М., Лазарев Г.Д., Казакова Т.А., Орлов Д.А., Индукаев К.В., Максимов Г.В. // Бюл. эксп. биол. и мед.-2005. 140. С. 237.

54. Sosnovtseva O.V., Pavlov A.N., Brazhe N.A., Brazhe A.R., Erokhova L.A., Maksimov G.V., Mosekilde EM Phys.Rev.Lett.-2005. 94. C. 218103.

55. Каюшин Л.П. и Людковская Р.Г. Изучение интерференционным методом упруго-объемных изменений в нерве при возбуждении. ДАН.-1995. 2. С. 253-255.

56. Колье O.P. Максимов Г.В. Раденович Ч.Н. // Биофизика ритмического возбуждения. Издательство МГУ 1993.

57. V. A. Andreev, К. V. Indukaev. The problem of subrayleigh resolution in interference microscopy., Journal of Russian Laser Research, V. 24, November 3, 2003.

58. A.B. Лопарев, П.С. Игнатьев, K.B Индукаев, П.А. Осипов, И.Н. Мазалов, A.B. Козырев. Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований. // Измерительная техника.- 2009. № 11. С. 60-64.

59. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев A.B., Осипов П.А. Модуляционная интерференционная микроскопия // Материалы конференции XI Международного форума Высокие технологии XXI века. М., 2008. С. 78-80.

60. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев A.B., Осипов П.А. Новое поколение лазерных микроскопов для медико-биологическихисследований // Материалы конференции цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. М.2009. С. 34-36.

61. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Лопарев А.В., Осипов П.А. Новые аспекты применения МИМ 310 для нанометрологии // Материалы конференции «Высокие технологии XXI века, М. 2009. С 17-22.

62. Борн М., Вольф Э. Основы оптики / Наука, 1970, С.720.

63. Солимено С., Крозиньяни Б., Ди Порто П. Дифракция и волноводное распространение оптического излучения / М, Мир, 1989, С.664.

64. Allen R.D., Travis J.L., Allen N.S., and Yilmas H. // Cell Motility.-1981. 1.275 C. 291.

65. Allen R.D., and Allen N.S. //J. Microsc.-21983.3.P.129.

66. Allen R.D// Ann.Rev.Biophys.Chem.-1985 14, P. 265.

67. Innoue S., Spring K.R. Video Microscopy: The Fundamentals // New York: Plenum Press, 1997.

68. Weiss D.J., and Maile W. Electronic Light Microscopy, New York, Wiley-Liss, 105 (1993); in Light Microscopy in Biology A Practical Approach (Ed. A.J. Lacey) (Oxford University Press, 1999).

69. Schneider et al., in Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes, Vol.2 (ed. J. Slavic) (New York: Plenum Press, 1998).

70. Баранова Н.Б., Зельдович Б ЯЛ ЖЭТФ-1981, 80, С. 1789.

71. Баранова Н.Б., Зельдович Б.Я., Мамаев А.В. // ЖЭТФ.- 1982. 83. С. 1702.

72. Bazhenov V.Yu., Soskin M.S., Vasnetsov M.V.// J.Mod.Optics.-1992,39, P. 985.

73. Basistiy I.V., Bazhenov V.Yu., Soskin M.S., Vasnetsov M.V. // Opt. Commun.-1993. 103. P. 422.

74. Даршт М.Я., Зельдович Б.Я., Катаевская И.В., Кундикова Н. Д. // ЖЭТФ.-1995. 107. С. 1468.

75. G. Yishnyakov, G. Levin, V. Minaev, V. Pickalov, A. Likharev, Tomographic interference microscopy of living cells // Europ. J. of Microscopy and Analysis.-2004. 87. P. 19-21.

76. Кардашова 3.3., Лезвинская E.M., Метелин В.Б. Современный взгляд на диагностику и лечение эритродермических вариантов злокачественных лимфом кожи // Лечащий врач. -2007. 9. С.22-25.

77. Ватазин А.В., Валов А.Л., Василенко И.А., Метелин В.Б. Параметры иммунокомпетентных клеток как критерий ранней диагностики отторжения ренального трансплантата // Вопросы современной клинической медицины. Пенза. ПТУ. 2006. С.58-59.

78. Korcakova L., Pekarek J., Rovensky J., Trnavsky K., Lukac J. Lymphocyte nucleolar activation as a marker of autoimmune disorders // Immunology. 31. P. 803-805.

79. Kysela K., Philimonenko A. , Philimonnenko, Janacek J., Kahic M., Hozak P. Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activety of the cell. Histochem // Cell Biol. -2005. 124. P. 347-358.

80. T.Karu. Low power laser therapy // Biomedical photonics handbook. Ch.48.CRC Press LLC, 2003.

81. Игнатьев П.С., Вышенская Т.В., Тычинский В.П., Василенко И.А. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной Фазовой Микроскопии // Альманах клинической медицины. -2008. Т.4. С. 65-67.

82. Игнатьев П.С., Василенко И.А.,. Вышенская Т.В., Метелин В.Б, Тычинский В.П. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной Фазовой Микроскопии // Вестник РАМН (принято в печать).

83. Ignatyev P.S., Tychinsky V.P., Vyshenskaya T.V., Metelin V.B., Vasilenko I.A. Investigation of lymphocyte activation by coherent phase microscopy // Proceedings of the topical meeting on optoinformatics, St. Petersburg, 2008.

84. Игнатьев П.С., Тычинский В.П., Вышенская T.B., Василенко И.А., Метелин В.Б. Исследование активации лимфоцитов методом Когерентной фазовой микроскопии // Материалы VI Международной научно-технической конференции Intermatic-2008. С. 157-159.

85. Е. Evans, Y.C. Fung, Improved measurements of erythrocyte geometry // Microvascular Researc.-1972. 4(4) P. 335-338.

86. S.M. Lewis, B.J. Bain, I. Bates, Dacie and Lewis practical hematology, 9th ed. Churchhill Livingstone, (2001)

87. D. Faber, M. Aalders, E. Mik, B. Hooper, M. Gemert, T, Leeuwen, Oxigen saturation-dependent absorption and scattering of blood, //Phys. Rev. Lett.-2004. 93. P. 9.

88. B. Rappaz, A. Barbul, F. Carriere, J. Kuhn, P. Marquet, R. Korenstein, C. Depeursinge, P. Magistretti, Erythrocyte volume and refractive index measurement with a digital holographic microscope // Proc. SPIE.-2007 v. 6445.

89. С. Curl, С. Bellair, В. Allman, A. Roberts, К. Nugent, P. Harris, L. Delbridge. Measurement of red blood cell volume changes in response to osmotic stimuli using quantitative phase microscopy // QPmbioApp.12.

90. Сохликов А.Б., Игнатьев П.С., Лазерная интерференционная микроскопия при нозематозе // Пчеловодство. 2008. №6. С. 31-33.

91. L. Bailey, Effect of Fumagillin upon Nosema apis (Zander) // Nature. 171. P. 212 213.

92. P. N. Pusey and W. van Megen, // Phys. Rev. Lett.- 1987. 59. P.2083.

93. K. Schatzel and B. J. Ackerson// Phys. Rev. E. -1993. 48. P.3766.

94. J. L. Harland and W. van Megen // Phys. Rev. E.-1997. 55.P. 3054(1997)

95. P. Jiang and M. J. McFarland // J. Amer. Chem. Soc.-2004. 126,1378.

96. H. Ф. Бункин, Ф. В. Бункин// ЖЭТФ. -1992. 100. С 512.

97. Н. Ф. Бункин, Ф. В. Бункин //ЖЭТФ.-2003. 123. 828.

98. N. F. Bunkin, К. V. Indukaev, P. S. Ignat'ev. Spontaneous self-organization of microbubbles in a liquid // Sov Phys JETP. -2007. 104:3. P. 486.

99. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, A. V. Shkirin, P. S. Ignat'ev, К. V. Indukaev. Study of nanostructure of highly purified water by measuring scattering matrix elements of laser radiation // Phys Wave Phen. -2008. 16:4. P. 243.

100. N. F. Bunkin, N. V. Suyazov, V. Shkirin, P. S. Ignatiev, К. V. Indukaev. Nanoscale structure of dissolved air bubbles in water as studied by measuring the elements of the scattering matrix // The journal of chemical physics.-2009.130. 1.

101. S. Rao, S. Balint, B. Cossins, V. Guallar, D. Petrov, Raman Study of Mechanically Induced Oxygenation State Transition of Red Blood Cells Using Optical Tweezers // Biophysical Journal. -2009 V. 96. 1. P. 209216.

102. P. Suga'r, K. Blasko, S. Gyorgyi, L. V. Shcagina, V. V. Malev, Cooperative Binding of Primycin and Gramicidin on Erythrocyte Membranes. A Cation Transport Study // Molecular Membrane Biology. -989. Vol. 8, No. l.P 1-10.

103. G. Popescu, Y. Parka, W. Choia, R. Dasaria, M. Felda, K. Badizadegan, Imaging red blood cell dynamics by quantitative phase microscopy // Blood Cells Molecules and Diseases.-2008. Vol. 41. Issue 1. P. 10-16.

104. Тычинский В.П., Вайсс Д., Вышенская Т.В., Ягужинский Л.С., Никандров С.Л.// Биофизика.-2000. 45. Р. 870.

105. Максимов Г.В., Никандров C.JL, Лазарева Е.С., Тычинский В.П., Рубин А.Б. // Бюл. эксп. биол. и мед.-2001. 131, С. 539.

106. Максимов Г.В., Никандров С.Л., Лазарева Е.С., Тычинский В.П. // Биофизика 47, 345 (2002)

107. Addison, P. S. The illustrated wavelet transform handbook. London, UK: IOP Publishing Ltd. 2002.

108. Allen, R. D. New observations on cell architecture and dynamics by video-enhanced contrast optical microscopy // Annu. Rev. Biophys. Cheml985. 14. P. 265-290.

109. Cohen, L. В., Keynes, R. D. & Hille, В. Light scattering and birefringence changes during nerve activity//Nature 1968. 218. C. 438-441.

110. Brazhe, N. A., Erokhova, L. A., Churin, A. A. & Maksimov, G. V. The relation of differentscale membrane processes under nitric oxide influence // J. Biol. Phys.-2005. 31. P. 531-546.

111. Brazhe, N. A., Brazhe, A. R., Pavlov, A. N., Erokhova, L. A., Yusipovich, A. I., Maksimov, G. V.,Mosekilde, E. & Sosnovtseva, О. V. Unravelling cell processes: interference imaging interwoven with data-analysis // J. Biol. Phys. -2006. 32. P. 191-208.

112. A.R. Brazhe, N.A. Brazhe, G.V. Maksimov, P.S. Ignatyev, A.B. et. al. Phase-modulation laser interference microscopy: an advance in cell imaging and dynamics study // J Biomed Opt. 2007. Vol. 3. - № 13. -034004

113. Иванов А.Б., Кретушев А.В., Игнатьев П.С., Тычинский В.П. и др. Растровый метод локализации динамических областей клетки // Российские нанотехнологии. 2007. - №6. - С. 54-59

114. Ivanov, A. Kretushev, P. Ignatiev, V. Tychinsky. Digital phase image processing of live cells: mapping of metabolic active areas // Proceedings of the topical meeting on optoinformatics, St. Petersburg. 2008.

115. P. Ignatyev, A. Ivanov, A. Kretushev, V. Tychinsky .Dynamic phase microscopy: a new method of theinteractive real-time investigations of local metabolic activity // Proceedings, Laser Applications in life sciences Moscow. 2007. TuL 03P4.

116. A. Ivanov, P. Ignatyev, A. Kretushev, V. Tychinsky. Coherent Phase Microscopy: New technique for location of intracellular dynamic processes // Proceedings, Laser Applications in life sciences . Moscow. 2007. TuL 03P7

117. Ю.С. Ченцов, Введение в клеточную биологию, // ИКЦ «Академкнига», 2004.

118. Yu-li, K. Hahn, R. Murphy, A. Horwitz. From imaging to understanding: Frontiers in live cell imaging // J. Cell Biol. 174 (2006) 481484.

119. T. Hattori, K. Watanabe, Y. Uechi, H. Yoshioka, Y. Ohta. repetitive transient depolarizations of the inner mitochondrial membrane induced by proton pumping // Biophys. J. 88(3): 2340-2349 (2005).

120. Donnert, G., J. Keller, R. Medda, M. A. Andrei, S. O. Rizzoli, R. Liihrmann, R. Jahn, C. Eggeling, S. W. Hell, Macromolecular-scale resolution in biological fluorescence microscopy// PNAS 103 ;11440-11445 (2006).

121. B. Rappaz, P. Marquet, E. Cuche, Y. Emery, C. Depeursinge, P. Magistretti, Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cell with digital holographic microscopy // Optics Express 2005, 13 (23). P. 9361-9373.

122. J. Millerd, N. Brock, J. Hayes, M. North-Morris, M. Novak, J. Wyant, Pixelated phase-mask dynamic interferometer // Proc. SPIE.- 2005. 5531. P. 304-316.

123. R. Langoju, A. Patil, P. Rastogi, Super-resolution Fourier transform method in phase shifting interferometry // Optics Express.- 2005. 13(18). P.7160-7173.

124. T. Ando, N. Kodera, E. T. Maruyama, K. Saito, A. Toda, A highspeed atomic force microscope for studying biological macromolecules, // PNAS. -2001. 98 P. 12468-12472.

125. H. Fried, U. Kutay, Nucleocytoplasmic transport: taking an inventory // Cellular and Molecular Life Sciences. -2003. 60. P. 1659-1688.

126. I. Raska, P. Shaw, D. Cmarko, Structure and function of the nucleolus in the spotlight // COCEBI.- 2006. 18: P. 1-10.

127. C. Mayer, H. Bierhoff, I. Grummt, The nucleolus as a stress sensor, // Genes&Development.-2005. 19. P. 933-941.

128. Grummt. Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus // Gen&Dev.- 2003. 17. P. 16911702.

129. M. Dundr, Urs Hoffmznn-Rohrer, Quyue Ни, I. Grummt, L. Rothblum, R. Phair, T. Misteli. A kinetic framework for mammalian RNA polymerase in vivo // Science.- 2002. 298. P. 1623-1626.

130. D. Jackson, A. Pombo, F. Ibora. The balance sheet for transcription: an analysis of nuclear RNA metabolism in mammalian cells, // FASEB 2000. 14. P. 242-254.

131. Тычинский В.П., Голубев C.C., Вышенская T.B., Кретушев А.В., Ягужинский JI.C. Электро-оптический эффект в многослойных фосфолипидных мембранах // Биологические Мембраны.- 2005. 22(2). С. 131-136.

132. М. Gurau, G. Kim, Soon-Mi Lim, F. Albertorio, H. Fleisher, P. Cremer, Organization of water layers at hydrophilic interfaces // ChemPhysChem. -2003. 4. P.1231-1233.

133. S.J. Chen, K. Dill, RNA folding energy landscapes // PNAS.-2000. 97 .P.133-138.

134. L. Li, L.A. Mirny, E.I. Shakhnovich, Kinetics, thermodynamics and evolution of non-native interactions in a protein folding in folding nucleus // Nat. Struct. Biol. -2000. 7. C. 336-342 ().

135. C.A. Пикин, Структурные превращения в жидких кристаллах // Наука, Москва. 1981.

136. М. Derenzini, G. Pasquinelli, M.-F. O'Donohue, D. Ploton, Structural and functiomal organization of ribosomal genes within the mammalian cell nucleolus // J. of Hystochem&Cytochem.- 2006. 54(2). P. 131-145.

137. M. Dundr, T. Misteli, Functional architecture in the cell nucleus // Biochem. J. -2001. 356 P. 297-310.

138. T. Cheutin, M,-F. O'Donohue, A. Beorchia, M. Vandelaer, H. Kaplan, B. Defever, D. Ploton, M. Thiry. Three-dimensional organization of active rRNA genes within the nucleolus // J. of Cell Science 115: 3297-3307 (2002).

139. Yun Wah Lam, L. Trinkle-Mulcahy, A. Lamond, The nucleolus //J. of Cell Science.-2005. 118. P. 1335-1337.

140. R. White. RNA polymerases I and III, growth control and cancer // Nature Reviews, Molecular Cell Biology.-2005. P. 69-78.

141. Andreev, V. A. Indukaev, K. V. Phase modulation microscope MIM-2.1 for measurements of surface microrelief. General principles of design and operation // J. Russian Laser Res.-2005.26. P. 380-393.

142. Описание электроники Апувсап 4 В состав электронного блока входят:

143. Импульсный двух полярный преобразователь напряжения РББОЗПВ с последующей схемой стабилизации напряжения.

144. Рисунок 1 Стабилизированный преобразователь напряжения

145. Генератор модулирующего сигнала, форма выходного сигнала -пила, амплитуда 50 В., частота -60 Гц

146. Рисунок 2 Схема генератора модулирующего сигнала с умножителем напряжения.

147. Резистор Л7 и конденсатор С6 задают частоту колебаний керамики, резистор Я6- амплитуду колебаний

148. Рисунок 3 Схема генератора линейно меняющегося напряжения.

149. Генератор опорного меандра необходимого для определения момента запуска АЦП.оит.1 х; .л2 .

150. Рисунок 4 Схема генератора опорного меандра.

151. Упрощенная схема генератора сигнала прямоугольной формы, очень близким к меандру, изображена на Рис 4.с