Лазерная спектроскопия и анализ микрокомпонентов выдыхаемого воздуха тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ГАЗОВОГО АНАЛИЗА В ИССЛЕДОВАНИЯХ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Высокочувствительный анализ состава выдыхаемого воздуха как инструментальная задача.

1.2. Аналитический потенциал диодной лазерной спектроскопии

1.3. Альтернативные аналитические методы исследований состава выдыхаемого воздуха

1.4. Молекулярные объекты высокочувствительного анализа состава выдыхаемого воздуха.

1.5 Выводы.

ГЛАВА 2. СПЕКТРАЛЬНЫЕ И АНАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ПДЛ И СИСТЕМ НА ИХ ОСНОВЕ.

2.1. Методы управления характеристиками ПДЛ.

2.2. Чувствительность детектирования резонансного молекулярнго поглощения с помощью ПДЛ.

2.3. Применение ИК волоконной оптики в схемах ДЛС.

2.4. Выводы.

ГЛАВА 3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ И АНАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ИССЛЕДУЕМЫХ ГАЗОВЫХ СРЕД.

3.1. Особенности концентрационных измерений с помощью ПДЛ

3.2. Специфика спектрального анализа выдыхаемого воздуха.

3.3. Метод выбора оптимальной аналитической линии.

3.4. Выводы.

ГЛАВА 4. ЛАЗЕРНЫЙ МОНИТОРИНГ ЭНДОГЕННОЙ МОНООКИСИ

УГЛЕРОДА В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ.

4.1. Актуальность и проблематика детектирования эндогенного СО

4.2. Лазерный анализатор СО в выдыхаемом воздухе.

4.3. Экспериментальные данные по мониторингу СО в выдохе человека и малых животных.

4.4. Применения для клинической диагностики заболеваний.

4.5. Лазерный анализ СО в исследованиях по физиологии растений

4.6. Выводы.

ГЛАВА 5. ЛАЗЕРНЫЙ АНАЛИЗ ЭНДОГЕННЫХ NO, NH3 И ОД В

ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ.

5.1. Эндогенная моноокись азота (N0).

5.2. Эндогенный аммиак (NH3).

5.3. Эндогенный метан (СН4).

5.4. Выводы.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ИЗОТОПИЧЕСКОГО ОТНОШЕНИЯ УГЛЕРОДА

13С/12С В ВЫДЫХАЕМОЙ ДВУОКИСИ УГЛЕРОДА.

6.1. Специфика определения ИОУ в СО2 выдыхаемого воздуха

6.2. Измерение отношения методами ДЛС.

6.3. Источники погрешностей при определении изотопического отношения углерода с помощью ПДЛ.

6.4. Моделирование влияния систематических погрешностей.

6.5. Экспериментальные результаты.

6.6. Результаты применений в клинической диагностике.

6.7. Выводы.

ГЛАВА 7. МЕТОДЫ МНОГОКОМПОНЕНТНОГО ЛАЗЕРНОГО

ГАЗОАНАЛИЗА ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИЙ ДИАГНОСТИКИ.

7.1. Использование случайного близкого расположения аналитических линий детектируемых молекул.

7.2. Специальные методы накачки ПДЛ.

7.3. Многоканальные оптические схемы.

7.4. Выводы.

Основные направления и актуальность исследований

Диссертация посвящена разработке нового направления диагностических применений диодной лазерной спектроскопии (ДЛС), связанного с высокочувствительным анализом газообразных молекул-биомаркеров в выдыхаемом воздухе (ВВ). Развиваемые в ней принципы и методы лазерной молекулярной спектроскопии предназначены для решения широкого круга как фундаментальных, так и прикладных задач в биомедицине, в частности, для исследований обменных процессов в живых организмах и диагностики заболеваний.

В воздухе, выдыхаемом человеком, помимо основных компонентов N2, О2, СО2 и Н2О содержатся следы еще около 600 летучих соединений, образуемых в организме (эндогенных) [1,2]. Продукция каждого такого вещества обусловлена течением определенных биохимических реакций и физиологических процессов, что позволяет использовать в качестве биомаркеров некоторые молекулы, имеющие высокую специфичность образования [1]. Этим обусловлена актуальность разработки современных методов высокочувствительного анализа молекул-биомаркеров, выделяемых с выдыхаемым воздухом и в результате других газообменных процессов в организме.

Детектирование следов газообразных молекул в выдыхаемом воздухе относится к числу наиболее сложных задач газового анализа, что связано с очень низкими их концентрациями и, напротив, высоким содержанием соединений, мещающих анализу. Используемые для этих целей инструментальные подходы должны обеспечивать возможность детектирования эндогенных соединений в диапазоне концентраций 0.1 ppb - 1 ррш1 при постоянной времени анализа 1-10 с. Предпочтителен прямой анализ без предварительного концентрирования или обогащения ВВ. Метод должен обладать высокой селективно

1 Для удобства обозначения относительной концентрации газообразных веществ в работе используются обозначения, принятые в международной научной литературе: 1 ррш - 10"4 % об., 1 ppb - 10"7 % об., 1 ppt - 10"10 % об. стью и/или быть нечувствительным к содержанию в анализируемой пробе доминирующих атмосферных компонентов. Желательно, чтобы используемый для анализа физический принцип был универсален и применим для детектирования различных молекулярных соединений, в том числе в режиме многокомпонентного анализа.

Одним из наиболее мощных современных методов газового анализа является диодная лазерная спектроскопия (ДЛС), используемая в данной работе. Разнообразные возможности перестраиваемых диодных лазеров (ПДЛ) были продемонстрированы при применении в многочисленных исследованиях [3-8]. Уникальные диагностические свойства ДЛС обусловлены редким сочетанием спектральных характеристик ПДЛ. При небольшой мощности излучения п

1 мВт) они обладают узкой линией (Av/v<10~ ) и широко диапазонной перестройкой частоты генерации, что позволяет с высокой точностью регистрировать колебательно-вращательную (KB) структуру спектров поглощения газообразных молекул и измерять различные параметры газовой среды (температуру, концентрацию молекул, характеристики их взаимодействия и др.). Низкий уровень амплитудных и частотных шумов ПДЛ позволяет регистрировать резонансное поглощение с чувствительностью к изменению оптической плотности вплоть до 10"7 и спектральным разрешением -3-1 О*4 см"1 при времени интегрирования около 1 мин. Электронное управление параметрами излучения ПДЛ дает возможость достаточно легко автоматизировать системы на основе таких лазеров и за счет малой инерционности участвующей в генерации оптического излучения электронной подсистемы в полупроводнике обеспечивает высокие скорости управления частотой излучения ПДЛ.

ПДЛ применимы для исследований большого числа молекул, спектры поглощения которых попадают в область генерации лазеров данного типа, простирающуюся от 0.6 до 40 мкм. Доступность такого широкого спектрального диапазона позволяет для конкретной исследуемой молекулы и аналитической задачи подобрать область, оптимальную для регистрации, с учетом микро-окон прозрачности атмосферы и интерференции со спектрами поглощения других мешающих газов. В настоящее время наибольшая концентрационная чувствительность при использовании ПДЛ реализуется в среднем ИК-диапазоне, где располагаются основные KB полосы поглощения молекул. При исследовании достаточно легких и простых молекул узкая линия генерации ПДЛ дает возможность регистрировать отдельные линии KB структуры, что обеспечивает повышение чувствительности, точности и селективности анализа. Например, использование изолированных молекулярных линий поглощения с интенсивностью порядка 10"18 см"'/молек-см"2 позволяет получить концентрационную чувствительность ~10 ppt [9-11].

Упомянутые выше аналитические характеристики достигаются при достаточно простых функциональных схемах приборов на основе ПДЛ. Возможна одновременная регистрация нескольких газов с помощью одного лазера. Миниатюрность ПДЛ позволяет интегрировать их в многокомпонентные аналитические системы, в том числе, с применением ИК волоконной оптики.

С точки зрения применений ДЛС для биомедицинской диагностики, основанной на анализе состава ВВ человека, перечисленные выше аналитические возможности ПДЛ достаточно четко определяют область их перспективного использования. Это, во-первых, детектирование в ВВ достаточно легких газообразных молекул-метаболитов типа СО, СО2, NO, NO2, N2O, NH3, Н2О, Н202, С2Н4, С2Н6, СН20, СН4, СНзОН, С2Н5ОН, CS2, H2S, с5н12, С2Нб, CH2OHS и других в диапазоне концентраций от 0.1 ppb до 10 ррт. Во-вторых, высокоточная регистрация в ВВ изотопомеров этих молекул, содержащих такие ста

13 18 15 35 бильные изотопы как D, С, О, N и S. В-третьих, долговременный мониторинг содержания перечисленных выше соединений в ВВ, включая многокомпонентный, а также исследование динамики их содержания в процессе одного дыхательного цикла в режиме реального времени, которые могут осуществляться без накопления или обогащения анализируемой газовой смеси. И, в-четвертых, применение данного подхода для исследований газообмена малых лабораторных животных и растений. Все эти направления стали в той или иной мере предметом исследований данной диссертационной работы и нашли отражение в работах [12-23].

Актуальность исследований, направленных на развитие методов высокочувствительного анализа газообразных молекул-биомаркеров с помощью ПДЛ, обусловлена перспективностью применения данного подхода для целей биомедицинской диагностики, а также в фундаментальных и прикладных исследованиях, включая клинические приложения. Использование методов ДЛС для исследований состава выдыхаемого воздуха на микроуровне могло бы позволить расширить круг доступных для изучения молекулярных объектов, продвинуться в область более низких концентраций детектируемых веществ, ускорить и упростить проведение анализа и, таким образом, получать новую информацию о процессах газообмена в живых организмах. Это создает основу для разработки новых технологических и методических подходов к неинва-зивной биомедицинской диагностике, базирующихся на анализе дыхания и газообмена с использованием исследований в реальном времени, долговременного непрерывного мониторинга, массовых скрининговых обследований, новых нагрузочных тестов и т.п. С точки зрения практической медицины актуальность данного направления обусловлена перспективностью использования результатов для разработки новых методов корреляционной диагностики заболеваний, радиационно-безопасной диагностики с применением стабильных изотопов, сопровождения и оптимизации терапевтических воздействий различного характера, диагностики экстремальных физиологических состояний, а также для фармакологических исследований, оценки воздействия загрязнений окружающей среды и скрининговых тестов населения.

Цели и задачи исследований

Целью диссертации является разработка физических, методических и инструментальных основ спектрального анализа, базирующегося на использовании принципов ДЛС и предназначенного для высокочувствительного детектирования газообразных молекул-биомаркеров, выделяемых биологическими объектами, и их апробация при решении задач биомедицинской диагностики.

Основными задачами работы являются

В области лазерной молекулярной спектроскопии и газоанализа: исследования и анализ спектральных характеристик ПДЛ среднего РЖ-диапазона (2-12 мкм), изготавливаемых с применением различных технологий (диффузионной, жидкофазной и молекулярно-лучевой эпитаксии); моделирование и анализ спектров поглощения высокого разрешения исследуемых газовых сред (выдыхаемого воздуха, искусственных воздушных смесей), разработка методов и алгоритмов выбора и выбор спектральных областей, наилучших для решения задач биомедицинской диагностики; диодная лазерная спектроскопия ряда легких газообразных молекул, имеющих диагностическую значимость (СО, NO, NH3, СН4, изотопомеров СО, СО2, NH3 и др), а также соединений, доминирующих в исследуемых газовых смесях (Н20 и СО2), в спектральных областях оптимального детектирования; измерение и уточнение параметров аналитических линий поглощения: положений центров, интенсивностей, коэффициентов уширения буферными газами и самоуширения и коэффициентов сдвига давлением, и определение уровня помех, обусловленных интерферирующими газами; разработка методов и алгоритмов высокочувствительного детектирования исследуемых молекул с применением ПДЛ, выявление основных факторов, ограничивающих чувствительность, точность, селективность и быстродействие их анализа, определение аналитических характеристик, достижимых с помощью ПДЛ; разработка методов многокомпонентного спектрального анализа с помощью ПДЛ, в том числе, с примнением волоконной оптики среднего ИК-диапазона.

В области разработки и создания лазерных систем: разработка и создание отдельных узлов лазерных анализаторов, включая системы криостатирования ПДЛ, оптико-механические узлы, специальные аналитические кюветы, блоки управления параметрами излучения ПДЛ, регистрации спектров, накопления и обработки сигналов и программное обеспечение, поддерживающее работу анализаторов; разработка высокочувствительных анализаторов на основе ПДЛ для детектирования в выдыхаемом воздухе молекул СО, NO, NH3, СН4 с чувствительностью на уровне 1 ppb; разработка методов и создание специализированного анализатора на основе ПДЛ для высокоточного (-0.5 %о) определения отношения концентраций

1 л 1 «5 изотопомеров СО2 и СОг в выдыхаемом воздухе; разработка принципов построения, узлов и действующих макетов многоканальных спектральных систем, предназначенных для многокомпонентного газового анализа с применением ПДЛ и элементов волоконной оптики.

В области исследований эндогенных газообразных веществ в выдыхаемом воздухе: разработка методов анализа СО, NO, NH3, СН4 и изотопического отно

J л шения углерода С/ С в С02 в выдыхаемом воздухе с помощью созданных лазерных систем; демонстрация возможностей аналитических методов, базирующихся на использовании ПДЛ, в применениях, связанных с исследованием закономерностей выделения эндогенных соединений с выдыхаемым воздухом, включая механизмы их образования, транспорта и выделения, а также с разработкой новых методов неинвазивной биомедицинской диагностики; апробация разработанных диагностических методов и систем в ходе клинических испытаний и медико-биологических экспериментов.

Научная новизна

Создано и разработано новое направление применения диодной лазерной спектроскопии - высокочувствительный спектральный анализ газообмена живых организмов. Целью анализа является исследование закономерностей выделения исследуемыми объектами газообразных молекул-биомаркеров на микроуровне (в диапазоне концентраций 1 ppb - 10 ррш) в масштабе времени близком к реальному и использование получаемых данных для решения задач биомедицинской диагностики.

Впервые получены следующие результаты:

1. На основе модельных расчетов и экспериментальных исследований спектров поглощения высокого разрешения определены области наиболее благоприятные для высокочувствительного детектирования СО, NO, NH3, СН4, а также изотопического анализа отношения С/ С в С02 в выдыхаемом воздухе. Анализ проведен для условий интерференции колебательно-вращательных спектров исследуемых молекул и основных мешающих компонентов выдыхаемого воздуха (Н20, С02 и др.). Для выбора оптимальных линий поглощения и условий спектрального анализа (метода регистрации и давления газовой смеси) предложен и использован критерий, основанный на определении условий исчезновения экстремумов в исследуемых спектрах пропускания.

2. На основе использования принципов диодной лазерной спектроскопии разработаны методы детектирования в выдыхаемом человеком воздухе таких газообразных молекул-биомаркеров, как СО, NO, NH3, СН4, с концентрационной чувствительностью на уровне 1 ppb. Для этих целей использованы перестраиваемые диодные лазеры среднего ИК-диапазона различных типов, работающие в спектральных областях, оптимальных для анализа. Разработаны специальные методы управления их спектральными характеристиками, аппаратные и программные методы снижения шумов и помех детектирования, увеличения контрастности регистрируемых спектров и повышения концентрационной чувствительности.

3. С использованием ПДЛ созданы высокочувствительные анализаторы моноокиси углерода (СО) и моноокиси азота (NO) в выдыхаемом воздухе. Лазерный анализатор СО обладает чувствительностью ~5 ppb, быстродействием 5 с и близкой к 100% селективностью и позволяет исследовать закономерности выделения СО с выдыхаемым воздухом в статическом режиме, в динамическом режиме, близком к режиму детектирования в реальном времени, и в режиме долговременного мониторинга. Анализатор N0 имеет чувствительность ~1 ppb и быстродействие 20 с. С помощью перестраиваемых диодных лазеров было осуществлено детектирование NH3 и СН4 в выдыхаемом человеком воздухе. Продемонстрирована возможность применения методов ДЛС для исследования роли СО, NO NH3 и СН4 в жизнедеятельности организма, а также для диагностики и терапии ряда заболеваний.

4. Разработаны методы и алгоритмы высокоточного определения изотопического отношения углерода 13С/12С в С02 выдыхаемого воздуха, основанные на применении методов диодной лазерной спектроскопии, а также проведен анализ и моделирование влияния основных источников случайных и систематических погрешностей измерений данным методом. Создан лазер

И 1 ■л ный анализатор изотопического отношения углерода С/ С в выдыхаемом С02, основанный на использовании перестраиваемых диодных лазеров в импульсно-периодическом режиме и позволяющий детектировать изменения относительной концентрации 13С02 и 12С02 с точностью -0.5 %о и быстродействием -20 с, и продемонстрирована возможность его использования для проведения дыхательных тестов в медицине с использованием препаратов, меченных стабильным изотопом углерода 13С.

5. Разработаны и применены для целей биомедицинской диагностики методы одновременного детектирования с высокой чувствительностью нескольких компонентов исследуемой газовой смеси, базирующиеся на использовании перестраиваемых диодных лазеров. В том числе, на основе таких лазеров разработаны многоканальные системы среднего ИК-диапазона с волоконно-оптическим вводом/выводом излучения, предназначенные для высокочувствительного многокомпонентного спектрального анализа.

Практическая ценность работы

Разработанные методы и результаты исследований мощностных и спектральных характеристик ПДЛ среднего ИК-диапазона позволили контролировать и совершенствовать технологию изготовления лазеров различных типов.

Созданные методы и системы высокочувствительного детектирования легких газообразных молекул, основанные на применении ПДЛ, могут быть использованы для решения различных аналитических задач, включая анализ сложных газовых смесей и многокомпонентный газоанализ, а также как поверочное средство для контроля более простых аналитических систем.

Развитые методы высокочувствительного анализа газообмена живых организмов могут быть применены для решения широкого круга как научных, так и прикладных задач в биохимии, биофизике, биологии, биомедицине и клинической медицине. Они могут быть использованы при разработке лазерных систем для регистрации газообразных молекул-биомаркеров, не рассматриваемых в рамках данной работы.

Разработанные аналитические подходы могут быть применены также для контроля загрязнений окружающей среды и фонового мониторинга атмосферы, разработки энергосберегающих технологий и управления процессами горения и современными химическими технологиями (плазменная и каталитическая химия), контроля качества продукции и в биотехнологиях, а также в космических исследованиях.

Данные, полученные при исследовании закономерностей выделения СО, NO, NH3, СН4 с выдыхаемым воздухом, могут быть использованы для развития представлений о газотранспортных свойствах систем крови и дыхания и более точного описания переноса легких газообразных лигандов. Разработанные методы могут быть применены для создания новых способов неинвазив-ной диагностики биохимических и биофизических процессов, заболеваний различных органов и систем организма, а также для контроля эффективности терапии.

Разработанные лазерные методы и приборы для высокоточного определения изотопического отношения углерода в СОг открывают возможность для существенного упрощения и удешевления технологии дыхательных тестов с использованием препаратов, обогащенных стабильным изотопом углерода

1 'Х

С, и, таким образом, для более интенсивного развития и освоения новых методов неинвазивной диагностики заболеваний в гастроэнтерологии и повышения эффективности терапии последних. На основе этого же подхода возможна диагностика заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. Эти методы могут применяться для исследований изотопного состава горных пород и полезных ископаемых (газ, нефть, минералы) в геологии, геохимии и минералогии. На их основе могут быть созданы приборы для анализа изотопического отношения по Н, N, О, S и другим элементам как в компонентах ВВ, так и в других сложных газовых смесях.

Защищаемые положения:

1. Высокочувствительный спектральный анализ газообмена живых организмов с использованием перестраиваемых диодных лазеров и его применение для фундаментальных биомедицинских исследованиях и клинической диагностики.

2. Методы селекции перестраиваемых диодных лазеров различных типов и алгоритмы и системы для управления их характеристиками, позволяющие получать оптимальные для спектральных и аналитических исследований параметры перестраиваемого по частоте лазерного излучения в требуемой спектральной области в среднем ИК-диапазоне.

3. Методы и алгоритмы выбора аналитических линий поглощения и условий их регистрации, позволяющих достигать наибольших чувствительности и селективности детектирования молекул с разрешенной структурой колебательно-вращательных спектров в сложных газовых смесях.

4. Обоснование выбора спектральных областей в среднем ИК-диапазоне, наиболее благоприятных для детектирования микроконцентраций молекул СО, NO, NH3, СН4 и изотопомеров С02 в выдыхаемом воздухе.

5. Методы и спектральные приборы, предназначенные для детектирования легких молекул-биомаркеров типа СО, NO, NH3 и СН4 с чувствительностью ~1 ppb и близкой к 100% селективностью в сложных газовых смесях, таких как выдыхаемый человеком воздух.

6. Методы и системы высокочувствительного многокомпонентного спектрального анализа, в том числе, базирующиеся на сочетании перестраиваемых диодных лазеров и элементов волоконной оптики среднего ИК-диапазона.

7. При использовании спектрального диапазона вблизи 4.35 мкм для опреде

13 12, ления изотопического отношения углерода С/ С в СО2 с помощью перестраиваемых диодных лазеров достигается чувствительность изотопного анализа лучше 0.5%о при времени анализа -20 с, концентрации СО2 в анализируемой пробе -3% и объеме последней <100 мл.

8. Лазерный анализатор, предназначенный для определения изотопного состава углерода в СО2 выдыхаемого воздуха, и инструментальное сопровождение диагностики гастроэнтерологических заболеваний с помощью дыхательных тестов, основанных на применении препаратов, меченных стабильным изотопом углерода 13С.

9. Применение разработанных лазерных методов и аппаратуры для контроля параметров дыхания в исследованиях по нормальной и гипербарической физиологии и физиологии дыхания, для неинвазивной диагностики заболеваний в гастроэнтерологии, гепатологии и пульмонологии, а также для определения эффективности используемых терапевтических подходов.

Личный вклад автора

Исследования по теме диссертационной работы выполнялись автором с 1986 года и по настоящее время в Институте общей физики им.А.М.Прохорова Российской Академии Наук (ИОФАН). Автором разработаны и сформулированы общая концепция и основные направления исследований. Все экспериментальные материалы и результаты, представленные в диссертации и касающиеся исследования характеристик ПДЛ, моделирования спектров поглощения молекул, экспериментального исследования молекулярных спектров с помощью ПДЛ, разработки методов детектирования, конструктивных и схематических решений, разработки, создания, настройки и испытания лазерных спектрометров и анализаторов, получены автором как лично, так и в соавторстве с руководимыми им аспирантами и сотрудниками Ле-меховым Н.В., Москаленко К Л., Понуровским Я.Я., Дараселия М.Д. Автоматизация спектральных измерений, в которой автор участвовал на стадии формирования технического задания, выработки используемых алгоритмов, испытаний и апробации, проведена к.т.н. Кузнецовым А.И. и н.с. Зыряновым П.В. Практические результаты по применению разработанных методов для биомедицинской диагностики были получены при непосредственном участии автора в ходе цикла фундаментальных и прикладных исследований, проведенных совместно с ГНЦ Институт медико-биологических проблем РАН, Институтом океанологии РАН, Московской медицинской академией им.И.М.Сеченова, Институтом пульмонологии РМА, и рядом других исследовательских медицинских учреждений. В этих исследованиях автор выступал в качестве научного соруководителя или ответственного исполнителя, лично участвовал в планировании и проведении экспериментов, обработке и обсуждении получаемых результатов.

В работе использованы ПДЛ, разработанные специалистами Физического института им.П.Н.Лебедева РАН (ФИАН), Физико-технического института им.А.Ф.Иоффе РАН (ФТИ РАН) и Тбилисского государственного университета (ТГУ), и лазеры, поставляемые фирмой Laser Components, GmbH, Германия.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях, симпозиумах и семинарах: Всесоюзной конференции "Современные проблемы физики и ее приложения" (Москва, 1987), VIII-XII Симпозиумах по молекулярной спектроскопии высокого разрешения (Красноярск, 1987, Якутск, 1989, Омск, 1991, Москва, 1993, Томск, 1999), Всесоюзном съезде по спектроскопии (Киев, 1988), Международной конференции "Лазеры и медицина" (Ташкент, 1989), Международной конференции SPIE "Лазеры и их применения" (Лос-Анжелес, США, 1990 и 1991, Сан-Хосе, США, 1994), Международной конференции ICO-15 "Оптика в науках о жизни" (Гармиш-Патеркирхен, Германия, 1990), Заседании Рабочей группы Международной спектроскопической ассоциации (Москва, 1990), Международном симпозиуме "Лазеры" (Гренобль, Франция, 1991), Международной конференции SPIE "Инфракрасная волоконная оптика" (Бостон, США, 1991 и Лос-Анжелес, США, 1992), Международном симпозиуме по применению ПДЛ (Фрайбург, Германия, 1991 и 1995), Международной конференции SPIE "Оптическая сенсорика для мониторинга окружающей среды" (Лос-Анжелес, США, 1993), XIII Коллоквиуме по Спектроскопии высокого разрешения (Ричоне, Италия, 1993), Международной конференции по ИК физике (Аскона, Швейцария 1994), Международной конференции SPIE "Биомедицинская оптика" (Лиль, Франция, 1994; Барселона, Испания, 1995; Сан-Хосе, США, 1995; Сан-Хосе, США, 1996), 2-ом Симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" (Москва, 1995), Коллоквиуме по полупроводниковым лазерам IV-VI (Фрайбург, Германия, 1995), Международной конференции SPIE "Передовые технологии для мониторинга окружающей среды" (Денвер, США, 1996), Международной конференции SPIE "Биомедицинские датчики, визуализация и слежение" (Сан-Хосе, США, 1997), V Конференции по биологии при высоких давлениях (С.Петербург, 1997), 11 Мировом конгрессе по гастроэнтерологии (Вена, Австрия, 1998), III, IV, V и VI Гастроэнтерологических неделях (Москва, 1998, 1999, 2000, 2001 гг.), 7-ой Всероссийской школе по физиологии дыхания (Бологое, 1998), Национальной школе гастроэнтерологов и гепатологов "Helicobacter! Pylori - Update 1998" (Москва, 1998), 11 Международном совещании по гастродоуденальной патологии и Helicobacterl Pylori (Будапешт, 1998), 2-ом Международном симпозиуме по ДЛС и ее применениям (Москва, 1998), 11 Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии (Москва, 1998), Всероссийской конференции "Медицинское обеспечение длительных походов кораблей" (Североморск, 1999), Международной конференции "Заболевания органов пищеварения" (Орландо, США, 1999), Международной конференции по заболеваниям органов дыхания и астме, (Сан-Диего, США, 1999), Международной конференции Европейского оптического общества (Берлин, Германия, 1999), Международном совещании по гастродоудеалной патологии и Helicobacterl Pylori (Хельсинки, Финляндия, 1999), Симпозиуме "Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacterl Pylori, (Москва, 1999), II Российской школе для практических врачей "Сободные радикалы и болезни легких" (Рязань, 1999), 7-ой объединенной европейской гастроэнтерологической неделе (Рим, Италия, 1999), Конференции "Возможности и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине" (Москва, 1999), Кон-френции «Биологические эффекты ЭМС» (Гераклион, Греция, 2000), 11 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Берлин, Германия, 2001), 5 Международном Конгрессе Европейской Биоэлектромагнитной Ассоциации (Хельсинки, Финляндия, 2001), Конференции IEEE по Биоэлектромагнетизму, Сан-Франциско, США, 2001), IV Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001).

Кроме того материалы диссертации были представлены на Заседании Отделения общей физики и астрономии РАН, семинарах ИОФАН им.А.М.Прохорова, Общемосковских семинарах по ДЛС, семинарах ФИАН им.П.Н. Лебедева, ГНЦ ИМБП, Института Пульмонологии РАМН, Московской медицинской академии, Берлинского технического университета, Берлинского университета им.Гумбольдта, Калифорнийского университета в Сан-та-Барбаре, Медико-биологического департамента Космического центра им.Дж.Кеннеди, НАС А и Семинаре по лазерной медицине Российской Лазерной Ассоциации.

Публикации

Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы

Основные результаты работы можно сформулировать следующим образом:

1. Обосновано использование методов диодной лазерной спектроскопии для целей высокочувствительного спектрального анализа газообмена живых организмов и применений в фундаментальных биомедицинских исследованиях и клинической диагностике.

2. Разработаны методы селекции перестраиваемых диодных лазеров различных типов и алгоритмы и системы для управления их характеристиками, позволяющие получать оптимальные для спектральных и аналитических исследований параметры перестраиваемого по частоте лазерного излучения в требуемой спектральной области в среднем ИК-диапазоне: одномодовый

3 1 режим генерации, спектральное разрешение <10" см", длинну отдельной моды 2-12 см"1, скорость перестройки частоты 102-104 см"'/с, диапазон температурной перестройки частоты -200 см"1 при диапазоне рабочих температур 80-120 К, отношение сигнал/шум регистрации лазерного сигнала до 10"5.

3. Для газообразных молекул-биомаркеров, обладающих разрешенной структурой колебательно-вращательных спектров, предложены методы и алгоритмы выбора аналитических линий поглощения и условий их регистрации, позволяющих достигать наибольших чувствительности и селективности при спектральном анализе сложных газовых смесей, когда ограничивающим фактором является интерференция (перекрытие) спектров исследуемых и доминирующих компонентов газовой среды.

4. Проведено обоснование выбора спектральных областей в среднем ИК-диапазоне, наиболее благоприятных для детектирования микроконцентраций молекул СО, NO, NH3, СН4 и изотопомеров С02 в выдыхаемом воздухе.

5. Разработаны методы и спектральные приборы, предназначенные для детектирования легких молекул-биомаркеров типа СО, NO, NH3 и СН4 с чувствительностью ~1 ppb и близкой к 100 % селективностью в сложных газовых смесях, таких как выдыхаемый человеком воздух, при содержании N2 и 02 на уровне десятков % и Н20 и С02 - на уровне 3-6 %.

6. Разработаны методы и системы высокочувствительного многокомпонентного спектрального анализа, в том числе, базирующиеся на сочетании перестраиваемых диодных лазеров и элементов волоконной оптики среднего ИК-диапазона.

7. Разработаны методы и алгоритмы высокоточного и селективного измерения относительного содержания изотопомеров легких газообразных молекул с помощью перестраиваемых диодных лазеров среднего ИК-диапазона, работающих в импульсно-периодическом режиме. При использовании спектрального диапазона вблизи 4.35 мкм для определения изотопического отношения углерода 13С/12С в С02 с помощью перестраиваемых диодных лазеров реализована чувствительность изотопного анализа лучше 0.5 %о при времени измерения -20 с, концентрации С02 в анализируемой пробе ~3 % и объеме последней <100 мл.

8. На основе перестраиваемых диодных лазеров создан анализатор, предназначенный для определения изотопного состава углерода в С02 выдыхаемого воздуха и инструментального сопровождения диагностики гастроэнтерологических заболеваний с помощью дыхательных тестов, основанных на применении препаратов, меченных стабильным изотопом углерода 13С.

9. В ходе лабораторных и клинических испытаний продемонстрирована применимость разработанных лазерных приборов и методов для контроля параметров дыхания в исследованиях по нормальной и гипербарической физиологии и физиологии дыхания, для неинвазивной диагностики заболеваний в гастроэнтерологии, гепатологии и пульмонологии, а также для определения эффективности используемых терапевтических подходов.

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что полученные в данной работе результаты свидетельствуют о возможности, перспективности и высокой эффективности использования высокочувствительного газового анализа, базирующегося на методах ДЛС, для исследования состава выдыхаемого воздуха и других процессов газообмена на уровне микроконцентраций. Спектральные области, оптимальные для анализа некоторых газообразных биомаркеров с помощью ПДЛ представлены в Таблице 9. Сравнение с альтернативными методами показывает, что использование данного подхода в ряде задач позволяет увеличить чувствительность, точность и скорость анализа, расширить число исследуемых молекул, отказаться от предварительной очистки, подготовки или концентрирования проб воздуха, проводить измерения в режиме мониторинга, осуществлять дистанционный анализ.

Применение лазерных методов высокочувствительного спектрального анализа газообразных молекул-биомаркеров в выдыхаемом воздухе перспективно в биомедицинской диагностике, как фундаментального, так и прикладного, клинического, характера. Использование возможностей ПДЛ в этой сфере позволяет расширить круг исследуемых объектов и решаемых задач, открывает перспективу для внедрения новых методических подходов в медикобиологиче-ских исследованиях (измерения в реальном времени, долговременный непрерывный мониторинг, массовые скрининговые обследования, применение новых нагрузочных тестов и т.п.). При использовании в диагностике заболеваний наряду с традиционными методами это может обеспечить неинвазивность, опера-тавность и удешевление исследований. При соответствующем развитии данного диагностического подхода он может быть применен для корреляционной диагностики заболеваний, радиационно-безопасной диагностики с применением стабильных изотопов, сопровождения и оптимизации терапевтических воздействий различного характера, диагностики экстремальных физиологических состояний, для фармакологических исследований, в том числе с использованием лабораторных животных, для оценки воздействия загрязнений окружающей среды и скрининговых эпидемиологических тестов.

Перспективы дальнейшего развития данной области исследований связаны с разработкой следующих направлений:

• совершенствование технологии ПДЛ (повышение надежности и ресурса лазеров, повышение рабочих температур до комнатных, освоение новых спек

273 тральных диапазонов, повышение степени интеграции элементов) и использование квантово-каскадных полупроводниковых лазеров;

• повышение чувствительности и скорости детектирования молекул (применение более чувствительных методов детектирования, разработка специализированных опто-механических схем, освоение УФ диапазона, где может быть реализована более высокая концентрационная чувствительность, увеличение быстродействия систем регистрации, снижение объемов аналитических кювет, повышение скорости анализа);

• расширение круга детектируемых объектов (спектроскопия малоисследованных молекул и выбор спектрального диапазона, разработка методов их высокочувствительного детектирования, исследование закономерностей их выделения, исследование диагностической значимости);

• развитие методов и систем многокомпонентного анализа(многоканальные системы регистрации лазерных сигналов, повышение степени интеграции опто-элктронных элементов аналитических систем);

• биомедицинские и клинические исследования (расширение сферы диагностических применений, исследование взаимосвязи между биомаркерами, разработка методов клинической диагностики);

• адаптация разрабатываемых лазерных систем под медицинского пользователя, разработка серийных образцов.

274

Благодарности

В заключении считаю своим долгом выразить признательность Миляеву Валерию Александровичу, под руководством которого мне довелось работать последние годы и который активно поддерживал развитие данного научного направления.

Благодарю сотрудников Физического института им.П.Н.Лебедева Селиванова Юрия Григорьевича и Чижевского Евгения Григорьевича за изготовленные и предоставленные для этой работы уникальные лазеры и поддержку в течение последних десяти лет.

Также я благодарен Яковлеву Юрию Павловичу и Даварашвилли Омари Ильичу, всемерно способствовавших продвижению данных исследований, и также предосталявших свои лазеры для работы.

Я благодарю коллег по совместной работе, без участия которых врядли было возможно развитие данного научного направления: Кузнецова А.И., Зырянова П.В., Шулагина Ю.А., Дьяченко А.И., Бинги В.Н., Павлова Б.Н., Никитину Е.И., Лапшина А.В.

Заключение

1. Phillips М., Breath Tests in Medicine, - Scientific American, July 1992, pp.74-79.

2. Phillips M., Herrera J., Krishnan S., Zain M., Greenberg J., Cataneo R.N., Variations in Volatile Organic Compounds in the Breath of Normal Humans, J.Chromatograph.B. Bio-med.Sci.Appl., 1999, Vol.729 (1-2), pp75-88.

3. Preier H., Physics and Applications of IV-VI Compound Semiconductor Lasers, Semicond. Sci. Technol., 1990, Vol.5, pp.S12-S20

4. Monitoring of gaseous pollutants by tunable diode laser, Proc. of the Int. symposium, held in Freiburg, FRG, 11-13, November 1986 (Edited by Grisar R., Preier H., Shmidtke G., Restelli G.) - Dordrecht, Holland, D.Reided Publishing Company, 1987, 176 p.

5. Monitoring of gaseous pollutants by tunable diode laser, Proc. of the Int. symposium, held in Freiburg, FRG, 17-18, October 1989 (Edited by Grisar R., Shmidtke G., Таске M., Restelli G.) - Dordrecht, Holland, Kluwer Academic Publishers, 1989, 305 p.

6. Monitorin of Gaseous Pollutants by Tunable Diode Lasers, Proc. of the Int. symposium, held in Freiburg, FRG, 17-18, October 1991 (Ed.by R.Grisar, H.Bottner, M.Tacke, and G.Restelli) - Dordrecht/Boston/London, Kluwer Academic Publishers, 1992, 372 p.

7. Proc. of the 4th Int. Symposium on Monitoring of Gaseous Pollutants by Tunable Diode Laser held in Freiburg, FRG, 19-20, October 1994 (Ed.by R.Grisar, M.Tacke, H.Bottner.) -Infr.Phys.Techn., 1996, Vol.37, No.l, pp.1-202.

8. Tunable Diode Laser Applications, A.I.Nadezhdinskii, A.M.Prokhorov, Editors, Proc. SPIE, Vol. 1724,1992, 275 p.

9. Carlisle C.B., Cooper D.E., Prier H., Quantum Noise-Limited FM Spectroscopy with a Lead-Salt Diode Laser, Appl.Opt., 1989, Vol.28, pp.2567-2576.

10. Fried A., Drummond J.R., Henry В., Fox J., Versatile Integrated Tunable Diode System for High Presision: Application for Ambient Measurements of OCS, Appl.Opt., 1991, Vol.30, pp. 1916-1932.

11. Werle P., Tunable Diode Laser Absorption Spectroscopy: Recent Findings and Novel Approaches, Infr.Phys.Techn., 1996, Vol.37, No.l, pp.59-66.

12. Логачев А.П., Степанов E.B., Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии, Тезисы IX Симпозиума по молекулярной спектроскопии высокого разрешения, - Якутск, 1989, с.37.

13. Логачев А.П., Степанов Е.В., Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии, Тезисы Международной конференции "Лазеры и медицина", - Ташкент, 1989, сс.62-63.

14. Кузнецов А.И., Логачев А.П., Степанов Е.В., Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии, Известия АН СССР, 1990, №10, сс.1909-1914.

15. Степанов Е.В., Москаленко К.Л., Кузнецов А.И., Диодные лазеры в анализе микропримесей выдыхаемого воздуха, В сборнике Совета по спектроскопии АН СССР "Диодная лазерная спектроскопия", - Москва, 1990, сс. 190-215.

16. Stepanov E.V., Moskalenko K.L., Gas Analysis of Human Exhalation byTunable Diode Laser Spectroscopy, Optical Engineering, 1993, Vol.32, No.2, pp.361-367.

17. Степанов Е.В., Миляев В.А., Селиванов Ю.Г., Лазерная ортомолекулярная медицинская диагностика, Успехи физических наук, 2000, т. 170, №4, сс.458-462.

18. Степанов Е.В., Миляев В.А., Применение перестраиваемых диодных лазеров для высокочувствительного анализа газообрзных биомаркеров в выдыхаемом воздухе, Квантовая электроника, 2002, т.32, №11, сс.987-992.

19. Страйер Л., Биохимия, в 3-х томах, Москва, "Мир", 1985.

20. Физиология человека, под. ред. Р.Шмидта и Г.Тевса, в 3-х томах, Москва, "Мир", 1996.

21. Risby Т.Н., Sehnert S.S., Clinical Applications of Breath Biomarkers of Oxidative Stress Status, Free Radical Biology & Medicine, 1999, Vol.27, No.11/12, pp.1182-1192.

22. DeZwart L.L., Meerman J.H.N., Commandeur J.N.M., Vermeulen N.P.E., Biomarkers of Free Radical Damage Applications in Experimental Animals and in Humans, Free Radical Biology & Medicine, 1999, Vol.26, No. 1/2, pp.202-226.

23. Скрупский B.A., Эндогенные летучие соединения биологические маркеры в физиологии и патологии человека и методы их определения, Научно-технический отчет, Институт Океанологии РАН, - М:, 1994, 75 с.

24. Дворецкий Д.П. Вентиляция, кровообращение и газообмен в легких, в кн. Физиология дыхания (Под ред. Бреслава И.С. и Исаева Г.Г.) - С.-П.: Наука, 1994, сс. 197-257.

25. LeMarchand L., Wilkens L.R., Harwood P. and Cooney R.V., Use of breath hydrogen and methane as markers ol colonic fermentation in epidemiological studies: circadian patterns of excretion, Env.HealthPerspect., 1992, Vol.98, pp.199-202.

26. Breath Tests and Gastroenterology, Edited by Dr.Hamilton L.H., QuinTron Instrument Co, -Milwaukee, WI, USA, 1998,123 p.

27. Coburn R.F, Williams W.J, Kahp S.B, Endogenous carbon monoxide production in patients with hemolytic anemia, J.Clin.Invest., 1966, Vol.45, No.4, pp.460-468.

28. Тиунов А.А., Кустов B.B., Продукты метаболизма при радиационном поражении, -Москва, Атомиздат, 1980, 104 с.

29. Gustafsson L.E., Leone A.M., Persson M.G., Wilkund N.P., Moncada S., Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, gunea pigs and humans, Biochem. and Bio-phys. Res. Com, 1991, Vol.181, pp.852-857.

30. Alving K., Weitzberg E., Lundberg J.M., Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics, Eur.Respir J., 1993, Vol.6, pp.1368-1370.

31. Phillips M, Greenberg J., Detection of endogenous ethanol and other compounds in the breath by gas chromatography with on-column concentration of sample, Anal.Biochem., 1987, Vol.163, No.l, pp.16-169.

32. Phillips M, Greenberg J., Ion-Trap detection of volatile organic compaunds in alveolar breath, Clin Chem., 1992, Vol.38, No.l, pp.60-65.

33. Phillips M., Method for the Collection and Assay of Volatile Organic Compaunds in Breath, -AnaLBiochem., 1997, Vol.247, pp.272-278.39.