Лазерный цитомонитор,определение функции распределения размерного состава взвесей методом малоуглового рассеяния тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

на правах рукописи

ЧИЖОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЛАЗЕРНЫЙ ЦИТОМОНИТОР. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРНОГО СОСТАВА ВЗВЕСЕЙ МЕТОДОМ МАЛОУГЛОВОГО

РАССЕЯНИЯ.

01.04.01 - приборы и методы экспериментальной физики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре физической электроники физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор И.Б. Тимофеев;

Официальные оппоненты: д.ф.м.н. профессор Ю.А. Пирогов,

д.б.н. в.н.с. В.Б. Григорьев.

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное

предприятие (ФГУП) ОКБ "Гранат" им. В.К. Орлова,

г. Москва, Волоколамское ш., д.95.

Защита состоится К_2004 г. в 15.00 часов

на заседании Диссертационного совета Д 501.001.66.

в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва,

ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, аудитория 5-19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " I * "_¿?3_.2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

А.П. Ершов.

2 005-4

\ъ%го

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Дисперсные среды составляют значительную часть окружающей среды, участвуют и в жизнедеятельности человека, и в различных технологических процессах. Особенно важную роль дисперсные среды играют в биологии и медицине, так как в этом случае носителями дисперсности выступают клетки, микроорганизмы, вирусы и т.п. Естественно, что получение новых знаний о состоянии и развитии дисперсных систем является важной задачей научных исследований. При этом значительную роль в таких исследованиях должны играть современные физические методы, использующие последние достижения в математической обработке данных, в оптических технологиях, вычислительной технике.

В свете вышесказанного, представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). А необходимость создания недорогой, удобной, автоматизированной и достаточно универсальной системы, позволяющей быстро и качественно проводить диагностику взвесей, актуальна и по сей день. Создание такой системы (программно-вычислительного комплекса - лазерного цитомонитора) даст возможность изучать поведение клеточных копуляций, решать экологические задачи по загрязнению атмосферы и водоемов и многое другое.

Цель работы и постановка задач

Целью диссертационной работы является создание и отладка программно-вычислительного комплекса позволяющего оперативно и достоверно проводить диагностику взвесей с целью определения функции распределения частиц взвеси по размерам. Процесс диагностики должен быть автоматизирован, чтобы обслуживание комплекса, не требовало высококвалифицированного персонала.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Создать программно-вычислительный комплекс (лазерный цитомони-тор), позволяющий проводить измерения индикатрисы рассеяния взвеси частиц в области малых углов. Представление данных об индикатрисе рассеяния должно осуществляться в электронном виде с возможностью дальнейшей обработки и анализа.

2. Разработать и апробировать математический аппарат, способный решать обратную задачу рассеяния для частиц размера 2-100 мкм. Создать программное обеспечение, позволяющее осуществлять удобное

чнхнациональная 1 I библиотека I

управление расчетами функции распределения взвеси по размерам с учетом тематики исследования.

3. Теоретически и экспериментально исследовать применимость нового метода по решению обратной задачи рассеяния при обращении малоугловой индикатрисы, и сравнить результаты с результатами метода, предложенного Шифриным К.С.

4. Провести эксперименты по решению программно-вычислительным комплексом (ПВК) экологической задачи, а именно, для диагностики мелкодисперсной пыли в г. Москве.

5. Провести экспериментальное исследование функции распределения эритроцитов в зависимости от осмотичности раствора. Изучить влияние гиперосмотического воздействия на функцию распределения по размерам эритроцитов.

6. Оценить влияние воздействия химических реагентов, изменяющих форму клетки, на решение обратной задачи рассеяния с помощью лазерного цитомонитора.

7. Изучить возможности использования ПВК лазерного цитомонитора для анализа кинетики (динамики) размеров клеток крови при воздействии на них внешними факторами.

Научная новизна результатов

Предложен принципиально новый метод математической обработки экспериментальной индикатрисы рассеяния, дающий возможность учитывать дополнительную информацию о клеточной популяции, что позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб, как в статическом, так и в динамическом режимах. При изучении клеточных распределений по размерам обычно имеют место полимодальные распределения, раскрывающие кластерную природу клеточного сообщества. Динамическими характеристиками клеточной популяции являются уровни "заселенности" кластеров. Скорость реорганизации клеток при переходе из кластера в кластер высока и составляет доли секунды. Используя данную информацию, метод обращения индикатрисы рассеяния в функцию распределения позволяет получать достоверные результаты.

Практическое значение работы

На основе оригинальной теории, математических алгоритмов, компьютерных программ и современных технических решений создана многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор) кинетической оценки реактивности клеток человека, животных и растений в реальном масштабе времени. Ее использование позволяет решать самые разнообразные задачи в области медицины, биотехнологии, фармакологии, сельского хо-

зяйства. Лазерный цитомонитор также может эффективно использоваться для эффективного экологического мониторинга обширных обитаемых территорий. Аналитическая система представляет собой комплекс методических и технических средств, работающих в автоматическом режиме.

Лазерный цитомонитор позволяет получить функции распределения клеток по размерам и их эволюцию во времени с разрешением порядка 0,02с. Данная работа также посвящена методическим вопросам определения функций распределения по размерам на биологических объектах и неорганических взвесях.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертации докладывались на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 4 работы, список которых приведен в конце автореферата.

Опытная партия программно-аппаратных комплексов была изготовлена на Красногорском оптико-механическом заводе им. С.А. Зверева.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии (170 наименований). Диссертация содержит 121 страницу текста, 28 рисунков и 2 таблицы.

Содержание работы

Во введении обосновывается актуальность работы и приводятся основные положения, выносимые автором на защиту. Обсуждается цель работы и формулируются ее задачи. Рассматривается практическое значение и научная новизна поставленной задачи и результатов ее решения, а также возможности новой автоматизированной аналитической системы (лазерного цитомонитора).

Глава 1 посвящена обзору литературы. Рассмотрены различные методы и модели решения обратной задачи рассеяния, как для полной индикатрисы, так и применительно к малоугольной ее части. Обсуждаются области применения тех или иных методов, точность результатов и их значимость. Также затрагиваются возможности по совершенствованию, модернизации подходов и методов расчета, обсуждаются связанные с этим проблемы и задачи. Анализируются как экспериментальное решение поставленных задач, так и теоретические исследования и работы в этой области.

Здесь проводится обзор сферы задач и проблем, где возможно и целесообразно применение созданного программно-вычислительного комплек-

са - лазерного циточоштгорз. Проводится кгагкпй обюр прпгоров и установок которые кг цанкый момгш используются лля решена вышеуказанных ¿¿дач. Дс:с1ся ич харахтеристшсс и обсумтются достоинства и недостатки кат- самих гр;'борпз трк и метоппя подхода заноженных з нп\.

В i лаве 2 лрлводиться подробное олисэние угтаговкп - цитомпнигора {оптическая схема прибора, система peracipaumi рассеяньох и сигнала, системы жпл гесбсспчем ия клеюк. электронное обеспечение с-гстеьш, программное обеспечегиг циточонктора, интерфейс пользователя).

Прибор представляет собой малогабаритную о.тш гескуш екгмыо. Наглядная схема прибора приведена па Рис 1. Ос-:овчнчи эгемеятзми схемы являются: источник когерентного излучения - He-Ne ла^ер типа ЛГ-207Б мггцвостьчз 1,5 тпВт (1): расширитель лалсряию луча - трехл.ниовая оптическая csicieMd. помегцешшй в цилиндрический метал лрчесгсий корпус (2), надевающейся непосредственно на корпус лазера; модуль рабочей кюветы с исследуемой суспензией биологических клеток ¿им гиьишеппых в жидкие im мелкодисперсных частит; (например, пыли) (3); система дегеитомет-рического контроля (4); входная шель (с), выр?лаьлцая из симмегрпчнсш картины рассеяния радиальную полоску: длиннофокусная еебираюнш линза (б) с фокусным расстооиеч F=^00 мм; кожух (7), закрывающий оптический гракт от внешней: паразлчэдГ- засветки; жестко фиксируемая юс-ткрово'шон системой плата -.{оюлриемнлка ГОС-лнксикн Toshiba типа TCD-S 3D0D (S), юегкревочяый сюлик (9), определяющий положение ПЗС ли ней mi и ¿окалзАОЙ плоскости л-шзы, электронный интерфе гс линейки (10): блок питания функциональной части (II); система перемешивания взвеси для поддержания ее однородной и (12); кндпкаюр .-лнпюля температуры рас i нора (13,1, блок ш-.тгияя лазера (14). оптическая скамьк обеспечивающая жесткость конструкции (15).

глрд-^я схема прибора.

Общие характеристики диагностического блока:

- длина волны зондирующего излучения_632 нм;

- длительность цикла непрерывной обработки

измерений с записью в память ЭВМ_не ограничено;

- минимальное время съема информации_20 мс;

- объем кюветы с суспензией_5 см3;

- размеры диагностического блока (лазер, система

юстировки, регистрирующее устройство и т.д.)_700x120x150 мм3;

- электропитание_220 В., 50 Гц.;

- потребляемая мощность_< 250 Вт;

- вес прибора_5,8 кг.

Характеристики оптической схемы диагностического блока:

- фокусное расстояние собирающей линзы_400 мм;

- минимальный угол индикатрисы_7';

- максимальный угол индикатрисы_4 ° 8 ';

- линейный размер фотоэлемента_8 мкм;

- количество рабочих элементов в ПЗС-линейке_3648 шт;

- разрешение_4 "/элемент;

- чувствительность фотоэлементов ПЗС-линейки 5.8 В/Лк*с.

Управление прибором осуществляется через компьютерную программу пользователем. Разработана программа, позволяющая получать индикатрису рассеяния, обрабатывать её и рассчитывать функцию распределения частиц по размерам. Для разработки программы использовалась среда программирования, LabVIEW 4 (разработчик среды: NATIONAL INSTRUMENTS). В программе заложены все необходимые функции -включение прибора, запись и обработка индикатрисы рассеяния, управление мотором, изменение температуры в кювете и т. д.

На Рис. 2 представлена функциональная блок-схема работы комплекса. Функционирование комплекса под управлением программы начинается со считывания настроек, хранящихся в соответствующем файле. Настройки определяют параметры основных процессов, выполняемых программой:

1. Тестирование установки - проверка и контроль ее работоспособности;

2. Проведение измерений — получение индикатрисы рассеяния;

3. Обработка результатов - расчет функции распределения частиц по размерам;

4. Формирование отчета об измерениях.

Таким образом, параметры настройки основных процессов определяют режимы работы всех составляющих комплекса.

Рис. 2 Функциональная блок-схема работы комплекса.

Пользователь программы выбирает один из вариантов работы. После чего запускается на выполнение соответствующий процесс. Тестирование и настройка системы выполняется как при включении прибора, так и непосредственно перед началом измерений с целью проверки работоспособности комплекса и получения максимально достоверных выходных данных.

После проведения тестирования комплекс готов к работе в выбранном режиме, о чём свидетельствует индикация в блоке отчёта. Настройка обработки полученных данных позволяет выбрать определённый уровень фильтрации полезных сигналов, чтобы избавиться от паразитных шумов системы и задать программу расчёта функции распределения частиц по размерам, соответствующую данной математической модели.

В основу математической обработки экспериментальной индикатрисы рассеяния света на малых объектах положен хорошо известный метод К.С.Шифрина, позволяющий восстанавливать функцию распределения частиц по размерам. Однако этот метод оказался чрезвычайно чувствительным к погрешностям любого рода, связанным с восстановлением функции распределения частиц, в частности к процессу сглаживания и математической аппроксимации индикатрисы рассеяния, особенно в области частиц малых размеров.

В связи с этим была проведена модификация метода восстановления функции распределения частиц по размерам по известной индикатрисе рассеяния света, позволяющая существенно расширить возможности существующей методики решения обратной задачи и повысить точность определения параметров в реальной взвеси исследуемых частиц. При этом особое внимание было уделено процессу образования достаточно крупных рассеивающих центров, возникающих при агрегации частиц. Для повышения точности решения и надежности конечных результатов при решении обратной задачи рассеянии целесообразно явно использовать в вычислениях дополнительную информацию об объектах исследования -живых клетках, особенности измерений, и др.

Во-первых, известно для клеток различных видов, что каждый вид клеток с (ст = 0... £-1) при активации меняет размеры почти дискретно, т.е. популяция по степеням активации (по размерам) разделяется на К = 5... 10 достаточно хорошо выраженных классов. Это позволяет функцию распределения рассеивающих центров (РЦ) по размерам представить в виде суммы распределений РЦ внутри класса

Непрерывная функция распределения по размерам заменяется распределением населенностей по дискретным классам к соответствующим определенным размерам:

здесь - доля РЦ в классе к , - распределение РЦ по размерам

внутри класса к, N - полное число клеток.

Переменные по времени шумовые составляющие могут быть эффективно устранены усреднением результатов измерений по нескольким близким моментам времени 1. Однако, если время заметного изменения на-селенностей клеточных классов сравнимо с интервалом усреднения или меньше его, то при этом усреднении теряется информация о динамике распределения. Произвести селекцию высокочастотных шумов в этом случае можно, используя гладкость временной зависимости населенности г|к класса к. Для этого функцию г|к = Г|к(1) можно представить многочленом:

Представим интенсивность I, зависящую как от угла Р, так и от времени г, в виде разложения по функциям !гк = /гк(Р) - вкладам в индикатрисы рассеяния от класса к (/гк - база данных модельных индикатрис от классов к вычисляется предварительно):

= (3)

Функция Ак(р) определяется интегралом:

(4)

здесь Л7(г, Р) - теоретическая индикатриса рассеяния от частиц размера г. Итак, подставив (2), (4) в (3), получим:

к~\

ос

(5)

Вся информация содержится в матрице размерностью КхТ.

Элементы матрицы определяются из условия наилучшего возможного согласия между 1ап(Р, 0 и измеренными значениям^Под наилучшим возможным согласием понимается наименьшая сумма квадратов отклонений 1ап(Р, 0 от 1,.к:

Итак, решение задачи определения динамики функции распределения сводится к определению элементов матрицы укл путем решения системы КхТ линейных уравнений.

Разработан новый метод определения кинетики размеров частиц биологического сообщества, учитывающий дополнительную информацию о клеточной популяции при активации (дискретность функции распределения, образование кластеров и др.), позволяющий значительно повысить точность решения обратной задачи малоуглового рассеяния.

В главе также обсуждаются функциональная, электрическая и оптическая схема всего измерительного комплекса. Обсуждаются различные подходы и конструктивные решения исполнения тех или иных узлов при-

бора. Приводится история модернизации и усовершенствования оптической и электрической схем прибора.

Проводиться анализ различных методов подхода к решению обратной задачи рассеяния. Теоретически и экспериментально проводятся исследования обращения малоугольной индикатрисы рассеяния методом Шифри-на К.С., обсуждаются достоинства и недостатки этого метода, очерчивается круг задач и возможность применения данного подхода.

Рассматривается применение принципиально нового метода математической обработки экспериментальной индикатрисы рассеяния для восстановления функции распределения частиц по размерам.

Для экспериментальной апробации модернизированного метода решения обратной задачи рассеяния проводились измерения индикатрисы рассеяния калиброванных по размерам порошков. Взвесь из тестируемых порошков была приготовлена в отфильтрованной дистиллированной воде (ГОСТ 6709-72). Для полученных индикатрис решалась обратная задача рассеяния. Рассчитанные функции хорошо согласуются с истинным средним значением тестируемых порошков.

Для проведения сравнения результатов решения обратной задачи рассеяния методами Шифрина К.С. и нового метода изложенного в § 2.2. производились следующие операции:

Был произведен расчет индикатрисы для частиц размером 3, 6, 20, 50 мкм по формуле: .которую в приближении дает

теория Ми для интенсивности света, рассеянного крупной частицей под малыми углами. Также были рассчитаны четыре индикатрисы для смеси частиц различных размеров в следующих составах: 4 и 7 мкм; 5 и 10 мкм; 10 и 40 мкм; 5, 7 и 15 мкм. Частицы всех размеров входили в состав в одинаковом количестве. Расчетная индикатриса являлась суммой индикатрис образованных каждым из исходных размеров

Для полученных индикатрис решалась обратная задача рассеяния методом малых углов Шифрина К.С. в математической оболочке Maple. Обращение индикатрис новым методом производилась в среде программирования Lab VIEW.

Для сравнения, полученные изображения функций распределения представлены на Рис. 3. Из графиков хорошо видно, что метод Шифрина дает наличие в восстановленной функции распределения участков с отрицательными значениями, что противоречит ее физическому смыслу и помимо основного пика присутствуют множество дополнительных, иногда превосходящих основной в несколько раз, что существенно искажает истинную функцию распределения. Появление пиков в области малых частиц и уход функции распределения в бесконечность обусловлены недос-

татком информации, т.е. вынужденным обрезанием индикатрисы со стороны малых и больших углов. Этот эффект существенно ограничивает применение метода в области малых углов. Для усовершенствования этого приближения в расчетах необходимо проводить аппроксимацию индикатрисы на малых и больших углах, и принимать это в расчет при решении обратной задачи.

т—I—I—1—1—I—III—I—I—I I (

10 30 50 70 г

Рис. 3 Функции распределения, полученные решением обратной задачи рассеяния (слева методом Шифрина К.С, справа новым методом.) для теоретических индикатрис от частиц радиусом б (сверху) и 50 (снизу) мкм.

Помимо всего, в восстановленных функциях распределения смесей по размерам (Рис. 4) не прослеживается равенство количества рассеивающих центров разных размеров и наблюдается некоторый уход положения максимумов от их истинного (заложенного входными данными) положения.

4 10 20

Рис. 4 Функции распределения, полученные решением обратной задачи рассеяния (слева методом Шифрина К.С, справа новым методом) для теоретических индикатрис от смесей частиц с радиусами 5 и 20 мкм.

Новый же метод обращения индикатрис рассеяния дает хорошее согласование между входящей и полученной функцией распределения.

§ 2.2 посвящен основе медико-биологической цитологической диагностики которая состоит в дозированном воздействии на клеточные популяции (активация), например, с помощью специальных биологически активных препаратов или физических воздействий, и в детальном измерении различных внешних динамических характеристических статистических параметров (обозначим их х, у, I...), которые описывают ход реакции на активацию клеточной популяции. Для выяснения, какая именно внутриклеточная подсистема ослаблена, могут использоваться дополнительные дозированные избирательные воздействия на подсистемы, участвующие в реакции на активацию. Различные типы поражений данной подсистемы, соответствующие разным патологиям, характеризуются различными отклонениями от нормы этих внешних характеристических статистических параметров (Дг, Ау, Таким образом, ранняя диагностика типа и сте-

пени поражения основана на сведениях о соответствующих данной пробе координатах точки в пространстве характеристических стати-

стических параметров х, у, г... Естественно, для применения этой методики необходимо предварительно определить область значений параметров х, у, г, характеризующих нормальную реакцию, и области значений, характерных для патологий различных типов (т.е. разработать базу данных по типам и степеням поражения).

Патологии могут быть связаны не только с болезнями, травмами или генетической предрасположенностью организма, но и с неблагоприятной экологической обстановкой. Поэтому данный прибор и методики диагностики могут эффективно применяться для экологического мониторинга. Экологическая диагностика водной и воздушной среды данной местности может проводиться двумя независимыми взаимно дополняющими методами. Во-первых, по вышеописанной схеме можно диагностировать состояние клеток растений или животных, живущих в данной местности. Во-вторых, можно тестовые клеточные популяции (пробы клеток растений, животных, человека) помещать в среду, содержащую исследуемые образцы воды с возможными загрязнениями. По их функциональному состоянию (определяемому по вышеописанной методике) можно делать заключение о комплексном качестве данных проб с точки зрения влияния на клетки данного вида организмов. Этот метод обладает уникальной возможностью использования цитологического экспресс-анализа для определения воздействия на человеческий организм пробы с возможными загрязнениями любой природы (в т.ч. опасными для здоровья и жизни) безо всякой возможности риска. При этом нет трудностей, известных для многих существующих методов экологического контроля, связанных с большим количеством возможных опасных агентов и с практически неизвестным взаимным влиянием (с экологической точки зрения).

Главы 3, 4 и 5 посвящены апробации лазерного цитомонитора при решении некоторых прикладных задач.

В Главе 3 рассматривается применения цитомонитора для диагностики мелкодисперсной пыли в воздухе города Москвы.

Атмосферная пыль может оказывать патогенное воздействие на организм человека, степень которого зависит как от химического состава пыли, так и от размеров пылинок. Относительно мелкая фракция (0,5 — 10 мкм) более опасна, т. к., во-первых наиболее мелкие частицы при дыхании попадают глубоко в легкие, проникая до легочных альвеол, во-вторых даже инертные микронные частицы вызывают поражение иммунной системы (поглощаются лимфоцитами). Поэтому важно диагностировать не только массовый объем пыли, но и размерный состав пылевых частиц.

Отбор проб проводился на 16 главных магистралях города - по 4 точки на каждой: 1 км от МКАД, половина расстояния от МКАД до Садового кольца, точка пересечения с Садовым кольцом, Центр.

Анализ результатов показал, что диаграммы характеризующие количественное содержание пыли в воздухе не обладают центральной симметрией и вытянуты вдоль направления, совпадающего с преимущественным направлением розы ветров (Рис. 5). Такое совпадение по-видимому не случайно и связано с выпадением тяжелой фракции пылевых потоков при пересечении территории города, изобилующей высокими строениями.

Рис. 5 Пространственное распределение мелкодисперсной пыли в г.Москве.

Для сравнения на Рис. 6 приведена экологическая карта города Москвы.

На ней приведено ориентировочное распределение загрязняющих веществ в атмосферном воздухе на территории г. Москвы полученное Московским центром по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. (Источник: http //www moscowmap iu/ecology/ecomap shtml) He смотря на то, что опасность загрязнения атмосферного воздуха характеризуется не только размерным составом пыли, но и ее химическим составом и ее количеством, из рисунков хорошо наблюдается корреляция между экологической обстановкой и средним размерным составом пыли в тех или иных районах г. Москвы.

Рис. б Ориентировочное распределение загрязняющих веществ в атмосферном воздухе на территории г. Москвы полученное Московским центром по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды.

(Источник: http://www.moscowmap.ru/ecology/

ecomap.shtml)

В Главе 4 исследуется возможность применения цитомонитора для получения функции распределения эритроцитов в средах с разной осмо-тичностью Так как клеточный объем является одним из важных показателей функционального и структурного состояния клетки, это делает весьма актуальной разработку методов, позволяющих эффективно определять функции распределения клеток по размерам и наблюдать кинетику изме-

нения клеточных размеров с высоким временным разрешением. Проведены измерения индикатрис рассеяния на эритроцитах, помещенных в раствор с разной осмотичностью (разным содержанием соли, что влияет на пропускную способность мембран и соответственно на размер клеток). Для калибровки распределение эритроцитов по плотности измеряли с помощью центрифугирования в капиллярах, содержащих смеси диметилфта-лата и диэтилфталата (метод Данона и Мариковского). Зная среднее значение содержания гемоглобина в клетке, можно перейти от экспериментально определенных средних значений плотности к средним значениям объема. Были определены средние величины объема клеток в средах со значениями и = 180, 220, 300, 430 мОсм. Зависимость объема клетки V от обратной осмотичности изображена на Рис. 7. Эта зависимость линейна, что согласуется с литературными данными. v 135 ~

125 115 105 ■ 85 ■ 85

75 -08

Рис. 7

Аналогичная зависимость может быть построена для полученной методом лазерного цитомониторинга величины R3=W (эффективный объем). На Рис. 8 представлена зависимость W от обратной осмотичности. Измерения проводили в средах с и = 160,180, 220,260, 300,360, 430,480 мОсм. На РИС. 8 видно, что полученная зависимость близка к линейной. Сравнивая между собой зависимости, представленные на Рис. 7 и Рис. 8, можно видеть, что значения V(MKM3) И W(усл. ед.) с помощью линейного преобразования легко пересчитываются друг в друга.

Зависимость объема эритроцитов (V, мкмЗ) от обратной осмотичности (300/и)

Рис. 8 Зависимость эффективного объема эритроцитов усл. ед.) от обратной осмотичности (300/и)

РИС. 9 Калибровочная кривая для определения среднего

объема эритроцитов V(MKM3) ПО величине определяемого методом лазерного цитомониторинга среднего эффективного объема W

На Рис. 9 представлена ка.ыб?оъочная »рквая. позволяющая велд-чз-не среднего эофгктизнсто объема \У(усл, елопределяемого метолом лажркою ишомснлторкша, 01.рсдели:ь реальный средилп обьем .¿гитрс-1Ш10В У(мим3}.

Применялось 1ак:кс влияние изменения формы кяетси на точность метода. Ферма клеток изменялась путем ьведения в раствор 2/1 динитрооечтпа (ксниентр,-шш! -,смV!'), что придавало эритро-игам зхино-1Ш1н>ю форму, а з расхви^е хлорипромгзша с концешрафией 60 мкМ клетки приобретали стоматоштную фор^у. Размер клеток з среде с хло-ропромазином совпадает с условиями, когда данный рсаггнг отсутствует. Еелк среда содержит динифобено I средина размер ,-слеюк яг 0,1-0.2 мк.м ме:1ьше. чем без него. Это, возможно, связанно с тем, ,тто за счет шипов эхиноцктоз характерный размер рассеивающей области клетки становиться меньше.

В Главе 5. рассматривается возможность применения галерного тпгго-моншора для анализа динамики фупвдик распределения клею к при акш-вировании ионофоралш. В буферный раствор с эритроцитами помещается ионофор для каггьция, В спедствип взаимодействия понофора с мембранами клеюк образуются канал ь; т>ьшшош,ие ионам кальция ныхидихь наружу, тем самым привода к увеяичетоо осмотического давления внутри ьлетки. Уравнивая разность осмотических дач некий вода покидает клетку, в результат чею уменьшается ее обьем. Время данного процесса состаа-ляс1 несколько десч! ков чилут.

С помощью лазерного цитомонитора проводилась диагностика данного процесса и регистрировалась динамика функции распределения эритроцитов по размерам. На Рис. 10 показана кинетика изменения средних размеров в течении первых 20-и минут.

В главе также обсуждается возможность применения лазерного цитомонитора для кинетического анализа реактивности клеточных популяций. Сдвиг популяции в сторону меньших размеров и прогрессирование этих изменений можно использовать как неспецифический показатель токсического воздействия на организм факторов внешней среды, а при сопоставлении этих показателей с другими характеристиками «красной» крови - и как специфический показатель воздействия гематропных ядов.

В описанном эксперименте хорошо прослеживается процесс агрегации клеток с образованием кластеров, что еще раз подтверждает возможность использования прибора для наблюдения за быстро протекающими процессами меняющими функцию распределения клеточного сообщества по размерам.

Основные результаты и выводы

Проведенный анализ теоретических и экспериментальных результатов позволяет сделать следующие выводы:

1. Разработана и изготовлена многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор), позволяющая диагностировать поведение клеточного сообщества как в статическом, так и в динамическом режимах. При этом минимальное время съема информации составляет 20 мс. Временной интервал между отдельными измерениями может плавно регулироваться в пределах от 20 мс до десятков минут. Предлагаемый метод кинетического анализа клеточных популяций позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб. Особенность и преимущество предлагаемого метода диагностики состоит, прежде всего, в проведении статистического динамического анализа клеточной популяции в реальном масштабе времени с учетом коллективных процессов, протекающих в клеточном сообществе. Для обслуживания комплекса не требуется высоко квалифицированный персонал.

2. Теоретически показано, что хорошо известный метод К.С.Шифрина по решению обратной задачи рассеяния имеет значительные недостатки, среди которых отметим следующие:

• необходимость предварительного сглаживания индикатрисы рассеяния;

• принципиальная непригодность метода для описания частиц малых размеров;

• возможность наличия в восстановленной функции распределения участков с отрицательными значениями при отсутствии обоснованных путей устранения этого недостатка.

3. Экспериментальные исследования пространственного распределения мелкодисперсной пыли в г. Москве показали, что диаграммы, характеризующие пространственное содержание пыли в воздухе не обладают центральной симметрией и вытянуты вдоль направления, совпадающего с преимущественным направлением розы ветров. Такое совпадение, по-видимому, не случайно и связано с выпадением тяжелой фракции пылевых потоков при пересечении территории города, изобилующей высокими строениями. Наличие повышенного содержания крупных частиц в юго-юго-западном секторе города может быть связано с функционированием вторичных источников пылеобразования, например, в районе между Каширским и Варшавским шоссе, где есть много мелких и крупных промышленных предприятий различного профиля.

4. Проведены измерения индикатрис рассеяния на эритроцитах помещенных в раствор с разной осмотичностью. Характерный размер эритроцитов полученный путем обращения малоугловой индикатрисы рассеяния сравнивался с размером, полученным методом определения клеточного распределения по плотностям в градиенте диметилфталата-диэтилфталата для такой же осмотичности. Результаты полученные обоими методами исследования хорошо согласуются. Что позволяет рекомендовать использование лазерного цитомонитора для данных исследований, и использовать его достоинства, а именно скорость проведения анализа, удобство и простоту в обслуживании.

5. Проверено влияние изменения формы клеток на точность метода. Эхи-ноцитная форма клеток приводила к незначительному уменьшению характерного размера клеток измеренного при помощи лазерного цито-монитора. Придание клетке стоматоцитной формы не повлияло на ее характерный размер.

6. Лазерный цитомонитор позволяет проводить экспресс диагностику динамики функции распределения клеток по размерам. Это подтверждено исследованиями процессов изменения размеров эритроцитов активированных ионофорным веществом. Альтернативные методы исследования динамики данных процессов весьма трудоемки (несколько часов) и не позволяют проводить измерения в начальной фазе изменения размера клетки (первые 5 минут).

7. Проведены исследования и подтверждена возможность использования ПВК «Лазерный цитомонитор» для применения в качестве инструмента по изучению кинетического анализа реактивности клеточных популяций и процессов агрегации клеток с высоким временным разрешением динамических процессов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Александров А.Ф., Свистов Д.А., Тимофеев И.Б., Тимофеев Б.И., Черников В.А., Чижов А.А., Чувашев С.Н. Лазерный цитомонитор // Биомедицинская радиоэлектроника 2000. №5, с. 50-64.

2. Шайтан К.В., Лобков А.Ф., Тимофеев И.Б., Лисовская И.Л., Чижов А.А., Терёшкин Э.В. Метод лазерного цитомониторинга и его применение для определения размеров эритроцитов // Биологические мембраны, 2002, том 19, №3, с. 210-218.

3. Шайтан К.В., Лобков А.Ф., Тимофеев И.Б., Чижов А.А., Терёшкин Э.В. О восстановлении функций распределения для мелкодисперсных и ультрадисперсных сред по рассеянию лазерного излучения. // Электронный журнал "Исследовано в России", 2002, 115, с. 1265-1278. http://zhumal.ape.relam.rU/articles/2002/l15.pdf.

4. Терёшкин Э.В., Лобков А.Ф., Чижов А.А. Регуляризация метода лазерного цитомонитора. // Тезисы докладов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Выпуск 7.- М.: Издательство МГУ, 2002 г. с. 55-56.

ООП Физ ф-та МГУ. Заказ 112-80-04

РНБ Русский фон

2005-4 13830

Введение

Цель работы и постановка задач

Научная новизна работы

Практическое значение работы

Структура и объем диссертации

Глава 1 Литературный обзор

§ 1.1 Дисперсная среда. Экспериментальные подходы в анализе.

§ 1.2 Дисперсная среда. Прямая и обратная задачи рассеяния, теоретические подходы решения.

§ 1.3 Актуальность решения обратной задачи рассеяния в различных областях науки и техники

Глава 2 Программно-вычислительный комплекс — Лазерный цитомонитор.

§ 2.1 Конструктивное исполнение ПВК Лазерного цитомонитора.

§ 2.2 Математический аппарат решения обратной задачи рассеяния

§ 2.3 Экспериментальное подтверждение применимости нового метода решения обратной задачи рассеяния

§ 2.4 Анализ возможностей метода решения обратной задачи малоуглового рассеяния предложенного Шифриным К.С.

§ 2.5 Модернизация ПВК Лазерного цитомонитора

§ 2.6 Методика цитологической диагностики

Глава 3 Использование лазерного цитомонитора для эффективного экологического мониторинга

§ 3.1 Постановка задачи

§ 3.2 Результаты и их обсуждение

Глава 4 Применение лазерного цитомониторинга для определения размеров эритроцитов.

§ 4.1 Постановка задачи

§ 4.2 Результаты и их обсуждение

Глава 5 Использование лазерного цитомонитора для изучения динамики функции распределения

§ 5.1 Постановка задачи

§ 5.2 Результаты и их обсуждение

Дисперсные среды составляют значительную часть окружающей среды, участвуют и в жизнедеятельности человека, и в различных технологических процессах. Особенно важную роль дисперсные среды играют в биологии и медицине, так как в этом случае носителями дисперсности выступают клетки, микроорганизмы, вирусы и т.п. Естественно, что получение новых знаний о состоянии и развитии дисперсных систем является важной задачей научных исследований. При этом значительную роль в таких исследованиях должны играть современные физические методы, использующие последние достижения в математической обработке данных, в оптических технологиях, вычислительной технике.

Высокой эффективности анализа дисперсных сред можно достичь с использованием оптических методов исследования. Важным преимуществом таких методов является безконтактный способ контроля [1]. Наряду с традиционным оптическим контролем с помощью светового микроскопа, все большое распространение получают методы, использующие эффекты рассеяния света и флуоресценции в дисперсной среде. Существует два подхода к исследованию состава дисперсной среды, а именно: методы, базирующиеся на измерениях отклика дисперсной системы как целого, и методы, которые изучают отдельные элементы дисперсной среды. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так достаточно легко построить эксперимент по измерению рассеяния света на ансамбле частиц, однако, извлечение полезной информации о дисперсности системы представляется довольно сложной задачей. С другой стороны, экспериментально достаточно сложно изучать отдельные элементы дисперсности, хотя, при этом определить параметры элемента по оптическим измерениям гораздо легче, чем в первом случае. Фактически перед исследователем стоит задача выбора наиболее эффективного способа решения своих задач с использованием одного из этих двух подходов.

Экспериментальные системы, позволяющие измерять свойства одиночных частиц, все еще достаточно сложны; теоретические разработки, связанные с определением параметров одиночных частиц, малочисленны и малоэффективны. Однако, в последнее время, в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных и появлением на мировом рынке диагностической аппаратуры, в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение оптические анализаторы одиночных частиц.

С другой стороны в настоящее время уже известно много приборов, работающих в различных областях науки и техники, позволяющих проводить оценку характеристик взвесей. Для решения данных задач используются различные подходы и физические теории. Одним из основных методов исследования является оптический метод. Всю доступную оптическим методам информацию о дисперсной среде несет матрица рассеяния света (MFC). Одним из самых ее информативных и часто используемым для анализа светорассеяния элементов является угловая зависимость интенсивности рассеянного света (индикатриса). Однако до недавнего времени полное использование потенциала, заложенного в структуре индикатрисы, было затруднено. В первую очередь, это связано с тем, что подавляющее число экспериментальных работ выполнено на взвесях. Любая взвесь является гетерогенной, т.е. частицы в ней имеют разный размер, форму, структуру, значения оптических констант. Такие распределения оптических свойств, какими бы узкими они не были, сказываются на структуре экспериментальной индикатрисы. Индикатриса получается «размытая» (сглаживаются экстремумы), теряется ее тонкая структура. Вторая причина - отсутствие единой и простой схемы дешифрирования рассеянного излучения разными по размеру и оптическим свойствам частицами. Из-за этого приходится решать обратную задачу каждый раз в оригинальной постановке в рамках конкретного приближения.

В свете вышесказанного, представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). А необходимость создания недорогой, удобной, автоматизированной и достаточно универсальной системы, позволяющей быстро и качественно проводить диагностику взвесей, актуальна и по сей день. Создание такой системы (программно-вычислительного комплекса - лазерного цитомонитора) даст возможность изучать поведение клеточных копуляций, решать экологические задачи по загрязнению атмосферы и водоемов и многое другое.

Подводя итог, можно сказать, что по существующим оценкам, лазерный цитомонитор можно использовать для:

- функционального анализа системы крови, состояния иммунитета, различных систем и органов (материалы пункций, биоптатов и т.д.);

- количественного описания поведения раковой популяции;

- выяснения популяционно-клеточных аспектов старения;

- для контроля терапевтических воздействий;

- разработки новых форм эффективного скрининга лекарств и токсикантов;

- экологического и клинического мониторинга;

- прогнозирования развития различных патологических процессов, их зависимости от терапевтических воздействий;

- высокочувствительной биоиндикации малых доз радиации; а также для решения других задач в различных областях науки и техники, где необходимо решать обратную задачу рассеяния.

Цель работы и постановка задач

Целью диссертационной работы является создание и отладка программно-вычислительного комплекса позволяющего оперативно и достоверно проводить диагностику взвесей с целью определения функции распределения частиц взвеси по размерам. Причем процесс диагностики должен быть автоматизирован, чтобы обслуживание комплекса не требовало высококвалифицированного персонала.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Создать программно-вычислительный комплекс (лазерный цитомонитор) позволяющий проводить измерения индикатрисы рассеяния взвеси частиц в области малых углов. Представление данных об индикатрисе рассеяния должно осуществляться в электронном виде с возможностью дальнейшей обработки и анализа.

2. Разработать и апробировать математический аппарат, способный решать обратную задачу рассеяния для частиц размера 2-100 мкм. Создать программное обеспечение, позволяющее осуществлять удобное управление расчетами функции распределения взвеси по размерам с учетом тематики исследования.

3. Теоретически и экспериментально исследовать применимость нового метода по решению обратной задачи рассеяния при обращении малоугловой индикатрисы, и сравнить результаты с результатами метода, предложенного Шифриным К.С.

4. Провести эксперименты по решению программно-вычислительным комплексом экологической задачи, а именно, для диагностики мелкодисперсной пыли в г. Москве.

5. Провести экспериментальное исследование функции распределения эритроцитов в зависимости от осмотичности раствора. Изучить влияние гиперосмотического воздействия на функцию распределения по размерам эритроцитов.

6. Оценить влияние воздействия химических реагентов, изменяющих форму клетки, на решение обратной задачи рассеяния с помощью лазерного цито-монитора.

7. Изучить возможности использования ПВК лазерного цитомонитора для анализа кинетики (динамики) размеров клеток крови при воздействии на них внешними факторами.

Научная новизна работы

Предложен принципиально новый метод математической обработки экспериментальной индикатрисы рассеяния, дающий возможность учитывать дополнительную информацию о клеточной популяции, что позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб, как в статическом, так и в динамическом режимах. При изучении клеточных распределений по размерам обычно имеют место полимодальные распределения, раскрывающие кластерную природу клеточного сообщества. Динамическими характеристиками клеточной популяции являются уровни "заселенности" кластеров. Скорость реорганизации клеток при переходе из кластера в кластер высока и составляет доли секунды. Используя данную информацию, метод обращения индикатрисы рассеяния в функцию распределения позволяет получать достоверные результаты. Лазерный цитомонитор может эффективно использоваться в медицине, 7 фармакологии и биотехнологии, а также применяться для эффективного экологического мониторинга обширных обитаемых территорий.

Практическое значение работы

На основе оригинальной теории, математических алгоритмов, компьютерных программ и современных технических решений создана многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор) кинетической оценки реактивности клеток человека, животных и растений в реальном масштабе времени. Ее использование позволяет решать самые разнообразные задачи в области экологии, медицины, биотехнологии, фармакологии, сельского хозяйства. Аналитическая система представляет собой комплекс методических и технических средств, работающих в автоматическом режиме.

Лазерный цитомонитор позволяет получить функции распределения клеток по размерам и их эволюцию во времени с разрешением порядка 0,02с. Данная работа также посвящена методическим вопросам определения функций распределения по размерам на биологических объектах и неорганических взвесях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии (170 наименований). Диссертация содержит 121 страницу текста, 28 рисунков и 2 таблицы.

Основные результаты и выводы

1. Разработана и изготовлена многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор), позволяющая диагностировать поведение клеточного сообщества как в статическом, так и в динамическом режимах. При этом минимальное время съема информации составляет 20 мс. Временной интервал между отдельными измерениями может плавно регулироваться в пределах от 20 мс до десятков минут. Предлагаемый метод кинетического анализа клеточных популяций позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб. Особенность и преимущество предлагаемого метода диагностики состоит, прежде всего, в проведении статистического динамического анализа клеточной популяции в реальном масштабе времени с учетом коллективных процессов, протекающих в клеточном сообществе. Для обслуживания комплекса не требуется высоко квалифицированный персонал.

2. Теоретически показано, что хорошо известный метод К.С.Шифрина по решению обратной задачи рассеяния имеет значительные недостатки, среди которых отметим следующие:

• необходимость предварительного сглаживания индикатрисы рассеяния;

• принципиальная непригодность метода для описания частиц малых размеров;

• возможность наличия в восстановленной функции распределения участков с отрицательными значениями при отсутствии обоснованных путей устранения этого недостатка.

3. Экспериментальные исследования пространственного распределения мелкодисперсной пыли в г. Москве показали, что диаграммы, характеризующие пространственное содержание пыли в воздухе не обладают центральной симметрией и вытянуты вдоль направления, совпадающего с преимущественным направлением розы ветров. Такое совпадение, по-видимому, не случайно и связано с выпадением тяжелой фракции пылевых потоков при пересечении территории города, изобилующей высокими строениями. Наличие повышенного содержания крупных частиц в юго-юго-западном секторе города может быть связано с функционированием вторичных источников пылеобразования, например, в районе между Каширским и Варшавским шоссе, где есть много мелких и крупных промышленных предприятий различного профиля.

4. Проведены измерения индикатрис рассеяния на эритроцитах помещенных в раствор с разной осмотичностью. Характерный размер эритроцитов полученный путем обращения малоугловой индикатрисы рассеяния сравнивался с размером, полученным методом определения клеточного распределения по плотностям в градиенте диметилфталата-диэтилфталата для такой же осмотичности. Результаты полученные обоими методами исследования хорошо согласуются. Что позволяет рекомендовать использование лазерного цитомонитора для данных исследований, и использовать его достоинства, а именно скорость проведения анализа, удобство и простоту в обслуживании.

5. Проверено влияние изменения формы клеток на точность метода. Эхино-цитная форма клеток приводила к незначительному уменьшению характерного размера клеток измеренного при помощи лазерного цитомонитора. Придание клетке стоматоцитной формы не повлияло на ее характерный размер.

6. Лазерный цитомонитор позволяет проводить экспресс диагностику динамики функции распределения клеток по размерам. Это подтверждено исследованиями процессов изменения размера эритроцитов, активированных ионофорным веществом. Альтернативные методы исследования динамики данных процессов весьма трудоемки (несколько часов) и не позволяют проводить измерения в начальной фазе изменения размера клетки (первые 5 минут).

7. Проведены исследования и подтверждена возможность использования ПВК «Лазерный цитомонитор» для применения в качестве инструмента по изучению кинетического анализа реактивности клеточных популяций и процессов агрегации клеток с высоким временным разрешением динамических процессов.

Автор выражает особую признательность КБ. Тимофееву и В.А. Черникову за руководство и постоянную поддержку при выполнении данной работы, а также всем соавторам за помощь и разрешение использовать в диссертации совместно полученные результаты.

Автор благодарен Б. И. Тимофееву за неоценимую помощь в разработке аппаратной части и программного обеспечения ПВК Лазерный цитомонитор, С.Н. Чувашеву за участие в обсуждении и интерпретации результатов расчета.

Автор выражает благодарность КВ. Шайтану, А.Ф. Лобкову, а также Гематологическому центру Российской академии медицинских наук в лице И.Л. Лисовской и Ф.И. Атауллаханова за постановку интересных прикладных задач в области биологии и медицины, обсуждение результатов и помощь в оформлении совместных работ.

Автор признателен профессору А. Ф. Александрову за поддержку и полезные контакты на разных этапах выполнения данной работы.

Автор благодарен Красногорскому оптико-механическому заводу им. С.А. Зверева в лице директора А.ИГоева, главного инженера В.В. Потело-ва и В.М. Румянцева за изготовление малой серии опытной партии программно-аппаратных комплексов, позволившей провести эксперименты.

1. Damaschke N., Gouesbet G., Grehan G., and Тгореа C. Optical technique for the characterization of non-spherical and non-homogeneous particles. // Measurement Science and Technology. - 1998. - V. 9. - P. 137 - 140.

2. Стейнкамп Дж. Цитометрия в потоке // Приборы для научных исследований. 1984. - N9. - С. 3-35.

3. Melamed M.R., Lindmo Т., and Mendelsohn M.L. (Eds). Flow cytometry and sorting. New York: Wiley-Liss, 1990. - 1140 c.

4. Cram L.S., Martin J.C., Steinkamp J.A., Ioshida T.M., Buican T.N., Marrone B.L., Jett J.H., Salzman G. and Sklar L. New flow cytometryc capabilities at the national flow cytometry resource. // Proceedings of the IEEE. 1992. - V. 80. -P. 912-917.

5. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. // Review of Scientific Instruments. 2000. - V. 71. - P. 243 - 255.

6. Roberts D. Particle sizing instrument for agrochemical and other industries. // American Laboratory. 1996. - V. 28. - P. 23 - 23.

7. Kachel V. Electrical resistance pulse sizing: Coulter sizing. // In: Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, eds. New York: Wiley, 1990. P. 45 - 81.

8. Coulter W.H. Means for counting particles suspended in a fluid. // US Patent No. 265508.1953.

9. Palmer A.T., Logiudice P.J., and Cowley J. Comparison of sizing results obtained with electrolyte volume displacement laser light scattering instrumentation. //American Laboratory. 1994. - V. 26. - P. 17 - 17.

10. Horan P.K., Muirhead K.A. and Slezak S.E. Standards and controls in flow cytometry. // In: Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, eds. New York: Wiley, 1990. - P. 397 - 415.

11. Salzman G.C., Singham S.B., Johnston R.G. and Bohren C.F. Light scattering and cytometry. // In: Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, eds. New York: Wiley, 1990. - P. 81 -109.

12. Wheeless L.L. Slit-Scanning. // In: Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, eds. New York: Wiley, 1990. P. 109- 127.

13. Loken M.R., Sweet R.G .and Herzenberg L.A. Cell discrimination by mul-tiangle light scattering. // J. Histochem. Cytochem. 1976. - V. 24, - P. 284291.

14. Сидько Ф.Я., Лопатин B.H. и Парамонов Л.Е. Поляризационные характеристики взвесей биологических частиц. Новосибирск: Наука, 1990. -120 с.

15. Ashkin A., Dziedzic J. М. Applied Optics. 1980. - V. 19. - P. 660.

16. Phillips D.T., Wyatt P. J., and Berkman R.M. Measurement of the Lorenz-Mie scattering of a single particle: polystyrene latex. // J. Colloid Interface Sci. -1970.-V. 34.-P. 159-162.

17. Wyatt P.J. Light scattering in the microbial world. // Journal Colloid and Interface Science. 1972. - V. 39. - P. 479-491.

18. Stull V.R. Size distribution of bacterial cells // J. Bacteriol. 1972. - V. 109. -P. 1301-1303.

19. Bartholdi M., Salzman G.C., Heibert R.D., and Kerker M. Differential light scattering photometer for rapid analysis of single particles in flow. // Applied Optics. 1980. - V. 19. - P. 1573 - 1584.

20. Ludlow I.A. and Kaye P.H. A scanning diffractometer for the rapid analysis of microparticles and biological cells. // J. Colloid Interface Sci. 1979. - V. 69. - P. 571 - 589.

21. Chernyshev A.V., Prots V.I., Doroshkin A.A., and Maltsev V.P. Measurement of scattering properties of individual particles with a scanning flow cy-tometer. //Applied Optics. 1995.- V. 34, N27. - P. 6301-6305.

22. Cooke D.D. and Kerker M. Particle size distribution of colloidal suspensions by light scattering based upon single particle counts-polystyrene latex. // J. Colloid Interface Sci. 1973. - V. 42. - P. 150-155.

23. Asano S. and Yamamoto G. Light scattering by a spheroidal particle. // Applied Optics. 1975. - V. 14. - P. 29 - 49.

24. Barber P.W. and Yeh C. Scattering of electromagnetic waves by arbitrarily shaped dielectric bodies. // Applied Optics. 1975. - V. 14. - P. 2864 -2872.216

25. Chevaillier J.P., Fabre J., Grehan G., and Gouesbet G. Comparison of diffraction theory and generalized Lorenz-Mie theory for a sphere located on the axis of a laser beam. // Applied Optics. 1990. - V. 29. - P. 1293 - 1298.

26. Draine B.T. and Flatau P.J. Discrete-dipole approximation for scattering calculations. // Journal of Optical Society of America A. 1994. - V. 11. - P. 1491 -1499.

27. Mishchenko M.I., Travis L.D., and Mackowski D.W. T-matrix computations of light scattering by nonspherical particles: A review. // Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer. 1996. - V. 55. - P. 535 - 575.

28. Acquista Ch. Light scattering by tenuous particles: a generalization of the Rayleigh-Gans-Rocard approach. // Applied Optics. 1976. - V. 15. - P. 2932 - 2936.

29. Chiappetta P. and Torresani B. Some approximate methods for computing elecromagnetic fields scattered by complex objects. // Measurement Science and Technology. 1998. - V. 9. - P. 171 - 182.

30. Marx E. and Mulholland G.W. Size and refractive index determination of single polystyrene spheres. // J. of the National Bureau of Standards. 1983. -V. 88.-P. 321-338.

31. Doornbos R.M.P., Schaeffer M., Hoekstra A.G., Sloot P.M.A., Degrooth

32. B.G., and Greve J. Elastic light-scattering measurements of single biological cells in an optical trap. // Applied Optics. 1996. - V. 35. - P. 729 - 734.217

33. Hirst E. and Kaye P.H. Experimental and theoretical light scattering profiles from spherical and nonspherical particles. // Journal of Geophysical Research. 1997. - V. 101. - P. 19231 - 19235.

34. Kaye P.H., Alexander-Buckley K., Hirst E., Saunders S., and Clark J.M. A real-time monitoring system for airborne particle shape and size analysis. // Journal of Geophysical Research. -1996. V. 101. - P. 19215 - 19221.

35. Latimer P. Light scattering and absorption as method of studying cell population parameters. // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1982. - V. 11. - P. 129-150.

36. Безрукова А.Г. и Владимирская И.К. Информативность параметров светорассеяния при исследовании клеток. // Цитология. 1982. - Т. 24, N5.1. C. 507-521.

37. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно- неоднородных средах. Москва: Мир, 1981. - Ч. 1. - 280 с.

38. Wyatt P.J., Schehrer K.L., Phillips S.D., Jackson С., Yu-Jain Chang, Parker R. G., Phillips D. Т., and Bottiger J. R. Aerosol particle analyzer. // Applied Optics. 1988. - V. 27. - P. 217-221.

39. Quist G.M. and Wyatt P.J. Empirical solution to the inverse-scattering problem by the optical strip-map technique // J. Opt. Soc. Am. A2. 1985. - P. 1979- 1986.

40. Jones M.R., Leong K.H., Brewster M.Q., and Curry B.P. Inversion of Light-Scattering Measurements for Particle Size and Optical Constants: experimental study. //Applied.Optics. 1994. - V. 33. - P. 4025-4034.

41. Ludlow I.K. and Everitt J. Application of Gegenbauer analysis to light scattering from spheres: Theory. // Physical Review E. 1995. - V. 51. - P. 2516 -2526.

42. Ludlow I.K. and Everitt J. Systematic behavior of the Mie scattering coefficients of spheres as a function of order. // Physical Review E. 1996. - V. 53. -P. 2909 - 2924.218

43. Min S. and Gomez A. High-resolution size measurement of single spherical particles with a fast Fourier transform of the angular scattering intensity. // Applied Optics. 1996. - V. 35. - P. 4919 - 4926.

44. Warner T.L. and Hirleman E.D. Toward Classification of Particle Properties Using Light Scattering Techniques. // Journal of the Institute of Environmental Science. 1997. - V. 40. - P. 15 - 21.

45. Ulanowski Z., Wang Z., Kaye P.H., and Ludlow I.K. Application of Neural Networks to the Inverse Light Scattering Problem for Spheres. // Applied Optics. 1998. - V. 37. - P. 4027 - 4033.

46. Borovoi A.G., Naats E.I., and Oppel U.G. Scattering of light by a red blood cell. // Journal of Biomedical Optics. 1998. - V. 3. - P. 364 - 372.

47. Hammer M., Schweitzer D., Michel В., Thamm E., and Kolb A. Single Scattering by Red Blood Cells. // Applied Optics. 1998. - V. 37. - P. 7410 -7418.

48. Nilsson A.M.K., Alsholm P., Karlsson A., and Andersson-Engels S. T-matrix computations of light scattering by red blood cells. // Applied Optics. 1998. -V. 37. - P. 2735 - 2748.

49. Uzunoglu N.K., Yova D., and Stamatakos G.S. Light scattering by paralogical and deformed erythrocytes: an integral equation model. // Journal of Biomedical Optics. 1997. - V. 2. - P. 310 - 318.

50. Bedner E., Burfeind P., Gorczyca W., Melamed M.R., and Darzynkiewicz Z. Laser scanning cytometry distinguishes lymphocytes, monocytes, and granulocytes by differences in their chromatin structure. // Cytometry. 1997. -V. 29.-P. 191 - 196.

51. Adams K.H. Mechanical Deformability of Biological Membranes and the Sphering of Erythrocyte. // Biophysical Journal. 1973. - V. 13. - P. 209 -217.

52. Doornbos R.M.P., Hennink E.J., Putman C.A., de Grooth B.G., and Greve J. White blood cell differentiation using a solid state flow cytometer. // Cytometry. 1993. - V. 14. - P. 589 - 594.

53. Lavigne S., Bossa M., Boulet L.-P., and Laviolette M. Identification and analysis of eosinophils by flow cytometry using the depolarized side scatter-saponin method. // Cytometry. 1997. - V. 29. - P. 197 - 203.

54. Keller H.U., Fedier A., and Rohner R. Relationship between light scattering in flow cytometry and changes in shape, volume, and actin polymerization in human polymorphonuclear leukocytes. // Journal of Leukocyte Biology. -1995.-V. 58.-P. 519-525.

55. Eisele S., Lackie J.M., Riedwyl H., Zimmermann A., and Keller H.U. Analysis of lymphocyte shape by visual classification, calculated measures of shape or light scattering. // J Immunol.Methods. -1991. V. 138. - P.103 - 109.

56. Ormerod M.G., Paul F., Cheetham M., and Sun X.M. Discrimination of apop-totic thymocytes by forward light scatter. // Cytometry. 1995. - V. 21. - P. 300 -304.

57. Голиков.В.И. Установка для измерения спектра размеров сферических частиц и капель туманов. Труды ГГО. 1961. вып 118.

58. Байвель.Л.П.ДГагунов.А.С Прибор для непосредственной записи индикатрисы рассеяния света при измерениях дисперсности жидкой фазы взвешенной в потоке. Труды ЦКТ. 1966.

59. Байвель.Л.П.JIaryHOB.A.C. Универсальный электронно-оптический прибор для контроля спектра размеров частиц. Приборы и системы управления. N 6.1974.

60. Байвель.Л.П.ДГагунов.А.С. Измерение распределения по размерам взвешенных в потоке частиц методом малых углов, 1969, ИФЖ, N 3

61. Felton,P.G. Measurments of particle/droplet size distribution by a laser diffraction technique.,Proc. of 2th European Symp.on Particle Caracterisation. PARTEC.Nuremberg. 1979

62. Swithenbank et al. A laser diagnostic technique for measurment of droplet and particle size disribution. AAIA, 16:79. 1976

63. Malvern particle sizer. Ser.1800 and 2600. Malvern Instr. England

64. Stiefel.E. Einfuchrung in die numershe matematik. B.G.Tubenr Verlagsges-selshaft, Stutgard6669,70,71,72,73,74,75,76,77,78.