Мезопористые кремнеземы как носители для белков на примере гемоглобина и пероксидазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ОВСЯННИКОВ Роман Алексеевич

МЕЗОПОРИСТЫЕ КРЕМНЕЗЕМЫ КАК НОСИТЕЛИ ДЛЯ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ ГЕМОГЛОБИНА И ПЕРОКСИДАЗЫ

02.00.15 — Кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва — 2011

4846089

Работа выполнена в лаборатории кинетики и катализа кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Атякшева Лариса Федоровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Левашов Андрей Вадимович Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

доктор химических наук, профессор Лебедева Ольга Евгеньевна Белгородский государственный университет

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии имени А. Н. Баха РАН

Защита диссертационной работы состоится «3» июня 2011 года в «15:00» на заседании диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ, аудитория 337.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова. Автореферат разослан «29» апреля 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Бобылёва М. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Интерес к биокаталитическим системам на основе иммобилизованных ферментов обусловлен их применением в качестве гетерогенных катализаторов, компонентов биосенсоров нового поколения, элементов биотопливных ячеек. Адсорбционная иммобилизация ферментов на мезопористых молекулярных ситах привлекает внимание исследователей на протяжении последних пятнадцати лет, с момента синтеза первых представителей этого класса адсорбентов — МСМ-41 и SBA-15.

К настоящему времени опубликованы результаты исследований адсорбции различных белков, в том числе гемоглобина и пероксидазы, на мезопористых молекулярных ситах структурных типов МСМ, SBA, FSM, однако полученные данные зачастую сильно расходятся или даже противоречат друг другу. В последние 2-3 года появились первые публикации по адсорбции белков на углеродных и кремнеземных адсорбентах с бимодальным распределением пор, однако они пока что немногочисленны. В литературе также нет достаточных сведений о закономерностях формирования структуры таких адсорбентов.

Цель и задачи исследования

Цель работы — установить основные закономерности адсорбции белков и каталитических свойств адсорбированных ферментов на мезопористых кремнеземах с различным характером пористости.

В связи с поставленной целью основные задачи исследования можно сформулировать следующим образом:

1) изучить факторы, определяющие формирование пористой структуры мезопористых кремнеземов с моно- и бимодальным распределением пор;

2) установить взаимосвязь между адсорбцией гемоглобина и пероксидазы на мезопористых кремнеземах и характером пористости адсорбента;

3) сравнить каталитические свойства адсорбционных слоев пероксидазы на различных носителях.

Научная новизна

Впервые установлены основные факторы, определяющие размер и распределение пор в бипористых кремнеземах, полученных в системе «Si02 — бромид цетилтриметиламмония — триметилбензол». Изменение рН реакционной смеси, концентрации ЦТАБ и ТМБ и температуры синтеза позволяет регулировать объем и соотношение пор разного размера.

Впервые проведено систематическое исследование адсорбции двух белков на мезопористых адсорбентах с моно- и бимодальным распределением пор. Установлено, что для адсорбции белка доступны поры, диаметр которых превышает размер молекул белка по крайней мере в полтора-два раза.

На примере пероксидазы впервые показано, что фермент на поверхности бипористых кремнеземов обладает более высокой каталитической активностью по сравнению с ферментом на поверхности кремнеземов с однородными порами.

Впервые показано различие в механизме адсорбции гемоглобина и пероксидазы на кремнеземных адсорбентах.

Практическая значимость

Полученные в работе результаты представляют практический интерес при разработке биосенсоров на основе иммобилизованных гемоглобина и пероксидазы. Синтезированные адсорбенты с бимодальным распределением пор могут быть использованы как эффективные носители для ферментов в различных каталитических и биотехнологических процессах.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, Россия, 2008), XVI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009», 5-м Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах и 3 тезисов докладов на международных и российских конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), экспериментальной части (глава 3), результатов и их обсуждения (главы 4, 5 и 6), выводов и списка цитируемой литературы.

Во введении обоснована необходимость детального исследования адсорбции белков на мезопористых кремнеземах. В главе 1 дан обзор основных методов иммобилизации белков на твердых носителях и рассмотрены современные методы синтеза мезопористых кремнеземов. Проанализированы различные механизмы мицеллярного темплатирования, способы регулирования размера пор в синтезируемых адсорбентах. В главе 2 подробно проанализированы опубликованные к настоящему времени результаты исследования адсорбции белков на различных кремнеземных адсорбентах. Сопоставлены величины адсорбции, полученные разными авторами, взаимосвязь величины адсорбции с размером пор адсорбентов. Проанализированы немногочисленные данные по каталитической активности ферментов, иммобилизованных на мезопористых молекулярных ситах.

В экспериментальной части (глава 3) описаны методики синтеза и постсинтетической обработки адсорбентов, описаны физико-химические методы исследования образцов. Приведены также методики исследования адсорбции и каталитических свойств адсорбционных слоев пероксидазы, указаны способы обработки экспериментальных данных.

В главах 4, 5 и 6 приведены экспериментальные данные и проведен детальный анализ полученных результатов с привлечением имеющихся литературных данных.

Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 70 рисунков и 38 таблиц. Список литературы включает 310 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методы исследования

В таблице 1 приведены основные параметры пористой структуры адсорбентов, исследованных в данной работе. Образцы 1-3 синтезированы по стандартным методикам. При синтезе образцов 4-10 исследовано влияние различных факторов на закономерности формирования пористой структуры. Образцы 11-14 — адсорбенты промышленного производства.

Таблица 1. Текстурные характеристики адсорбентов

№ адсорбент маркировка Ббэт, М2/Г V, см3/г Омане, НМ

1 кремнезем МСМ-41 МСМ-41 1000 1.5 6.0

2 кремнезем 8ВА-15 БВА-15 1000 1.2 9.5

3 алюмосиликат БВА-15 АС-БВА-15 370 1.3 20

4 мезопористый кремнезем МК-1 670 0.6 нет

5 мезопористый кремнезем МК-2 500 0.4 3.0

6 бипористый кремнезем БК-1 790 1.9 3 и ~45

7 бипористый кремнезем БК-2 915 2.3 4 и-45

8 бипористый кремнезем БК-3 720 2.1 9 и-60

9 бипористый кремнезем БК-4 810 2.2 5.5 и -50

10 бипористый алюмосиликат БАС 840 2.1 3 и -30

11 силохром С-120 С-120 120 1.0 45

12 силохром широкопористый силохром 40 не опред. не опред.

13 силикагель гидротермальный силикагель 20 не опред. не опред.

14 у-оксид алюминия А120З 240 0.6 10

Образцы МК-1 и МК-2 синтезированы из тетраэтоксисилана в присутствии полиэтиленгликолей с молекулярной массой 4000 и 35 ООО, соответственно. Бипористые кремнеземы и бипористый алюмосиликат синтезированы с использованием силиката натрия в качестве источника кремния и бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ) в качестве темплата. В качестве расширителя пор использовали триметилбензол (ТМБ).

Параметры пористой структуры адсорбентов получены методом низкотемпературной адсорбции азота. Физико-химические характеристики материалов исследованы методами просвечивающей (ПЭМ) электронной микроскопии, термопрограммированной десорбции аммиака (ТПД ЫН3), термогравиметрического (ТГА) и дифференциально-термического (ДТА) анализа, ИК спектроскопии.

Исследована адсорбция гемоглобина и пероксидазы — гемсодержащих белков, различающихся своими функциями, олигомерным составом, размером молекул и другими свойствами.

Таблица 2. Свойства исследованных белков

Белок мг олигомерный состав О, нм Р1

гемоглобин бычий (НЬ) 65 000 тетрамер 6.2 6.9

пероксидаза хрена (НИР) 39 000 мономер 4.6 5.7

Адсорбцию проводили при температуре 6 °С из водных растворов белков. Величину адсорбции рассчитывали по разнице концентраций белка в контактном растворе и контрольной пробе. Исследования вели в диапазоне начальных концентраций 10-300 мкг/мл для пероксидазы и 20-600 мкг/мл для гемоглобина. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 400 нм. Время адсорбции составляло от 1 до 500 часов для гемоглобина и от 1 до 70 часов для пероксидазы.

Каталитическую активность пероксидазы определяли в модельной реакции пероксидазного окисления йодида калия.

Кинетический анализ адсорбции проведен в рамках кинетической схемы двухстадийной адсорбции (1) с обратимой первой стадией (Полторак О.М., Пряхин А.Н., Чухрай Е.С. 1982):

Е + П<=^-=>ЕОс,—Ь->ЕС1пр (1)

к л

В этой схеме Е — белок (фермент) в растворе, О — контактная площадка носителя, £Ц,, и £1\„р — соответственно слабо и прочно связанное состояние белка на поверхности, к\, к-ь и к2 — константы скорости адсорбции, десорбции и прочного связывания соответственно.

Для обработки экспериментальных данных использовали уравнение (2):

Применение этого уравнения позволило установить кинетический механизм адсорбции и рассчитать константы скорости обратимой стадии.

Для определения механизма адсорбции использовали зависимости функции F= С(1-0)/0 от 9 (Полторак О.М, Пряхин А.Н., Чухрай Е.С., 1977).

2. Синтез бипористых кремнеземов

Формирование мезопористой структуры при синтезе кремнеземов изучали в системе «Si02 — бромид цетилтриметиламмония — триметилбензол». В таких системах пористая структура является результатом взаимодействия между силикатными ионами и мезофазой ПАВ. Поэтому параметры продукта этого взаимодействия — пористого кремнезема — могут регулироваться при изменении как свойств силикатных ионов, так и свойств мезофазы ПАВ. В качестве факторов, влияющих на пористую структуру кремнеземов, были изучены:

1) рН реакционной смеси, определяющий степень полимеризации силикатных ионов и, следовательно, их размеры;

2) концентрация темплата, влияющая на характер организации мицелл

3) использование солюбилизата (триметилбензола), приводящее к увеличению размера мицеллы ПАВ;

4) температура синтеза.

В выбранных условиях синтеза (источник БЮг — свежеосажденный кремнегель, Н20/8Ю2= 55, ЦТАБ/8Ю2 = 0.2) установлено, что мезопористый кремнезем со структурой МСМ-41 (Опор = 3 нм) образуется при рН 11 (рис. 1, пик I). Уменьшение рН осаждения геля приводит к образованию бипористых материалов, на кривых распределения пор которых появляется второй максимум в области 20-100 нм (пик II). Интенсивность пика I при этом снижается, что свидетельствует об уменьшении в материале доли пор с диаметром 3 нм.

Наблюдаемые изменения могут быть объяснены с учетом изменения свойств силикатных ионов. Уменьшение рН кремнеземных гидрогелей

(2)

ПАВ;

в области щелочных рН приводит к увеличению степени полимеризации, укрупнению силикатных анионов и одновременному уменьшению их заряда. Присутствие в реакционном объеме крупных олигомерных силикат-ионов, заменяющих галогенид-ионы на поверхности мицелл ПАВ, может приводить к 200 о, А частичному разрушению упоря-

Рис. 1. Кривые распределения пор по д0чеНной гексагональной упаков-диаметрам для образцов, полученных при

рН 11 (—) и при рН 10 (- -) ' ки трубчатых мицелл ПАВ и их

дополнительной агрегации. В результате формируются новые, более крупные фрагменты мезофазы ПАВ — темплат для широких пор с диаметром 20-100 нм.

Снижение заряда крупных силикатных ионов приводит к тому, что они слабее взаимодействуют с ассоциатами ПАВ. Данные ДТА позволили установить, что, в отличие от мицелл ПАВ в порах с диаметром 3 нм, удаляющихся только при прокаливании, из пор диаметром 20-80 нм ЦТАБ легко удаляется при промывании после синтеза.

^астч Ч»

б) рН 10

■' .

50 пт

Рис. 2. Электронно-микроскопические изображения (ПЭМ) образцов, полученных а) при рН 11 (МСМ-41); б) при рН 10 (БК-1)

Различия в текстуре полученных материалов видны на микрофотографиях, приведенных на рис. 2. При рН 11 в материале заметны гексагонально упорядоченные поры (структура типа МСМ-41), в то время как при рН 10 поры в материале более крупные и распределены случайным образом.

Таким образом, пористая структура кремнеземов, синтезированных при рН 10, образована порами двух типов: I — с диаметром 3 нм и II — с диаметром 20-80 нм. Определение условий синтеза кремнеземов, позволяющих изменять соотношения объемов пор в пользу пор II типа, позволит решить задачу целенаправленного регулирования свойств сорбентов для иммобилизации ферментов.

Влияние концентрации темплата

Увеличение концентрации ПАВ в реакционной смеси от 5 до 20 % мае. (рН кремнегеля = 10, Н20/8Ю2 = 55, температура синтеза 100 °С) приводит к росту объема пор в получаемых материалах более чем в два раза (рис. 3). Увеличение объема пор сопровождается изменением соотношения его

составляющих: объем пор I типа (Б = 3 нм) проходит через максимум при концентрации темплата 14% мае., а объем пор II типа (Б = 60-80 нм) монотонно возрастает. Очевидно, синтез кремнеземов при концентрации темплата 20 % мае. сопряжен с частичным разрушением гексагональной упаковки мицелл ЦТАБ, образованием более крупных агрегатов ПАВ и, как следствие, прогрессивным формированием пор II типа.

Влияние концентрации триметилбензола

Увеличение размера пор мезопористых кремнеземов может быть достигнуто с использованием явления солюбилизации — увеличения размера мицелл при вхождении органических молекул в гидрофобную часть

и поры I в поры II

^ 1,4

5% 10% 14% 20%

концентрация ЦТАБ Рис. 3. Изменение объема пор I и II с ростом концентрации ЦТАБ в реакционной смеси

мезофазы ПАВ. По литературным данным введение триметилбензола (ТМБ) в реакционную смесь при рН 11 позволяет увеличить диаметр пор с 3 до 10 нм, сохранив при этом гексагональную симметрию пор материала МСМ-41.

Влияние ТМБ на формирование

—■—только ЦТАБ —в—ТМБ/ЦТАБ = 1 -й- ТМБ/ЦТАБ = 2

бипористых кремнеземов (рН = 10, H20/Si02 = 55, температура синтеза 100 °С) исследовали в диапазоне мольных соотношений ТМБ/ЦТАБ от 1 до 4. Введение уже небольшого количества ТМБ изменяет характер пористости материала (рис. 4) вследствие изменения структуры 20 2оо D д мезофазы ПАВ в растворе.

Рис. 4. Изменение характера пористости Интенсивность пика 1 на кривой кремнеземов при введении ТМБ распределения пор уменьшается,

пик становится шире, смещаясь в область больших диаметров пор. Интенсивность второго максимума при этом увеличивается, но он несколько смещается в область пор меньшего диаметра.

При дальнейшем увеличении содержания ТМБ (ТМБ/ЦТАБ = 2-4) на кривой распределения появляются уже не два, а три-четыре максимума

поры I ■ поры II

i,6

£ 1,2

£ 0,8

0J

,0

ю

о

0,4

0

0

12 3 4 ТМБ/ЦТАБ Рис. 5. Изменение объема пор I и II с ростом отношения ТМБ/ЦТАБ в реакционной смеси

сравнимой интенсивности (рис. 4). По-видимому, в процессе синтеза образуется мезофаза «ЦТАБ-ТМБ», состоящая из агрегатов молекул разного размера и формы. Распределение темплата в системе носит случайный характер, о чем свидетельствует отсутствие монотонной зависимости диаметра пор I и II от содержания триметилбензола (рис. 5). Таким образом, корреляции между содержанием ТМБ в реакционной смеси и диаметрами пор I и II типа установить не удалось.

Влияние температуры синтеза

Влияние температуры на параметры пористой структуры кремнеземных адсорбентов исследовано в диапазоне 80-120 °С (рН кремнегеля = 10, Н20/8Ю2 = 55, ЦТАБ/БЮг = 0.2). Согласно фазовой диаграмме водного раствора ЦТАБ, в данной области температур при концентрации 14 % фазовый состав системы не меняется. Это объясняет тот факт, что величина объема пор первого типа не зависит от температуры синтеза (рис. 6).

Одновременно с этим объем пор второго типа уменьшается примерно вдвое — с 1.5 до 0.7 см3/г (рис. 6). Их диаметр при этом монотонно возрастает с 50 до 80 нм. Наблюдаемые изменения могут быть связаны с большей скоростью реакции поликонденсации кремнеземных фрагментов и образованием более плотных фаз с ростом температуры.

Проведенное исследование показало, что в системе «8Ю2-ЦТАБ» при рН 10 происходит частичное деструктурирование мезофазы ПАВ, что позволяет получать материалы с бимодальным распределением пор.

Изменение условий приготовления позволяет регулировать не только объем, но и диаметр пор первого и второго типа в бипористых кремнеземах. Повышение диаметров пор I и II достигается введением триметилбензола и повышением температуры синтез. Наибольшая доля пор II типа достигается в условиях: рН 10, концентрация ЦТАБ 20 % мае., температура 80-100 °С.

3. Свойства поверхности пористых кремнеземов

Для оценки количества адсорбционных центров на поверхности различных кремнеземов использовали ИК спектроскопию, термопрограммированную десорбцию аммиака (ТПД >1Нз), термогравиметрический (ТГА) анализ.

На рис. 7, а приведены фрагменты ИК спектров изученных образцов в области 3600-3800 см-1. Изолированным ОН-группам на поверхности БЮ2 отвечает характеристическая полоса 3745 см4. Широкий пик с максимумом

10

ш поры I в поры II

1,6 -

80 90 100 110 120 температура, °С

Рис. 6. Изменение объема пор I и II с ростом температуры синтеза

3640 см"1, соответствующий связанным ОН-группам, исчезает после откачки образца в вакууме при 450 °С.

На рис. 7, б приведены спектры ТПД аммиака для нескольких исследованных образцов. В таблице 3 приведены результаты обработки экспериментальных данных.

3800 3750 3700 3650 волновое ЧИСЛО, СЛЛ"1

3600

100 200 температура, "С

300

б) спектры ТПД N113 кремнеземов

Рис. 7. а) ИК спектры образков кремнеземов в области валентных колебаний ОН-групп

Из спектров ТПД N11] рассчитывали число центров связывания аммиака, из площадей полос 3745 см"' в ИК спектрах оценивали относительное содержание свободных гидроксильных групп на поверхности адсорбентов. Для определения общего содержания гидроксильных групп использовали данные ТГА по количеству воды, удаляемой с поверхности адсорбентов в интервале температур 175-800 °С.

Таблица 3. Концентрация на поверхности кремнеземных адсорбентов центров связывания аммиака (яо) по данным ТПД 1ЧНз, ОН-групп (ион) по данным ТГА и относительное содержание свободных ОН-групп (83745) по данным ИК спектроскопии

Образец Б, м2/г а0, 1/нм2 «он, 1/нм2 Б3745, о.е./нм2

БК-2 915 0.0134 3.1 1.0

МСМ-41 1000 0.0075 2.7 0.4

МК-2 550 0.0086 1.9 0.4

силохром 40 не опред. 5.9 0.7

Количество адсорбционных центров на поверхности 8Ю2 зависит от природы материала. Наибольшая концентрация гидроксильных групп

соответствует силохрому, а на поверхности бипористых кремнеземов больше всего свободных гидроксильных групп. Содержание центров связывания аммиака на два порядка ниже содержания гидроксильных групп.

4. Изотермы адсорбции гемоглобина и пепоксидазы

На рис. 8 приведены изотермы адсорбции гемоглобина на бипористом кремнеземе при разных временах адсорбции (8, а) и изотермы адсорбции гемоглобина на других мезопористых и широкопористых адсорбентах (8, б). Из приведенных данных видно, что адсорбция на бипористом адсорбенте (мг/г) выше на порядок. Изотермы адсорбции гемоглобина на всех бипористых адсорбентах с увеличением продолжительности эксперимента достигают насыщения и приобретают вид, характерный для необратимой адсорбции (рис. 8, а).

Рис. 8. Изотермы адсорбции гемоглобина: а) на бипористом кремнеземе БК-4 при разных временах адсорбции; б) на снлохроме (1), МСМ-41 (2), МК-1 (3), МК-2 (4) и силикагеле (5) при времени адсорбции 5 суток

Изотермы адсорбции гемоглобина на всех других исследованных адсорбентах (рис. 8, б и 9, а) формально подчиняются уравнению Ленгмюра (рис. 9, б). Величина адсорбции на этих адсорбентах также зависит от времени контакта белка с адсорбентом. Изотермы адсорбции белка при разных временах получены нами впервые. Интересным является тот факт, что независимо от времени адсорбции обработка изотерм в двойных обратных координатах (рис. 9, б) дает одну и ту же величину для предельной адсорбции (емкости монослоя).

5

О 50 100 150 200

С, мкг/мл

О 100 200 300 400

С, мкг/мл

200 -

150

S <

100

50

♦ 1 сутки □ 5 суток Л 12 суток

а

: и ! ❖

0,02 0,016 0,012 0,008 -0,004

f iff'

♦ 1 сутки □ 5 суток А12 суток

0 П~

б)

50

100 150 С, мкг/мл

200

0,1 0,2 1/С, мл/мкг

0,3

Рис. 9. Изотермы адсорбции гемоглобина на алюмосиликате со структурой 8ВЛ-15 при разных временах адсорбции и спрямление их в координатах Ленгмюра

Для пероксидазы получены

изотермы адсорбции Б-типа на всех

адсорбентах (рис. 10). Такой тип

изотерм свидетельствует о сильном

межбелковом взаимодействии на

поверхности. Изотермы адсорбции

пероксидазы спрямляются в

двойных обратных координатах

при концентрациях, превышающих

70 мкг/мл, что позволило оценить

предельные величины адсорбции

для каждого адсорбента.

100 150 С, мкг/мл

Рис. 10. Изотермы адсорбции пероксидазы на кремнеземах и оксиде алюминия. Время адсорбции 25 часов

5. Кинетика и механизм адсорбции

Кинетика адсорбции гемоглобина исследована в рамках кинетической схемы (1) двухстадийной адсорбции с обратимой первой стадией (см. стр. 5). На рис. 11 приведены кинетические кривые адсорбции гемоглобина на

бипористом кремнеземе и зависимости функции рассчитанной из

кинетических данных, от времени адсорбции.

♦ 145 мкг/мл 100

80 -

< 60 • S

■ 270 мкг/мл А 457 мкг/мл

40

20 -

о а

0,08

0,04 -

♦ 145 мкг/мл и 270 мкг/мл 457 мкг/мл

4 6 t, Ч

10

-0,04 J

Рис. 11. Кинетические кривые (а) адсорбции гемоглобина на бипористом кремнеземе

Щ +4it (2)

БК-2 и спрямление их (б) в координатах уравнения

Из рис. 11 видно, что отрезки, отсекаемые от оси абсцисс, не зависят от начальной концентрации белка в растворе. Следовательно, в данных

к,

условиях реализуется схема

Е + П<

> EQr

->яп„ (О —

равновесная адсорбция с последующим необратимым связыванием белка.

Необратимое связывание белка на второй стадии приводит к тому, что в конечном итоге адсорбция гемоглобина и пероксидазы становится

необратимой. Об этом свидетельствуют изотермы адсорбции и десорбции гемоглобина (рис. 12) и данные табл. 4.

При десорбции, проводимой в тех же условиях, что и адсорбция, с поверхности адсорбентов удалось удалить не более 5 % адсорбированного белка. Количество обратимо связанного белка зоо возрастает с увеличением степени заполнения поверхности (см. табл. 4).

♦ 5 суток - адсорбция О 5 суток - десорбция

0 100 200 С, мкг/мл

Рис. 12. Изотермы (♦) адсорбции и (о) десорбции гемоглобина на кремнеземе МСМ-41

Таблица 4. Зависимость количества пероксидазы, десорбируемой с поверхности бипористого кремнезема, от степени заполнения поверхности. Время адсорбции и десорбции 2 суток, температура 6 °С

Степень заполнения 0.08 0.13 0.19 0.26 0.37 0.43 0.52 0.65

% десорбции 0.1 0.3 0.5 0.8 1.2 1.4 1.8 2.2

Обработка данных кинетических экспериментов позволила определить кинетические константы обратимой стадии. Для расчета константы скорости обратимой адсорбции (к\) и константы скорости десорбции (к_{)

использовали уравнения:

(3);

к_

-— (4)

К„бс

УЕа-Е_т

Эффективные константы скорости адсорбции рассчитывали из кинетических зависимостей. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5. Константы скорости обратимой стадии адсорбции гемоглобина на различных адсорбентах и эффективные константы скорости адсорбции

Адсорбент Омакс» нм ки М-1 с-1 ^хЮ'.с"1 ¿эффХ105,СЧ

силохром -150 8.5 3.5 4.8

БК-2 4 и-45 6.8 2.6 4.5

МК-2 3 6.5 0.9 4.2

МСМ-41 6 4.8 1.0 3.2

Проведенное исследование показало, что скорость адсорбции зависит от характера пористости адсорбента. Самые большие значения кинетических констант соответствуют адсорбции на широкопористом силохроме и бипористом кремнеземе. Самые маленькие константы скорости адсорбции получены для МСМ-41 — адсорбента с системой одномерных цилиндрических пор, диаметр которых (6 нм) соизмерим с диаметром молекулы гемоглобина (6.2 нм). По-видимому, молекулы белка адсорбируются в основном в устьях пор, ограничивая доступность их внутренней поверхности. В случае образца МК-2 (Опор = 3 нм) адсорбция происходит только на внешней поверхности, и ее скорость выше, чем в случае МСМ-41.

Для определения механизма адсорбции использовали зависимости функции F=C(l-Q)/Q от 0. В соответствии с разработанной ранее концепцией (Полторак О.М, Пряхин А.Н., Чухрай Е.С., 1977) независимость функции F от степени заполнения для гемоглобина подтверждает отсутствие межбелковых взаимодействий при адсорбции этого белка. Ниспадающий характер зависимости функции F от степени заполнения пероксидазы свидетельствует о более сложном механизме адсорбции — неограниченной линейной ассоциации белка при адсорбции.

О сильном взаимодействии между молекулами пероксидазы в адсорбционном процессе свидетельствует и характер изотерм адсорбции этого фермента (рис. 10).

60

50 -

40 -

У

1С

ь 30 -

и.

20 -

10 -

0 -

А)

10

i 6 S

2 -

Б)

............1

á

А

.......ОТ«'

-е—— 4 — *---JC-X** Х5

ОД 0,2 0,3 0,4 Степень заполнения

0,5

0,2 0,4 0,6 Степень заполнения

0,8

Рис. 13. Изотермы адсорбции пероксидазы (А) и гемоглобина (Б) на силохроме в координатах F = С(1-в)/9 — 9. Время адсорбции: 2 (1), 5 (2), 25 (3), 120 (4) и 240 (5) ч

6. Предельные величины адсорбции и их зависимость от размера пор

Предельные величины адсорбции определяли в основном линеаризацией изотерм адсорбции в координатах Ленгмюра. Для бипористых адсорбентов предельной величиной адсорбции считали максимальную, полученную экспериментально (рис. 8, а). Предельные адсорбции пероксидазы и гемоглобина на всех исследованных адсорбентах приведены в таблице 6.

Анализ полученных экспериментальных данных показал, что:

1) адсорбция гемоглобина на всех исследованных адсорбентах выше адсорбции пероксидазы в тех же условиях, хотя размер молекулы пероксидазы меньше;

2) хорошими адсорбционными свойствами обладают бипористые адсорбенты: они адсорбируют 350-460 мг/г гемоглобина и 80-100 мг/г пероксидазы;

3) максимальная адсорбция в расчете на единицу поверхности получена для широкопористых силикагеля и силохрома, причем она одинакова для обоих адсорбентов как при адсорбции пероксидазы, так и при адсорбции гемоглобина.

Поскольку на двух широкопористых образцах, удельная поверхность которых различается вдвое, получены одинаковые предельные адсорбции в расчете на единицу поверхности, считаем, что это — предельные адсорбции для всех кремнеземных адсорбентов в данных условиях. Тогда можно определить поверхность каждого адсорбента, доступную для адсорбции гемоглобина (Бнь) и пероксидазы (8Нщ>). Эти данные приведены в таблице 6 и на рис. 14.

Рис. 14. Доступность поверхности адсорбентов для гемоглобина и пероксидазы «Доступность поверхности» — это отношения 8нь/8бэт и вняр/звэт (%)

Среди мезопористых кремнеземов наиболее высокой доступностью

поверхности для гемоглобина и пероксидазы обладают силохром С-120

(Вср = 35 нм) и алюмосиликат 8ВА-15 (Оср=15нм). Достаточно высока

доступность поверхности и у образцов с бимодальным распределением пор.

Она составляет 30-40 % при среднем диаметре пор 10-12 нм.

Таблица 6. Адсорбция гемоглобина (Hb) и пероксидазы (HRP)

Se3t — удельная поверхность адсорбентов, определенная методом низкотемпературной адсорбции азота; DMaKC — положение максимумов на кривых распределения объемов пор по их диаметрам; Dcp — средний диаметр пор; Ань — адсорбция гемоглобина; Ahrp — адсорбция пероксидазы; Sm, и Surf — поверхности, доступные для адсорбции гемоглобина и пероксидазы, соответственно.

Эпь и Бнир рассчитаны из адсорбционных данных в предположении, что вся поверхность широкопористых силикагеля и силохрома доступна для адсорбции белков. Оср = 4У/8. * — средний диаметр пор силикагеля и силохрома по литературным данным

Адсорбент Dcp? нм Dmakcj HM Ань. мг/г Ань, мг/м2 Ahrp, мг/г Ahrp, мг/м2 SB3T, м2/г Sm,, м2/г Shrp, м2/г Sub/SraT, % Shrp/Sj;-jt> %

МСМ-41 6.0 6.0 45 0.045 17 0.017 1000 32 55 3.2 5.5

SBA-15 8.5 9.5 130 0.13 90 0.09 1000 93 160 9.3 16

AC-SBA-15 15.1 20 320 0.86 71 0.192 370 230 240 62 65

МК-1 3.3 нет 50 0.075 14 0.021 670 36 45 5.4 6.7

МК-2 3.1 3.0 32 0.064 3.0 0.008 500 27 13 5.4 2.6

БК-1 9.5 3 и -45 370 0.47 — — 790 265 — 33 —

БК-2 10.3 4 и-45 350 0.38 80 0.089 915 250 260 27 28

БК-3 11.7 9 и-60 460 0.64 — — 720 320 — 42 —

БК-4 11.5 5.5 и -50 450 0.56 100 0.125 810 320 320 40 40

БАС 10.5 3 и -30 400 0.48 100 0.120 840 290 320 35 38

С-120 35 45 130 1.1 25 0.208 120 90 80 75 67

силохром -100* не опред. 57 1.4 12.5 0.312 40 40 40 100 100

силикагель —150* не опред. 28 1.4 6.2 0.310 20 20 20 100 100

А1203 10.8 -10 40 0.17 3.0 0.0125 240 29 10 12 4.2

В качестве критерия адсорбционной способности исследованных образцов можно использовать А1АЩКд — отношение предельной адсорбции (мг/м2) на данном адсорбенте к предельной адсорбции на широкопористых кремнеземах. На рис. 15 представлена зависимость А1А„ред от среднего диаметра пор адсорбентов для гемоглобина и пероксидазы.

На этой зависимости можно выделить три области. Если размер пор адсорбента меньше или соизмерим с диаметром молекулы белка, адсорбция мала и слабо зависит от размера пор. Резкое увеличение адсорбции происходит, когда средний диаметр пор в полтора-два раза превышает размер молекулы белка. При таком соотношении диаметров белок имеет возможность проникать внутрь пор адсорбента. Если средний диаметр пор больше размера молекулы в 3-5 раз, величина адсорбции продолжает увеличиваться, но ее рост не так значителен.

❖ пероксидаза о гемоглобин

АС-БВА-15 ...... ¿/С"120

0,6 -1

<

0,4

0,2

К

БК, БАС

,Ь 4

10

20

30

40

Рис. 15. Зависимость адсорбционной способности {Л/Л„ре(,) в отношении гемоглобина и пероксидазы от среднего диаметра пор адсорбентов

Размер пор адсорбента — не единственный критерий, влияющий на величину адсорбции белков. Существенную роль при адсорбции играет и природа адсорбционных центров. Например, адсорбция гемоглобина на бипористых образцах БК-1 (Оср = 9.5 нм) и БАС (Оср=Ю.5нм) составляет 0.47-0.48 мг/м2. На мезопористом оксиде алюминия (Бср = 10.8 нм) адсорбируется только 0.17 мг/м2 гемоглобина.

7. Свойства адсорбентов после адсорбции белков

В результате адсорбции изменяются параметры пористой структуры адсорбентов. Исследование методом низкотемпературной адсорбции азота показало, что в результате адсорбции гемоглобина удельная поверхность и объем пор адсорбентов снижаются (табл. 7). Наиболее сильно это проявляется для бипористых кремнеземов. В случае мезопористого кремнезема МК-2 (Бср = 3 нм) уменьшение объема пор и удельной поверхности незначительно, поскольку молекулы белка не могут проникать в поры данного адсорбента.

Таблица 7. Параметры пористой структуры до и после адсорбции гемоглобина

Образец 5 БЭТ, м2/г до адсорбции Бют» М2/Г после адсорбции Упор, см3/г до адсорбции Упор, см3/г после адсорбции

МК-2 500 440 0.4 0.3

МСМ-41 1000 680 1.5 0.75

БК-2 915 170 2.3 0.3

Исследование адсорбентов методом ИК спектроскопии показало, что после адсорбции гемоглобина (рис. 16, а) и пероксидазы (рис. 16,6) в ИК спектрах кремнеземов появляются характерные для белков полосы «амид-1» и «амид-Н».

-БК — БК+НЬ--НЬ -БК---БК+НЯР--НШР

1800 1700 1600 1500 1400 1800 1700 1600 1500 1400 волновое число, см"1 волновое число, см1

Рис. 16. Фрагменты ИК спектров бипористых кремнеземов до и после адсорбции

а) гемоглобина, б) пероксидазы.

Положение полос в спектре гемоглобина: амид-1 — 1653 см-1, амид-П — 1534 см"1; в спектре пероксидазы: амид-1 —1658 см"1, амид-П —1526 см"1

Присутствие этих полос подтверждает сохранение вторичной структуры белков на поверхности адсорбентов. Незначительное смещение максимумов полос и изменение их контура может свидетельствовать о некоторых изменениях конформации белковых молекул, адсорбированных на поверхности.

8. Каталитическая автивность адсорбционных слоев пероксидазы

Пероксидаза, адсорбированная на поверхности всех исследованных адсорбентов, частично сохраняет каталитическую активность. В таблице 8 приведены значения параметров уравнения Михаэлиса-Ментен для пероксидазы в растворе и в иммобилизованном состоянии.

В результате адсорбции на кремнеземах и алюмосиликатах константа Михаэлиса увеличивается приблизительно в три раза, а на А1203 — в пять раз. Увеличение Км в 3-5 раз может быть обусловлено незначительными конформацион-ными изменениями адсорбированной молекулы фермента.

Таблица 8. Константы Михаэлиса и удельные активности пероксидазы

раствор

Образец К„„ мМ Уд. активность, мкмоль/мин-мг

раствор 0.11 200

БК-2 0.31 50.0

БК-4 0.33 48.4

БК-1 0.35 47.8

БАС 0.31 44.4

8ВА-15 0.36 28.5

С-120 0.35 18.8

МСМ-41 0.35 18.2

МК-2 0.30 16.4

МК-1 0.38 16.2

силикагель 0.37 16.0

А1203 0.54 8.4

БК-2 С

н

БК-4 рГЩ

БК-1 "У---"1

-I

БАС СИЗ

БВА-15 С-120 МСМ-41 МК-2 МК-1 силикагель А1203

активность, %

50

75

100

0 25

Рис. 17. Удельные активности гетерогенных биокатализаторов и пероксидазы в растворе

Активность адсорбционных слоев пероксидазы ниже ее активности в растворе. Из гетерогенных образцов наибольшей активностью обладает пероксидаза на поверхности бипористых адсорбентов. На этих адсорбентах пероксидаза сохраняет около 25 % от своей активности в растворе (рис. 17).

Каталитическая активность пероксидазы зависит от степени заполнения поверхности. Такие зависимости приведены на рис. 18, а. Уменьшение активности с ростом степени заполнения является результатом межбелковых взаимодействий в адсорбционном слое.

40-й

0,4

30 -

20

10

..... ——:

0,3

0,2

ОД

0,2

0,4

0,6

0,1

0,2 0,3 в

0,4 0,5

Рис. 18. Зависимость удельной активности пероксидазы, адсорбированной на различных носителях, от степени заполнения (а) и определение удельной активности изолированных глобул фермента (б) на поверхности адсорбентов

Из рис. 18, а видно, что удельная активность пероксидазы на поверхности всех адсорбентов уменьшается с увеличением степени заполнения. Эти зависимости использовали для определения активности единичной глобулы фермента на поверхности. Обработку экспериментальных данных (рис. 18, б) проводили с использованием уравнения для модели неограниченной линейной ассоциации белка в адсорбционном слое по двухконтактному механизму:

1 1 у

В этой формуле а — экспериментально найденная удельная активность

фермента, а0 — удельная активность изолированных молекул фермента на

поверхности, % — безразмерная константа равновесия ассоциации белка в

адсорбционном слое. Полученные результаты приведены в табл. 8.

22

Зависимости, приведенные на рис. 18, а, свидетельствуют, что при всех степенях заполнения активность биокатализаторов, полученных адсорбцией пероксидазы на кремнеземах с бимодальным распределением пор, выше активности всех других гетерогенных биокатализаторов.

Более высокая активность пероксидазы, адсорбированной на бипористых носителях, может быть обусловлена дезагрегирующим и активирующим влиянием малых пор. Крупные поры, в свою очередь, служат депо для нативных, но неактивных ассоциированных молекул, способных к активации в результате приповерхностной диссоциации.

Основные итоги и выводы

— Размер и распределение пор в бипористых кремнеземах, получаемых в системе «ЗЮ2 — бромид цетилтриметиламмония — триметилбензол», определяется рН и температурой синтеза, а также концентрацией ЦТАБ и ТМБ в реакционной смеси. Условия получения материалов с максимальным вкладом пор диаметром 20-80 нм: рН 10, температура синтеза 80-100 °С, концентрация ЦТАБ — 20 % мае.

— Бипористые кремнеземы являются лучшими носителями для пероксидазы по сравнению с другими исследованными адсорбентами. Широкие поры позволяют достигать высоких значений адсорбции, а благодаря дезагрегирующему действию узких пор биокатализатор проявляет наибольшую активность (до 25 % от исходной активности фермента в растворе).

— На примере гемоглобина и пероксидазы показано, что для адсорбции белковых молекул в порах адсорбентов необходимо, чтобы их диаметр превосходил размер молекул белка по крайней мере в полтора-два раза.

— Установлено, что адсорбция гемоглобина соответствует двухстадийной кинетической схеме с обратимой первой стадией. Рассчитанные константы скорости адсорбции и десорбции зависят от характера пористости кремнеземного адсорбента. Адсорбция гемоглобина не осложнена ассоциацией белка, а адсорбция пероксидазы происходит по механизму неограниченной линейной ассоциации.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. JI. Ф. Атякшева, Е. С. Чухрай, И. И. Иванова, Е. Е. Князева, Р. А. Овсянников. / Кинетика адсорбции гемоглобина на силикатных адсорбентах. //Журнал физической химии. 2010. Т. 84. № 6. С. 1187-1191.

2. Е. С. Чухрай, О. С. Пилипенко, Р. А. Овсянников, Л. Ф. Атякшева, Е. Е. Князева, И. И. Иванова. / Механизм димеризации ферментов при адсорбции на силикатных адсорбентах на примере лизоцима и ß-галактозидазы. //Журнал физической химии. 2010. Т. 84. № 11. С. 2175-2181.

3. Л. Ф. Атякшева, Р. А. Овсянников, Е. С. Чухрай, Е. Е. Князева, И. И. Иванова. / Адсорбция и каталитические свойства пероксидазы. // Журнал физической химии. 2011. Т. 85. № 2. С. 377-383.

4. Л. Ф. Атякшева, И. В. Добрякова, И. И. Иванова, Е. Е. Князева, Р. А. Овсянников, Е. С. Чухрай. / Адсорбционные свойства гемоглобина. // Журнал физической химии. 2011 (в печати).

5. Овсянников Р. А. / Синтетические мезо-макропористые силикаты как носители для иммобилизации ферментов. // Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». Белгород, 9-11 декабря 2008, с. 115.

6. Овсянников Р. А. / Синтетические мезо-макропористые силикаты как носители для иммобилизации ферментов. // Сборник тезисов 5-го Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 16-20 марта 2009, с. 300.

7. Овсянников Р. А. / Синтетические мезо-макропористые силикаты как носители для иммобилизации ферментов. // Материалы XVI Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009», секция «Химия». Москва, 13-18 апреля 2009 (электронная публикация).

Заказ № 239-1/04/2011 Подписано в печать 27.04.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ (www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Иммобилизация белков на твердых носителях.

Синтез и свойсгва мезопористых кремнеземных адсорбентов

1.1 Общие сведения

1.2 Методы иммобилизации ферментов

1.2.1 Необратимое связывание

1.2.2 Обратимое связывание

1.3 Особенности адсорбции белковых молекул

1.3.1 Термодинамика адсорбции

1.3.2 Химия поверхности носителя и фермента

1.3.3 Пористая структура носителя

1.4 Классификация носителей для иммобилизации ферментов

1.4.1 Природные высокомолекулярные соединения

1.4.2 Органические носители

1.4.3 Неорганические носители

1.5 Методы получения мезопористых кремнеземов

1.5.1 Принцип супрамолекулярного темплатирования

1.5.2 Регулирование размера пор

1.5.3 Синтез крупнопористых адсорбентов и создание вторичных мезопор

1.5.4 Модифицирование поверхности кремнезема

Глава 2. Иммобилизация белков на кремнеземных адсорбентах

2.1 Адсорбция белков на кремнеземных адсорбентах

2.1.1 Адсорбция белков на силикагелях и силохромах

2.1.2 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с одномерной системой пор (МСМ-41, БВА-15 и РБМ-16)

2.1.3 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с трехмерной системой пор (МСМ-48)

2.1.4 Адсорбция белков на мезопористых молекулярных ситах с разупорядоченной структурой

2.1.5 Новые кремнеземные адсорбенты

2.2 Изотермы и кинетика адсорбции белков на кремнеземных адсорбентах

2.2.1 Изотермы адсорбции

2.2.2 Кинетика адсорбции белков

2.3 Свойства адсорбционных слоев ферментов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1 Синтез кремнеземных адсорбентов

3.1.1 Синтезы на основе неионогенных ПАВ

3.1.2 Синтезы на основе катионных ПАВ

3.1.3 Выбор носителей для адсорбции белков

3.2 Физико-химические методы исследования адсорбентов

3.2.1 Низкотемпературная адсорбция азота

3.2.2 Электронная микроскопия

3.2.3 ИК спектроскопия

3.2.4 Термопрограммированная десорбция аммиака

3.2.5 Термогравиметрия и дифференциально-термический анализ

3.3 Исследование адсорбции белков

3.3.1 Адсорбаты

3.3.2 Адсорбционные измерения

3.3.3 Измерение концентрации гемоглобина и пероксидазы

3.3.4 Вычисление предельных величин адсорбции белков

3.3.5 Измерение ферментативной активности пероксидазы

3.3.6 Определение кинетических параметров пероксидазной реакции

3.3.7 Приготовление растворов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Темплатный синтез кремнеземов

4.1 Синтез в присутствии полиэтиленгликолей (ПЭГ)

4.1.1 Первичные синтетические процессы

4.1.2 Постсинтетическая обработка

4.1.3 Детемплатирование

4.2 Синтез бипористых кремнеземов в присутствии ЦТАБ

4.2.1 Формирование крупных пор в системе «ЦТАБ-БЮг» при рН

4.2.2 Влияние концентрации ЦТАБ на текстуру материала

4.2.3 Изменение текстуры кремнезема при введении ТМБ

4.2.4 Влияние температуры на текстуру материала

4.3 Характеристика поверхности пористых кремнеземов

Глава 5. Адсорбция гемоглобина

5.1 Кинетика адсорбции

5.1.1 Двух стадийная кинетическая схема адсорбции белков

5.1.2 Обработка экспериментальных результатов

5.1.3 Кинетические закономерности адсорбции гемоглобина на кремнеземах

5.2 Изотермы адсорбции гемоглобина

5.2.1 Изотермы Ь-типа

5.2.2 Изотермы адсорбции на бипористых кремнеземах и алюмосиликатах

5.3 Свойства кремнеземов после адсорбции гемоглобина

5.3.1 Данные низкотемпературной адсорбции азота

5.3.2 Данные ИК спектроскопии

5.4 Зависимость предельной адсорбции от размера пор адсорбента

5.5 Гемоглобин как тестовый белок для оценки поверхности адсорбентов

Глава 6. Адсорбция и каталитические свойства пероксидазы

6.1 Адсорбция пероксидазы на мезопористых кремнеземах

6.1.1 Изотермы адсорбции и предельные величины адсорбции

6.1.2 Механизм адсорбции

6.2 Свойства адсорбционных слоев пероксидазы

6.2.1 Данные ИК спектроскопии

6.2.2 Активность фермента в адсорбционном слое

6.2.3 Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен

6.3 Адсорбция гемоглобина и пероксидазы — сравнительная характеристика

ВЫВОДЫ

Интерес к биокаталитическим системам на основе иммобилизованных ферментов обусловлен их применением в качестве гетерогенных катализаторов, компонентов биосенсоров нового поколения, элементов биотопливных ячеек. Биокатализаторы на основе иммобилизованных ферментов отличаются высокой стабильностью, экологической чистотой, возможностью проведения реакций с участием оптически активных соединений. Иммобилизованные гемсодержащие белки — гемоглобин и пероксидаза — могут применяться в качестве биораспознающих элементов для безмедиаторных биосенсоров, биореакгоров и биомедицинеких устройств нового поколения.

Адсорбционная иммобилизация ферментов на мезопористых молекулярных ситах (ММС) привлекает внимание исследователей на протяжении последних пятнадцати лет, с момента синтеза первых представителей этого класса адсорбентов — МСМ-41 и SBA-15. Применение таких носителей для получения гетерогенных биокатализаторов представляет несомненный научный и практический интерес. К настоящему времени опубликованы результаты исследований адсорбции различных белков, в том числе гемоглобина и пероксидазы, на ММС структурных типов МСМ, SBA, FSM, однако полученные данные зачастую сильно расходятся или даже противоречат друг другу. Совершенно не изучены кинетические аспекты адсорбции белков, не исследованы особенности изотерм адсорбции белков на адсорбентах данного типа.

В последние 2-3 года появились первые публикации по адсорбции белков на адсорбентах с бимодальным распределением пор, однако они пока что немногочисленны. В литературе также нет достаточных сведений о закономерностях формирования структуры таких адсорбентов.

Цель данной работы — установить основные закономерности адсорбции белков и каталитических свойств адсорбированных ферментов на мезопористых кремнеземах с различным характером пористости. В связи с поставленной целью основные задачи исследования можно сформулировать следующим образом: изучить факторы, определяющие формирование пористой структуры мезопористых кремнеземов с моно- и бимодальным распределением пор, установить взаимосвязь между адсорбцией гемоглобина и пероксидазы на мезопористых кремнеземах и характером пористости адсорбента; сравнить каталитические свойства адсорбционных слоев пероксидазы на различных носителях.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Сокр. Расшифровка

EDX локальный рентгеноструктурный анализ

ЕО этиленоксид (звено цепи полиэтиленгликоля)

FSM Folded-sheet Mesoporous Material (класс мезопористых материалов)

НЬ гемоглобин

HRP пероксидаза хрена

Км константа Михаэлиса

РО пропиленоксид (звено цепи полипропиленгликоля)

MCF мезопористая ячеистая пена мсм Mobil Composition of Matter (класс мезопористых материалов)

SBA Santa-Barbara Acid (класс мезопористых материалов)

ДТА дифференциально-термический анализ ккм критическая концентрация мицеллообразования мк мезопористый кремнезем

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПЭГ полиэтиленгликоль пэм просвечивающая электронная микроскопия

СЭМ сканирующая электронная микроскопия

ТГА термогравиметрический анализ

ТМБ триметилбензол

ТПДЫНз термопрограммированная десорбция аммиака

ТЭОС тетраэтоксисилан

ЦТАБ бромид цетилтриметиламмония

выводы

Размер и распределение пор в бипористых кремнеземах, получаемых в системе «БЮг — бромид цетилтриметиламмония — триметилбензол», определяется рН и температурой синтеза, а также концентрацией ЦТАБ и ТМБ в реакционной смеси. Условия получения материалов с максимальным вкладом пор диаметром 2080 нм: рН 10, температура синтеза 80-100 °С, концентрация ЦТАБ — 20 % мае.

Бипористыс кремнеземы являются лучшими носителями для пероксидазы по сравнению с другими исследованными адсорбентами. Широкие поры позволяют достигать высоких значений адсорбции, а благодаря дезагрегирующему действию узких пор биокатализатор проявляет наибольшую активность (до 25 % от исходной активности фермента в растворе).

На примере гемоглобина и пероксидазы показано, что для адсорбции белковых молекул в порах адсорбентов необходимо, чтобы их диаметр превосходил размер молекул белка по крайней мере в полтора-два раза.

Установлено, что адсорбция гемоглобина соответствует двухстадийной кинетической схеме с обратимой первой стадией. Рассчитанные константы скорости адсорбции и десорбции зависят от характера пористости кремнеземного адсорбента. Адсорбция гемоглобина не осложнена ассоциацией белка, а адсорбция пероксидазы происходит по механизму неограниченной линейной ассоциации.

1. Березин И.В., Клячко H.JL, Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., ХмельницкийЮ.Л. /Иммобилизованные ферменты. //М.: Высшая школа. 1987. 296 с.

2. Cao L. / Carrier-Bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design. // Weinheim: Wiley-VCH. 2005.

3. Taylor R.F. / Protein Immobilization — Fundamentals and Applications. //N.Y.: Marcel Dekker. 1991. Pp. 305-318.

4. Brummer W., Hennrich N., Klockow M., Lang H., Orth H.D. / Preparation and Properties of Carrier-Bound Enzymes. // Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 25. No. 1. Pp. 129-135.

5. Cristallini C., Lazzeri L., Cascone M.G., Polacco G., Lupinacci D., Barbani N. / Enzyme-based bioartificial polymeric materials: the a-amylase — poly(vinyl alcohol) system. // Polym. Int. 1997. Vol. 44. No. 4. Pp. 510-516.

6. Dunlap B.R. Immobilised chemicals and affinity chromatography. //N.Y.: Plenum Press. 1974. Pp 123-134.

7. Martinek K., Mozhaev V.V. / Immobilization of enzymes: an approach to fundamental studies in biochemistry. //Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1985. Vol.57. Pp. 179-249.

8. Bickerstaff G.F. / Application of immobilised enzymes to fundamental studies on enzyme structure and function. // Top. Enz. Ferment. Biotech. 1984. Vol. 4. Pp. 162-201.

9. Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Егоров A.M. /Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена. // Рос. хим. ж. 2008. Т. 52. № 2. С. 60-65.

10. Hartmeier W. / Immobilized Biocatalysts. // Berlin: Springer-Verlag. 1988.212 p.

11. Nelson J.M., Griffin E.G. / Adsorption of invertase. //J. Am. Chem. Soc. 1916. Vol. 38. No. 5. Pp. 1109-1115.

12. Harkins W.D., Fourt L., Fourt P.C. / Immunochemistry of Catalase II. Activity in Multilayers. //J. Biol. Chem. 1940. Vol. 132. No. 1. Pp. 111-118.

13. Gale E.F., Epps H.M. /Studies on bacterial amino-acid decarboxylases: l.l(+)-lysine decarboxylase. // Biochem. J. 1944. Vol. 38. No. 3. Pp. 232-242.

14. Кобозев Н.И. /Катализатор и фермент (проблема сверхактивности природных веществ). //Учен. зап. Моск. ун-та. 1955. Т. 174. С. 125-154.

15. Полторак О.М. /Адсорбционное моделирование биомембран и ферментных комплексов.// Журн. физ. химии. 1967. Т. 41. № 10. С. 2544-2562.

16. Полторак О.М., Чухрай Е.С. / Липопротеидные слои на твердых носителях и свойства биомембран. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1970. № 2. С. 133-146.

17. Чухрай Е.С., Полторак О.М.* /Об изотерме адсорбции глобулярных белков на твердых носителях // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1973. Т. 14. № 3. С. 271-277.

18. Курганов Б.И., Лобода Н.И. / Регуляция активности ферментов в адсорбционных ферментных системах. // Биоорганическая химия. 1977. Т.,3. №10. С. 1407-1419.

19. Полторак 0:М., Пряхин А.Н., Чухрай« Е.С. / Адсорбционная иммобилизация* ферментов и проблемы ассоциации белков. Ниспадающие кривые удельной каталитической активности. //Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1977. Т. 18. №. 2. С. 125-142.

20. Tosa Т., Mori Т., Fuse N., Chibata I. / Studies on continuous enzyme reactions. I. Screening of carriers for preparation of water-insoluble aminoacylase. // Enzymologia. 1966. Vol. 31. No. 4. Pp. 214-24.

21. Silman I.H., Katchalski E. / Water-Insoluble Derivatives of Enzymes, Antigens, and Antibodies. //Annu. Rev. Biochem. 1966. Vol. 35. Pp. 873-908.

22. Axen R., Porath J., Ernback S. / Chemical Coupling of Peptides and Proteins to Polysaccharides by Means of Cyanogen Halides. //Nature. 1967. Vol.214. No. 5095. Pp. 1302-1304.

23. Sharp K., Kay G., Lilly M.D. /The kinetics of beta-galactosidase attached to porous cellulose sheets. // Biotechnol. Bioeng. 1969. Vol. 11. No. 3. Pp. 363-380.

24. Чухрай Е.С:, Полторак O.M. / Каталитические свойства адсорбированной сукцинат-дегидрогеназы. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1970. № 6. С. 10-13.

25. Nilsson Н., Mosbach R., Mosbach К. /The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes. //Biochim. Biophys. Acta, Enzymol. 1972. Vol. 268. No. l.Pp. 253-256.

26. Полторак O.M., Чухрай E.C., Хорикова Е.С. Веселова М.Н. / Некоторые аспекты механизма действия каталазы и возможность регуляции ее активности путем адсорбции и десорбции на твердых носителях. //Журн. физ. химии. 1974. Т. 48.- С. 2019-2023.

27. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Хорикова Е.С. / О механизме действия фосфо-глюкомутазы в растворе и в адсорбционно иммобилизованном состоянии. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1974. Т. 15. № 4. С. 410-416.

28. Messing R.A. / Carriers. // Immobilized Enzymes for Industrial Reactors. / Messing R.A. (ed.). N.Y.: Academic Press. 1975. Pp. 151.

29. Brodelius P., Mosbach K. / Immobilization Techniques for Cells/Organelles. //Methods Enzymol. 1987. Vol. 135. Pp. 173-454.

30. Andrade J.D., Hlady V., Wei A.P. / Adsorption of complex proteins at interfaces. // Pure Appl. Chem. 1992. Vol. 64. No. 11. Pp. 1777-1781.

31. Clark D.S. /Сап immobilization be exploited to modify enzyme activity? //Trends Biotechnol. 1994. Vol. 12. No. 11. Pp. 439-443.

32. Ramsden J J. / Puzzles and paradoxes in protein adsorption. //Chem. Soc. Rev. 1995. Vol. 24. No. l.Pp. 73-78.

33. Bruggink A., Roos E.C., de Vroom E. / Penicillin Acylase in the Industrial Production of p-Lactam Antibiotics. // Org. Process Res. Dev. 1998. Vol. 2. No. 2. Pp. 128-133.

34. Зайцева E.A., Чухрай E.C., Полторак O.M. Адсорбция и стабилизация дрожжевой гексокиназы. //Журн. физ. химии. 2001. Т. 75. №. 3. С. 549-552.

35. Cao L., Langen L.V., Sheldon R.A. / Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free? // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. Vol. 14. No. 4. Pp. 387-394.

36. Brodelius P. / Industrial applications of immobilized biocatalysts. // Adv. Biochem. Eng. 1978. Vol. 10. Pp. 75-129.

37. Bickerstaff G.F. / Immobilization of enzymes and cells. // Molecular Biology and Biotechnology. 5 ed. / Walker J.M., Rapley R. (ed.). London: Royal Society of Chemistry. 2009.

38. Scouten W.H. /Survey of Enzyme Coupling Techniques. //Methods Enzymol. 1987. Vol. 135. Pp. 30-65.

39. Bickerstaff G.F. / Characterization of Enzyme Activity, Protein Content, and Thiol Groups in Immobilized Enzymes. //Immobilization of Enzymes and Cells. Vol. 1. /Bickerstaff G.F. (ed.). Totowa,NJ: Humana Press. 1996. Pp. 253-259.

40. Brena B.M., Batista-Viera F. Immobilization of Enzymes: a Literature Survey. // Immobilization of Enzymes and Cells. Vol. 22. / Guisan J.M. (éd.). Totowa, NJ: Humana Press. 2006. Pp. 15-30.

41. Lawson T., Regnier F., Weith H. / Separation of synthetic oligonucleotides on columns of microparticulate silica coated with crosslinked polyethylene imine. // Anal. Biochem. 1983. Vol. 133. No. 1. Pp. 85-93.

42. Porath J., Axen R. / Immobilization of enzymes to agar, agarose, and Sephadex supports. // Methods Enzymol. 1976. Vol. 44. Pp. 19-45.

43. Guisan J. / Aldehyde-agarose gels as activated supports for immobilization-stabilization of enzymes. // Enzyme Microb. Technol. 1988. Vol. 10. No. 6. Pp. 375-382.

44. Drobnik J., Labsky J., Kudlvasrova H., Saudek V., Svec F. / The activation of hydroxy groups of carriers with 4-nitrophenyl and N-hydroxysuccinimidyl chloroformâtes. // Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. 24. No. 2. Pp. 487-493.

45. Miron T. / A spectrophotometric assay for soluble and immobilized N-hydroxysuccinimide esters. // Anal. Biochem. 1982. Vol. 126. No. 2. Pp. 433-435.49.