Монослои и тонкие пленки тиакаликс[4]аренов с иммобилизованным цитохромом C как биомиметрическая модель антиоксидантной активности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

''К

КОЧЕТКОВ ЕВГЕНИЙ НИКОЛАЕВИЧ

МОНОСЛОИ И ТОНКИЕ ПЛЕНКИ ТИАКАЛИКС[4]АРЕНОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ ЦИТОХРОМОМ С КАК БИОМИМЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

19 ^ 2015

005559166

Нижний Новгород -2015

005559166

Дасгертац!кя*ггя работа выяолиска з Государственном бюджетном образовательном учреждении т.ысюсг-с профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Мкнис.-срства здравоохранения Российской Федерации

Научный рукпводитсл Официальные ошшнеш и:

Ведущая организация:

Мельникова Н;п:а Борисовна

доктор химических наук, профессор

3 :мы!!гляе;-.а Ольга Георгиевна -окго? химических наук, доцент, профессор кафедры «Высокомолекулярных соединений и .'коллоидной химии» Нижегородского государственного университета Н.И.

Лобачевского

Кстков Сергей Юлиевпч

доктор химических наук, зав. лабораторией "Наноразмершлх систем и струю-урной химии" ФГБУН "Институт кеталлоорганпческой химии гги. Г.А. Разув:;сва" РАН, Нижний Новгород

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии имени А. И. Фрумкина РАН (ИФХЭ РАК)

Защита диссертации состоится «26»_марта 2015 г в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 212.166.08 по химическим наукам при ФГАОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, ГСП-20, пр. Гагарина 23, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского и на сайте http://diss.umi.nl/445

Автореферат разослан »^>¿^». 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук,

Сулейманов Евгений Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы -

Установление взаимосвязи между свойствами тонких пленок, находящих широкое применение в различных областях науки и техники, и процессами, протекающими на границе раздела фаз, является одной из важнейших задач физической химии.

Изучение процессов на межфазных границах раздела (клеточных мембранах, тонких капиллярах и др.) в биологических системах обычно проводится либо in vitro, либо in vivo, что требует больших затрат и использования животных. В последнее время для описания стали привлекать упрощенные химические модели, способные HMHTHpoeáTb биологические процессы, сократить время и ресурсы исследований, а также выявить новые закономерности.

Одним из приемов изучения биомиметических взаимодействий элементов биосистем с экзо- и эндогенными биологически - активными веществами (БАВ), является моделирование реакций на поверхности искусственных мембран, рецепторов, капилляров. Биомиметическими моделями могут быть тонкие пленки и ленгмюровские монослои молекул, склонных к структурированию и самоорганизации.

Одним из классов структурообразующих веществ, способных формировать монослои, являются макроциклы тиакаликсаренов (ТКА). Они имеют полость, ' способную включать молекулы "гостей" за счет гидрофобного связывания и л - к взаимодействий, мостиковые атомы серы и заместители на нижнем ободе, обуславливающие различные донорно - акцепторные взаимодействия. Следовательно, ТКА способны выполнять роль искусственного рецептора как низкомолекулярных БАВ, так и биополимеров в монослое.

Важным биополимером является металлопротеин - цитохром с (cyt с), определяющий общий антиоксидантный статус организма за счет участия в схемах фотосинтеза, дыхания и некоторых других окислительно - восстановительных реакциях. Цитохром с проявляет себя как антиоксидант, участвующий во многих каталитических реакциях цитохром с — оксидазы. Следовательно, монослои ТКА с иммобилизованным cyt с могут выполнять роль биомиметической модели антиоксидантной активности БАВ.

Информация о физико - химических закономерностях создания биомиметических моделей антиоксидантой активности металлопротеинов на основе монослоев и тонких пленок ТКА крайне скудна, а имеющиеся литературные данные носят разрозненный характер.

Цель работы: установление физико-химических закономерностей формирования тонких пленок производных тиакаликс[4]арена и иммобилизации цитохрома с в ленгмюровские монослои на различных подложках (вода, кремний, кварц, индий олово оксид ГГО, золото) для создания биомиметической модели антиоксидантной активности.

В задачи исследования входило:

1. Изучение фазового состояния и условий получения монослоев производных тиакаликс[4]арена и выбор соединений, способных образовывать стабильные и воспроизводимые ленгмюровские монослои на межфазой границе «вода-воздух».

2. Исследование физико-химических свойств монослоев тиакаликс[4]арена с иммобилизованным цитохромом с - элементов биомиметической модели антпоксидантной активности, на водной субфазе аскорбиновой кислоты, монооксида азота и дигидрокверцитина, имеющих более высокий, чем металлопротеин, редокс-потенциал.

3. Установление физико-химических закономерностей формирования тонких пленок производных тиакаликс[4]арена с иммобилизованным цитохромом с на твердой подложке (кремний, кварц, индий олово оксид ГГО, золото).

Научная новизна

1. Впервые установлена связь между структурой тиакаликс[4]аренов и физико-химическими свойствами пленок на водной поверхности. Истинные жесткие конденсированные монослои образуют тиакаликс[4]арены с тре/и-бутильной группой на верхнем ободе и ю-цианоалкокси-, п - цианобензилокси- группами и краун-эфирным фрагментом на нижнем ободе. 7/>ет-бутилтиакаликс[4]арены с гидрофильными заместителями (ОН - группами) на нижнем ободе дают монослои на субфазе, содержащей Ag+, за счет образования координационной связи между донорами электронов (8 и О) с ионами серебра.

2. Впервые показана высокая рецепторная способность трет-бутилтиакаликс[4]аренов с неполярными заместителями на нижнем ободе по отношению к цитохрому с, причем иммобилизация металлопротеина происходит по типу физической адсорбции Ленгмюра.

3. Впервые изучено биомиметическое взаимодействие цитохрома с с антиоксидантами — аскорбиновой кислотой и дигидрокверцитином, на монослоях трет-бутилтиакаликс[4]арена с иммобилизованным металлопротеином. Изменение свойств водной субфазы и монослоев в присутствии биологически активных веществ позволяет рассматривать пленки тиакаликс[4]арена с иммобилизованным цитохромом с в качестве биомиметической модели или элемента сложного сенсора на вещества, имеющие более высокий по сравнению с цитохромом с редокс-потенциал.

4. Показано, что на инертных твердых подложках (кремний, кварц, индий олово оксид ГГО) первоначально образуются пленки тиакаликс[4]арена островкового характера, в отличие от золота, на котором сплошная пленка образуется при однократном переносе.

Практическая значимость

Тиакаликс[4]арены (ТКА), как искусственные рецепторы, перспективны для экспрессного изучения биомиметических взаимодействий лекарственных веществ, не проводя длительных и дорогостоящих экспериментов на животных. Пленки ТКА с иммобилизованными ферментами, металлопротеинами и другими распознающими элементами могут быть использованы в качестве биосенсоров на маркеры заболеваний, токсичные метаболиты, ионы металлов и различные полюенты. Применение биосенсоров с наноразмерными чувствительными элементами в аналитической химии позволяет отказаться от токсичных аналитических реагентов, сократиться время и стоимость анализа, улучшить селективность и пределы обнаружения аналитов.

Способность ТКА сглаживать неровности твердых поверхностей, позволяет конструировать атомарно-гладкие, гидрофобные подложки при исследовании органических и биологических образцов методом атомно-силовой микроскопии. Полученные платформы лишены некоторых недостатков пиролитического графита, слюды и кристаллического кремния - наиболее доступных подложек АСМ.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Объекты исследования В работе использован цитохром с (cyt с), выделенный из сердца быка. Его формула и основные редокс — реакции отражены на рисунке 1.

Рисунок 1. Структура гема и редокс - реакции цитохрома с

В качестве структурных элементов монослоев были использованы ТКА, формулы которых представлены в таблице 1. Изучаемые ТКА были синтезированы и охарактеризованы методами ЯМР Н1 и С13, МАЛДИ ТОФ, ИК-спектроскопии, элементного анализа в ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН в лаборатории «Химии каликсаренов» (завлабораторией Антипин И.С.). Свойства и структура перенесенных пленок были изучены на кафедре физики КНИТУ в лаборатории "Спектроскопии, микроскопии и термического анализа" (зав каф Нефедьев Е.С.), и в лаборатории «Электрохимического синтеза» ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН под руководством Кадирова М.К.

402- + 4Н- + О, - 40, + 2Н,0: 30,- + 4Н* +202- 30, + 2Н202:

Таблица 1. Формулы тиакаликс[4]аренов

Формула ТКА и шифр Номенклатура по Д. Гютше Формула ТКА и шифр Номенклатура по Д. Гютше

СЫ СЫ N0 ЫС I 25,26,27, И-тетракис-[0-{Ъ-циано)пропокси] -5,11,17,23 -тетра-п-т/)ет-бутил-2,8,14, 20-тетратиакаликс[4]арен СЯ С» »С N0 V 25,26,21,2%-тетракис-[0-(Ъ-циано)пропокси]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен

о / (° П } п CN CN N0 N0 1| 25,26,27,28-тетракис-[0-(циано)метокси]-5,11,17,23-тетра-п-трет-бугил- 2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен 0 он он О. Чл= АсБ^ VI 25,27-дигидрокси-26,28-ди-[0-( 2-ацетилтио)этокси]-5,11,17,23-тетра-п-/ире»)-бугил-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен

о/ ЗмЗД СЫ СЫ О! с™ III 25,26,27,28-тетракис-[0-(4-циано)бензилокси]-5,11,17,23-тетра-п-тре/и-бутил-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен щ 0 ОН он 0. V -V VII 25,27-дигидрокси-26,28-ди-[0-( 2-метилтио)этокси]-5,11,17,23-тетра-п-трет-бугил-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен

. Асв .Б А с щ. ^О-^ IV 25,27-краун(тетраэтокси)-26,28-ди-[0-( 2-ацетилтио)пропокси]-5,11,17,23 -тетра-п-трет-бугил-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен 6 6 V,,, 25,27-дигидрокси-26,28-ди-[0-( 2-бензилтио)этокси]-5,11,17,23-тетра-п-треш-бутил-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XVI Нижегородской сессии молодых ученых (естественно - научные дисциплины) («Красный плес», 2011), XVI Конференции молодых ученых - химиков Нижегородской области (Нижний Новгород, 2013), I Всероссийская XII Ежегодная научная сессия молодых ученых и студентов с международным участием» Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2013).

Личный вклад автора. Автор участвовал в постановке задач исследования, сборе и анализе литературных данных, выполнении эксперимента, анализе, обработке и интерпретации полученных данных, написании статей для публикации.

Структура и объем диссертации. Диссертационая работа состоит из введения, 3 глав (литературный обзор, результаты работы и их обсуждение, экспериментальная часть). Работа представлена на 123 страницах машинописного текста, содержат 12 таблиц, 42 рисунка, 6 схем. Список цитируемой литературы включает 111 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа выполнена при финансовой поддержке Научно-образовательного центра (грант 14.740.11.0384).

Методы исследования и приборы.

Монослои и пленки изучали на установке, состоящей из тефлоновой ванны и весов Ленгмюра. Для формирования монослоя на поверхность водной фазы помещали 10 мкл раствора, содержащего 10.0 мг раствора ТКА в 10 мл СНС1з. Воспроизводимость взвешивания ТКА в пикнометре оценивали по дисперсии s2 = 6.4-Ю-6 и относительному стандартному отклонению RSD (%) = 8.5, погрешность Е = 10.0±0.1 мг. Поверхностная концентрация составляла 1.05-10"8 моль на одну ванну (3.8-10~"моль-см~2). После испарения растворителя монослои сжимали в условиях, обеспечивающих минимальный гистерезис сжатия. При сжатии монослоя измеряли площадь поверхности и силу (поверхностное давление), которая действует на подложку до и после нанесения монослоя на поверхность жидкости. Поверхностное давление л = Yo - Y, где fa и у — поверхностное натяжение (мН м-1) до и после нанесения монослоя. Молекулярную площадь (Ао) ТКА в монослое определяли графически путем экстраполяции спадающего участка изотермы к = f(A) на ось абсцисс к я = 0.

Фазовое состояние двумерной пленки ß оценивали по модулю тангенса угла наклона изотермы сжатия к = f(A) на участке с максимальной крутизной ß = drc/dA (Hm"3).

Электронные спектры поглощения водных растворов и пленок на поверхности кварца (Sigma Aldrich) регистрировали на приборах «Bio line Specord S 100» («Analytik Jena») и «Shimadzu UV - 1800» (Japan) С толщиной кварцевой кюветы 10 мм. Растворы

БАВ и монооксида азота готовили перед использованием. RSD при взятии навески составило 0.8%. Оптическую плотность перенесенных монослоев ТКА (горизонтальный метод) с субфазы, содержащей cyt с и антиоксиданты, на кварцевую пластину оценивали по длине волны 410 нм.

Смачивание и долю поверхности, занятой компонентами пленки, определяли в условиях натекания, используя воду.

Спектры электронного парамагнитного резонанса ЭПР получали на приборе Bruker ER - 200D - SRC, снабженным двойным резонатором ER - 4105 - DR с рабочей частотой 9.95 ГГц при 77 К. В качестве стандартного образца был использован 2,2,6,6 -тетраметилпиперидин - 1 - оксид (TEMPO), осажденный на кварц из толуольного раствора. Образцы кварца с перенесенными монослоями ТКА и иммобилизованным cyt с погружали в водный раствор, через который пропускали газообразный N0 либо в раствор, содержащий нитрит и аскорбат натрия, в течение 1 минуты.

Морфологию и структуру тонких пленок изучали на сканирующем зондовом микроскопе (MultiMode V "Veeco") в прерывисто - контактном режиме с использованием приема фазового контраста.

Очистка воды для приготовления субфаз проводилась установкой обратного осмоса Millipore Elix 3 (электропроводность воды >15 МП).

Исследования антиоксидантной активности цитохрома с в присутствии дигидрокверцитина, аскорбиновой кислоты и монооксида азота в процессах липопероксидации, индуцированной железом и пероксидом водорода, in vitro проводили хемилюминесцентным анализом на приборе БХЛ - 06. Использовали параметры: К= Imax/S - фактор антиоксидантной - активности, где Imax (mV) - максимальная вспышка хемилюминесценции; S (mV) - суммарная хемилюминесценция за 30 сек.; tg а2 - скорость нормализации процессов свободно-радикального окисления. Уровень первичных продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов (ДК) и триеновых конъюгатов (ТК) проводили в метанол-гексановой фазе экстракта липидов при длинах волн 232 нм и 275 нм, а также по содержанию конечных продуктов - оснований Шиффа (ОШ) методом флуоресценции при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 420 нм.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 1 патент, 6 статей в ведущих рецензируемых журналах и тезисы 2 докладов на всероссийских научных конференциях.

Соответствие диссертации паспорту специальности. Диссертационная работа по своим целям, задачам, содержанию, научной новизне и методам исследования соответствует п.З паспорта специальности 02.00.04 — физическая химия и решает важную

задачу физической химии по установлению закономерностей формирования монослоев и тонких пленок тиакаликс[4]аренов и иммобилизации в них цитохрома с.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание биомиметической модели антиоксидантной активности cyt с предполагает выбор ТКА, способных образовывать истинные монослои и проявлять рецепторные свойства по отношению к металлопротеину, а также выявление свойств и параметров, отражающих взаимодействие cyt с с низкомолекулярными антиоксидантами в монослоях и пленках на твердых подложках.

1. Фазовые состояния Ленгмюровских монослов и пленок производных тнакаликс[4]арена на межфазной границе «вода- воздух»

Тиакаликс[4]арены с циано-, меркапто- и монокраун-эфирными заместителями I -V не являются классическими дифильными соединениями, в связи с чем возникают затруднения с доказательством истинности ленгмюровских монослоев. Кроме того, возможны стерические затруднения при сборке ТКА в монослой, поскольку они существуют либо в 1,3- альтернат конформации, либо представляют смесь с конус конформацией.

Нами показано, что при медленном сжатии (15 мм мин*1) поверхностной пленки ТКА I - V на воде образуются устойчивые монослои (табл. 2, рис. 2 а,б). Параметры изотерм сжатия n=f(A) ТКА I и IV, отсутствие гистерезиса сжатия и близость значений Ао к молекулярной площади, определенной методом РСА, для близких по химической природе соединений [М. N. Kozlova, 2007], указывают на образование истинной жестко -конденсированной пленки с отсутствием фазовых переходов (табл. 2, рис. 2 а,б).

При увеличении полярности заместителя на нижнем ободе, за счет уменьшения длины углеводородной цепочки, возможна агрегация ТКА в слоях, что подтверждается уменьшением величины Ао с 1.11 нм2 (ТКА I) до 0.88 нм2 (ТКА II).

Введение ароматического фрагмента в заместителе на нижнем ободе приводит к монослоям более сложного строения. Изотерма сжатия я = f(A) для ТКА III имеет точку перегиба в области поверхностного давления ЗОмН м'1, соответствующую фазовому двумерному переходу. Свойства пленки де-трет-бутилированного ТКА V кардинально отличаются от аналога с заместителем на верхнем ободе.

Уменьшение молекулярной площади в два раза до А0=0.56 нм2 и увеличение коэффициента ß = 2.51017 Н м"3 свидетельствуют о склонности к структурированию этого соединения в монослое, и, возможно, к образованию дуплексной (бислойной) пленки.

А, нн1 -молекула1 д'

А, нм3-молекула 'в'

А, нмг-молекула''5^

Рисунок 2. Изотермы сжатия Tt=f(A) монослоев

а) ТКАI-V на водной субфазе: кривая 1- ТКА I; кривая 2- ТКА II; кривая 4-ТКАIV; кривая 5 -ТКА V. На вставке предсавлен гистерезис сжатия ТКА I.

б) кривая 3 -ТКА III

в) ТКА V-VIII на водной субфазе и на 0.01 М растворе AgNCh: кривая 5 (5') -ТКА V; кривая 6 (б') -ТКА VI; кривая 7 (7') - ТКА VII; кривая 8 (8') - ТКА VIII

Таблица 2. Данные по свойствам монослоев к рисунку 2 а,б,в

ТКА Субфаза № кривой (рис) А0 ±0.02, им2 (Р±0.1)-10-17, Н-м"3

I вода 1(2 а) 1.11 1.9

II вода 2 (2 а) 0.88 2.2

III вода 3(2 6) 1.11 (л< 30 мН м"') 1.28 (я> 30 мН м"1) 1.7 1.0

IV вода 4 (2 а) 1.16 2.0

V вода 5 (2 а,в) 0.56 2.5

АЁЫ03 (0.01 М) 5'(2 в) 0.56 2.5

VI вода 6 (2 в) агрегирование -

АёЫОз (0.01 М) 6'(2 в) 1.10 2.5

VII вода 7 (2 в) агрегирование -

АёК03(0.01 М) 7'(2 в) 1.17 (тс >40 мН'м"1) 1.21 (я <40 мН м'1) 2.8 2.5

VIII вода 8 (2 в) агрегирование -

АёМОз (0.01 М) 8' (2 в) 1.21 3.1

Соединения ТКА VI, VII и VIII, содержащие сильно полярные группы (две ОН-группы или меркаптановые фрагменты) на нижнем ободе, не образуют пленок на водной поверхности (табл. 2, рис. 2 в), о чем свидетельствует вид их изотерм сжатия. Об агрегации в монослоях ТКА VII свидетельствует область, соответствующая состоянию неконденсированной или жидкой пленки при я ~ 1-2 мНм"1; пленка характеризуется величинами лК0ЛЛапса ~ 50 мНм"1 и эффективной молекулярной площадью Ао ~ 0.2 нм2. Изотермы сжатия соединений VI и VIII имеют обширное плато в области я = 3 - 5 мНм"1, что характеризует сильное межмолекулярное взаимодействие на границе раздела " вода -монослой".

Для формирования монослоев ТКА полярной природы (VI - VIII), нами был использован прием изменения межмолекулярных взаимодействий на межфазной границе "вода - воздух" за счет комплексообразования донорных групп кислорода и серы ТКА с ионами металлов в субфазе. Нами предложено введение нитрата серебра в водную субфазу, поскольку, ранее была показана возможность образования прочных комплексов тиреш-бутил-ТКА с амидопиридин-, морфолид-, пирролидин- и гидразид- содержащими группами на нижнем ободе с ионами серебра по типу "гость - хозяин" [Evtugyn G.A., 2008].

Из данных рисунка 2 в и таблицы 2 следует, что на водной субфазе, содержащей AgN03, формируются истинные монослои ТКА VI, VII и VIII, значения А0 которых равны 1.10 нм2; 1.17 нм2 и 1.21 нм2; 1.21 нм2, соответственно. Особенностью изотермы сжатия монослоя ТКА VII являются два жестко - конденсированных состояния, отличающиеся параметрами (3i = 2.8-Ю17 Н м"3 и р2 = 2.51017 Н м"3, и значениями А0 = 1.17 им2, 1.21 нм2, соответственно.

В пользу образования координационной связи между ионами серебра и донорными атомами ТКА VI - VIII свидетельствуют данные по неизменности состояния монослоев ТКА V, не имеющего гидроксильных групп и серы на нижнем ободе, на водной субфазе содержащей AgNCh.

Таким образом, изучение параметров изотерм я = f(A) ТКА I - VIII и свойств полученных пленок показало, что воспроизводимые стабильные монослои на водной субфазе образуют ТКА I - IV. Отсутствие трет-бутильного заместителя на верхнем ободе способствует образованию более жесткой дуплексной (бислойной) пленки, а при наличии двух гидроксильных групп и меркаптоалкоксильных (или меркаптобензильных) групп на нижнем ободе ТКА VI - VIII монослой формируется только на субфазе содержащей нитрат серебра.

2. Изучение биомиметического взаимодействия цитохрома с, иммобилизованного в монослои тиакаликс[4]арена, с антиоксидантами 2.1. Иммобилизация цитохрома с в монослои тиакаликс[4]арена

Иммобилизация су1 с была изучена на истинных монослоях ТКА I и IV, введением в водную субфазу металлопротеина.

Свойства монослоев ТКА, сформированных на растворе су! с зависят от концентрации металлопротеина в субфазе, при этом величина эффективной молекулярной площади увеличивалась с 1.11 нм2 и 1.16 нм2 до 1.84 нм2 при увеличении концентрации су! с в растворе до 50 мгл"1 (рис. 3). Свойства полученных пленок для соединений I и IV приведены в таблице 3.

Рисунок 3. Изотермы сжатия ТКА I при различной концентрации су1 с: 1 - 0 мг л"1; 2 -5 мг-л"1; 3- 10 мг л ; 4-25 мг л"1; 5-50 мг л"1

Таблица 3. Зависимость свойств монослоев ТКА I, IV от концентрации суХ с в

ТКА I ТКА IV

СсуЬ мгл"1 Ао±0.02, нм2 ДАо±0.02*, нм2 (Р±0.1)Т0", Нм"3 Арьо.ог, нм2 ДАо±0.02*, нм2 (Р±0.1)Т0"", Нм"3

0 1.11 0 1.9 1.16 0 2.0

5 1.52 0.41 - 1.55 0.39 0.95

10 1.70 0.59 1.0 1.78 0.62 0.75

25 1.82 0.71 0.9 1.83 0.67 -

50 1.84 0.73 0.8 1.84 0.68 0.7

*- ДА0 = Ао(С) - Ао(Со), где А0(С0) = 1.11 нм и 1.16 нм , для ТКА I и ТКА IV, соответственно

Иммобилизацию с>1 с в монослои ТКА I и IV можно формально рассматривать как адсорбцию металлопротеина, зависящую от концентрации с в растворе: Г*= Г(Ссу1), где Г* — поверхностная концентрация су! с в монослое; Сс)1 — объемная концентрация цитохрома с в растворе.

Принимая следующие условия:

1) монослой - двумерный раствор суг с и ТКА, в котором каждая молекула ТКА занимает ту же площадь, что и в гомогенном монослое;

2) отсутствуют латеральные взаимодействия между ТКА и су1 с,

можно предположить, что адсорбционные свойства цитохрома с, главным образом, определяются взаимодействием адсорбат — монослой. С учетом этих условий величина площади, занимаемой одной молекулой ТКА в смешанном адсорбционном слое Аср может быть представлена в виде уравнения, справедливого для двухкомпонентного монослоя [Адамсон, 1979]:

А^ = <рГА01 + (1-ф|)'А0,2, где Ао,1 - молекулярная площадь тиакаликсарена на воде; Ао,г - площадь, занимаемая фрагментами су1 с в отсутствии ТКА; ф] - доля поверхности ТКА в монослое; (1-фО-доля поверхности иммобилизованного су1 с.

Зависимость прироста молекулярной площади ТКА I и IV от концентрации су1 с в растворе имеет область плато (> 10 иг-л"1), что характеризует насыщение монослоя металлопротеином, и близка по своей природе изотерме адсорбции Ленгмюра (рис. 4).

ААо,

Ссу(, мгл"1

Рисунок 4. Зависимость ДА = для ТКА I и IV

Следовательно иммобилизация с>! с в монослои ТКА I, IV зависит от концентрации металлопротеина в субфазе, причем характер изменения ДА = А^С^) формально соответствует адсорбции Ленгмюровского типа.

2.2. Взаимодействие аскорбиновой кислоты, дигидрокверцитина и монооксида азота с цитохромом с, иммобилизованным в монослои тиакаликс[4]арена

Свойства монослоев ТКА I не изменялись при добавлении в водную субфазу дигидрокверцетина (ДКВ) с различной концентрацией и в присутствии трис(оксиметил)аминометана (ТА). Реакция су1 с с ДКВ в гомогенном растворе и под монослоем ТКА I привела к изменению свойств пленки с иммобилизованным металлопротеином: Ао увеличилась с 1.11 им2 (рис. 5, табл. 4) до 1.23 нм2. Аналогичное изменение в свойстве пленок было отмечено под влиянием аскорбиновой кислоты (АК) в водной субфазе. Взаимодействие с)1 с и АК в субфазе над монослоями ТКА I приводит к образованию монослоя с такой же эффективной Ао (4о = 1.24 нм2), как и в отсутствии сух с, в отличие от пленок над субфазой, содержащей ДКВ: Ао увеличилось до 1.62 нм2. Характерным признаком иммобилизации антиоксидантов в монослой является двукратное уменьшение жесткости Р пленок (табл. 4).

Рисунок 5. Изотермы сжатия я = ("(А) монослоев ТКА I на субфазах: 1 — вода;

2 — ДКВ (510 М);

3 — с>* с (4 10-7 М (5 мг л"1)) + ДКВ(5-10~бМ);

4 — АК(510"4 М);

5 — су1 с (4-Ю"7 М (5 мг-л"'))+ АК (510"4М)

2.0 3.0

А, нм' молску.т'

Таблица 4. Влияние состава субфазы (см. подпись к рис. 5) на свойства монослоев ТКА I

Кривая Субфаза Ао, нм2 /МО17 Н-м"3

1 вода 1.11±0.01 1.9±0.1

2 ДКВ 1.23±0.01 1.1±0.1

3 су1 с + ДКВ 1.62±0.04 0.7±0.1

4 АК 1.64±0.02 0.6±0.1

1.23±0.02 1.0±0.1

5 су! с +АК 1.24±0.01 1.0±0.1

Можно полагать, что изменения А0 ТКА I под действием низкомолекулярных БАВ обусловлены их включением в полость рецептора, увеличивая его Ао на постоянную величину за счет изменения пространственного положения заместителей нижнего обода на межфазной границе раздела, тогда как биополимер су\ с иммобилизуется в монослой не только за счет рецепторой способности ТКА I.

Влияние ДКВ и АК на су! с в водном растворе субфазы хорошо отражают данные электронных спектров поглощения (рис. 6). В растворах, содержащих ДКВ и су* с при рН близких к 10, наблюдались следующие изменения: 1) увеличение поглощения полосы в области 324-327 нм за счет ионизации катехольного фрагмента ДКВ; 2) уменьшение интенсивности поглощения полосы хромоновой группы (Х,„ах = 290 нм) ДКВ; 3) появление плеча в области 324-327 нм, соответствующего хиноидной структуре ДКВ (рис. 6а, в).

он

1 ДКВ

AoiH

о.ю

[ДКВ] = const pH 7

cyt с (окне) cytc (восст)

¡0

А СОВ 0.80

[ДКВ] = const pH 10

560 X, HM

в)

6)

Рисунок 6. Спектры водных растворов:

а) 1 - 2-Ю"5 М ДКВ; 2 - эквимолярная смесь 2-10"5 М ДКВ и ТА; 3 - 4-10"6 М с>* с (окисленный); 3' - 410"6 М суX с (восстановленный);

б) смеси 20-10"6 М ДКВ и суг с: 4 - 20:3, 5 -20:4; 6 - 20:5; 7 - 20:6; 8 - 20:7; 9 - 20:8; соответственно;

в) смеси 20-10"6 М ДКВ и су\ с в буферном растворе с рН 10.2 состава 20:6: 10 — после смешения; 11 — через 60 мин.

В видимой области спектра поглощения cyt с после реакции с ДКВ появлялись слабо выраженные, а- (550 нм) и ß- (520 нм) полосы, а также самая интенсивная у-полоса при 415 нм, тогда как, окисленной форме cyt с соответствует интенсивная у-полоса,

смещенная с сторону УФ-области спектра с = 409 - 411 нм (рис. 6 а). Показано, что изменения в электронных спектрах зависят от концентрации суг с (рис. 6 б).

Аналогичные изменения в спектре су! с отмечались в спектрах его смесей с АК (рис. 7), а также в спектрах смесей газообразного монооксида азота (N0) с су! с. В реакции су1 с и АК, проявляющейся в УФ-спектре в виде полосы с Хщ^ = 270 нм, АК окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, характеризующейся = 317 нм.

,4 AOTm=f(t)

5 А^ВД

0.00

270 317 3S1 410415

240 340 440

нм

Рисунок 7. Изменение электронных спектров растворов смеси 6.410-6 М (80 мг-л"1) cyt с и МО"5 М АК во времени: т = 60 мин(2), 120 мин (3), и 6.410""6 (80 мг-л"1) М cyt с (1). На вставке показано изменение во времени оптической плотности при X = 270 нм (4) и 550 нм (5)

Исследование реакции cyt с с газообразным NO в растворе показало, что под действием NO цитохром с переходил в восстановленную форму cyt с2+ (появление в спектре и - и ß - полос, смещение у - полосы до 415 нм), при этом также образовывались нитрозильные комплексы, характеризующиеся полосой 358 нм (рис. 8).

Рисунок 8. Электронные спектры водных растворов, содержащих 2.410"6М су! с: 1- после реакции с газообразным N0; 2 - исходный раствор (суг с¥). Вставка показывает длинноволновую часть спектра реакции N0 с с>1 с

А, нм

В экспериментах in vitro на плазме крови человека оценена антиоксидантная активность изучаемых БАВ в присутствии cyt с (табл. 5). Наблюдаемые закономерности восстановления cyt с под действием антиоксидантов - АК, NO и ДКВ, имеющих более высокий редокс - потенциал, чем у с цитохрома с, позволяют предложить биомиметическую модель антиоксидантной активности БАВ, изучая отклик взаимодействия цитохрома с, иммобилизованного в монослои ТКА с антиоксидантами.

Таблица 5. Показатели свободно — радикального окисления липидов плазмы крови.

Опыт Интенсивность свободно-радикального окисления липидов (ПОЛ) по Фентону Показатели ПОЛ

K=Imax/S tg Ct2 (Скорость нормализации ПОЛ) ДК (диеновые конъюгаты) ТК (триеновые конъюгаты) ОШ (основания Шиффа)

Контроль 0.1340 ±0.0110 0.4200 ±0.0630 0.210±0.011 0.04110.002 4.24±0.69

cyt с 0.1227 ±0.0639 0.4667 ± 0.0058 0.201±0.016 0.031±0.003 3.18+0.65

cyt с +ДКВ 0.1136 ±0.0367 0.5473 ± 0.0438 0.160+0.011 0.023±0.010 2.17±0.51

cytc+AK 0.1167 ± 0.0443 0.5460 ±0.0240 0.150+0.013 0.021 ±0.011 2.15+0.56

cyt c+NO 0.1131 ±0.0253 0.6120 ±0.0450 0.130±0.017 0.019±0.014 2.03+0.56

Моделирование процессов взаимодействия металлопротеинов, иммобилизованных в монослои, с БАВ позволяет изучать окислительно - восстановительные реакции в коллоидных растворах металлопротеинов, независимо от их структуры в растворе в реальных масштабах времени, поскольку на границе раздела фаз скорость реакции намного выше, чем в объемных фазах. Таким образом, система «монослой ТКА с иммобилизованным су! с» может быть использована при биомиметическом исследовании и прогнозировании антиоксидантной активности веществ.

3. Условия получения и свойства тонких пленок производных тиакаликс[4]арена и тиакаликс[4]аренов с иммобилизованным су) с на твердых

подложках.

Полноту покрытия твердых подложек пленками ТКА контролировали методом смачивания (рис 9). Долю поверхности, занятой ТКА I, рассчитывали по уравнению Касси - Бакстера:

С05в„аб„ = (русохв1 + (1- 1р1)-СО$в2, ГДе ф] — доля поверхности, занятая ТКА; 9] — краевой угол смачивания на сплошной пленке ТКА; — краевой угол смачивания на чистой поверхности твердой подложки.

Доля поверхности, занятая ТКА I, ф1 =1 достигалась при 9„абл = 81 град, что соответствовало переносу от 4 до 8 монослоев ТКА на поверхность инертных кремния, кварца и 1ТО (рис.9).

Рисунок 9. Зависимость контактных углов смачивания пленок ТКА I от количества перенесенных слоев п на подложке: 1 -1ТО; 2 - кварц; 3- кремний

Толщину и структуру поверхности перенесенных пленок ТКА контролировали методом АСМ. Образование сплошного покрытия на ITO происходит при переносе 4-5 монослоев (рис. 10). В отличие от этого, при переносе монослоев ТКА I на поверхность кремния ТКА в монослоях агрегируется с образованием частиц высотой 50 - 70 нм.

< ч (

.V С ! / *

г

<

«Г

<г, , ( t

Minn/ к ■ '

Г _ -S.

а) 1 перенос (Si)

б) 3 переноса (Si)

в) 4 переноса (Si)

400 440 480

X. нм

При трех слоях ТКА I с иммобилизованным су1 с, средняя толщина пленки на стекле 1ТО составила 12 нм (рис. 12), следовательно толщина одного слоя ТКА с цитохромом с соответствовала 4 нм (3 нм размер сух с и 1 нм - ТКА).

г) 5 переносов (Si) д) 3 переноса (ITO) е) 5 переносов (ITO)

Рисунок 10. АСМ изображения ТКА 1, перенесенного на твердые подложки: а-г на кремний, а) - 1 монослой; б) - 3 монослоя; в) - 4 монослоев; г) — 5 монослоев; д,е на ITO; д) - 3 монослоя; е) - 5 монослоев. Под фотографиями представлены распределения поверхности пленки по высоте.

Полноту переноса монослоев ТКА I с иммобилизованным су1 с на кварц по методу Ленгмюра - Шеффера (ЛШ) контролировали по длине волны 410 нм (рис. 11).

А™

Рисунок 11. UV-vis спектр перенесенных слоев ТКА I с иммобилизованным cyt с

Рисунок 12. АСМ изображение 3 перенесенных монослоев ТКА I с иммобилизованным cyt с на ITO. Справа представлен рельефный профиль.

ACM изображения поверхности чистого золота имеют зернистую структуру (рис. 13 а), а также размытый фазовый контраст (рис. 13 б). В отличие от этого, при однократном переносе ТКА I на золотую поверхность отмечаются однозначные изменения состояния поверхности, фиксируемые фазовым контрастом (рис. 14 а): отмечалось изменение формы зерен при сохранении топологии поверхности (рис. 14 б), что характерно для хемосорбционных пленок.

Рисунок 15 а. АСМ изображение монослоя ТКА I с иммобилизованным cyt с

Рисунок 15 б. Фазовый контраст монослоя ТКА I с иммобилизованным cyt с (рис. 15 а)

Рисунок 13 а. АСМ изображение поверхности золота

Рисунок 13 б. Фазовый контраст

Рисунок 14 а. АСМ изображение монослоя ТКА I на поверхности золота

Рисунок 14 б. Фазовый контраст монослоя ТКА I на поверхности золота (рис. 14 а)

Процесс переноса ТКА I на золото близок по своей природе к получению самоорганизующихся монослоев алкилтиолов, что делает перспективным модификацию золота ТКА I для приготовления золотых электродов для биосенсоров. Однако, при однократном переносе ТКА I с иммобилизованным су1 с на золото наблюдались треугольные призмы высотой 50 нм шириной 200 нм и длиной 600-800 нм, предположительно являющиеся кристаллами су1 с (рис. 15 а, б). Следовательно, для получения биосенсора с однородной пленкой ТКА - су\. с на поверхности золота, необходимо чередовать нанесение слоев следующим образом: вначале переносится монослой с ТКА как линкерной молекулой, затем монослой ТКА с иммобилизованным су! с.

Таким образом на примере ТКА I была продемонстрирована возможность получения сплошных пленок на поверхности ГГО методом переноса Ленгмюра - Шеффера с водной субфазы. На кремнии, кварце и ГГО формирование покрытия происходит через стадию образования островков (4-8 монослоев), а на поверхности золота сплошное покрытие может достигаться при одном переносе.

Полученные тонкие пленки соответствовали по качеству требованиям, предъявляемым к платформам для АСМ и поверхности электрода - элемента биосенсора.

Перспективность использования монослоев ТКА с иммобилизованным су1 с, как поверхности биосенсора, подтверждены исследованием как в водной субфазе, содержащей монооксид азота и су1 с, так и в пленке монослоев ТКА после насыщения его газообразным N0 (рис. 16).

-0.001

X, нм

Рисунок 16. Влияние газообразного N0 на спектр с)! с2* в составе пленки с ТКА I во времени, номер кривой соответствует времени протекания реакции.

Особенностью электронных спектров с>1 с, иммобилизованного в монослои ТКА, перенесенных на поверхность кварца, является уменьшение интенсивности поглощения а и р полос су\ с2* во времени. ЭГ.'Р спектры фиксируют сигналы N0 ($>=2.005) в тонких

пленках TICA с cyt с, иммобилизованным в присутствии N0, причем интенсивность сигналов уменьшается во времени (рис. 17).

3 (45 мин) 2 (5 мин)

1 (1 мин) 4 (TEMPO)

340 350 360 Магнитное поле (мТс)

Рисунок 17. ЭПР спеюры продуктов реакции NO с цитохромом с, иммобилизованным в монослои TICA и перенесенным на поверхность кварца. Время после реакции: 1-1 мин; 2-5 минут; 3-45 минут; 4 - стандарт TEMPO.

Таким образом, тонкие пленки ТКА с иммобилизованным cyt с способны быстро образовывать нитрозильные комплексы, отражающие уровень монооксида азота, являющимся важнейшим эндогенным регулятором физиологических процессов и маркером сосудистых заболеваний, в организме.

Выводы:

1. Впервые установлено влияние структуры тиакаликс[4]аренов на их фазовое состояние в ленгмюровских монослоях на водной субфазе. Стабильные монослои образуют трет-бутил-тиакаликс[4]арены с ш-цианоалкокси-, л-цианобензилокси- и с монокраун-эфирным заместителями на нижнем ободе, в отличие от функционализированных двумя гидроксильными группами и двумя меркаптоалкоксильными или меркаптобензильными радикалами.

2. Выявлена возможность управления фазовым состоянием пленок трет-бутил-тиакаликс[4]аренов с гидроксигруппами на нижнем ободе, путем изменения состава субфазы: истинные монослои образуются на водном растворе А§ЫОз.

3. Впервые выявлены закономерности иммобилизации цитохрома с в монослои тиакаликс[4]арена I на водной субфазе в присутствии аскорбиновой кислоты и дигидрокверцитина. Процесс сопровождается увеличением Ао практически вдвое при увеличении концентрации металлопротеина. Зависимость приращения молекулярной площади ЛАо-Г(Ссу0 имеет вид изотермы адсорбции Ленгмюра.

4. Показано что изменения в свойствах монослоев тиакаликс[4]аренов с иммобилизованным цитохромом с над субфазой, содержащей антиоксиданты, могут

выступать в качестве прогностического фактора редокс-процесса, а сами монослои тиакаликс[4]арена I с иммобилизованным цитохромом с - играть роль биомиметической модели или сложного сенсора на вещества, имеющие более высокий по сравнению с цитохромом с редокс-потенциал.

5. Изучена способность трет - бутилтиакаликс[4]аренов с цианоалкокси-заместителями на нижнем ободе выступать в качестве линкерных молекул в монослоях, перенесенных по методу Ленгмюра - Шеффера для формирования сплошных пленок на поверхности ITO и золота. Показано, что пленки на поверхности ITO являются атомарно -гладкими и могут быть использованы для исследований образцов методом АСМ.

6. Установлены закономерности переноса монослоев тиакаликс[4]арена с иммобилизованным цитохрома с в на твердые подложки для создания элемента биосенсора на монооксид азота.

Статьи опубликованные по результатам работы:

1. Мельникова Н. Б. Монослои трет-бутилтиакаликс[4]арена как биомиметическая модель окисления антиоксидантов цитохромом е./ Н. Б. Мельникова, Е. Н. Кочетков, С. Е. Соловьева, Е. В. Попова, И. С. Антипин, А. Е. Большакова, О. Е. Жильцова, А. И. Коновалов.// Изв. АН. Сер. хим.-2011. № 9.С. 1915-1921.

2. A. A. Muravev. Thiacalix[4]monocrowns Substituted by Sulfür-ContainingAnchoring Groups: New Ligands for Gold Surface ModificationA A. A. Muravev, S. E. Solovieva, E. N. Kochetkov, N. B. Mel'nikova, R. A. Safiullin, M. K. Kadirov, S. K. Latypov, I. S. Antipin, A. I. KonovalovV/MaKporeTepouHKHbi/Macroheterocycles. -2013. 6(4).302-307.

3. N. B. Mel'nikova. iert-Butylthiacalix[4]arene monolayers as a biomimetic model for the oxidation of antioxidants with cytochrome c.\ N. B. Mel'nikova, E.N. Kochetkov, S.E. Solovieva, E.V. Popova, l.S. Antipin, A.E. Bol'shakova, O.E. Zhil'tsova, A.I. Konovalov.W Russian Chemical Bulletin. - 2011. 60(9). 1948 - 1955.

4. Мельникова H. Б. Подложка атомно-силового микроскопа. Описание полезной модели к патенту. RU 110082 Ul\ Н.Б.Мельникова, С. Е.Соловьёва, М. К. Кадиров, Е.Н.Кочетков, И. Р.Низамеев, Р. А.Сафиуллин, Е. В.Попова, И. С. Антипин, А. И.Коновалов.\\ Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. -10.11.2011.Бюл. №31.

5. Низамеев И. Р. Самоорганизованные монослои некоторых каликсаренов на твердой поверхности: методы определения толщины./ И.Р. Низамеев, P.A. Сафиуллин, Е.С.Нефедьев, М.К.Кадиров, С.Е. Сольвьева, И.С. Антипин, Н.Б. Мельникова, E.H.

Кочетков.// Вестник Казанского Государственного Технологического Университета. -2011. №14. С.35-38.

6. Сафиуллин Р. А. Монослои цианопропокси- п - тре/я-бутилтиакаликс[4]арена на поверхности твердых подложекЛ Р. А. Сафиуллин, Е. Н. Кочетков, Н. Б. Мельникова, С. Е. Соловьева, И. С. Антипин, М. К. Кадиров, Е. С. Нефедьев.\\ Вестник Казанского Государственного Технологического Университета. - 2012. №15. С.61-62.

7. Сафиуллин Р. А. Реакция на нитрат серебра пленок Ленгмюра-Блоджетт ряда производных тиакаликс[4]аренов.// Вестник Казанского Государственного Технологического Университета. -2013. №8.С.48-50.

8. Кочетков E.H. Монослои трет-бутилтиакаликс[4]арена как биомиметическая модель каталитического окисления цитохромом с.\\ E.H. Кочетков, Н.Б. Мельникова, С.Е. Сольвьева, Е.В. Попова, И.С. Антипин, А.И. Коновалов, А.Е. Исакова, O.E. Жильцова, А.А Логунов \\ Сборник тезисов докладов I Всероссийского симпозиума по поверхностно-аетивным веществам "От коллоидных систем к нанохимии". - Казань. - 2011. -С.85.

9. Кочетков E.H. Наноразмерные биомиметические модели на основе монослоев тиакаликс[4]арена.\\ E.H. Кочетков, Н.Б. Мельникова\\ Сбоник материалов XVI конференции молодых ученых - химиков Нижегородской области. - Нижний Новгород. -2013. - С.46-47.

Подписано в печать 24.10.2014 г. Заказ №2300. Тираж 100 шт. Отпечатано в ООО «Типография АТЭМ» 603126, г. Н. Новгород, ул. Родионова 192 в тел.: 434 90 69