Нового типа объемные атомные модели и молекулярное моделирование биоструктур тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ■ М. В. ЛОМОНОСОВА

МИКЕЛЬСААР Райк-Хийо Неэмеевич

НОВОГО ТИПА ОБЪЕМНЫЕ АТОМНЫЕ

МОДЕЛИ И МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОСТРУКТУР

02.00.10 Биоооганическз я химия, химия природных и физиологически активных веществ

химических наук в форме научного

Химический факультет

На правах рукописи

УДК 577.22.088.5

Диссертация на соискание ученой степени доктора

доклада

Москва 1988

Работа выполнена в лаборатории молекулярного моделирования НИИ общей и молекулярной патологии Тартуского государственного университета.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Е.Б.Буряакова

доктор химических наук, профессор

Ю.Ш.Стручков

доктор химических наук

А.М.Копылов

Ведущая организация:

Институт белка Академии наук СССР

Защита состоится " ЬН " ¿УМ^. Д.Д- 1983 года в £ часов на заседании Специализированного совета Д 055.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. и,В.Ломоносова по адресу: Москва 119699, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Современный период развития естественных наук характеризуется все более глубокий проникновением в секреты строения и структурных превращений химических веществ. Особу» важность имела расиифровка принципов генетического кодирования синтеза белка, что привело к созданию совершенно новой области науки - молекулярной биологии. Важной наукой стала мембранология, изучающая биологические мембраны и связанные с последней многие первостепенные функции клеток. Основой развития этих наук явилось выяснение структуры химических компонентов клеток и организма на молекулярном уровне. Главным объектом исследования стали разные макромолекулы, представляющие собой биополимеры. В отличие от простых неорганических веществ и мономерных органических соединений, биомолекулы имеют сложную пространственную структуру. При этом важна не только обиап последовательность атомных групп и мономеров (т.е. первичная структура), но еще более их относительное расположение - конфориация - в пространстве, т.н. вторичная и третичная структура. Именно последняя определяет функциональное назначение самой молекулы, а также возможности ее взаимодействия с другими молекулами.

В настоящее время установлена первичная структура большинства биологических нолекул. Выяснение же вторичной и третичной структур явно отстает от расшифровки первичной. Это обусловлено главным образом методическими трудностями и иа-лым числом подходящих биофизических методов. Наибольшую точность дает рентгеноструктурный анализ, однако последний используется в основном лишь для изучения кристаллического, статического, нередко небиологического состояния молекул.Выяснению структуры макромолекул во многом способствовали методы конформационного анализа я компьютерной графики. Однако последние позволяют точно вычислить структурные состояния лишь конкретных молекулярных комплексов с заданными теоретическими характеристиками, но они малопригодны для генерирования новых идей об изначальном составе и расположении отдельных молекул и атомных групп в пространстве.

По мере развития тонких биофизических и математических методов увеличивается объем сведений о детальном строении химических веществ, однако все труднее получить общее представление о закономерностях микромира. Такая противоречивая

тенденция ощущается как в области научных исследований, так и в педагогике: учащихся с помощью обычных методов трудно ознакомить со стереохимией даже относительно простых, моио-ыерных молекул, не говоря ухе о сложных макромолекулах в биополимерах. Поэтому все более явной становится необходимость изыскания новых способов доступного и динамичного исследования строения и структурных превращений молекул и наглядного демонстрирования особенностей химического микромира.

Одним из таких методов является молекулярное моделирование с поиоиыо объемных атомно-молекулярных моделей, позволяющих исследовать не только конкретные стереохимические особенности молекул, но и переходы из одной конформации в другую. Особенно важно, что работа с такими моделями дает ценный исходный материал для развития новых представлений о структуре молекул, которые в дальнейшем могут быть уточнены методами конфориационного анализа и компьютерной графики. Молекулярное моделирование помогло бы решить многие проблемы в области синтеза белков, эволюционной биохимии, мембраноло-гии, биоэнергетики и других важных разделов биологической химии и молекулярной биологии. Однако использование в этих целях объемных атомно-молекулярных моделей довольно ограничено ввиду дефицитности и несовериенстга указанных пособий.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исходя из выиеприведенно-го целью работы являлось создание нового типа высококачественных объемных атомно-молекулярных моделей, пригодных для широкого внедрения в практику научно-исследовательской к учебно-педагогической работы, и выяснение эффективности применения метода молекулярного моделирования при создании новых конформационных моделей биоструктур и исследовании их эволюционных особенностей.

Конкретными задачами исследования были: I) усовервенст-вование параметров, создание наглядной унифицированной номенклатуры и улучшение технической конструкции объемных атомно-молекулярных моделей; 2) создание методики определения двугранных конформационных углов и моделирования апла-нарных циклических соединений с помощью объемных атомно-молекулярных моделей; 5) разработка метода рентгеномодельного анализа для определения атомных координат и имитируемых химических связей в объемных моделях, а также непосредственного сопоставления моделей с кристаллографическими картами электронной плотности самой молекулы; 4) характеристика и молекулярное моделирование нестандартных пар нуклеотидов в

составе тРНК; 5) уточнение эволюционных особенностей структуры тШК е помопьп новых атомно-иолекулярных моделей; 6) молекулярное моделирование липкдных комплексов в ноно- п '';;спо-ях, а также общей структур« бяомомбран; ?) выяснение -о-;.«-цвотпз: особенностей лкпидной части Ско.ембран t»«rcr,0" г-одо-куларного моделирования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. I) Созданы нового типа объемнно атои'но-'иолекупярннв модели, превосхоцягто ярецкк,/V • -г.с.к по параметрам, Т"К и технической кокструкц;::»; рвзрэ-воч-.г.г уяафщирояачняя иоаенкяатура этих иоделе».

. :;:г;г. :с г.озисзиос*ь определения двугг>яя";и i »vm»«»-

..»рования апданарных пя-г-^исли" с поноцью объем-

ных я :.!4;од рентгеноиодельного анализа

структур; 3) впервые проведена систематическая характеристика нестандартных пар нуклеотидов в структуре тШК н кодон-антикодонового комплекса; 4) выявлены закономерности конфорцацнонных сдвигов рибозо-фосфатных цепей и положения азотистых оснований при включении нестандартных пар нуклеотидов в двойную спираль JHK; 5) проаналчзгг стеряческие условия третяпноЗ структур* тГЯК пр.? -■- . нестандартны»- r.sr. лук.чсотпцоь г. пояохояяя 26-Ч-. к . .....) ■ror'.'.-'-'-iz :сок?орчг:ц«о!')гыо волмо-кност;: дг",.

!:'<.')Ц.':;о;'Ого комплекса; ?) установлена ко-глс:.. ; -<<\с-

'юсдтшдйртпц-/: пор нуклестпдсч; г ". с: руг.турси н стеряческини условиями их воян'-'д:.-. "-:;пмл 1- гГЛК; 6) впорякс осуществлено точное иолекулярксо ';одс;:;;-риссин* яаппдни-х коиплексов ноно- и бислоев разной структуры г. происхождения; 9) создана новая модель сотовидного о .-оспа«: багомембран; 10) ввявяеяо функциональное эначскяс лэпп-ционных особенностей ляпядннх структур бкомембран.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ И РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. Соякалине автором объемные атомяо-молекулярные модели нового типа способствуют повышению как уровяя научных исследований в институтах химического и биологического профилей, так я качества учебного процесса в вузах и общеобразовательное зколах. Предлагаемые кояформационные модели биоструктур Hj-sHa для планярованяп и проведения многочисленных новых экспериментальных работ в молекулярной биологии. Концепции, выдвинутые автором на основания молекулярного моделирования, уже получили подтверждение и дальнейшее развитие в трудах других исследователей (Gu et al., 1?83; Trifonov, Bolshoi,

1983; Hickey et al., 1985; Sibler et al., 1965; Wrede, 1985; Гнмаудтинова и соавт., 1986 ж др.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Создание объемных атомно--молекулярных моделей нового типа

1.1. Усовершенствование параметров, создание наглядной унифицированной номенклатуры и улучшение технической конструкции объемных атомно-молёкулярных моделей

Высококачественными атомно-молекулярными моделями можно считать лишь те из них, для которых: I) параметры модулей соответствуют последним данным кристаллографии и рентгено-структурного анализа; 2) обозначения отдельных модулей краткие и наглядные; 3) крепежные элементы обеспечивают надежную фиксации деталей друг с другом. Однако как непосредственное ознакомление с разными типами модулей, так и подробный анализ литературных данных (Walton, 1978) убеждают, что даже лучшие из существующих типов объемных моделей, включая "СН" ("США) и "Maruzen" (Япония), не соответствуют этим требованиям.

Целью данной работы было создать такие объемные атонно-молекулярные модели, которые превосходили бы существующие аналоги как по параметрам, так и по технической конструкции.

Для усовершенствования параметров моделей вами были обработаны современные кристаллографические и биофизические данные и на основании этого анализа у ряда модулей изменены геометрические признаки, соответствующие валентным углам и радиусам. Введены также и некоторые новые виды деталей: например, специальный модуль атома углерода для имитации экзо- и эндо-конформаций фуранозного и пирроли-динового колец и специальные модули тригонального атома кислорода с валентным углом 120° и тетраэдрического атома фосфора с неравными валентными углами для моделирования сахаро--фосфатной цепи нуклеиновых кислот (табл. I).

При создании новой номенклатуры учитывались геометрическая форма модуля 'тетраэдряческий, диэдриче-ский, тригональный) и тип химического соединения ''пептидный,

Таблица I

Номенклатура и теоретические характеристики наиболее используемых новых объемных"атомных моделей

Название и обо- Валентный Валентный Ван-дер-

значение модуля угол радиус ваальсов радиус

HI Водород 0,30 0,95

Н2 Водород короткой 0,30 0,20

Н-свяэи

НЗ Ёодород длинной 0,30 0,60

Н-связи

FI Фтор 0,60 1,33

СИ Хлор 0,99 1,70

BrI Бром 1,14 1,90

JI Йод 1,34 2,05

Sil Кремний 102° 118° 1,07 1,15 1,65

CI Тетраэдрический С 109,5° 0,75 1,25

CIA Эндо-С 105° 100° 0,75 1,25

С2 Ароматический С 108° 120° 132° 0,68 0,70 1,65

5-членных колец

СЗ Ароматический С 120° 0,68 0,74 1,65

6-членных колец

С4 Пептидный С II6°I20,5° 123,5° 0,74 0,75 1,50

С5 Этиленовый С 114° 123° 0,67 0,73 1,60

С6 Алленовый С 180° 0,67 1,60 !

С7 Ацетиленовый С 180° 0,60 1,60

N1 Тетраэдрический и 109,5° 0,75 1,25

N2 Ароматический Н 108° 120° 132° 0,68 0,70 1,65

5-членных колец

КЗ Ароматический И 120° 0,68 0,74 1,65

б-членных колец

N4 Пептидный 119° 122° 0,57 0,70 1,40

N4B Экзо- Ы 119° 122° 0,57 0,70 1,40

N5 Нитро- И 116,5° 127° 0,60 0,70 1,40

Кб Азидный 180° 0,55 0,65 1,40

И 7 Нитрильный 0,55 1,40

01 Сахаро-гидро- 109,5° 0,66 0,70 1,30

ксильный 0

02 Сахаро-фосфатный 0 120° 0,68 х,зо

03 Карбонильно- 0,50 1,30 .

фосфатный 0

Si Тетраэдрическая S 102° 118° 0,92 0,98 1,50

PI Тетраэдрический Р 102° 118° 0,92 0,98 1,50

аэо, сульфо, нитро, фосфатный и др.). Для новых модулей использовали специальные названия (эндо, экзо) или название по типу соответствующего химического соединения (сахаро-фосфат-ный).

Для быстрого запоминания к выбора модулей нами разработана новая система их кратких обозначений по принципу: символ химического элемента + (основной) цифровой индекс + (иногда) буквы А, В или С Стабл. I). Для облегчения быстрого выбора нужных деталей вышеописанные обозначения нанесены прямо на поверхности пересечения модулей.

Главной характеристикой созданной нами конструкции крепежных элементов является следующее: соединительные стержни имеют кольцевые выступы, а пластмассовые модули - отверстия с канавками, соответствующими форме выступов. Это обеспечивает плотный контакт между выступами к канавками по всей длине крепежного отверстия, а также позволяет моделировать различные межатомные расстояния. Применен удобный масштаб модулей: I с» ■ I ! ■ 0,1 нм.

1.2. Создание возможности определения двугранных углов и моделирования апланарных циклических соединений с помощью объемных атомно-молекулярных моделей

Несмотря на то, что двугранные углы являются важными параметрами конформации всех типов макромолекул, до сих пор не имелось возможности определить и установить эти углы также и на молекулярных моделях. Другим недостатком выпускаемых ранее объемных моделей было то, что они позволяли моделировать линь пленарные циклические соединения. Это обусловлено тем, что при составлении цикла в центре последнего сумма углов модулей равна или несколько меньше 360°, что не позволяет выводить один или несколько "атомов" из плоскости цикла.

Напей задачей было создать возможность определения двугранных конформационных углов и моделирования апланарных циклических соединений с помощью объемных атомно-молекулярных моделей.

Возможность определения и установки двугранных углов создана благодаря тому, что пластмассовые модули в местах их соприкосновения снабжались градусными делениями. Повернув модули на стержнях крепления на определенное число градусных делений получаем конкретное значение двугранного угла (рис. I).

Возможность моделирования апланарных циклических соединений достигается тем, что модули выполнены в виде неправильных многогранников, сумма углов которых в месте соединения вершин превышает 560°. Например, при построении пятичленного цикла после соединения четырех элементов, чтобы прикрепить пятый, необходимо развернуть два соседних элемента по оси их крепления. После крепления пятого модуля (неправильного тетраэдра), последний окажется выдвинутым из плоскости цикла, как и должно быть в апланарном циклическом соединении (рис. 2). Моделирование таких соединений нередко имеет важное значение. Возможность имитировать геометря» апланарных пятичленных циклических соединений позволяет впервые с помощью объемных моделей моделировать конформации сахаро-фосфатных цепей в А- и В-семействах нуклеиновых кислот и пирролидинового кольца аминокислот пролина и оксипро-лина в белках.

В

Рис. I. Определение двугранных конформационных углов с пс^сщья объемных ?томно-иоп^«уппрнм1г моделей. А - модель из двух деталей с градусными делениями (цис-положение, двугранный угол = 0°); В - та же модель с повернутыми относительно друг друга моделями (двугранный угол = 30°).

Рис. 2. Моделирование пятичленного апланарного циклического соединения с помощью новых моделей. Сумма углов в центре цикла больше 360°, поэтому пятый модуль можно присоединить к остальным' только вне плоскости цикла.

I.3. Разработка метода рентгеномодельного анализа - новой области применения объемных атомно-молекулярных моделей

Объемные атомно-молекулярные модели имеют ряд преиму-цеств, по сравнению с так называемыми стержневыми моделями. Однако недостатком известных объемных моделей является невозможность точного определения атомных координат и имитируемых химических связей, что обусловлено расположением этих элементов в толще модулей модели. Ввиду непрозрачности объемных моделей для видимого света их изображение на полупрозрачном зеркале нельзя непосредственно сопоставлять с изображениями кристаллографических карт электронной плотности.

Вашей целью была выработка методики, позволяющей освободить объемные модели от вышеотмеченных недостатков.

Поставленная цель достиглась тем, что: I) для исследования объемных моделей применяют рентгеновские лучи, 2) модули снабжены рентгеноконтрастными шариками, находящимися в их центрах, и стержнями, размещенными внутри креплений по ах центральным осям и 3) линейные очертания на кристаллографических картах электронной плотности также маркируют рент-геноконтрастным материалом (рис. 3).

Описанная методика открывает новую область применения объемных атомных моделей. Ее можно назвать - по аналогии с методом ремтгеноструктурного анализа -рентгено-модельным анализом.

II. Молекулярное моделирование нестандартных пар нуклеоти-дов в нуклеиновых кислотах

11.1. Характеристика нестандартных пар нуклеотидов в структуре тНК и кодон-антикодонового комплекса

В последние десятилетия рентгеноструктурные исследования и некоторые теоретические работы показали, что в структуре нуклеиновых кислот (особенно тНШ) и кодон-антикодоно-вом комплексе, наряду со стандартными парами нуклеотидов О-С и А~и(Т) могут существовать также и нестандартные пары (С1'2.ск, 19о6; БипЛагаИпсаш, 1977; ТгИГопоу, 1965 к др.). Однако частота встречаемости и роль неклассического спаривания нуклеотидов изучены еще мало.

Пашей задачей ЯЕКлась характеристика нестандартных пар нуклеотидов в некоторых участках Еторнчвой и третичной структур тШ и в '.'.'оЪЪХе-позиции кодон- антикодоновых комплексов. Работа проведена на 233 первичных структуре:; тНаК

Рис. 3. Методы рентгенографии при применении атомно-иояек;-лярных моделей. А - атомно-молекулярные модели нового типе с рентгеноконтрастними шариками и стержнями: а - модуль в разрезе; Ь - соединяющий модули стержень в разрезе. Б -

- принципы ректгеномодельного анализа: а - рентгенограмма новых объемных моделей, снабженных рентгеноконтрастними центрами и стержнями; Ъ - схема определения атомных координат с помоиью рентгеновых лучей; с - кристаллографическая карта электронной плотности молекулы из пяти атомов; й -

- сопоставленные та же карта электронной плотности молекулы и рентгенограмма ее модели.

Таблица 2

Количество нестандартных комбинаций иуклеотидов в основных двутяжеввдс участках тНК ''пары 1-72 до 7-66, 10-25 до 12-25, 27-43 до 31-39 и 49-65 до 53-61Г

Количество комбинаций нуклеотидов Количество

Вид тГЕК G -U (m2G-U, G-¥) С-А U-U (у-Ч'.и-1?) A-G и-с с-с А-А G-S изученных тГНК

Элонгаторные 173 (102-19-16-36)** 7 (5-1-0-1) 24 (2-0-6-16) 5 (5-0-0-0) 2 (0-1-1-0) 0 0 0 147

Инициаторные 20 (0-12-1-7) 8 (8-0--O-OJ 0 0 0 X (1-0-0-0) 0 0 25

Участвующие в синтезе стенки бактериальной клетки 6 (6-4-0-0) 0 4 (0-4-0-0) 0 0 0 0 0 6

Мутаитные 20 (6-4-2-8) II (4-2-4-1) 2 (0-0--I-I) I (1-0-0-0) 3 (0-0-3-0) 0 0 0 55

Всего 219 26 30 6 5 I 0 0

* Использована нумерация нуклеотидов в тНШ, предложенная в 1978 Г. участниками симпозиума

по ifflK в Cold Spring Harbor.

** Б скобках приведены количества нестандартных комбинаций нуклеотидов соответственно в акцепторном стебле, В-шлильке, антикодоновом шпильке и Т-апильке.

разного происхождения (Микельсаар, 1980; Iíikelsaar, 1981).

Сравнительный анализ первичных и вторичных структур тШКпоказал, что наиболее часто в двутяжевых участках тГНК, помимо классических пар, обнаруживаются пары G-TJ, реже - С-А и U-U, а совсем редко - A-G, J-C и С-С (табл. 2).

Б положениях 26-44 среди тТНК с короткой экстрапетлей наиболее часто отмечались противостояния irigG-A, A-G, G-A, m^G-A и A-A, и сравнительно редко - пара А-С (табл. 3). Совершенно иная картина наблюдалась среди

Таблица 3

Количество комбинаций нуклеотидов в положениях 26-4-4 tfflK

Комбинация Количество тГНК

нуклеотидов с короткой * экстрапетлей с длинной экстрапетлей

А—С 7 43

2-, -т т21г~ т 0-U т|<з-и - 20 7

т®!?—U * 0 -J 1 1 1

,'!_ "J 2 1

A-U 7 2

U-A 1 -

TJ-G 1 -

1 -

0-G 1 -

C-G 1 -

C-U ó -

А-А И 17 -

! 20 -

¡ 32 -

i о ^ 41

j Всего 153 80

~В короткой экстрапетле содержатся 3-4, а в длинной экстрапетле - 10-22 нуклеотидных остатков.

tIHK с длинной экстрапетлей. Здесь пара А-С в положениях 26-44 встречалась наиболее часто. В остальных случаях у таких

2 ?

tíHK в этих положениях имелись пары m^G- Urn, G-U, m|G-U и

Среди 233 исследованных нами первичных структур тН1К в положениях 15-48 наиболее часто обнаруживали пары G-C (115 тШК) и G-m5C (6? гШ), реже - A-U (36 тШК) и очень редко - G-A (2 тЩК), О-G (I тРНК) и U-C* (I тШ). У остальных 8 tIHK в указанных положениях наблада-лась пара С-А.

В третьей (wobble-)позиции кодон-антико-донового комплекса описана существование ряда нестандартных пар нуклеотидов (U-G, G-A, U-U, U-C, I-A, Х-С и I-U). Анализ экспериментальных данных позволил вам включить в этот ряд также и пару С-А. Наше предположение (Микельсаар, 1980; Hikelsaar, 1981),. согласно которому wobble-пара С34-А имеет кодовую значимость, в настоящее время подтверждено исследованиями других авторов (Anderson et al., 1981; Gu et al., 1983 и Hudspeth et al., 1583).

Таким образом, в двутяжевых участках и положениях 15-48 tIHK и wobble-позиции кодон-антикодоновых комплексов, наряду со стандартными нуклеотидными парами, иногда содержатся и нестандартные противостояния нуклеотидов ( !-'-т', '"-A, U-U, A-G, U-0 и др<) • В положениях 26-44 тШК выявляются почти исключительно только неклассические нуклеотидные пары (А-С, "-U, G-A, A-G, А-А и др.). Наибольшее распространение среди указанных нестандартных пар имеет G-U, однако сравнительно часто встречается и пара С-А.

II.2. Молекулярное моделирование нестандартных нуклеотидних пар в двутяжевых участках HÎK

Структура водородно-связакных нуклеотидных пар в двой-яой спирали РНК рассматривалась главным образом в теоретических работах (Crick, 1955; Topal, Fresco, 1S7ó; iiilcplsanr, 1981; de Bmijn, Klug, 1983; Chuprina, Poltev, 1S83; 1285). Рентгено-структурные данные о нестандартных парах нуклеотидов во вторичной структуре РНК получены только при исследовании пар G-U в тГНК (Jack et al., 1975; Stout et al., 1978; Dunas et al., 7S85). Сведения о структуре некоторых пар (G-T, G—A, G-Asyn, С-А+) установлены при исследовании кристаллических фрагментов ДНК (Brovm et al., 1í>K5; Hunter

et al., 1986; Prive et al., 1987). Метод молекулярного модеГ-лкровэння применялся лишь в единичных.трудах (Grôs.jesn et

ni., 1 Г78;_ IvîikelsaeïV" ТГ.1 ).

Нашей целью было характеристика структуры нестандартных пар водородно-связанных азотистых оснований и вызванных ими конформвционных превращений двойной спирали, основываясь на данных молекулярного моделирования.

Всего с поусзью новых объемных атомных моделей былк смодулированы 5 классических и 10 нестандартных нуклеотидных

I ''вис. 4). Благодаря улучшенным параметров, жестко* гсг-струкции и удобному >«гc-iiii.y к окно было полу-

лдв»;.т о расстояния между Ст -атомами при спаренных основаниях fi об угле между гликозидныыи овязями и прямой, соединяющей С^-атоиы при этих основаниях <"табл. 4) . Согласно этим данным исследованные нестандартные пары нуклеотидов можно было сгруппировать следующим образом: пары типа G-U (G-U, А+-0, Asyn-G), длинная пара A-G , короткие пары (U-U, U-C) и трапе-

-пары (А-А, G-G, A-G). Пары типгз G-U имеют строение, близко» тпковому для классических пар. Длинная пара л-" характеризуется самым большим расстоянием между С^-атоыами '13,5 л), отличный от классического на 2,4 5?, а углы при гликозидных связях 5лизкк к стандартный. Короткие пары ("J-U, • и *-С) имеют расстояние между С^-атомаыи '8,8-8-,9 , которое значительно короче ''на 1-2,3 а) стандартного. Углы при тчтнкозйдных связях в паре J-C лишь незначительно отличаются от величин стандартных пар; в парах U-TJ и С+-С -эти различия несколько больше. Три транс-пары (А-А, G-G п А-С) различаются относительно большим расстоянием между -атомами и значительной разницей углов при гликозидных связях, по сравнению с уотсон-криковскими парами, причем различия наименьшие для пары А-С. В литературе не проводилось сравнительного количественного анализа выяеуказанных параметров для нестандартных нуклеотидных пар.

Первые опыты по моделированию конформацпоа-н ы х сдвигов в антяпараллельных рибозо-фосфвтных цепях при включении нестандартных пар в двойную спираль А-ШК были проведены нами в Институте биологической физики АН СССР (г. Пуиино) с венгерскими атомными моделями "Эугон" СМикельсаар, 1980; I.îikelaaar, 1981). Одна ко Солее точное исследование конформационных изменений при включении нестандартных пар оснований s двойную спираль полииуклеотидннх

Рве. 4. Молекулярные кодег.я водородно-связанных пар азотистых оснований при антжпараллельяых полинуклеотидных цепях. (Черяки* штриха« указано направление гликозидных связей).

Таблица 4

Характеристика иуклеотндяых пар ШК при молекуяярвоы иоде-лировакия (аитн-конформация , аятипараллельяые вукдвотид-яне пеня)

Пара оснований Расстоя-яяе между СД-ато-мВмя вря спареи-я'кг основаниях (Ь Угол между гликозждяой связью я прямой, соедияяюдей С1-атомы при спареяиых основаниях

основала о И разница по срав-иеияю с основанием стая-дартной пары осяо-ввяяв 74 разница по сравнению с основанием стандартно! паря

стандартнее: G-C A-U 11,1 11,0 G А 59° 62° с а 55,5° 55°

типа G-U: G-U А+-С Asyn-G 11,2 11,1 G А+ A syn 47° 44° 43,5е -12° -18° -п и с (Í 67° 66° 60° 12° 10,5° Io

длинная A-G 13,5 к 50° -12° а 52,5° -6,5°

короткие : U-U о+-с и-с 8,8 8,9 8,9 и с+ и 47,5° 45° 62° -7,5° -10,5 7° а с с 80° 81° 64° 25° 25,5° 8,5°

транс: А-А G-G А-С 12,8 11,8 11,6 А G А -19,5° -29° -2,5° -81,5° -88° -64,5° А G С 28° 40,5° 24,5° -34° -18,5° -зх°

*

Исключением является пара Asyn-g, где адевжн я сии-кои-формации.

цепей стало возможным только после создаяяя нами новых тар« тусккх моделей, которые имеют ряд преимуществ по сравнен*»

4*

15

с существующими аналогами. Возможность установления 5 -эндо конформации рибоз и уточнение валентных углов модулей кислорода и фосфора, а также улучшение конструкции крепежных элементов позволило удачно имитировать Л-тип двойной спирали ГНК. В состав этой спирали были включены 5 стандартных пар G-C, из которых средняя в ходе исследовании была заменена на нестандартную пару.

Наши опыты с молекулярными моделями позволили установить, что при включении нестандартных пар в двойную А-спи-раль ГНК в последней возникают разного рода изменения: изменение расстояния между рибозами, сдвиг положения гликозидных связей, нарусение стэкинга оснований и изгибы рибозо-фосфат-ных цепей fpHC. 5). В наименьшей мере эти изменения выражены в парах типа G-U (G-U, А -С и Asyn-G)? где расстояние между Cj-атомами близко к стандартному, и в положении оснований и атомных групп рибозо-фосфатной цепи появляются лишь небольшие сдвиги. Незначительные конформационные перестройки наблюдаются и для длинной пары A-G и для короткой пары U-C, хотя в этих парах резко изменены расстояния между Cj-атомами соответствующих рибозных остатков при спаренных основаниях. По-видимому, в таких парах неблагоприятные конформационные эффекты изменения расстояния между рибозами и сдвигов положения гликозидных связей как-то нейтрализуют

друг друга. В коротких парах U-U и С+-С отмечены как

t

уменьшение расстояния между Cj-атомами так и умеренные сдвиги в расположении оснований и ходе рибозо-фосфатной цепи. В транс-паре А-С расстояние между С^-атомами близко к стандартному, но положение оснований и компонентов рибозо-фос-фатных цепей подвергается умеренным сдвигам. Наибольшие конформационные перестройки возникают при включении в двойную спираль транс-пар А-А и G-G: расстояние между рибозами увеличивается, основания резко сдвинуты в сторону от стандартного положения, нарушается их стэкинг, а в рибозо-фосфатной цепи выявляются значительные изгибы.

Литературные сведения о конформационных изменениях при включении в двойную спираль нуклеиновых кислот нестандартных пар нуклеотидов скудны и в некоторой мере противоречивы. Однако рентгеноструктурные данные о двутяжевых участках тНЗК и фрагментах РНК согласуются с нашим выводом, по которому, несмотря на значительные отклонения в структуре самой нестандартной пары оснований, общий ход двойной спирали обычно изменяется мало (Jack et al., 1976; Dumas et al., 1985;

Kneale et al., 1985; Prive et al., 1987). Kaii в лятерату-

pe, гак я яаыя описаны сдвиги в положении оеноваяяй^яеетав- ---------

- -----------дартянх пар,- степень стэкиига я данные о расстояния между

цепяип. Однако не отмечаются сдвиги Cj-атомов в латеральной яаправлеааи от стаядартяого положения. Напя опыты с молеку-

Рас. 5. Молекулярное моделирование коиформационних сдвигов в двойной спирали А-НШ яря включении нестаядартннх пар яу-клеотадов. А - пара А'-С, сдвиг протонированного осноракяп А в сторону м„лой, а основания С - больяой бороздкя; В -- пара и-и, сдвиг одного урацяльного остатка (ц.)) к боль-пой, и другого (7д) - к малой бороздке; С - пара А-С, сдвиг обоих оснований, а при адеяяновом остатке и фосфатной группы - к малому желобку.

5

17

лярными моделями показали, что изменение расположения основании нередко сопровождается значительным сдвигом С^-атома при этом основании. Молекулярное моделирование впервые выявило еще одну закономерность: если изменение величины угла при гпикозидных связях не компенсировано сдвигами в расстоянии С^-атомов, то, как правило, приближение основания к малой бороздке спирали связана с уменьшением угла при соответствующей гликозидной связи, и передвижение основания в боль-вой желобок коррелирует а увеличением этого угла.

Полученные данные имеют значение для выяснения конкретной химической. структуры и причин различной частоты встречаемости нестандартных нуклеотидных пар, фактически найденных в двутяжевых участках IHK. Для некоторых водородко--связанных пар нет альтернативных молекулярных структур, и жх частоту можно прямо связать с установленными конформа-ционными особенностями. Так, близость структуры пары G-U к таковой при стандартных парах A—U и G-C и незначительное карухеяхе хода спирали позволяют понять, почему эта пара так ■нроко распространена в разных типах IHK. В случае пары TJ-U также не известны другие типы водородного связывания, а значительное укорочение расстояния между Cj-атомами и выраженные конформационные сдвиги рибозо-фосфатной цепи позволяют объяснить умеренную частоту встречаемости этих пар. Вполне понятна исключительная редкость транс-пар А-А и G-G в ШК: прж этих парах в двойной спирали возникают резко выраженные кояформациониые изменения.

Встречаемость других нестандартных пар нельзя прямо связывать со структурными особенностями, здесь нужно учиты-йать роль дополнительных факторов. Например, структура водо-родно-связанной пары С+-С очень близка паре U-U, однако первая в отличие от второй в двутяжевых участках обнаруживается чрезвычайно редко. По-видимому, именно трудности, связанные с протонироваинем цхтозина в катлвной ШК, резко ограничивают встречаемость пары С+-С При парах A-G и А-С возможны два варианта водородно-связанных структур, выбор между которыми сделать нелегко. Молекулярное моделирование позволило показать, что в двойную спираль ШК одинаково легко встраивать как относительно короткую пару Asyn-G так и длинную пару A-G. Экспериментальные данные также указывают на реальность существования обеих альтернатив в двойной спирали нуклеиновых кислот (Patel et al., 1984; Hunter et al;, 1986;

Prive et al., 1987). То же самое можно отметить и относительно пары А-С— Рентгеноструктурный анализ показал, что в кристаллическом фрагменте ДНК пара существует реально

(Hunter et al., 1986). de Bruijn ■ Klug (1983) считали возможным, что А и С так могут связываться и в двутяжевых участках некоторых митохондриальных тШК. Ыожно предположить, что как и при паре Asyn-G, близость структуры пары А+-С к паре G-U должна сопровождаться большей встречаемостью этой структуры среди ШК, однако этого ие наблюдается. Кроме того, протоиирование, как правило, требует понижения рН, чего обычно при функционировании ГОК в клетке не наблюдается. Поэтому наряду с протонированным вариантом структуры пары А-С реальным можно считать и предположенную нами (Микельеаар, 1980; Mikelaaar, 1981) возможность возникновения обратной хугстиновой транс-пары, образующейся при водородном связывании атомов N4 и N3 цитозина с атомами N7 и N6 аденина. Существование такой нуклеотидной пары вероятно по следующим соображением: I) протонирования аденина в клетке обычно ие наблюдается; 2) энергия взаимодействия между спаренными пи-тоэином и аденином относительно высокая (Pullman et al., 1966; Danilov et al., 1974; Полтев, личное сообщение); 3) расстояние между С^-атоыааи близко к стандартной; 4) кон-формационлые сдвиги при включении такой пары в двойную спираль HîK умеренны: они не превышают таковых при встраивании пары U-U, частота встречаемости которой в ШК почти такая же, как для пары С-А.

Итак, молекулярное моделирование позволило получить ряд ценных параметров вероятной структуры нестандартных пар нук-леотидов в двутяжевых участках FHK и характеристику коифор-мационных сдвигов в участках их включения в двойную спираль аятипараллельных полинуклеотидных цепей.

II.3. Молекулярное моделирование нуклеотидной пары 26-44 в тШК с короткой и длинной зкстрапетлями

Литературные сведения о стереохимической структуре нуклеотидной пары 26-44 весьма скудны. По реятгеноструктуриым данным (Ladner et al., 1975), » дрожжевой тШК^Ье у короткой экстрапетли водородные связи, по-видимому, образуются между атомами н 06 гуанина 26 ж атомами N1 и N6 аденн-на 44, т.е. возникает длинная пара G-A. В паре А26-С44 же, в тГНК с длинной экстрапетлей, по утверждеини Bretman ж

5*

19

Sundaralingam (1976), образуется лишь одна водородная связь, соединяющая атомы Иб адеяяяа х N3 цхтозиха. Данных о структуре других хуклеотядянх пар в положениях 26-44, а также причинах столь разной частоты встречаемости отдельных пар в тШК с короткой экстрапетлей, по сравнению с тГНК с длинной петлей, хан хайтя хе удалось.

Была поставлена цель исследовать, основываясь на результатах молекулярного моделирования, возможную структуру спаривания самых частых комбинаций нуклеотидов в положениях 26-44. Построили модель дрожжевой фехнлалахнховой тШК., £ частя опытов в зтой модели у короткой экстрапетии в положениях

о

26-44 собствеххая пара m^G-A бела заменена другими нестандартными' парам*. Для создания возможности изучить стерхче-скхе условия формирования нукяеотяднкх пар 26-44 в тГНК с длинной экстрапетлей, между нуклеотнднымх остатками 45 я 47 была создана "искусственная" длинная .экстрапетля, состоящая кз стебля (двойной спирали) с 10 спарекнымх хуклеотндами л

нз неспареяной части с 5 свободными хуклеотидами.

pjie

При ясследованхя модели тН1К с короткой вкстрапетлей установили, что расстояние между Cj-атомами рнбоз 26 ж 44 - 13,5 Значительное укорочение указанного расстояния трудно осуществимо, так как основание 26 находятся в стэкххг-аэаяыодействии с основанием 27, я иуклеотид 45 фиксирован с помощью водородных связей с яуклеотядом 10. Поэтому неудивительно, что вместо 2

;обственной пари mgG-A в эти положення модели легко включаясь только пары A-G и А-А, также имеющие относительно (линиое расстояние между Cj-атомами.

Прн сравнении наших данных молекулярного моделирования ! частотой встречаемости отдельных нуклеотидных пар в поло-гекхях 26-44 тЕНК с короткой экстрапетлей, выяснилось, что гаявояее часто в этих положениях действительно встречаются ■е пары (G-A, A-G я А-А), для возникновения которых в указанных условиях имеются наиболее благоприятные стернческие словия.

Молекулярное моделирование показало, что в тШК с лянной экстрапетлей в положениях 2644 возникают соверяенно хные условия для спаривания основа-яЯ* На модели с "искусственной" длинной экстрапет-

еЯ гждво, что нуклеотхд 45 освобожден нз связей с нукдеоти-ои 10 я включен в двойную спираль длинной экстрапетли. Этот цвяг как б и смещает нуклеотхд 44 в другую сторону, что соп-

Рис. 6. Стерические условия образования водородно-связэнной нуклеотидной пары 26-44- в третичной структуре тШК с короткой (прерывистая линия) и длинной (зачернена) экстрапетлей (ССАфН - акцепторный конец; Т - Т-петля; Л - &-петля;

Ас- антикодоновая петля; Вх - экстрапетяя; цкфраыи отмечены нуклеотяды; 44з - местоположение нуклеотида 44 у тШК с короткой экстрапетлей и 44Ь - с длинной экстрапетлей).

Рис. 7- Молекулярные модели: А - третичная структура дрожжевой тИК5*16, в которую в позициях 44-47 вставлена длинная экстрапетля (Ех); В - пара А26-С44, включенная в модель фе-нилаланиновой тШК с "искусственной" экстрапетлей. (Стрелкой указано место включения пары А-С).

ровождается сдвигом С^-атома соответствующего рибозного остатка примерно на б £ (рис. б). Уменьшается стэкинг оснований 26 и 27 и увеличивается стэкинг 26 и 25. Одновременно примерно на 2 X уменьшается расстояние между рибоэными остатками 26 И' 44.

При сравнительном исследовании возможности включения моделей разных пар нуклеотидов между Cj-атомаии рибозных остатков 26 и 44 в модель тЕНК с длинной экстрапетлей выяснилось, что легче всего было встроить в эти положения пару А-С (рис. 7), несколько труднее - пары G-U, А+-С и Asyn-G значительно труднее - стандартные пары A-U и G-C п пару G-G. Практически невозможно включить в эти положения без сильных искажений модели длинные пары А-3, G-A u А-А, а такие короткие пары U-U, С+-С и U-0.

Частота встречаемости нуклеотндних пар в положениях 26-44 тШК с длинной экстрапетлей явно взаимосвязана со структурными особенностями этих пар: для нормальных 'пемутаитных) тНК найдены только пары А-С и G-U, обладающие наиболее выгодными параметрами иезсрибозиого расстояния и положения гли-;соэидных связей. А^-С :: Asyn-G являются пэраки типа i-U, поэтому могли бы встречаться с такой ;.;е частотой, как к C-'J, Однако вряд ли они реально суаествуют з тРНК, т.к. для ирото-*:::ровання адеияна потребовалось бы понижение рН среди и с;.н--кон$ормация оснований в тИК не встречается.

Таким образом, с помощью молекулярного моделирования паи удалось показать структурные предпосылки, определяющие наличие у тНК с короткой экстрапетлей в положениях 26-44 главным образом пар G-A, A-G и А-А и у тИШ с длинной экстрапетлей -- почти исключительно только пар А-С и G-U.

II.4. Молекулярное моделирование нуклеотидной пары 15-48 в третичной структуре тШК

Методом рентгеноструктурного анализа доказано наличие в положениях 15-48 тШК Еодородно-свпзанных нуклеотидных пар G-C в A-U (Ladner et al., 1975; Stout et al., 1976; Дит.аР et al., 1986). Xlug и сотр. (1975) предполагали существование в этих положениях также и водородно-связанной пары А-С, однако геометрия такой пары была впервые предложена нами: предполагается, что водородные связи в этой паре образуются между атомами "5 и 111 аденина и пз и 114 - цитозина (Ми-кельсаар, 1980; I;ikelsaar, 1981). Впоследствии такая струк-

турз для пари AI5-C4-8 была описана Giarabiagi и сотр.Г19ВЗ). Несмотря на то, что спектр нуклеотидных-комбинаций в положениях 15-48 тГНК" довольно узок, до cits пор отсутствует сравнительный анализ структурных особенностей этих пар и не выяснены причины их разной встречаемости. Hsu не удалось также найти сведений о молекулярном моделировании указанных нуклео-тиднкх пар.

Решено било провести молекулярное моделирование нуклео-тиднга: пар, которые могут встраиваться в положения 15-4-8 третичной структуры тГНК, сравнить их структурнке ocotfeuuoc-ти и привянь! ряяпяггя? - частоте встречаемости.

Ьч-я построены объемные молекулярные модели 4 пар оснований (рис. 8). Схемы образования водородных связей для трех из них (G-0, A-U и А-С) известны ранее, структура же пары G-U предлагается нами на основании аналогии о другими парами. При детальном исследовании молекулярных моделей выяснилось, что все 4- пары оснований имеют гликозидяые связи в транс-конформации, что, по-видимому, характерно для нуклео-тидных пар между парпллельянми нуклеотидннми цепями. Расстояние между Cj-атомвыи для спаренных оснований было наименьшим для пары С—С и наибольшим для пар А-С и -~-U -'табл. 5) • Углы между глнкозидной связью и прямой, соединяюяе?! С^-атоыы рябоа, при пурнновых основаниях довольно близки (от -25° до —+0°), при пиримидпновых - они более разбросаны (от 35,5° до 70°).

При исследовании построенной нами модели третичной структуры дрожжевой tHIK^110 выяснилось, что

расстояние между С^-атомами рибоз в паре G15-C48 - 11,3 При определении возможности включения в положения 15-4-8 указанной модели разных пар оснований, выяснилось, что легко включаются пары G-C и А-1Г. Однако (хотя и с некоторыми затруднениями) в этот участок модели тЕНК можно встроить и пары А-С и G-U.Ha модели THilfke видно также, что нуклеотпд 15 находится в тесном контакте с нуклеотидом 14, содержащим пуриноБое основание. Поскольку пуриновые основания обладают больней способностью к стэкингу, чем пиримидиновые, то, исходя из стабильности третичной структуры тШК, можно понять, почему в положении 15 локализуются пуриновые, а не пириыиди-новые основания.

Частота встречаемости отдельных нуклеотидных пар в положениях 15-48 взаимосвязана с их структурными особенностями. Стерически наиболее выгодными являются параметры пара G-C

1

!

Рис. 8. Молекулярные подели водородно-связанных пар азотистых оснований, которые могут включиться между параллельным полинуклеотидными цепями в положения 15-48 тРНК.

Таблица 5

Характеристика нуклеотидных пар в положениях 15-48 тН5К при молекулярном моделировании (анти-конформация, параллельные полинуклеотидные цепи)

Расстояние Угол между гликозидной прямой, соединяющей С1 спаренных основаниях связью и -атомы при

Пара оснований между С2-ато-мами при спаренных основаниях (Я) основание Л разница по сравнению с осно- основание /\ разница по сравнению с осно-

ванием в в паре б-С ванием С в паре С-С

"г-С и,3 0 -40° С 70°

А-и и,5 А -37 3° и 51,5° -18,5°

А-С 12,4 А -25 15° С 38,5° -31,5°

о-и 12,4 а -50° 10° и 35,5° -34,5°

и A-U, поэтому наиболее часто встречающейся является первая и несколько более редкой_-вторая ма названных пар. Логично также, что пара А-С, имеющая значительно больную разницу в структуре, присутствует гораздо реже. Удивительно л» то, что в тГНК еде реально не найдена пара G15-U48, структура которой близка таковой пары А-С.

Итак, молекулярное моделирование помогло уточнить возможные структурные особенности и причины различной частоты встречаемости водородно-связанних нуклеотидннх пар, способных включаться в положения 15-48 третичной структура тЕНК.

II.5- Молекулярное моделирование wobble-nap нуклеотидов в кодон-антикодоновых комплексах

Фактические данные о стереохимической структуре кодон--аятикодоновых комплексов отсутствуют. Fuller я Hodgeon (1967) исследовали такие комплексы с яомоцыо объемнее ("СРК") и скелетных моделей. 1Ьс гипотеза о стэкинге пяти ну-

г- 1

клеотидов в 3 -половине и двух нуклеотидов - в 5 -половине антикодоновой петли позднее получила блестяиее подтверждение при рентгеноструктурном анализе и тВЗК4811

(Leaner et al., 1975; Jack et al., 1976; Dumas et al., 1985). Хотя метод молекулярного моделирования Fuller и Hodgson успешно применялся ухе до расшифровки третичной структуры тШК, впоследствии он не получал достаточного распространения при выяснении структурных особенностей »тжх молекул.

Навей задачей являлось с помощь» молекулярного моделирования антикодоновой петли и возможных нуклеотидных комбинаций в кодон-антикодоновом комплексе описать стернческне условия для возникновения нестандартных водородно-свяэанных пар в wobble-позиции данного комплекса.

В первую очередь, детально исследовали а н т я к о -доновую петлю объемной модели тГОК-^116. Полученные нами точные данные молекулярного моделирования позволили критически проанализировать результаты рентгенострук-турного анализа дрожжевой тН1КГЬе (Ladner et al., 1975; Jack et al., 1976 я др.). Выяснилось, что относительно легко моделировать стэкинг пяти оснований (с 34 до 38) в 3*-половине и двух оснований (32 и 33) - в 5*-половине антикодоновой петли, что согласуется с результатам* кристаллографического анализа. Локализация боковой группы гипермоджфжци-

рованного основания 37 по данным рентгеноструктурного анализа яе была идентифицирована. По данным нашего моделирования, «та группа при описанной конформации 3 -половины антикодоно-вой петля может образовать водородную связь с аминогруппой основания 38. По утверждению ladner и сотр. (1976), атом КЗ урацяла 33 взаимодействует с фосфатом 36. На модели тЖК вам яе удалось имитировать такой водородной связи, не ломая стэ-кяяга между основаниями, т.е. здесь сведения молекулярного моделирования не согласуются с данными рентгеноструктурного аиаджза. Нам кажется вероятным, что расстояние между атомом НЗ урацяла 33 и кислородным атомом фосфата 36 - примерно 3,5-4 1.

Для имитация кодон-антикодоновых взаимодействий нами построена модель тринук-леотяда, который соединяли с помощью "водородных связей" с вухлеотидамя автикодояа модели тШК. Установлено, что вполне допустимо образование стереохимического комплекса не только между GmAA (антикодон фенилаланиновой тГОК) я UUC ■ кодон фенилаланина), но и между другими комплементарными тринук-яеотидами, встроенными в этот комплекс. В шЪЫе-поэицию кодон-антякодонового комплекса легко включились многие нестандартные пары: G-U, A-G, Asyn-G, C-I, U-I, A-I, А+-С и А-С (рис. 9). Трудности возникли лишь при включении в эту позицию коротких пар U-U и U-G, а также транс-пар А-А и G-G. При коротких парах U-U я U-C затруднения могут быть обусловлены малой подвижностью нуклеотида 34 в конформации антикодона типа Fuller-Hodgson. Укорочение расстояния между С^-атомаыи, на основании наакх данных моделирования двутяже-вых участков РНК, требует взаимного сближения рибозо-фосфат-иых цепей. Есля это сближение затруднено, хотя бы с одной стороны (как в денном случае при антикодоне), то водородно--связанные пары типа U-U ж U-C не могут образоваться. Исключением в отношении этих пар, возможно, являются митохонд-ряаяьные TíHK (Mikelsaar, 1987).

На основании полученных данных можно полагать, что ко-дон-антикодоновое считывание с помощью wooble-пар нередко требует больяих конформационных сдвигов рибозо-фосфатных цепей не у антикодона, как считают Puller и Hodgson (1969) и Topal я Fresco (1976), а при кодоне. Так может бить в случае включения пары С34-А, при котором главные изменения кон-формацяя полинуклеотидных цепей должны быть обнаружены у адекхна.

Рис. 9- Молекулярная модель кодон-антикодонового комплекса фенилаланиновой тЯК, в wobble-позицию которого встроена пара СЗА (Ас - антикодон; Со - кодов).

Следовательно, молекулярное моделирование позволило детализировать представления о структуре кодон-антикодоновых комплексов.

II.6. Характеристика эволюционных особенностей структуры тШК на новых атоино-молекулярных моделях

Кзгсстпс, "тс структура мятохондриальных. TirlilC зп**чя— тельно различается от таковой немитохондриальных тЯЗК прокариот, цитоплазмы эукариот и хлоропластов (de Brutjn, I9B3» Clary, Wolstenholme, 1984- и др.). Согласно напей архигеае-тической гипотезе (Mikelsaar, 1983, 1987), эти различия являются эволюционно-бмохимическими особенностями митохондрий. Такие различия считаются одной из причин возникновения "странностей" кктохондриальной системы генетического кодирования. Так, например, то обстоятельство, что нетяоянновке тШК митохондрий животных и дрожжей считывают кодоны AUA я АТС, а неыитохондриальные элонгаторные тШК - из этих двух кодонов только A.JG, связывают с возможной модификацией цк-тозина в первой позиции внтикодона митохондрнальных тРЙК (Anderson et al., 1S81). Однако ранее нами уже отмечалось, что цитозин способен образовывать водородно-связаиную пару с аденином именно в неиодифицярованном виде. Следовательно, роль модификации wobble -яуклеотида в разных эволюционнмг системах требует дальнейшего исследования.

Исходя из сказанного было реяено уточнить эволюционные

особенности структуры игаЪЫе-нуклеотида митохондриальных и немитохондриальных метиониновых тГНК с помощью новых обменных атомно-молекулярных моделей.

В наших опытах молекулярного моделирования выявлено влияние модификации цитозина на геометрию образуемых им во-дородно-связанных пар (рис. 10). В положении 34 антнкодона до сих пор идентифицированы три производных цитозина: 5-ые-тнлцхтозин (пг'С), 2*-О-метнлцитоэин (Ст) и 4-ацетнлцито-эхн (ас^С). Намх показано, что метильная группа не мешает возникновению пар т^С-Я и т-'С-А. Конформационные же сдвиги ацетильной группы не действуют на спаривание ас^С с а, но влияя-на местоположение Н-атома при атоме С8 аденииа, блокируют образование водородной связи между атомами N4 цитозина я N7 аденина. Метильная группа в Ст, взаимодействуя с атомом 02 цктозина, по-видимому, нарушает копланарность основа-

В

Ряс. 10. Предполагаемое влияние метильных к ацетильных групп на образование водородных связей между основаниями в нуклео-тхдннх парах С-А я С-й в шоЪЪ1е -позиции кодон-антикодоно-вого комплекса. Несколько удаленная метильная группа в пг'С не меяает образованию водородно-связанных пар. Метильная группа же в От и ацетильная группа в ас^С, по видимому, исключают я затрудняют возникновение некоторых водородных связей. А - схематическое изображение вышеуказанных воздействий. В - молекулярная модель пары ас^С-А; взаимодействие ацетильной группы с атомом Н8 мешает возникновению водородной евяэх между атомом N4 цитозина и атомом N7 аденина (направление указанной связи маркировано стрелкой).

ний и вместе с тем затрудняет образование водородных связей атомов 02 и N3 цитоэина с атомами Н2 гуанина я ?Тб аденина.

5

Поэтому кодовую значимость могут иметь лишь пары т C-G, щ-'С-А, ac^C~G и Cm-G, сохраняющие все три или две водородные связи. Пары ас^С-А и Ст-А, имеющие лишь одну Н-связь, для этой цели непригодны, т.к. они весьма нестойки.

Из приведенного следует, что при некоторых химических модификациях (ас^С и Cm) цитозин способен к образованию устойчивой водородно-связвнной пары только с гуанином, но не с еденином. Поэтому можно полагать, что у яёиэтохопдрнальяых метиониновых тШК, которые считывают кодон AUG, цнтозин в иоЬЫе-позиции модифицирован. Действительно, у таких тЯК в положении 34 обнаружены как раз те модификации (ас^С ■ Cm), которые мешают цитозину образовывать устойчивую пару с аде-нином(Ohas! et al., 1972; Murasugi, Takemura, 1978). He-модифицированный цнтозин, как нами указывалось выше, способен образовывать водородные связи не только с гуанином, но и с аденином. Поэтому, можно полагать, что цитозин в wobble--положении антикодона митохондриальных метиониновых тШК, считывающий два кодона (AUG и AUA), является немоднфяцн-рованным. Это предположение (Uikelsaar, 1983) противоречит высказыванию Anderson я сотр. (1981), которые считали, что цатозян в указанном положении этих тН1К должен существовать в модифицированном виде. Однако недавно наше предположение получило фактическое подтверждение: HsuGhen (1983) и Sibler в сотр. ''1985) доказали, что в wobble-позиции антикодона метиониновых тГНК митохондрий насекомых и дрожжей содержится как раз немодифицировэнный цнтозин.

Таким образом, характер модификации цитозина в wobble--позиции антикодона является важной эволюционной особенностью разного типа метиониновых тШК.

III. Молекулярное моделнроканяе

липидных комплексов б я о -

мембран

III.I. Липидные комплексы и новая (сотовидная) модель структуры биомембран

Структурной основой биологических мембран, согласно общепринятому представлению, является липидный бнслой.Нгиболь-

■ее признание получила т.н. хидко-мозаячная модель, согласно которой липидный бислоё представляет собой "море" жидких яи-пидов, в котором плавают "айсберги" белков (Singer, Nicolson, 1972). Указанная модель довольно хорошо объясняет обширный фактический материал о мембранах, но не дает картины точной молекулярной архитектуры липидных комплексов в биомембране.

Целью данной работы было уточнить строение молекулярных комплексов и обвей структуры липидной частя биологических мембран путем молекулярного моделирования.

Наин эксперименты с новыми атомно-молекулярными моделями показали, что двухвостовые глицеро- и сфинголипиды (т.н. фундаментальные липиды) способны образовать тримерные (тримолекулярные) циклические комплексы, которые склонны включать в свои центральные участки стеролы, гопанои-ды, каротнноиды, терпены и другие изопреноиды (т.н. а с -систентные липиды) или льдоподобную воду (рис. II).

Рис. II. Молекулярная модель тримерной гексагонально-призматической липидной единицы биомембраны. А - полярная зона; Б - центральная зона; С - углеводородная зона; I - остаток пальмитиновой кислоты лецитина; 2 - карбонильный кислородный атом этого остатка; 3 - глицериновый остаток лецитина; 4 - фосфатный остаток лецитина; 5 - холяновый остаток лецитина; 6 - водный мостик; 7 - Зр гидроксильная группа холе-стерола; 8 - корпус холестерола; 9 - хвост холестерола.

В указанных липидных комплексах можно различать три зоны: полярную, центральную и гидрокарбонную (углеводородную).™-

В полярной зоне находятся три головные группы фундаментальных липидов, связанные между собой путем электростатического взаимодействия, водородных связей и водных или катионных мостиков (рис. 12). Эта зона включает также наи-больяее количество водных молекул л ионов липидного бислоя.

С А

Рис. 12. Поперечное сечение (параллельно плоскости кеибраны) модели полярной зоны липидного бислоя. Фосфорилхолиновые остатки трех молекул лецитина связаны в пределах липидных единиц путеы электростатических взаимодействий (закрытая по-ляропора). п^О _ молекулы воды; И- азотный атом аммониевой группы; С1 - углеродный атом глицеринового остатка; СЗ - углеродный атом метильной группы; Р - фосфорный атом фосфатной группы; 04 и 05 - кислородне атомы той же группы.

Центральная зона образована треня остатками глицерина нлн головными группами сфингоэиновых остатков, но она содержит также н воду и полярные группы ассистентных ли-пидов, например, 30 Ш-группы холестерола (рис. 13). Как молекул* воды, так н гндроксильные группы холестерола образуют водородные связи с карбонильными кислородными атомами ляпндов. Часть иолекул воды создает между соседними молекулами липидов водные мостики, что является одним из наиболее важных факторов образования липидных комплексов.

Рис. 13. Поперечное сеченке центральной зоны глицеролипидной части биомембран. 3 СН01.-0Н - гндроксильные группы трех молекул холестерола (в обобщенном виде), Н-01-Н - водный мостик, 02 - кислородный атом эфирной связи, 03 - карбонильный кислородный атом хярнокислотного остатка, 06-Я - Зр гидроксиль-Н1я группа холестерола, С2 - углеродный атом карбоксильной группы жирнокнслотного остатка.

Периферическая часть углеводородной зоны содержит шесть углеводородных цепей (остатки-жирных кислот------ -

чли их альдегидов и хвостовые группы остатков сфингоэина у эубактерий к эукариот, и фитанолоьые остатки у архебактерий) ,

которые связаны с центральной зоной сложно-эфирной, змидной, эфирной .чли одинарной -С-С- связями (рис. 1'+) . Центральная -;асть углеводородной зона включает обычно ассистентные лл-лхяя, лаприкчр корпус л хаос? молекул холестерола, имеющие

Рис. 1'+. Поперечное сечение углеводородной зоны липкдной части биомембран. СН - насыщенная углеводородная цепь; CHOL -

- холестерол; 3 CHOL - три молекулы холестерола в обобщенном виде; AUG - край ангулярных метильных групп холестерола; CYCL - край атомных циклов холестерола; = - край связанных двойной связью атомов углерода холестерола; НОН - вода; С00~

- гидропероксильная группа при углеводородной цепи.

ван-дер-ваальсовы контакты как между собой, так и с окружающими углеводородными цепями. Плоскости, проходящие через циклические части молекул холестерола, пересекаются в центре липидного комплекса, образуя углы 120°. Более узкая боковая область корпуса холестерола, содержащая двойную связь между 5-6 углеводородными атомами, располагается периферически, вблизи межлипидного водного мостика. Более широкая боковая область, содержащая ангулярнне метильные группы, обращена к центру комплекса.

Вместо ассистентных липидвсв в углеводородной зоне могут содержаться льдоподобные структуры, связанные между собой водородными связями молекулы воды (рис. 15). Главными элементами этих структур являются циклические гекса-гоны из 6 молекул воды, объединенные в пределах липидного монослоя в виде 4-6 и в пределах бислоя - 8-12 слоев. Так образуются своеобразные "водные" призмы или цилиндры. Последние являются "кусками" льда I, в центре которых имеется канал диаметром 3 2, по-видимому, заполненный несвязанной водой. Такие каналы носят название "шафт" (shaft - Eisenberg, 1969). Ъ1ы предлагаем употреблять термин "шафт" для обозначения всей "водной" призмы, т.е. канала вместе с окружающими молекулами льдоподобной воды. Скоплении) структурированной воды в углеводородной зоне способствуют, по-видиыому, отрицательно заряженные гидропероксильные группы ROO", нередко возникающие под действием кислорода в области двойных связей ненасыщенных углеводородных цепей.

Толщина зон липидных комплексов зависит от химического состава биомембраны, однако в среднем в полярной зоне она составляет 5 2, в центральной - 3 2 и в гидрокарбонной -

- 20 2. Таким образом, толщина монослоя, содержащего тример-ные липидные единицы - в общем 28 2, а липидного бислоя -

- 56 2.

На поперечном разрезе липидного комплекса в углеводородной зоне образуется шестиугольник (г е к с а -гон), имеющий в каждом угле элемент углеводородной цепк. Общая площадь шестиугольника - 222 2 углы - 120°. Однако стороны его не равны: короткие стороны (8,5 2), образованные углеводородными цепями одной и той же липидной молекулы, чередуются с длинными сторонами (10,0 2), сформированными цепями соседних молекул.

Соответственно форме поперечного сечения углеводородной зоны общая внешняя форма комплексов, образованных тремя моле-

••таеми Фундаментальных ляпядов вместе с ассистеитнцци яяпидв-- гокслтональпо-лризматичеокая. Площадь грзяеЯ "лрйзм" соот-7л ;■■:'<• ? лдлне сторон ¡аест'дуг ельника: :\-у,.гл'л черо-

•-тсл •. лл>л.-л . Нозт'лг" .¿щвд.ше комплексы можно наз-

вать т г> и ? р '' и м л : л л с л г з л з л ь л о -

-> •( •ЛКП'ЛЛ^ЛЛ лллиднсгс Саслоя.

- оппзи с тем, что оЛичио ; '"л;-плл лллллол „•>}•;>•: -

■ ■ ."Л ' " , . . ™ т.. л Л-л л " ■;.- : л 1 л л,7 г л л л; л л ,

: ¿Мж;нпцами имеются только ван-дер--наальсовые взаимодействия. Лучшая что..«--------датмгя»»-

..........................

у-?;-Г'■

•" - ■ ' ■ '•' -Л' • ^..л,.^- «одели льдоподобной структуры -и а ф т а . А - длинный шафт; В - тот ге шафт, в верхней половине включенный в тримерный липидный комплекс; О - шафт, непрерывно соединяющий два лнпидных комплекса; В и Е -концы шафтов в углеводородной зоне липидных комплексов.

ся в том случае, если большая грань одного лияидного комплекса контактируется с малой другого, и наоборот. В таких случаях возникает регулярная сотовидная упаковка отдельных липид-ных комплексов. Такого вида упаковка, по-видимому, в общем не нарушается, если часть шестигранников вместо липидных комплексов заполнена молекулами других веществ, например, полипептидами. Поэтому вышеописанную структуру, липидный бислой которой состоит из тримерных гексагонально-призматических единиц с включением белков, можно назвать сотовидной моделью биологических мембран.

Что касается функциональной роли липидных комплексов, единицы, образованные комбинацией фундаментальных и ассис-тентных липидов, являются относительно инертными барьер-но-структурными компонентами биомембран. Три-мерные же комплексы с центром из льдоподобной воды можно рассматривать в качестве липидных каналов. В этих каналах, аналогично названию зон липидных комплексов, можно различать поляропоры, центропоры и гидрокарбопоры, Соответственно конформацион-ному состоянию полярных головок липидов поляропоры могут быть открытыми или закрытыми (рис. 12, I? и 18).

В литературе сведений, в которых на такой же уровне точности расположения атомных групп было бы приведено представление о структуре биомембран, нам не удалось найти. Предложенная Pranks (1976) объемная молекулярная модель имеет ряд характеристик, практически совпадающих с нашей моделью, однако этим автором не были смоделированы латеральные контакты между отдельными липидами. В статье Forslind и Kgellander (1975) на основании конформационных свойств льдоподобной воды приведено интересное представление липидного бислоя, однако применение скелетных моделей вместо объемных не позволило авторам получить точных структурных данных.

Таким образом, эксперименты с новыми атомно-молекулярны-ми моделями позволили показать, что липиды способны образовывать тримерные циклические комплексы, которые взаимодействуя друг с другом, образуют сотовидную структуру биологических мембран.

III .2. О молекулярной основе протон-проводяаих путей в биомембранах

Многочисленные экспериментальные данные о том, что липидный бислой имеет аномально высокий коэффициент проницае-

мости протоков , заставили предполагать наличиев гидрофобной зоне зодородно-связаняых цепочек молекул воды (Пеашег, "ЗПсЬо1я , 1965; Генкин и соавт., 1986; ЗгалЛа11 , 19В7). Однако не приведено точиых представлений о протон-провадя-ийх путях. Кроме того, более подробная характеристика этих путей важна для реиения ряда Зиологзчвских проблем, нвпркаер, з области биоэнергетик (МхЬсЬеН , 1961. 1979; Скулачев, 1972).

Рис. 16. Прбтон-проводящие пути в пафте (на молекулярных моделях). А - вид на минус (-) конец иафта по вертикальной (с-) оси; В - вид на плюс (+) конец нафта по той хе оси; С - свободная молекул» воды в канале иафта; 33 - вид на вафт в направлении одного из горизонтальных (а-) осей, стрелками указан протон-проводяций путь от минус-конца к пляс-концу иафта; I - атомы кислорода; 2 - атома водорода.

Нашей целью было выяснить возможные протон-проводящие пути в липидном бислое биомембран, основываясь на гипотезе о сотовидной структуре мембраны и используя новые объемные атомно-нолекулярные модели.

Согласно сотовидной моделе, в центре гексагонально-призматических единиц фундаментальных липидов могут быть включены т.н. шафты - "дефектные" недолгоживущие льдоподобные структуры. Шафты являются структурами, в которых компоненты - водные молекулы - связаны между собой с помощью водородных связей (рис. Хб). Детальное ознакомление с молекулярной моделью шаф-та показало, что водородные связи в этих льдоподобных структурах однонаправлены (рис. 16). Это связано с тем, что шафты, соответственно форме окружающей липидной единицы, имеют ось симметрии третьего порядка. Шафты пронизывают мембраны непрерывными структурами, сохраняющими однонаправленность водородных связей и при переходе из одного липидн»го монослоя в другой. Каждый шафт имеет плюс- и минус-концы с соответствующими зарядами. Поэтому энергетизированные протоны, направленные к одному концу шафта, могут индуцировать передачу протонов по водородно-связанным цепочка водных молекул до другого конца шафта по механизму, предложенному Eigen и De Maeyer (1958) . Льдоподобные водородно-связанные структуры сравниваются с полупроводниками (Onsager,196S),поэтому предлагаемые нами протон-прово-дящие пути можно назвать протон-семикондук-торной системой.

Суммируя, на основании молекулярного моделирования можно полагать, что льдоподобные структуры - шафты - могут быть молекулярной основой протон-проводящих путей биомембран.

III.5. Кооперативные конформационные сдвиги в липидных молекулах биомембран

Общеизвестно, что многие важные функции мембран не могут реализоваться без кооперативных сдвигов в конформации биомолекул. Например, с точки зрения биоэнергетики важно, что протоны, выкачиваемые через мембрану, не рассеиваются в водной среде, а быстро распространяются по полярным головкам липидов ( Prats et el. , 1986; Selwyn , 1986). При исследовании механизмов передачи нервного импульса выяснено, что до начала потока натрия через мембрану регистрируют т.н. воротной ток, который связывают со сдвигами заряженных групп при открывании каналов (Ходжкин, 1965", Куффлер, Николе, 1979). Однако точная

природа атомных групп и характер конформацконнмх сднгов при кооперативных_переходах состояния-биомембран не Известны"!

За основании данных молекулярного моделирования нами зыпснена возможней роль липидных молекул в кооперативных конформационных сдвигах биомеыбраы.

При исследовании моделей тримерных гексагонально-призматических молекулярных комплексов выяснилось, что полярные группы липидов могут концентрироваться не только в центрах тримерных комплексов (рис. 12), но временно и в межкомплексных областях, формируя т.н. иятергсдладь-я а в коиплекеи ''рис. I?). Влутрикомллексяая груи-

Рис. 1?. Поперечное сечение полярной зоны липидной части биомембраны с открытыми поляропорами и интермедиальными комплексами (обозначения см, рис. 12)

пировка может легко переходить в межкомплексную и наоборот, поэтому эти группировки полярных групп являются как бы двумя разными триггерными состояниями ли-пидного бислоя. Можно полагать, что к таким триггерным переходам наиболее склонны холинолипиды, при которых Я+-атомы холиновнх остатков могут связываться с 0~-атоиами остатков фосфорной кислоты посредством легко управляемых электростатических взаимодействий. Угол передвижения продольной оси фосфорилголиновых остатков в плоскости липидного бислоя при переходе из одного триггерного состояния в другое равен примерно 50° (рис. 18).

Механизм кооперативных сдвигов полярных головок липид-ных молекул в биомембранах можно представить следующим образом (рис. 19). Экзогенный ©- заряд или отталкивает анало-

А

В

Рис. 19. Инду - ератИВН! ТКР'

А - поляропор-. : . гом сос. - . ..и (

под действие:: - - вда; С - . ,укц;

I) - открытое :/".'Очь.' обеих г. . 5noj

с

>геннын фактором ( I: I рим -:р, . ■-) - зарядом).1 стояние); Б - одви.' с цноп полярной группы «51 поляропоры одно!; г. эляркзй груа.юй; состояние) 1

гичние атомные группы холиновнх остатков, или притягивает отрицательно.заряхеяние кислородные атоиы (0~) остатка фосфорной кислотн холинофосфориловых липидов. Н+ - и 0~-ато11ы раздвинутых фосфорияхолиновых групп вступают во взаимодействие с соответствующими атомами внутрикомплексных тримерных группировок полярных головок соседних пнпидннх единиц. Возникаю-цее раэдвижение полярных групп, в свою очередь, передается на все большее количество липидннх единиц. При этом раздвинутые полярнне головки временно образуют межкомплексные группировки (рже. I?).

Описанные кооперативные сдвиги в полярных головках липидов могут участвовать в распространении информации (передача нервного импульса), в транспортировке протонов (процессы биоэнергетики) и в других мояекулярнкв механизмах жизнедеятельности.

Итак, применение молекулярных моделей позволило уточнить ж подробно охарактеризовать возможные кооперативные конформа-пионные сдвиги в липидннх молекулах биомембран.

III.4. Эволюцжоняо-биохимичеокие особенности яипидного бислоя у организмов разного происхождения

Несмотря на то, что о яжпидном составе биомембран собрав обширный материал, эволюционные особенности липидных молекул рассматриваются лжиь в немногих трудах (Rehmer et al., 1979; Kandier, 1981; Ивков, Берестовский, 1982; Шведова и соавт., 1987)• Не имеется и представлений об эволюционной биохимии мембранных липидов, что, возможно связано с отсутствием конкретизированной структурной концепции о строении биомембран.

Целью напей работы было установление эволюционных особенностей мембранных липидов зукариот, архебактерий и эубак-терий в свете сотовидной модели структуры биомембран, используя данные молекулярного моделирования.

Выяснилось, что с точки зрения образования тримерных гексагонально-призматических комплексов наиболее совершенными свойствами обладают липяды, свойственные плазматической мембране аукариот. В полярной зоне липидных комплексов этих организмов имеются фосфорилэтаноламиновые группы, которые связываются между собой как с помощью водородных связей, так и электростатических взаимодействий, обеспечивая устойчивое закрытие поляропор. Является важным, что в полярной зоне у зукариот присутствуют и фосфорияхолиновые группы,

которые взаимодействуют друг с другом только с помощью электростатических взаимодействий - я легко подвергаются кооперативным конформационным сдвигам. В центральной зоне эукарио-тических лшшднкс единиц имеются сложно-эфирные связи, в области которых располагаются карбонильные кислородные атомы, являющиеся основой образования стабилизирующих водных мостиков между липидпнми молекулами комплекса (рис. 20). В этих комплексах в плазматической мембране эукариотических клеток содержатся и сфинголипиды, дающие местами стабильные молекулярные структура в «иомеибрзпах. Паконеи, в к-ч-е*---ос::=тгатаых липидов в структурные единицы у эукариот включаются стеролы, создающие хорошие ван-дер-ваальсовые контакты как друг с другом, так и с фундаментальными липидами.

£1« Ха' ¿¿4кг.!1

гя с. пан :

и0ле!<5'лярные модели фундаментальных липидов биомемб-А - архебактерий и В - эукариот. В качестве полярной группы в липидах эукариот обитео служит фосфорилхолин (I), а в липидох архебактерий - фосфорилэтаноламин (2). Литаздние молекулы эукариот имеют гидрофобные хвосты из остатков жирных кислот (3), молекулы же архебактерий - из остатков фитанолов (4) . В центральной области этих молекул у эукариот присутствуют высокореактивные карбонильные атомы кислорода (5). В лн-пидах архебактерий такие атомы отсутствуют.

Архебактерии же, согласно вышеприведенный критериям, наоборот, являются наиболее примитивной эволюционной группой организмов. В полярной зоне липидного слоя этих бактерий, как у эукариот, имеются фосфорилэтаноламиновые группы, характеризующиеся стабильными связями. Однако у них отсутствуют важные мобильные фосфорилхолиновые головки. Особенно характерно, что архебактерии имеют в центральной зоне липидов не сложно-эфирные, а простые эфирные связи, при которых нет карбонильных атомов кислорода. Поэтому между фундаментальными липидами архебактерии в центральной зоне не возможно образование стабильных водных мостиков (рис. 20). У архебактерии нет также и сфинголипидов, характеризующихся сетью водородных связей в центральной зоне липидного.слоя. В качестве ассистентных липидов присутствуют сквалены (бифэрне-зилы), формирующие с фитаноловыми остатками ван-дер-вааль-совы контакты, которые, по-видимому, менее плотны, чем таковые между стеролами и остатками жирных кислот.

Мембранные липиды эубактерий по структурно-фундаментальному совершенству яеляются промежуточными между соответствующими молекулами эукариот и архебактерии. У эубактерий, так же как и у архебактерий, в полярной зоне липидного слоя обычно отсутствуют фосфорилхолиновые остатки, а в центральной и углеводородной зонах - сфингозиновые остатки. Однако глицериновые остатки липидов у эубактерий, так же как и у эукариот, связываются с помощью сложно-эфирных связей с остатками жирных кислот. Ассистентными липидами у них 'наряду со скваленом и кэротиноидами) являются гопаноиды, которые по структуре весьма близки к стеролам эукариот.

Липиды органелл эукариотических клеток -хлоропласт ы и митохондрии - имеют как примитивные свойства, - общие с бактериями (фосфорил- и дифосфорилглице-риновые остатки в качестве полярных групп, отсутствие сфинголипидов и стеролов и др.), так и прогрессивные, - общие с плазматической мембраной эукариот ''включение фосфорилхоли-новых групп).

Полученные нами данные об эволюционных особенностях липидов согласуются с концепцией Моезе и сотр. (1976; 1981), по которой эукариоты, архебактерии и эубактерий дифференцировались из общего предшественника. Сохранение наиболее древних липидов у архебактерии можно обосновать тем, что последние в настоящее время обитают в таких же экологических условиях, как и во время их дивергенции из прешест1;ен-ников. Понятно и совершенство липидкых комплексов в плазматы-

44

ческой мембране эуквриот - эти организмы способны к прогес-сивныц эволюционным изменениям_и в - других-многочисленных пс-~ --------

пактах. ¡-римитивнне липилы т. органеллах могут быть нэследова-'V от яредзественников хлоропластов я митохондрий, проникших когда-то з клетку в качеств* симбионтов.

* с

Стгммипув ло"оннэе, можно сказать.

tiu úuauBHKH» н=«и нового тяг? объешь! атомно-молекулярные модели являются эффективным средством исследования молекулярной структуры и кокформационных превращений как нуклеиновых кислот, так и биологических мембран.

ВЫВОДЫ

1. Созданы объемные втомно-молекуляряые модели нового типа, превосходящие предыдущие аналоги как по параметрам, так а по технической конструкции. Наглядная номенклатура обеспечивает высокую точность и оперативность молекулярного моделирования. Специальные методик:: дают возможность определять двугранные конфорыеционные углы и ими-TVipGi'nTL апланарные циклические соединения с помощью объемных моделей .

2. Разработан оригинальный метод рентгеномодельного анализа, который позволяет определять атомные координаты и направление химических связей в объемных моделях, а тзк;;;е непосредственно сопоставлять эти модели с кристаллографическими картами электронной плотности.

3- В двутяжевих участках тРНК наряду с уотсон-криковскима парами оеип»чкий нередко встречаются нестандартные противостояния последних. Для некоторых водородно-связан-нкх пар (".:-U, А-А и G-G) нет вероятных альтерна-

тивных структур и их структурные особенности прямо связываются с частотой встречаемости в тгПК. Другие лары имеют структурные варианты .(A-G и Asyn-G, А -С и А+-С), вероятность реального существования которых зависит не только от стерических характеристик, но и от протониро-вания и других факторов.

4. Согласно данным молекулярного моделирования нестандартные

пары оснований различаются расстояниями между С^-атомами и углами при гликозидных связях, образуя группы: пары типа G-U, длинная пара A-G, короткие пары U-U, С+-С, TJ-C и транс-пары А-А, G-G, А-С. При включении указанных пар в двойную спираль НШ в последней возникают разного рода конформационные изменения: изменение расстояния между рибозами, сдвиг положения гликозидных связей, нарушение стэкинга оснований и изгибы рибозо-фосфатных цепей. Эти изменения наименее выражены для пар типа G-U и наиболее - для транс-пар А-А и G-G.

5. Глубокие различия в частоте встречаемости нестандартных нуклеотидннх пар в положениях 26-44- между тНК с короткой и тШ с длияной экстрапетлей прямо связаны со степенью соответствия между локальными стереохимическими особенностями и структурными различиями водородно-связанных пар оснований. Б тГНК с короткой экстрапетлей расстояние между рибозами 26 и 44 весьма длинное и здесь могут встроиться лишь пары G—A, A-G и А-А. В тШК с длинной экстра-

I

петлей С^-атом рибозы 44 значительно сдвинут и стериче-ские условия пригодны только для включения пар А-С и G-u.

6. В положениях 15-48 тГНК между параллельными цепями поли-нуклеотидов могут образоваться пары G-C, A-U, А-С и

G-U, имеющие гликозидные связи в транс-позиции. Стериче-ские условия для образования водородно-связанной пары в этих позициях наиболее благоприятны для G-C, менее благоприятны для A-U и хуже - для А-С. Частота встречаемости указанных нуклеотидных пар в тГНК взаимозвязана с их структурными различиями.

7. в vrobble-позиции кодон-антикодоновых комплексов стери-ческие условия образования водородно-связанной пары наиболее благоприятны для комбинаций G-U, I-TJ, I-C, I-A и

C-A. Возникновение коротких пар "J-U и 'J-C затруднено в связи с фиксацией нуклеотида J4 в стандартной конформации антикодоновой петли. Возможность образования транс-пары Cj^-A указывает на значительную гибкость рибозо-фосфатной цепи в области третьего нуклеотида кодона.

8. Различия в модификации цитозина в v.-obble-нуклеотиде ан-тикодона являются важной эволюционной особенностью разного типа ыетиониновых тШ. Влияние модификации цитозина на образование водородно-связанной пары этого основания с аденином выявляется по-разному: метильная группа я'О

не мешает спариванию, ацетильная группа в &с С и метиль-

ная группа в Ст блокируют возникновение водородных связей.

9. Согласно данным молекулярного моделирования глицеро- и сфинголипиды способны образовывать тримерные циклические комплексы, включающие в себя обычно стеролы, гопаноиды, каротинонды или терпены и иногда - льдоподобные структуры водных молекул. На основании сотовидной модели биологических мембран указанные комплексы являются структурными единицами липидного бислоя. Мембранные белки представлена полипептидными цепями, замещающими местами липидные структуры.

10. Льдоподобные структуры, которые по данным молекулярного моделирования могут включаться в липидный бислой биомембран, имеют ось симметрия третьего порядка и обладают однонаправленностью водородных связей. Поэтому они могут являться составным компонентом в образовании протон-про-водящих путей мембран.

11. Полярные головки липидных молекул биомембран способны к кооперативным конформационным сдвигам, которые могут участвовать в молекулярных механизмах разных процессов жизнедеятельности 'передача нервного импульса, транспортировка протона и др.).

12. В липицных комплексах биомембран эукариот, архебяктерий V. эубактерий существуют значительные эволюционные различия. Наиболее примитивными можно считать липиды архебактерий и наиболее развитыми - липидные комплексы плазматической мембраны аукприот.

ШЕДР£йИ£ ТАРТУСКИХ АТОМНО-МОЛЕКУЛЯИЛК МОДЕЛЕЙ

При создании нового типа объемных втомно-молекулярных моделей был сделан ряд изобретений, приоритет которет защищен эыорскими свидетельствами г патентемк (см. приложение). Лля обозначения оригинальных моделей разработан специальный изобразительный то-;:рнцц знак 'рис. 21), зарегистрированный в СССР и 19 зарубежных странах-

Изобретения, сделанные при создании тартуских моделей, реализованы в конструкции сложных пресс-форм для литья пластмассовых деталей. Разработаны технология окрашивания и литья подходящих термопластических пластмасс и применены специальные прессы для изготовления пластмассовых модулей. С 19М г.

при Тартуском ГУ начато экспериментальное производство новых моделей как в виде отдельных деталей, так и комплектов ''"Биохимия", "Белок", "Нуклеиновая кислота").

Тартуские атомно-молекулярные модели демонстрировались на многочисленных республиканских, всесоюзных и зарубежных конференциях и выставках. Соответствующая реклама дана в отечественных и иностранных журналах (""Химия и жизнь", "Trends in Biotechnology", "Clinical Laboratory International" и др.), изданы рекламные проспекты и брошюры с детальной теоретической характеристикой и инструкцией по практическому использованию.

Созданные объемные атомно-молекулярные модели используются в многочисленных НИИ АН СССР и вузах нашей страны (Институт биоорганической химии, Институт биологической физики, Институт белка, Институт кристаллографии, Институт молекулярной биологии, Институт молекулярной генетики, МГУ, ЛГУ и др.). Через внешнеторговые объединения "Лицензинторг" и "Estimpex" начата продажа тартуских моделей на международном рынке. Первые партии этих пособий используются в университетах США, Великобритании, Голландии, ГДР, Чехословакии, Болгарии, Югославии и Индии.

Рис. 21. Фотокопия товарного знака новых объемных атомно-мо-лекулярных моделей (свид. Госкомизобрет. № 73971, 12.08.1983).

.. .. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ-ДИССЕРТШИИ" ОПУБЛИКОВАНЫ -----------

В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Микельсаар Р.Н. Поверхностная пленка (фактор поверхностного натяжения легких). Физиологический журнал СССР им. Сеченова, 196?, № 8, с.98?-989.

2. Никельсаар Х.Н., Микельсаар Р.Н. Гипотетическая модель и самосборка биомембран. Биофизика, 1972, т.17, вып.2,

с.218-223.

Н. йвкея»-с я ар Р.Н . О -»напенил аестаидвртаазс aap азотистых оснований в молекулярной патологии. Тезисы докладов научной конференции Тартуского госуниверситета "Медицинский факультет - здравоохранению", Тарту, 1580, с.160-161.

4. Микельсаар Р.Н. О возможностях образования водородно-свя-занной пары цитозин-аденин в структуре транспортной рибонуклеиновой кислоты и Gobble -позиции кодон-антикодоново-го комплекса. Молекулярная биология, 1980, т.14-, с.694--7075. Микельсаар Р.Н. Лара цитозин-аценин как метка для нуклеи-ного-белконого узнавания. Тезисы докладов УХ объединенного симпозиума биохимических обтает? СССР и ГДР, Таллин, I9PI, c.5P-0Q.

о. -.¡икольса-р Р."Л. цитозин-аденин - г.оббл-пара в кодон-антп-ко-оно:;:.:;: кокплсксах. ТблИоы симпозиума по оиофиэике нуклеиновых кислот я нуклеопротеидоь, Таллин, 1981, C.6J.

7- Микельсаар Р.Н. О значении нестандартных пар азотистых оснований в структуре и функции нуклеиновых кислот. Тезисы 71 конференции биохимиков прибалтийских республик, Белорусской СО? и Ленинграда, Рига, 1961, с.102.

8. Mikelsaar R. A hypothesis on the archigenetic origin of mitochondrial transfer ГША'з. Biochemical Society Transactions, 1ЛЯ1, v.?, lJ°2, 25°Г.

9. I.likelrnni- It. :-A l:»se pairs in transfer ribonucleic acids г.ац с :> don-ant loo don complexes. J. Theor.Biol., 1981, v. 92, ':c2, p. 1 ->3-1"0.

10. Лг>е1пааг -. t jcionili" al -ec'ianisn of the protein synthesis as p.n archi-isnetic relic. Abstracts of the 12th International Congress of Siociiemistry, Perth (West-Australia), 1iB2, POS ---03-059.

11. inilcelsaar ii. Gytosin-adenine - a wobble base pair in '»/.e codon-anli?od?n comperes. Studia oiophysica, 1932, v.67, "-'>2/3, р.1Г'-118.

12. Mikelsaar R. Tartu precision space-filling atomic-molecular models. Advertisment, Tallinn, 1982, p.1-4.

13. Микельсаар Р.Н. Значение данных молекулярной эволюции для выяснения структуры и функции клетки. Тезисы конференции "4ундаментальные исследования клиники", Тарту, 1982,

с.29-30.

14. Микельсаар Р.Н. Объемные атомно-молекулярные модели. Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982, т.1У, с.ЮЗ.

15. Микельсаар Р.Н. Пара оснований С-А и дивергенция мтохон-дриальных метиониновых транспортных РНК» Тезисы У1 двустороннего симпозиума - СССР-Франция, Цхалтубо, 1982,

о.50.

16. Микельсаар Р. Архигенетическая гипотеза клеточной эволюции. В кн.: "Теория клетки" (на эст. яз.), Тарту, 1983, с.52-7?.

17. Mikelsaar R. Llolecular evolution of the mitochondrial genome and genetic code. Theses of the 15th PEBS Meeting, Brussels, Belgium, 1983, p.307.

18. Mikelsaar R. Human mitochondrial genome and the evolution of methionine transfer ribonucleic acids. J.theor. Biol., 1983, V.105, p.221-232.

19. Mikelsaar R. Evolutionary peculiarities of the tRUA mac-romolecular structure. Abstracts of the 4th Symposium USSR-Italy "Macromolecules in the Functioning Cell", Kiev, 1984, p.87.

20. Микельсаар P.K. Митохондриальный геном человека и эволюция метиониновых транспортных рибонуклеиновых кислот. Молекулярная биология, 1984, т.18, вып.2, с.325-331-

21. Микельсаар Р.Н. Новые объемные атомные модели в молекулярной биофизике. Тезисы докладов АН Молдавской ССР "Первая республиканская конференция по биофизике", Кишинев--Щтиинца, 1984, с.22-23.

22. Верховский Л.И., Микельсаар Р.Н. Новая спиральная структура двухцепочечного полинуклеотида. Тезисы докладов All Молдавской ССР "Первая республиканская конференция по биофизике", Кишинев-Штиинца, 1984, с.23-25-

23- Микельсаар Р.Н. Атоыно-молекулярные модели - пособия для исследования химического строения лекарственных веществ. Тезисы конференции ТГУ "Медицинские исследования практике", Тарту, 1984, с.177-178.

24. Микельсаар Р.Н. Объемные атомно-молекулярнне модели ново-

го типа - эффективное пособие для учебных процессов и

научных исследоганий по химии. Тезисы республиканской конференции "Научные достижения химиков - народному хозяйству", Вильнюс, 1984, с.172-173.

25- Микельсаар Р.Н. Анализ структуры тИ1К при помощи объемных молекулярных моделей. Тезисы докладов 8-го объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии", Рига,

1985, с. 186.

26. Черкяй Л.ТТ., "икедьааир Р.Н., Зерховскяй Д.И. Применение рентгеновской фотограмметрии для определения пространственных координат элементов молекулярных моделей. "Геодезия и аэрофотосъемка", 1985, № 3, с.83-88.

27. Микельсаар Р.Н. Модели, которые пока есть у немногих. "Химия и жизнь", 1985, № II, с.58-59.

28. Микельсаар Р.-Х.Н., Брусков В.И., Полтев В.И. Новые прецизионные объемные атомно-молекулярные модели, Пущино, 1985, 40 с.

2r . llikelcaar р..-H.H., Bruskov V.l., Poltev V.l. Mew precision space-filling atonic-molecular models, Pushchino, 1985, \\ p.

30. Шке?!-.0^^1 г "~оw ^.тос ivni.nn fnace-fillinr' atoniic—mclccu— l[>r models, .'.bctracts o:' the 13th International Congress oi -jIg t , /.т.") t erdttJü, li'5'3, p . о 14 •

JI. .Микельсаар P. Случай и правило в первичной и вторичной

структуре тЖК. Б кн.: "Стохастические модели в биологии" (на эст. яз.), Тарту, 1985, с.81-85.

32. Микельсаар Р.-Х.Н. Атомно-молекулярные модели - пособия для научных исследований по биотехнологии и генной инженерии. В кн.: "Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии", Тарту, 1986, с.140 141.

33. Микельсаар Р.-Х.Н. О молекулярной морфологии сурфактан-та легких. В кн.: "Успехи медицинской науки", Тарту, 1985, с.85-86.

34. Микельсаар Р.-Х.Я. Гипотеза о тримерном строении структурных единиц липидного бислоя биомембран. 3 кн.: "Успехи медицинской науки", Тарту, 1986, с.89-91-

35. Iiikelsaar R.-H.iJ. Evolutionary peculiarities of the tRliA macromolecular structure. In: IJacromolecules in the functioning cell, Pushchino, 1S86, p.37-41.

3G. Hikelsaar R. Hew space-filling atomic-molecular models.

5Г

Trends Biotechn., 1986, v.4, №6, p.152-163.

37. Mikelsaar R. A hypothesis on the structure of the biomembrane lipid bilayer. In: 5th European winter liquid crystal conference on layered and columnar mesomorphic systems, Sofia, 1987, p.125.

38. Млкельсаар P. О молекулярной эволюции липидного бислоя биомембран на основании сотовидной модели структуры мембраны. В кн.: "Систематика и теория эволюции" (на эст. яз.), Тарту, 1987, с.97-105.

39- Мякельсаар Р.-Х.Н. Молекулярное моделирование липидного бислоя биомембран. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987, с.55-

40. Mikelsaar R. A novel hypothesis on the structure of biomembrane lipid bilayer. Abstracts of the 10th FEBS Meeting, Ljubljana, Yugoslavia, 1987, p.163.

41. Mikelsaar R. A view of early cellular evolution. J. Mol; Evol., 1987, v.25, №2, p.168-183.

42. Mikelsaar R. A hypothesis on the structure of the biomembrane lipid bilayer. Molecular crystals and liquid crystals, 1987, v.152, p.229-257.

43. Mikelsaar R.-H. Molecular organization of biomembrane lipids. Abstracts of the 5th Soviet-Swiss symposium "Biological membranes: structure and function", Riga, 1988, p.122.

44. Mikelsaar R.-H. New space-filling atomic models and molecular modelling of the biomembrane lipids. Abstracts of the 14th International Congress of Biochemistry, Prague, 1988, TH:377, p.158.

ПАТЕНТЫ И АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ, ИСПОЛЬЗОВАННЫМ ПШ СОЗДАНИИ НОВЫХ АТОМНО-МОЛЕКУЛЯШЫХ МОДЕЛЕЙ

1. Mikelsaar R.-K.N. Modèle tridimensionnel de structure moléculaire. Royaume de Belgique. Brevet d'invention № 897042, 14.12.1983.

2. Mikelsaar R.-K.Ii. Modèle tridimensionnel de structure moléculaire et dispositif destiné à son assemblage et

à son démontage. Royaume de Belgique. Brevet d'invention № 897076, 19.12.1983.

3. Микельсаар P.-X.H. Объемная модель молекулярной структуры. Патент (эквивалент) ГДР M I4I5-I945250/dd. 10.01. 1985.

Микельсвар P.-X.H.. Объемная модель молекулярной структуры. Патент (эквивалент) ЧССР N9 14-15-294-3250/~cs7 " 10".01 Г""" 1285.

5. i,;ikelsp,ar К.-K..'I, ¡Codàle tridimensionnel de structure moléculaire et dispositif destiné à son assemblage et ч ■••on ?c~onta.to. République française. Brevet d'invention :-r°Li53b'Jl 1 , 2e. .04 .1985.

6. Mikelsaar R.-K.i,'. LIodèle tridimensionnel de structure no-Тп/чрт'го. Republique française. Brevet d'invention "'"-n"«. im.ui.iju;.

7. Llikelsaar R.-K. '. ïredimensionell molekylstrukturmodell. Konungariket SveriG'e Patent jJ°8403974-2, 05.0o.198S.

3. Iiiikelsuar R.-lv.Ii. 'ïredimensionell molekylstrukturmoûell och anording for montering och. demontering av modellen. Konungariket Sv^rige Patent №8403312-5, 12.06.1986.

9. ilikelsaar R.-K.'ii. 'Dredimensionell molekylstrukturnodell. Xonunfjariket Sverige Patent №8505300-7, Oo. 11.1985.

-.'"iri'V. 'If

' , : .-a. ,. -noccj r.o 40 " r РЧ'ЛЯГИ ! ^Г

. ' екг-иь: .¡онт> ЧСС? IK 2519" OS.Cé.IÇe? 14. Mikelsaar к.-iv.-:. Aoli.ilulc L tein-r.

Tiurkamista ja uudelleankokoanistc. varten.

1\î. HiKelsaar u.-^.-.. ..ûl'— - .4-.:

mensionell molekylstrukturmodell. Suomi-Pinland Patent ;;o72p?rs 1 Э .07.1?S7. -, • . ' - ' ~ , .-л«-Л(явпяional model OjT molecular

w», Ihiited ütaxes im

tent ?>7°231-S?5, 29.11.1987.

18. iiikelsaar R.-K.'T. Three-dimensional model of molecular strukture. UK Patent ÎT°21S7593, 17.02.1988.

19. Hikelsarr R.-К.Г1. Räumliches j,Molekular Strukturmodell. Srfindungspatent für die Schweiz und Lichtenstein

K° S55498, 13.05.1988.

20. Mikelsaar R.-K.H. Raummodell einer Kolekttlstruktur. Erfindungspatent für die Schweiz und Lichtenstein № 565916, 15.05.1988.

21. Микельсаар Р.-Х.Н. Устройство для моделирования молекулярных структур. Авторское свидетельство СССР fS 1278922, 22.08.1986.

22. Ынкельсаар Р.-Х.Н., Яагоскльд А.Д. Соединение деталей. Авторское свидетельство СССР № 1373053, 08.10.1987.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ БЫЛИ ДОЛОЖЕНЫ:

На XIII и Х1У международных биохимических съездах (Амстердам, 1985 и Прага, 1988), на Х1У, ХУ1 и ХУШ конференциях ФЫБО (Эдинбург, I98I; Москва, 1984.и Любляна, 1987), на У Европейской зимней конференции по жидким кристаллам (Еоровец, 1987), на I всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1962), на всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на У1 и УШ объединенных симпозиумах биохимических обществ СССР-ГДР (Таллин, 1981 и Рига, 1985), на У1 двустороннем симпозиуме СССР-Франция (Цхалтубо, I9E2), на 1У симпозиуме СССР-Италия (Киев, 1984), на У симпозиуме СССР-Швейцария (Рига, 1988), на IX всесоюзной симпозиуме "Структура и функции тРКК и аминоацил-тГНК-синтетаз" (Ужгород, 1983), на всесоюзной школе по молекулярной биологии (Звенигород, 1981), на летней школе по молекулярной биофизике "Биофизика нуклеиновых кислот" (Харьков, 1983), на всесоюзной школе по биофизике "Биохемилюм" (Красноярск, 1985), на У1 конференции биохимиков прибалтийских республик,Белорусской ССР и Ленинграда (Рига, 1981), на 1У всесоюзном совещании-семинаре по молекулярной генетике дрожжей (Ленинград, 1987), на симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов ¡'Таллин, I9SI), на всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, I9G7), г:г республиканской конференции "Научные достижения химиков -- неродному хозяйству" (Вильнюс, 1984), на конференции "Успехи медицинской науки" (Тарту, 1986), на IX, XI, XII и XIII школах по теоретической биологии (Хаэска, 1983; Аакре, 1985; Хобулайд, 1986 и Краби, 1987).