Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

□03060201

На правах рукописи

Дергунова Елена Сергеевна

НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ, ОСНОВАННЫЕ НА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ СЕНСОРОВ

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 МАЙ 2007

Воронеж - 2007

003060201

Работа выполнена на кафедре химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Липецкий государственный технический университет»

Научный руководитель. доктор химических наук, профессор

Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Решетилов Анатолий Николаевич кандидат химических наук, доцент Суханов Павел Тихонович

Ведущая организация Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита состоится « ¿9 » мая 2007 г в /6 ч ООшш в аудитории на заседании диссертации совета Д212 038 19 по химическим наукам при Воронежском государственном университете по адресу 394006, г Воронеж, Университетская пл , 1, химический факультет, (ауд УЗЗ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан « ЦЦ » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

д х н , проф РММ' Г В Семенова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Иммунохимические методы анализа находят применение при анализе объектов окружающей среды, пищевой и фармацевтической промышленности, в клинической диагностике Они основаны на специфическом гомогенном или гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обеспечивает селективное определение целевых компонентов в сложных матрицах Такие методы характеризуются достаточно высокой чувствительностью и селективностью Однако, как правило, анализ выполняется в дискретном режиме и плохо поддается автоматизации

Известно, что проведение иммунохимических реакций на поверхности электродов сенсоров облегчает автоматизацию анализа, снижает его продолжительность Применение пьезокварцевых резонаторов, чувствительных к изменению массы, и специфических иммунореагентов, иммобилизованных на поверхности электродов, позволяет разработать пьезокварцевые иммуносенсоры, обеспечивающие прямое детектирование токсичных соединений в водных средах без введения дополнительных меток Такие сенсоры положительно зарекомендовали себя при определении ряда токсикантов, характеризуются высокой чувствительностью, малой инерционностью, что обеспечивает наблюдение за ходом иммунохимических взаимодействий практически в режиме реального времени

Загрязнение объектов окружающей среды соединениями, оказывающими негативное влияние на эндокринный статус человека (эндокринные деструкторы), явилось следствием широкого применения их при производстве пластмасс, моющих средств, красителей и гербицидов Эндокринные деструкторы (бисфенол А - В РА, нонилфенол - NP, линейные алкилбензолсульфонаты - LAS; ПДК - 1, 20, 500 нг/мл, соответственно) подобно половому гормону эстрогену влияют на репродуктивные функции человека, блокируют выработку мужских гормонов, характеризуются мутагенным и канцерогенным свойствами, вызывают расстройства половой и эндокринной систем Присутствующий в качестве примеси в фармацевтических препаратах на основе парацетамола 4-аминофенол (4-АР) обладает пирогенным эффектом и вызывает заболевания кожных покровов, глаз, нарушает работу печени (содержание в препарате не должно превышать 0,01%) Котинин (СОТ) может служить маркером для оценки степени отравления курильщиков никотином при проведении анализа биологических проб

Высокочувствительное и селективное определение таких биологически активных веществ (БАВ) в объектах окружающей среды, лекарственных препаратах и биологических образцах является актуальной задачей аналитической химии

Цель работы. Исследование закономерностей иммунохимических реакций, протекающих на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров,

и разработка методик проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных деструкторов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи

- Изучить и научно обосновать стратегию сайт-направленной ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов или аналитов на предварительно активированной поверхности пьезокварцевого резонатора,

- Исследовать закономерности гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело,

- Исследовать кинетику взаимодействия гаптен-белковых конъюгатов, иммобилизованных на поверхности электрода сенсора с антителами,

- Оценить специфичность применяемых иммунореагентов,

- Выявить доминирующие факторы, определяющих чувствительность проточно-инжекционного определения биологически активных соединений,

- Разработать методики проточно-инжекционного определения эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в различных объектах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров в качестве детектора

Научная новизна.

- Установлены и реализованы на практике принципы формирования многослойного биорецепторного покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспечивающие высокую активность биослоя и сохранение его постоянной массы в течение 15-30 циклов измерений

- Изучено влияние природы рецепторных покрытий и технологии их получения на величину аналитического сигнала сенсора при определении нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов

- Установлены закономерности иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий проточно-инжекционного определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в сложных по составу смесях с применением пьезокварцевого сенсора

- Оценено влияние различных форматов иммунохимического анализа (конкурентный, анализ с утяжелением массы) на аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора

- Установлены количественные взаимосвязи чувствительности определения фенолов (А) с величинами электронных эффектов заместителя в их молекулах, имеющие прогнозирующие функции

- Выявлены основные факторы, влияющие на оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров при проточно-инжекционном определении БАВ в жидких средах

- Показана возможность конкурентного определения следовых концентрации эндокринных ядов, 4-аминофенола в жидких средах на уровне нг/мл

Практическая значимость Предложены способы получения многослойных рецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров,

обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ, широкий диапазон определяемых содержаний и продолжительность эксплуатации

Разработаны методики высокочувствительного и селективного проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в жидких средах Методика определения нонилфенола в жидких средах защищена патентом РФ (Патент № 2287820)

Показана возможность применения пьезокварцевого иммуносенсора для экспрессного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях На защиту выносятся:

— Результаты исследований и выбора способов формирования биорецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, предназначенных для определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов

- Результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций антиген-антитело, протекающих на поверхности пьезокварцевого сенсора и лежащих в основе определения биологически активных веществ в жидких средах.

- Кинетические исследования иммунохимических реакций, рассчитанные значения констант скоростей прямой и обратной реакции, констант аффинности комплементарных иммунореагентов

— Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных антител с эндокринными ядами и их структурными аналогами

— Результаты исследования условий проточно-инжекционного определения биологически активных веществ и факторы, обеспечивающие оптимальные оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров

- Методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах, котинина в биологических жидкостях

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003), XII Научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003), IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), I Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), Всероссийской студенческой научно-технической школе -

конференции «Инженерные науки - защите окружающей среды» (Тула, 2006), The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва, 2006), VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2006» (Самара, 2006), Всероссийской конференции «Фагран-2006» (Воронеж, 2006)

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 12 тезисах докладов, 1 патенте РФ на изобретение

Структура работы. Диссертационная работа изложена на _

страницах машинописного текста, включает_рисунков и_таблиц

Состоит из введения, _ глав, выводов и списка использованных

библиографических источников, включающего _ ссылок на

отечественные и зарубежные работы

Работа выполнялась при финансовой поддержке программ Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» (тема № 01970006723 «Проточные пьезокварцевые иммуносенсоры новые возможности для определения физиологически активных веществ»), темплана Минобрнауки РФ (тема «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ»), регионального гранта РФФИ (грант № 06-03-96339_р_центр_а), стипендии Президента РФ

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из двух частей в первой части рассмотрены опубликованные за последние пять лет современные методы определения эндокринных деструкторов в объектах окружающей среды Как правило, применяемые методы анализа требуют сложного и дорогостоящего оборудования, процесс анализа продолжителен, поскольку включает многостадийные процедуры пробоподготовки. Показано, что альтернативу таким методом составляют способы анализа с применением иммуносенсоров Во второй части обобщены литературные сведения по способам иммобилизации иммунореагентов на поверхности пьезокварцевых сенсоров Подчеркнуто, что общие подходы для выбора способа иммобилизации до настоящего времени не разработаны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектами исследования являлись нонилфенол, бисфенол А, линейные алкилбензолсульфонаты, котинин ("Sigma", USA)

Иммунореагенты - котинин, 3-(р-сульфофенил)-бутановая кислота и бисфенол А, конъюгированные с белковыми молекулами (бычий (BSA), яичный(ОУА) и соевый (STI) альбумины) (COT-ST1, BPA-BSA, BPA-OVA, BPA-STI); 4-аминофенол и 4-нонилфенол, конъюгированные с бычьим и

яичным сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида (4-AP-GA-BSA и NP-OVA), кроличьи антисыворотки, содержащие поликлональные антитела к линейным алкилбензолсульфонатам (p-SPh-azo-OV-A, p-SPh-azo-BSA-B, pSPh-but-TG-A, 6-pSPh-hex-OV-A, pSPh-but-BSA-A), котинину (LOT ILS-106, LOT ILS- 983-6, LOT ILS - 985-7, NOS 3, NOS 12), 4-аминофенолу (Myg 2 и 3, IgG Myg 2) предоставлены д x н , проф С А Ереминым (МГУ им M В Ломоносова), поликлональные антитела к нонилфенолу (anti-NP(STI), anti-HHA(BSA), ser. 8-3(NP-BSA), anti-NP(NP-BSA)R-8) - к б н A A Мартьяновым (Институт биохимии им АН Баха РАН), моноклональные антитела к нонилфенолу (4Н6) - проф M Франеком (Институт Ветеринарии, Брно, Чехия), куриные сыворотки, содержащие поликлональные антитела к бисфенолу A (Kip 28/4 и An-HPVA) - проф Б де Меленаер (Университет Гента, Гент, Бельгия) и проф Р А Абукнеша (Королевский Колледж, Лондон, Великобритания) Синтез гаптен-белковых конъюгатов для определения LAS (LAS-43-BSA, LAS-43-OVA, LAS-43-STI) был осуществлен карбодиимидным методом

Для формирования подложек были использованы у-аминопропилтриэтоксисилан (y-APTS), меркаптопропионовая кислота (MPА), меркаптоэтиламин (MEA) ("Sigma", USA), тетраэтоксисилан (TESi) (х ч, Россия) В качестве кросс-реагентов применяли глутаровый альдегид (GA) ("Reanal", Hungary), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAQ, N^'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) ("Sigma", USA)

Лабораторная установка для проточно-инжекционного анализа включала перистальтический насос, дозатор, проточную ячейку детектирования, объемом 15-20 мкл, с пьезокварцевым резонатором АТ-среза с серебряными или золотыми электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 107±1 Гц (ЗАО «ЭТНА», ОАО «Квант», Россия), частотомер 4354, персональный компьютер

Аналитическим сигналом сенсора служит изменение частоты его колебаний (Af, Гц) при увеличении массы биорецепторного покрытия за счет образования поверхностного иммунного комплекса Важнейшими характеристиками применяемых покрытий при проточно-инжекционном определении являются концентрационная чувствительность (А, Гц мл мкг"1) сенсора, показывающая изменение частоты колебаний иммуносенсора (Af) при введении в поток раствора-носителя пробы, содержащей 1мкг/мл антител, число циклов измерений (N), в которых аналитический сигнал не снижается более чем на 5 %

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО СЛОЯ НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДОВ ИММУНОСЕНСОРОВ

К биорецепторным покрытиям пьезокварцевых сенсоров предъявляются следующие требования

— прочность закрепления рецепторных молекул на поверхности электрода,

— сохранение высокой активности иммобилизованных биомолекул,

— равномерность распределения активных сайтов связывания по всей площади электрода,

— физическая и химическая устойчивость покрытия в течение цикла измерения при контакте с жидкостью (включая устойчивость в процессе регенерации),

— минимальная масса рецепторного слоя (чем меньше масса покрытия, тем большая величина приращенной массы может быть определена микровзвешиванием)

Обзор литературы показал, что в наибольшей степени таким условиям отвечают покрытия, полученные ковалентным закреплением биомолекул

Ковалентная иммобилизация рецепторных молекул. Изучены многослойные способы иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов на предварительно активированной поверхности серебряных и золотых электродов, включающие получение подложки с высокой адгезией к металлу, активацию поверхности с применением бифункциональных реагентов и ковалентное закрепление биомолекул Методом поэтапного пьезокварцевого микровзвешивания регистрировали массу (Ат„) покрытий на основе различных модификаторов (TESi, y-APTS, МРА, МЕЛ), формирующих тонкую промежуточную прослойку с распределенными на ней активными функциональными группами, не разрушающуюся при длительном контакте с жидкостью

Максимальная масса и толщина покрытия (АА„, нм) наблюдается при модификации поверхности методом золь-гель технологии с помощью TESi, что может служить причиной сужения диапазона определяемых содержаний всех изучаемых аналитов (Табл 1)

При формировании подложек методом самособирающихся монослоев (SAM, self-assembled monolayers,) на основе y-APTS, МРА, МЕА отмечается оптимальное сочетание чувствительности и воспроизводимости при определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов Более высокую адгезию к металлу показывают подложки на основе y-APTS, который предохраняет поверхность Ag-электродов от окисления и способствует высокой упорядоченности поверхностных NH2-rpynn для удобного прикрепления биомолекул с помощью кросс-реагентов. Морфология поверхности такой подложки существенно зависит от температуры и продолжительности высушивания оптимальные параметры -120 °С и 15 мин, соответственно В этом случае формируется более легкое (3,35 мкг) и тонкое (0,12 нм) промежуточное покрытие 1

Монослои на основе тиолов (МРА, МЕА) имеют более низкую массу прослойки, однако процедура получения слоя модификатора более продолжительна (1-12 час) Результаты последующей ковалентной пришивки на таких покрытиях биореагентов через GA и EDAC показывают, что в этом процессе задействованы не все активные группы подложки, что приводит к возрастанию доли неспецифического взаимодействия по сравнению с покрытиями на основе y-APTS. Было установлено, что оба применяемых

кросс-реагента вА и ЕБАС достаточно прочно закрепляют белковые молекулы на всех изученных подложках и обеспечивают равную доступность активных центров для связывания с антителами Однако, структура бифункциональных реагентов и природа активных функциональных групп оказывают влияние на стерическую доступность центров связывания Применение в качестве кросс-реагента С/4, присоединяющего биомолекулы через более длинную линкерную цепочку, обеспечивает лучшую пространственную доступность для иммунохимического взаимодействия, что подтверждается более высокими значениями аналитического сигнала сенсора АГ

Таблица 1 Характеристики биорецепторных покрытий (САт=50 мкг/мл)

Состав покрытия Д m„, МКГ Ah„, HM A, Гц мл мкг"1 Af, Гц Диапазон определяемых содержаний, нг/мл N

Бисфенол А (антитела к бисфенолу А Kip 28/4)

TESi-GA-BSA-BPA 25,5 0,35 1,9 95 2-25 15

y-APTS-GA-BSA-BPA 19,5 0,22 4,0 200 1-75 28

MEA-GA-BSA-BPA 13,5 0,19 3,0 150 2-50 21

MPA-EDA C-BSA-BPA 11,0 0,18 2,2 112 1-50 18

Линейные алкилбензолсульфонаты (антитела 6-pSPh-hex-OV-Ä)

TESi-GA-BSA-LAS 26,9 0,35 1,7 84 2-25 15

y-APTS-GA-BSA-LAS 20,5 0,23 5,8 185 5-100 28

MEA-GA-BSA-LAS 15,5 0,19 4,0 155 5-75 21

MPA-EDA C-BSA- LAS 14,0 0,18 2,4 104 5-75 18

Нонилфенол (антитела 4H6)

TESi-GA-OVA-NP 28,1 0,36 1,8 92 2-25 15

y-APTS-GA-OVA-NP 19,7 0,23 2,3 114 1-50 28

MEA -GA- OVA-NP 14,5 0,19 2,0 108 2-25 21

MPA-EDAC- OVA-NP 13,1 0,18 1,8 88 2-25 18

На чувствительность определения аналитов в жидких средах конкурентным методом влияет и природа белковой молекулы, входящей в состав гаптен-белкового конъюгата Например, значение А при определении ВРА и LAS снижается в следующем ряду протеинов BSA>OVA>STI и, следовательно, зависит от природы и молекулярной массы применяемого белка

Установленные закономерности изменения аналитического сигнала сенсора и чувствительности от способа иммобилизации сохраняется для всех изученных эндокринных деструкторов В тоже время абсолютная

величина Af выше при определении ВРА, по сравнению с аналогичными значениями для LAS и NP Совокупность оптимальных характеристик сенсоров достигается при иммобилизации иммунореагентов на силоксановой подложке на основе y-APTS, полученной методом самособирающихся монослоев с помощью глутарового альдегида, которая обеспечивает до 30 измерений на одном биослое

Фотоиммобилизация рецепторных молекул. Этим методом получены покрытия на основе производных бисфенола А, содержащих -СООН функциональные группы, взаимодействующие при УФ-облучении с NH2-группами подложки (Табл 2)

Таблица 2. Характеристики биослоев, полученных методом фотоиммобилизации_

Состав покрытия Д/ил> мкг нм А, Гц мл мкг"1 AF, Гц Диапазон определяемых содержаний, нг/мл N

y-APTS-EDA С-ВРА 5,6 0,15 1,4 70 10-200 12

y-APTS-DCC-BPA 5,0 0,12 1,4 72 10-240 14

В качестве фотоинициаторов использовали ЕОАС и ВСС. Основными достоинствами такой методики является- расширение диапазона определяемых соединений, вследствие более низкой массы покрытия (Дт„ < 6 мкг), исключение гаптен-белковых конъюгатов из схемы иммобилизации, ускорение процесса получения биорецепторного слоя (30-45 мин) Формирование более легкого и ' тонкого покрытия объясняется отсутствием на поверхности белковых молекул | Однако небольшой объем, занимаемый молекулой ВРА, создает стерические затруднения для взаимодействия с антителами, поэтому чувствительность определения аналита несколько ниже по сравнению с методами ковалентной иммобилизации, предел обнаружения составляет 5 нг/мл

ОЦЕНКА АФФИННОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИММУНОРЕАГЕНТОВ

Кинетические исследования изменения частотного сигнала сенсора при протекании реакции взаимодействия гапен-белковых конъюгатов со специфичными антителами позволили (с применением методики Скетчардта) установить константы скорости прямой и обратной реакции, и рассчитать константы аффинности иммунореагентов (Табл 3)

УФ ^свет

I <j>

I-S'— (снгь— мн2 N=\

I I * ЧСИЙ-ИН,

I О „^

Ulli

* > > > > > >

-^1-0-^1 O-StO-Sl-O SJ-O-Si-O-SMMj

Рис 1 Принципиальная схема rroouecca (Ьотоиммобилизации

Таблица 3 Кинетические и термодинамические характеристики иммунохимического взаимодействия на поверхности пьезокварцевого сенсора_ __^ _^ _1

Антитела коЮ-'ДМ"1 с"') кр 105 (с') КА 10"°, (М"1)

Конъюгат 4-АР-СА-В8А

Муя-3 11,70 3,97 2,95

4Н6 15,00 1,07 26,14

Муя-2 37,70 2,42 15,60

1явМуя-2 60,70 4,46 13,60

аШШР(8Т1) 11,37 6,8 1,7

апй-ННА(В8А) 21,55 7,85 2,7

¡ег. 8-3, СЧР-ВЯА) 21,07 6,29 3,4

аМШР^Р-ВБА), К-8 15,48 5,00 3,1

Конъюгат ЛТ-ОК4

апН-№@Т1) 140 1,5 93

ап И-ННА (ВЗА) 113,33 0,7 162

«гг. в-ЗОЧР-ВЯА) 74,67 2,00 37,3

аШШР^Р-ВБАЖ-З 110,00 0,005 220

4Н6 291,67 0,03 972

Конъюгат 1А8-43-В8А

р-БРИ-аго-ОУ-А 8,97 3,58 2,51

р-БРИ-аго-ВБА-В 16,1 4,10 3,93

р-БРк-ЬМ-Тв-А 28,7 2,41 11,9

р-йРИ-ЪМ-ВБА-А 151 0,40 37,75

б-р-вРИ-Иех-ОУ-А 838 0,39 215

Конъюгат ВРА-В8А

Юр 28/4 18,0 0,122 148,0

Ап-НРУА 13,0 1,2 10,8

Конъюгат СОТ-БТ!

ЬОТШ-Юб 15,1 1,84 8,20

ЮТ Ий-983-6 26,3 9,89 2,66

ЮТИЛ-985-7 17,7 1,10 16,00

N053 18,7 98,83 0,19

N0512 9,0 3,78 2,38

Скорость взаимодействия комплементарных пар иммунореагентов зависит от вида антител (поли- или моноклональные), структуры применяемого гаптен-белкового конъюгата и способа его иммобилизации

Наиболее высокая скорость образования иммунокомплекса характерна для реакции между гомологичными антителами и гаптен-белковыми конъюгатами Например, при взаимодействии антител к 4-аминофенолу Myg-2 и конъюгата 4-АР-СА-В8А значение ко составляет 60,70 10э М"1 с"1, что в 5 раз превышает аналогичное значение для пары апН-МР(БТ1) и 4-АР-йА-ВБА (11,37 1 03 М"1 с"1) А при взаимодействии моноклональных антител 4Н6 с различными конъюгатами (4-АР- С А -В8А и МР-ОУА) скорость образования гомологичного комплекса выше в 20 раз Влияние способа иммобилизации на кинетику взаимодействия в основном определяется плотностью упаковки рецепторных молекул и отсутствием стерических затруднений для доступа

антител к активным сайтам связывания В этом случае для покрытия y-APTS-G/4-конъюгат наблюдается более высокая скорость взаимодействия по сравнению с рецепторными слоями, сформированные другими способами

Значения КА определяются природой антител, активностью и степенью их очистки Так, величина КА для моноклональных антител 4Н6 превышает аналогичное значение для поликлональных антител Myg-З и1 Myg-2, используемых без предварительной очистки, в 2 и 10 раз, соответственно Поликлональные антитела к бисфенолу А характеризуются достаточно высокой активностью, однако значение КА= 1,48 109 М"1 для сыворотки Kip 28/4 практически в 15 раз превышает КА для Ап-НРУА Активность антител к LAS возрастает в следующем ряду p-SPh-azo-OV-A>p-SPh-azo-BSA-B> р-SPh-but-TG-A>p-SPh-but-BSA-A>6-p-SPh-hex-OV-A, что подтверждает зависимость КА от строения, типа линкерной связи и ее длины, а также массы применяемого белка носителя в иммуногене.

Известно, что в иммуноанализе могут быть использованы комплементарные пары с константой связывания не ниже 108 л/моль, что позволило на основе значений КА определить круг иммунореагентов для высокочувствительного определения БАВ

Поскольку поликлональные антитела могут участвовать в неспецифических реакциях со структурными аналогами аналитов, были рассчитаны значения коэффициентов перекрестного реагирования (CR,% = 1С50(В) 100ЯС5о(А), где 1С5о - концентрация, соответствующая 50%-ому ингибированию связывания токсиканта (А) и его аналога (В)), позволяющие оценить селективность иммунохимического определения эндокринных ядов в присутствии родственных соединений (Табл 4)

Антитела к LAS характеризуются групповой специфичностью -значения CR,% находятся в диапазоне 50 — 100% для всех исследованных структурных аналогов Однако, величины CR,% для ДСК — соединения неароматического строения, не превышает 5%, для фенола CR,% < 0,2 Следовательно, можно констатировать, что возможно селективное определение суммарного количества алкилбензолсульфонатов в присутствии сульфосоединений неароматического характера и фенолов

Поликлональные антитела к бисфенолу А обладают высокой специфичностью, что позволяет проводить определение ВРА с использованием этих иммунореагентов в присутствие других фенольных соединений (CR,% < 6% ), а высокое значение CR,% (120 %) для 2-(п-гидроксифенил),2-(я-карбоксифенил)пропана объясняется использованием данного соединения для получения конъюгированного иммуногена Коэффициенты перекрестного реагирования для 4Н6 не превышают 5% для родственных фенолов, содержащих заместители в пара- и орто- положениях Антитела IgG Myg 2 характеризуются максимальным значением CR,% для 4-аминофенола (150%) Достаточно высокие значения коэффициентов CR,% для пара-замещенных фенолов с электронодонорными заместителями (70100%), свидетельствует о том, что поликлональные антитела! узнают специфическую электронную конфигурацию, образующуюся при

взаимодействии 7г-электронов ароматического кольца с заместителем (-ОН, -С9Н19), которая придает сходство пара-замещенным фенолам с 4-аминофенолом Коэффициенты СЯ,% для фенолов с электроноакцепторным заместителем (-N02) существенно ниже

Таблица 4 Коэффициенты перекрестного реагирования (CR, %)

Линейные алкилбензолсульфонаты

аналоги7 p-SPh-azo-OV-A p-SPh-azo-BSA-B pSPh-but-TG-A pSPh-but-BSA-A 6-pSPh-hex-OV-A

ЛАС-1 62 63 68 73 75

ЛАС-2 52 53 55 58 60

ЛАС-3 65 67 69 73 76

ЛАС-4 64 66 68 71 74

ЛАС-42 67 69 72 73 75

ЛАС-43 68 70 73 77 79

4-ДБСК 100 100 100 100 100

ДСК 4 3 5 5 1

Бисфенол А

Антитела Структурные аналоги"1

ВРА ВРА-СООН Ph 4-NPh 4-KR БЗ

Kip 28/4 100 120 3,6 2,1 1,8 4,7

An-HPVA 100 105 5,0 2,3 2,0 6,2

Нонилфенол

Структурные аналоги Антитела

4116 | IgGMyg 2

CR,% А, Гц/нг

Нонилфенол 100,0 100 2,5

4-Аминофенол 3,2 157 1,8

Фенол 2,4 16 3,7

4-Нитрофенол 3,7 57 7,9

2,4-Динитрофенол 0,8 28 5,4

2,4,6-Тринитрофенол 0,4 20 5,1

2,4,6-Трибромфенол 2,0 19 4,7

2,4,6-Трихпорфенол 0,9 18 4,3

4-Гидроксифенол 2,4 72 5,6

- J1AC-1 - р-сульфобензойная кислота, ЛАС-2 - р-сулъфофенилуксуспая кислота, ЛАС-3 - 3-(р-сулъфофенил)-пропионовая кислота, ЛАС-4 - 4-(р-сульфофенил)-бутановая кислота, ЛАС-42 - 2-(р-сулъфофенил)-бутаноеая кислота, ЛАС-43 - 3-(р-сулъфофенил)-бутаноеая кислота, ДБСК - 4-додецилбензолсулъфокислота, ДСК— додецилсульфокислота.

1 - ВРА-СООН - 2-(п-гидроксифенил),2-(п-карбоксифенил)пропан; Ph - фенол, 4-NPh - 4-нитрофенол, 4-KR - крезол, БЗ - бензидин

Установлены линейные взаимосвязи между чувствительностью определения фенолов А и константой а, характеризующей электронные эффекты заместителей для следующих реакционных серий- lgA = 0,28с + 0,57 - для пара-замещенных фенолов (1), lgA = 0,28а + 0,55 — для moho-, ди-, тринитрофенолов (2); lgA = 0,05а + 0,60 - для тризамещенных фенолов (3), которые использованы для прогнозирования чувствительности определения замещенных фенола с помощью поликлональных антител Например, для

нонилфенола рассчитанное по уравнению (1) и полученное экспериментально значение А практически совпадают (2,6 и 2,5, соответственно), относительная погрешность прогнозирования не превышает 3-4 %

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОТОЧНО-ИНЖКЦИОННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Сравнение форматов иммунохимического анализа. Сопоставлены различные форматы иммуноанализа для определения низкомолекулярных БАВ с применением пьезокварцевых сенсоров конкурентный анализ и анализ с утяжелением массы (Табл 5) В случае конкурентного анализа гаптен, иммобилизованный на поверхности сенсора, и гаптен анализируемой пробы конкурируют за взаимодействие с фиксированным количеством антител Для усиления сигнала и утяжеления массы белковых I молекул антител применяли латексную агглютинацию Высокая концентрация аналита ингибирует прикрепление антител к гаптен-белковому конъюгату рецепторного слоя Аналитический сигнал, как и при конкурентном анализе, обратно пропорционален концентрации аналита в растворе

Таблица 5 Характеристика различных форматов иммуноанализа

Формат анализа ДПГц А, Гц мл мкг'Гц Сщ1П> нг/мл Диапазон определяемых содержаний, нг/мл

Конкурентный 114 2,3 0,5 1 ^75

С утяжелением массы 180 3,6 10 50 - 250

Сравнительная оценка различных форматов иммуноанализа с применением пьезокварцевым иммуносенсоров при определении нонилфенола показала, что конкурентный формат позволяет определять более низкие концентрации токсикантов (С1ШП=0,5 нг/мл), в то время как применение анализа с утяжелением массы расширяет (диапазон определяемых содержаний нонилфенола

Оптимизация условий проточно-инжекционного определения БАВ.

Поскольку лимитирующей стадией гетерогенной иммунохимической реакции является стадия диффузии, исследовано влияние природы, состава, рН и скорости потока-носителя на величину аналитического сигнала при проточно-инжекционном определении БАВ Оптимальное значение скорости потока носителя зависит от характера использованных антител при применении поликлональных антител наибольшее значение АГ наблюдается при пропускании через ячейку детектирования анализируемой пробы со скоростью 50 - 60 мкл/мин Увеличение скорости потока приводит к снижению АГ и сужению диапазона определяемых концентраций, так как антитела не успевают связаться с рецепторными молекулами, закрепленным на поверхности иммуносенсора В случае использования моноклональных антител, вследствие большей скорости образования иммунокомплекса, возможно увеличение скорости потока-носителя до 80 мкл/мин

Было рассмотрено влияние на величину аналитического сигнала сенсора рН и природы буферных растворов КН2РО4 - ЫагНРС^ (рН 6,0 - 7,6), Н3ВО3 - НС1 (рН 8,0), КН2Р04 - №ОН (рН 6,4 - 7,8), ЫаН2Р04 - №2НР04 (рН 6,0 -7,6) и установлено, что проведение иммунохимической реакции антиген-антитело в фосфатном буферном растворе с рН 7,2 повышает чувствительность определения эндокринных деструкторов и стабильность работы пьезокварцевого иммуносенсора в проточно-инжекционном режиме, поскольку в этих условиях сохраняется нативная конформация белковых молекул и облегчается взаимодействия антител с активными сайтами на поверхности биорецепторного покрытия

Обоснованы условия регенерации рецепторного слоя после завершения цикла измерений под действием различных химических реагентов, вызывающих диссоциации иммунного комплекса и обеспечивающих многократное использование биослоя При применении в качестве регенерирующего раствора КСЫ8 (0,035 мМ), способствующего достаточно быстрой диссоциации иммунного комплекса без изменения массы подложки, возможно многократное использование биослоя (до 25-30 циклов измерений)

ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Предложены методики экспрессного проточно-инжекционного определения БАВ в различных объектах с применением пьезокварцевого иммуносенсора Метрологические характеристики разработанных методик приведены в табл 6

Таблица 6 Метрологические характеристики разработанных методик

Конъюгат Антитела Уравнение градуировочной функции Сп11П) нг/мл Линейный диапазон, нг/мл

Нонилфенол

4-АР-вА-В$А 4Н6 у = -2,5 х + 48,6 0,8 1-20 0,99

4-т-ОУА у = -1,92х+ 114,4 0,5 1-50 0,98

Бисфенол А

ВРА-В8А Юр 28/4 у = -2,6 х + 200 0,5 1-75 0,99

Ап-НРУА у = -1,9 х + 101 1,0 5-50 0,99

Линейные алкилбензолсульфонаты

1Л8-43 р-ЗРИ-аго-ОУ-А у = -0,3 х + 40 6,0 10-125 0,99

р-БРИ-аго-ВЗА-В у = -0,3 х + 47 6 10-125 0,99

р-вРк-ЬМ-Тв-А у = -0,4 х + 52 4 10-125 0,99

р-8Рк-ЬШ-ВВА-А у = -1,6х+ 174 1Д 5-100 0,99

б-рЗРк-Ъех-ОУ-А у = -2,7 х + 275 1,0 5-75 0,99

4-Аминофенол

4-АР-СА-В$А | Муя-3 | у = -1,55х + 203 | 1,0 | 2-150 | 0,99

Котинин

СОТ-ВТI ЮТИЛ-985-7 у = -8,9 х + 75,9 0,07 мкг/мл 0,1-8,0 мкг/мл 0,99

Пределы обнаружения разработанных способов анализа указывают на возможность детекции эндокринных деструкторов и 4-аминофенола на уровне предельно допустимых концентраций В случае применения комплементарных пар (например, конъюгат 4-NP-OVA и антитела 4Н6) отмечается расширение диапазона определяемых содержаний и снижение предела обнаружения (0,5 нг/мл) Введение в анализируемую пробу различных изученных антител к LAS (Табл 6) позволяет изменять диапазон определяемых содержаний в зависимости от предполагаемой концентрации аналита (LAS) в пробе Отсутствие систематической погрешности при определении нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов с применением проточного пьезокварцевого иммуносенсора подтверждена методом «введено - найдено» и статистическими методами по критерию Стьюдента

Методики определения эндокринных ядов (нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов) в объектах окружающей среды апробированы при анализе поверхностных и сточных вод Анализ природных вод осуществляли без предварительной пробоподготовки

Таблица 7. Результаты определения эндокринных ядов в природных и технологических водах (п=5, Р=0,95)

Аналит Номер пробы С, нг/мл sr

Нонилфенол Природные воды р Воронеж |

№ 1(выше г Липецка) 9,0±0,2 0,01

№ 2(ниже г Липецка) 15,2±0,6 0,02

Технологические воды металлургического производства

№1 2,8±0,1 0,03

№2 2,6±0,3 0,03

№3 3,3±0,5 0,03

Бисфенол А Природные воды р Воронеж j

№1 2,5±0,1 0,02

№2 2,3±0,1 0,02

№3 2,8±0,1 0,02

№4 3,0±0,1 0,03

р Нева

№1 3,2±0,1 0,03

№2 3,5±0,1 0,03

ЛАС Природные воды р Воронеж

№ 1 (выше г Липецка) 57±1 0,03

№ 2 (ниже г Липецка) 61±1 0,02

Установлено, что во всех анализируемых образцах природной воды эндокринные яды (нонилфенол, бисфенол А, линейные алкилбензолсульфонаты) присутствует в следовых количествах, не

превышающих нормативные показатели, установленные Environmental Pollution Agency (ЕРА) (отечественные нормативы отсутствуют)

В фармацевтических препаратах на основе парацетамола присутствует в качестве примеси 4-аминофенол (4-АР), использующийся при синтезе и накапливающийся в лекарственных формах при нарушении условий и сроков хранении При превышении безопасных концентраций (0,01% - Россия, 0,005% - Великобритания, США, Япония) 4-аминофенол вызывает заболевания кожных покровов, глаз, нарушает работу печени

Разработана методика проточно-инжекционного определения 4-аминофенола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в фармацевтических препаратах, содержащих парацетамол Пробоподготовка лекарственных препаратов, осуществлялась в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи (XI, вып 2)

Таблица 8 Результаты определения 4-аминофенола в лекарственных формах

(п=5, Р=0,95)

Концентрация Содержание 4-АР в

Фармацевтический препарат 4-АР в анализируемом растворе, нг/мл лекарственной форме, % Sr

«ПАРАЦЕТАМОЛ» ЗАО «Еврофарм», Барнаул ОАО «Татхимфармпрепараты», Казань 66Д±0,1 5,1±0,1 0,007 0,0005 0,01 0,02

ОАО «Биохимик», Саранск 5,4±0,1 0,0005 0,01

ЗАО «Медисорб», Пермь ОАО «Уралбиофарм», Екатеринбург ОАО «Фармстандарт», Курск 10,6±0,1 3,8±0,1 3,5±0,1 0,001 0,0004 0,0003 0,02 0,01 0,01

«Со1с1гех НоЖет» ИахоЗтПЬКЬпе, Испания 18,6±0,1 0,002 0,01

«Парацетамол - НС» ОАО «Щелковский витаминный 2,8±0,1 0,0003 0,02

завод»

«Аскофен-П» ОАО «Фармстандарт», Курск 20,1±0,1 0,002 0,02

«Цитрамон-П» ЗАО «Медисорб», Пермь 26,5±0,1 0,003 0,02

Во всех анализируемых формах не зарегистрировано превышение нормативов, установленных Государственной Фармакопеей. Однако, содержание 4-аминофенола в препарате, произведенном в ЗАО «Еврофарм» превышает международные нормы

Все разработанные методики характеризуются высокой чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, селективностью (вследствие применения иммунореагентов) и экспрессностью, позволяют проводить анализ сложных многокомпонентных проб без предварительного

разделения или выделения целевых компонентов и по совокупности

показателей превосходят известные способы определения БАВ средах

в жидких

Автор благодарит кхн, доцента ЕН Калмыкову за помощь при разработке методики определения котинина, ктн , доцента В Ю Ширяева за техническое содействие в организации эксперимента, дхн, проф С А Еремина (МГУ им М В Ломоносова) за любезно предоставленные иммунореагенты и консультации по методике синтеза гаптен-белковых конъюгатов, кбн А А Мартьянова (Институт биохимии им \А Н Баха РАН), М Франека (Институт Ветеринарии, Брно, Чехия), Б де Меленаера (Университет Гента, Гент, Бельгия) и Р А Абукнеша (Королевский Колледж, Лондон, Великобритания) за любезно предоставленные иммунореагенты

ВЫВОДЫ

1 Разработаны способы ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности электродов пьезокварцевых иммуносенсоров для определения эндокринных ядов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах, обеспечивающие прочное закрепление иммунореагентов, сайт-направленную пространственную ориентацию, уменьшение неспецифической сорбции и высокую продолжительности эксплуатации. Показано, что наилучшие характеристики сенсоров достигаются при иммобилизации иммунореагентов на предварительно полученную методом самособирающихся монослоев подложку на основе у-аминопропилтриэтоксисилана с помощью глутарового альдегида Установлено, что метод фотоиммобилизации позволяет ускоренно формировать легкое и тонкое покрытие (30 - 45 мин), расширяв^ линейный диапазон определяемых содержаний бисфенола А в жидких средах

2 Изучены закономерности обратимой иммунохимической реакции на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров, лежащей | в основе определения бисфенола А, нонилфенола, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах Установлены значения КА, количественно описывающие степень связывания биологически активных веществ со специфичными антителами Исследованы перекрестные взаимодействия нонилфенола, бисфенола А, | линейных алкилбензолсульфонатов и их структурных аналогов с поликлональными антителами, рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (СИ, %), использованные для выбора комплементарных пар иммунореагентов, предназначенных для селективного определения БАВ в многокомпонентных пробах

3 Выявлены доминирующие факторы и оптимизированы условия проточно-инжекционного определения биологически активных соединений в жидких

средах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров Показано, что оптимальная скорость потока носителя различна при применении поликлональных (50 - 60 мкл/мин) и моноклональных (80 мкл/мин) антител Для регенерации биорецепторного слоя рекомендован раствор тиоцианата калия с концентрацией 0,035 шМ, практически полностью разрушающий гетерогенный иммунокомплекс и обеспечивающий многократное использовании сенсора На примере нонилфенола, исследовано влияние различных форматов иммуноанализа на чувствительность определения токсикантов

4 Разработаны методики проточно-инжекционного определения с применением пьезокварцевых иммуносенсоров нонилфенола, линейных алкилбензолсульфонатов, бисфенола А в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях (урина)

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Дергунова ЕС Пьезокварцевый иммуносенсор для определения котинина в жидких средах [Текст]/ Е С Дергунова// Актуальные проблемы современного естествознания науч. конф фестив студентов, аспирантов и молодых ученых, тез докл - Иваново, 2003 - С 14

2 Дергунова Е С. Определение метаболита никотина в биологических средах [Текст]/ Е С Дергунова, Е Н Калмыкова, Т Н Ермолаева// Наша общая окружающая среда 4 науч -практич конф студентов, аспирантов и молодых ученых Липецкой области- тез докл - Липецк, 2003 - С 45

3 Ермолаева ТН Перспективы использования пьезокварцевых сенсоров для иммунохимического анализа [Текст]/ Т.Н Ермолаева, Е Н Калмыкова, Е С. Дергунова, Е В Мелихова, С А Еремин// Х11У Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, тез докл - Казань, 2003 - С 230

4 Ермолаева Т Н Пьезокварцевые биосенсоры как тест-средства и детекторы для проточно-инжекционного анализа [Текст]/ Т Н Ермолаева, Е Н Калмыкова, Е С Дергунова, С А Еремин// Аналитика и аналитики международ форум тез докл - Воронеж, 2003 — Т 1, С 238

5 Дергунова Е.С Применение пьезокварцевого сенсора для кинетического исследования иммунохимических реакций [Текст]/ Е С. Дергунова, Е Н Калмыкова, ТН Ермолаева// Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии IV Всерос конф молодых ученых: тез докл

- Саратов, 2003 - С 89

6 Калмыкова Е Н Кинетические исследования аффинного взаимодействия и их применение при разработке пьезокварцевых иммуносенсоров [Текст]/ Е Н Калмыкова, Е В Мелихова, Е С Дергунова, С А Еремин, Т Н Ермолаева// Сорбционные и хроматографические процессы - 2004

- № 5 - С 597-605

7 Калмыкова Е H Пьезокварцевый иммуносенсор для определения фенола и его структурных аналогов в жидких средах [Текст]/ Е H Калмыкова, Е С Дергунова, С А Еремин, Т H Ермолаева// Аналитика России Всерос конф. тез докл - Москва, 2004 - С.86 I

8 Дергунова Е С Определение нонилфенола в водах с помощью проточного пьезокварцевого иммуносенсора [Текст]/ Е С Дергунова// Ломоносов-2005 международ науч конф студентов, аспирантов и молодых ученых тез докл - Москва, 2005 -С 13 |

9 Дергунова Е С Кинетические исследования аффинных взаимодействий антиген - антитело на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров [Текст]/ Е С Дергунова, Е H Калмыкова, Т H Ермолаева// Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии II' Междун симпоз.тез докл - Краснодар, 2005 - С 161 |

10 Dergunova ES. Flow-injection détermination of endocrine disruptors with piezo crystal îmmunosensors [Text]/ E S Dergunova, S A Eremin, T N Ermolaeva// The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 Bookofabstracts -Moscow,2006 - Vol 2 -P 403

11 Ермолаева TH Проточно-инжекционное определение нонилфенола в жидких средах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора [Текст]/ Т.Н Ермолаева, Е.С Дергунова, E H Калмыкова, С А Еремин// Журн аналит хим -2006 - Т. 61 -№6 - С 660-665

12 Дергунова Е С Проточно-инжекционное определение бисфенола А в объектах окружающей среды с помощью пьезокварцевого иммуносенсора [Текст]/ Е С. Дергунова, T H Ермолаева// Инженерные науки — защите окружающей среды Всерос студ науч -техн школы-конф сб трудов - Тула, 2006 - С 136-140

13 Дергунова ЕС Проточно-инжекционное определение эндокринных деструкторов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров [Текст]/ Е С Дергунова, С А Еремин, T H Ермолаева// Экоаналитика-2006- VI Всерос конф тез докл - Самара, 2006 - С 133

14 Воронежцева О В Пьезокварцевый иммуносенсор для определения 4-аминофенола в фармацевтических препаратах [Текст]/ О В Воронежцева, Е С Дергунова// Повышение эффективности металлургического производства XIV Обл науч-техн конф .'тез докл -Липецк, 2006 - С 9

15 Смирнова Е В Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для определения бисфенола А в водных средах [Текст]/ Е В Смирнова, Е С Дергунова// Повышение эффективности металлургического производства XIV Обл науч -техн конф тез докл - Липецк,! 2006 - С 24

16 Дергунова Е.С Способы формирования биорецепторного покрытия иммуносенсоров для определения нонилфенола и линейных алкилбензолсульфонатов в жидких средах [Текст]/ Е С Дергунова, О. Ю Шашканова, T H Ермолаева// Физико-химические процессы в

конденсированном состоянии и на межфазных границах «ФАГРАН-2006» III Всерос конф тез докл - Воронеж, 2006 - С 757.

17 Мелихова ЕВ Применение пьезокварцевых иммуносенсоров для определения биологически активных соединений в жидких средах [Текст]/ Е В Мелихова, Е С Дергунова, Т Н Ермолаева// Пути и формы совершенствования фармацевтического образования Создание новых физиологически активных веществ 3-я Всерос науч-метод конф тез докл - Воронеж, 2007 - С 235 - 237

18 Патент РФ 2287820 Способ селективного определения нонилфенола в растворе с помощью пьезокварцевого иммуносенсора/ ТЫ Ермолаева, Е С Дергунова, Е Н Калмыкова// Б И. № 36, 2006

Подписано в печать 19 04 2007г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Ризография Печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ №364 Липецкий государственный технический университет 398600 г Липецк, ул Московская, 30 Типография ЛГТУ 398600 г Липецк, ул Московская, 30

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные способы определения эндокринных деструкторов в объектах окружающей среды.

1.2. Методы формирования биочувствительного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, биополимеров и иммунореагентов.

2.2. Приборы и вспомогательное оборудование.

2.3. Подготовка проб для анализа объектов окружающей среды, лекарственных препаратов, полимерных материалов и средств гигиены.

2.4. Синтез гаптен-белковых конъюгатов для определения линейных алкилбензолсульфонатов.

2.5. Определение константы аффинности.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО

СЛОЯ НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДОВ

ИММУНОСЕНСОРОВ.

3.1 Ковалентная иммобилизация рецепторных молекул.

3.2. Фотоиммобилизация рецепторных молекул.

4: ОЦЕНКА АФФИННОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ

ИММУНОРЕАГЕНТОВ.

4.1. Кинетические исследования иммунохимического взаимодействия антиген-антитело.

4.2. Оценка специфичности иммунореагентов.

5. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.

5.1. Сравнение форматов иммунохимического анализа.

5.2. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту протекания иммунохимических реакций.

5.3. Влияние скорости, природы и рН буферного раствора-носителя на величину аналитического сигнала.

5.4. Влияние природы регенерирующего раствора на воспроизводимость аналитического сигнала.

6. ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ.

6.1. Определение нонилфенола в водных средах.

6.2. Определение бисфенола А в жидких средах.

6.3. Определение линейных алкилбензолсульфонатов в жидких средах.

6.4. Определение 4-аминофенола в фармацевтических формах.

6.5. Определение котинина в биологических пробах.

ВЫВОДЫ.

Актуальность. Иммунохимические методы анализа находят применение при анализе объектов окружающей среды, пищевой и фармацевтической промышленности, в клинической диагностике. Они основаны на специфическом гомогенном или гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обеспечивает селективное определение целевых компонентов в сложных матрицах. Такие методы характеризуются достаточно высокой чувствительностью и селективностью. Однако, как правило, анализ выполняется в дискретном режиме и плохо поддается автоматизации.

Известно, что проведение иммунохимических реакций на поверхности электродов сенсоров облегчает автоматизацию анализа, снижает его продолжительность. Применение пьезокварцевых резонаторов, чувствительных к изменению массы, и специфических иммунореагентов, иммобилизованных на поверхности электродов, позволяет разработать пьезокварцевые иммуносенсоры, обеспечивающие прямое детектирование токсичных соединений в водных средах без введения дополнительных меток. Такие сенсоры положительно зарекомендовали себя при определении ряда токсикантов, характеризуются высокой чувствительностью, малой инерционностью, что обеспечивает наблюдение за ходом иммунохимических взаимодействий практически в режиме реального времени.

Загрязнение объектов окружающей среды соединениями, оказывающими негативное влияние на эндокринный статус человека (эндокринные деструкторы), явилось следствием широкого применения их при производстве пластмасс, моющих средств, красителей и гербицидов. Эндокринные деструкторы (бисфенол А - ВРА, нонилфенол - NP, линейные алкилбензолсульфонаты - LAS; ПДК - 1, 20, 500 нг/мл, соответственно^ подобно половому гормону эстрогену влияют на репродуктивные функции человека, блокируют выработку мужских гормонов, характеризуются мутагенным и канцерогенным свойствами, вызывают расстройства половой и эндокринной систем. Присутствующий в качестве примеси в фармацевтических препаратах на основе парацетамола 4-аминофенол (4-АР) обладает пирогенным эффектом и вызывает заболевания кожных покровов, глаз, нарушает работу печени (содержание в препарате не должно превышать 0,01%). Котинин (СОТ) может служить маркером для оценки степени отравления курильщиков никотином при проведении анализа биологических проб.

Высокочувствительное и селективное определение таких биологически активных веществ (БАВ) в объектах окружающей среды, лекарственных препаратах и биологических образцах является актуальной задачей аналитической химии.

Цель работы. Исследование закономерностей иммунохимических реакций, протекающих на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров, и разработка методик проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных деструкторов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- Изучить и научно обосновать стратегию сайт-направленной ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов или аналитов на предварительно активированной поверхности пьезокварцевого резонатора;

- Исследовать закономерности гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело;

- Исследовать кинетику взаимодействия гаптен-белковых конъюгатов, иммобилизованных на поверхности электрода сенсора с антителами;

- Оценить специфичность применяемых иммунореагентов;

- Выявить доминирующие факторы, определяющих чувствительность проточно-инжекционного определения биологически активных соединений;

- Разработать методики проточно-инжекционного определения эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в различных объектах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров в качестве детектора.

Научная новизна.

- Установлены и реализованы на практике принципы формирования многослойного биорецепторного покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспеччвающие высокую активность биослоя и сохранение его постоянной массы в течение 15-30 циклов измерений.

- Изучено влияние природы рецепторных покрытий и технологии их получения на величину аналитического сигнала сенсора при определении нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.

- Установлены закономерности иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий проточно-инжекционного определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в сложн »ix по составу смесях с применением пьезокварцевого сенсора.

- Оценено влияние различных форматов иммунохимического анализа (конкурентный, анализ с утяжелением массы) на аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора.

Установлены количественные взаимосвязи чувствительности определения фенолов (А) с величинами электронных эффектов заместителя в их молекулах, имеющие прогнозирующие функции.

Выявлены основные факторы, влияющие на оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров при проточно-инжекционном определ ;нии БАВ в жидких средах.

- Показана возможность конкурентного определения следовых концентрации эндокринных ядов, 4-аминофенола в жидких средах на уровне нг/мл.

Практическая значимость. Предложены способы получения многослойных рецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ, широкий диапазон определяемых содержаний и продолжительность эксплуатации.

Разработаны методики высокочувствительного и селективного проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в жидких средах. Методика определения нонилфенола в жидких средах защищена патентом РФ (Патент № 2287820).

Показана возможность применения пьезокварцевого иммуносенсора для экспрессного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях.

На защиту выносятся:

- Результаты исследований и выбора способов формирования биорецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, предназначенных для определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.

- Результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций антиген-антитело, протекающих на поверхности пьезокварцевого сенсора и лежащих в основе определения биологически активных веществ в жидких средах.

- Кинетические исследования иммунохимических реакций, рассчитанные значения констант скоростей прямой и обратной реакции, констант аффинности комплементарных иммунореагентов

- Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных антител с эндокринными ядами и их структурными аналогами.

- Результаты исследования условий проточно-инжекционного определения биологически активных веществ и факторы, обеспечивающие оптимальные оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров.

- Методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах, котинина в биологических жидкостях.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); XII научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); I Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); Всероссийской студенческой научно-технической школе -конференции «Инженерные науки - защите окружающей среды» (Тула, 2006); The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2006» (Самара, 2006); Всероссийской конференции «Фагран-2006» (Воронеж, 2006).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 14 тезисах докладов, 1 патенте РФ на изобретение.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на Д9 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 20 таблиц. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 125 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности электродов пьезокварцевых иммуносенсоров для определения эндокринных ядов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах, обеспечивающие прочное закрепление иммунореагентов, сайт-направленную пространственную ориентацию, уменьшение неспецифической сорбции и высокую продолжительности эксплуатации. Показано, что наилучшие характеристики сенсоров достигаются при иммобилизации иммунореагентов на предварительно полученную методом самособирающихся монослоев подложку на основе у-аминопропилтриэтоксисилана с помощью глутарового альдегида. Установлено, что метод фотоиммобилизации позволяет ускоренно формировать легкое и тонкое покрытие (30 - 45 мин), расширяет линейный диапазон определяемых содержаний бисфенола А в жидких средах.

2. Изучены закономерности обратимой иммунохимической реакции на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров, лежащей в основе определ.?ния бисфенола А, нонилфенола, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах. Установлены значения Кл, количественно описывающие степень связывания биологически активных веществ со специфичными антителами. Исследованы перекрестные взаимодействия нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов и их структурных аналогов с поликлональными антителами, рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (CR, %), использованные для выбора комплементарных пар иммунореагентов, предназначенных для селективного определения БАВ в многокомпонентных пробах.

3. Выявлены доминирующие факторы и оптимизированы условия проточно-инжекционного определения биологически активных соединений в жидких средах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров. Показано, что оптимальная скорость потока носителя различна при применении поликлональных (50 - 60 мкл/мин) и моноклональных (80 мкл/мин) антител. Для регенерации биорецепторного слоя рекомендован раствор тиоцианата калия с концентрацией 0,035 тМ, практически полностью разрушающий гетерогенный иммунокомплекс и обеспечиаающий многократное использовании сенсора. На примере нонилфенола, исследовано влияние различных форматов иммуноанализа на чувствительность определения токсикантов.

4. Разработаны методики проточно-инжекционного определения с применением пьезокварцевых иммуносенсоров нонилфенола, линейных алкилбензолсульфонатов, бисфенола А в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях (урина).

1. Schettler, Т. Generations at Risk. Reproductive Health and Environment Tixt./ T. Schettler. L.: Mil Press, 1999. - 326 p. - ISBN 0-262-19413-9.

2. Loder, N. Royal Society Warns on Hormone Disrupters Text./ N. Loder// Nature. 2000. - Vol. 406. - P. 4 - 5.

3. Katzenellenbogen, J. The Structural Pervasiveness of Estrogenic Activity/ J. Katzenellenbogen Text.// Environ. Health. Perspect. 1995. - V.103. - №7. -P. 99-101.

4. Никитин, А.И. Гормоноподобные ксенобиотики и репродуктивная система Текст./ А.И. Никитин// Проблемы репродукции. 2002. - №2. -С. 5-15.

5. Другов, Ю.С. Экологическая аналитическая химия Текст./ Ю.С. Другов. СПб.: АНАТОЛИЯ, 2000. - 432 с. - ISBN 5-88851-034-3.

6. Майстренко, В.Н. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов Текст./ В.Н. Майстренко, Р.З. Хамитов, Г.К. Будников. М.: Химия, 1996. - 319 с. - ISBN 5-7245-1100-2.

7. Dalzell, D.J. A comparison of five rapid direct toxicity assessment methods to determine toxicity of pollutants to activated sludge Text./ D.J. Dalzell, S. Alte, E. Aspichueta, A. de la Sota, J. Etxebarria, M. Gutierrez, C.C.

8. Hoffmann, D. Sales, U. Obst, N. Christofi// Chemosphere. 2002. - V. 47, N.5.-P. 535-545.

9. Hellmann, H. Abbau von Alkylphenolethoxilaten in Waschmitteln — Ni.chweis durch IR-Spektroskopie/Dunnschicht-Chromatographie Text./ H. Hellmann// Fresenius' J. Anal. Chem. 1985. - V. 321, N. 2, - P. 159-162.

10. Huang, Ling. Определение следов фенольных примесей в бисфеноле А методом капиллярной газовой хроматографии Text./ Ling Huang,

11. Ming-jun Xie, Yan Jiang// Shiyou huagong. 2002. - V. 31, N 6. - P. 476478.

12. Wang, Shengping. Определение синтетических продуктов переэтерификации фенола диметиоксалатом методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии Text./ Shengping Wang, Zhenhua Li, Xinbin Ma, Genhui Xu// Fenxi huaxue. 2002. - V. 30, N 7. - P. 829832.

13. Giese, R. W. Measurement of endogenous estrogens: analytical challenges and recent advances Text./ R. W. Giese// J. Chromatogr. A. 2003. - V. 1000.-P. 401-412.

14. Chiron AS Company электронный ресурс./ The Biomarker Catalog 20042005// Режим доступа: www.chiron.no/html/biomarker2004/19-25.pdf, свободный. Загл. с экрана.

15. Lee, Н. С. Bisphenol A and nonylphenol bioconcentration in spotted halibut Varaspar variegates Text./ H. C. Lee, K. Soyano, A. Ishimatsu, M. Nagae, S. Kohra, Y. Ishibashi, K. Arizono, Y. Takao// Fisheries Science. 2004. -V. 70.-P. 192- 194.

16. Jiang, J.Q. Occurrence and treatment trials of endocrine disrupting chemicals (EDCs) in wastewaters Text./ J.Q. Jiang, Q. Yin, J.L. Zhou, P. Pearce// Chemosphere. 2005. - V. 61. - P. 544 - 550.

17. Guenther, К. Estrogen-active nonylphenols from an isomer-specific viewpoint: a systematic numbering system and future trends Text./ K. Guenther, E. Kleist, B. Thiele// Anal. Bioanal. Chem. 2006. - V. 384, № 2.- P. 542-546.

18. Thibaut, R. Identification of 4-n-nonylphenol metabolic pathways and residues in aquatic organism by HPLC and LC-MS analyses Text./ R. Thibaut, A. Jumet, L. Debrauwer, E. Rathahao, L. Lagadic, J.-P. Cravedi// Analusis. 2000. - V. 28, № 9. - V. 793-801.

19. Haefliger, О. P. Universal two-dimensional HPLC technique for the chemical analysis of complex surfactant mixtures Text./ O. P. Haefliger// Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 371-378.

20. Yamamoto, H. Effects of Physical-Chemical Characteristics on the Sorption of Selected Endocrine Disruptors by Dissolved Organic Matter Surrogates/

21. H. Yamamoto, H. M. Liljestr, Y. Hisashimizu, M. Morita Text.// Environ. Sci. Technol. 2003. - V. 37. - P. 2646-2657.

22. Garballo, A. Methodology for different resolution degrees of LAS homologues and isomers in commercial formulations by HPLC-FD Text./ A. Garballo, M. del Olmo, A. Gonzalez-Casado, A. Navalon, J. L. Vilchez,

23. Lopez, J. A. de Ferrer, A. Moreno, J. L. Berna // Luminescence. 2002. -V. 17.-P. 224-227.

24. Petrovic, M. Analysis and environmental levels of endocrinedisrupting compounds in freshwater sediments Text./ M. Petrovic, E. Eljarrat, M. J. Lopez de Alda, D. Barcelo //TRAC: Trends Anal. Chem. Ref. Ed. 2001. -V.20. - P. 637 - 648.

25. Hideyuki, Y. Liquid chromatographic determination of bisphenols based on intramolecular excimer-forming fluorescence derivatization Text./ Y. Hideyuki, H. Hajime, N. Hitoshi, Y. Masatoshi// Anal. chim. Acta. 2003. -V. 488, N2.-P. 211-221.

26. Mottaleb, M. A. Application of HPLC-FTIR spectroscopy using thermospray interface for analysis of anionic surfactants Text./ M. A Mottaleb//Anal. Sci. 1999. - V. 15. - P. 1137-1140

27. Shao, B. Determination of nonylphenol ethoxylates in the aquatic environment by normal phase liquid chromatography-electrospray mass spectrometry Text./ B. Shao, J. Ни, M. Yang//J. Chromatogr. A. 2002. -V. 950.-P. 167-174.

28. Nagahashi, M. Separation and estimation of bisphenol a by liquid chromatography with UV detection Text./ M. Nagahashi, N. Kikuchi, E. Migaki, S. Watanabe, T. Miki// Acta chromatogr. 2000. - N 10. - P. 110121.

29. Inoue, K. Determination of phenolic xenoestrogens in water by liquid chromatography with coulometric-array detection Text./ K. Inoue// J. Chromatogr. A. 2002. - V. 946. - P. 291-294.

30. Babay, P.A. Separation of nonylphenol ethoxylates and nonylphenol by nonaqueous capillary electrophoresis Text./ P.A. Babay, R.T. Gettar, M.F.

31. Silva, В. Thiele, D. Batistoni//J. Chromatogr. A. 2006. - V. 1116. - P. 277-285.

32. Yakovleva, J. Development of a polarization fluoroimmunoassay for linear alkylbenzenesulfonates (LAS) Text./ J. Yakovleva, A. Lobanova, I. Michura, A. Formanovsky, M. Franek, J. Zeravik, S. Eremin// Anal. Lett. -2002. V. 35, N 14. - P. 2279-2294.

33. Nistor, C. Competitive flow immunoassay with fluorescence detection for determination of 4-nitrophenol Text./ C. Nistor, A. Oubina, M.-P. Marco, D. Barcelo, J. Emneus//Anal. chim. Acta. 2001. - V. 426, N 2. - P. 185195.

34. Farre, M. La. Wastewater toxicity screening of non-ionic surfactants by Toxalert' and Microtox' bioluminescence inhibition assays Text./ M. La Farre, M.-J. Garcia, L. Tirapu, A. Ginebreda, D. Barcelo// Anal. chim. Acta. -2001.-V. 427,N2.-P. 181-189.

35. Ohno, K. Estrogen receptor binding assay method for endocrine disruptors using fluorescence polarization Text./ K. Ohno, T. Fukushima, T. Santa, N. Waizumi, H. Tokuyama, M. Maeda, K. Imai// Anal. Chem. 2002. V.74. -P. 4391-4396.

36. Korshin, G.V. Comparative study of reactions of endocrine disruptors bisphenol A and diethylstilbestrol in electrochemical treatment andchlorination Text./ G.V. Korshin, J. Kim, L. Gan// Water Res. 2006. - V. 40.-P. 1070- 1078.

37. Wang, Y. Определение анионных поверхностно-активных веществ в природных водах потенциометрическим методом в системе проточно-инжекционного анализа Text./ Y. Wang, S. Guan, D. Hao, D. Dan// Fenxi huaxue. 2002. - V. 30. - P. 1455-1458.

38. Гоголашвили, Э. JI. Применение магнитно-релаксационного метода для эк ;пресс-анализа строения неионогенных ПАВ Текст./ Э. Л. Гоголашвили/ Физико-химические методы в координационной и аналитической химии. 1999. - С. 48 - 51.

39. Tojo, Т. A simple and extremely sensitive system for detecting estrogenic activity using transgenic Arabidopsis thaliana Text./T. Tojo, K. Tsuda, T. S. Wada, К. I. Yamazaki// Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006. - V. 64. - P. 106- 114.

40. Horisberger, М. Labelling of colloidal gold with protein Text./ M. Horisberger, M. Vauthey// Histochemistry and Cell Biology. 1984. - V. 80, №1.-P. 13-18.

41. Abad, J.M. A quartz crystal microbalance assay for detection of antibodies against the recombinant African swine fever virus attachment protein pl2 in swine serum Text./ J.M. Abad, F. Pariente, L. HernaAndez, E. Lorenzo//

42. Anal. Chim. Acta. 1998.-V. 368. P. 183-189.

43. Huenerbein, A. Real-time monitoring of peptic and tryptic digestions of bovine (3-casein using quartz crystal microbalance Text./ A. Huenerbein, С. E.H. Schmelzer, R. H.H. Neubert// Anal. Chim. Acta. 2007. - V. 584. - P. 72-77.

44. Иммобилизованные ферменты Текст./ Отв. ред. И. В. Березин, В. К. Антонов, К. Мартинек. М.: изд-во МГУ, 1976. - Т. I. - С. 266.

45. Uttenthaler, Е. Quartz crystal biosensor for detection of the African Swine Fever disease Text./ E. Uttenthaler, C. Koeslinger, S. Drost// Anal. Chim. Acta.- 1998.-V.362.-P. 91-100.

46. Carter, R.M. Piezoelectric Detection of Ricin and Affinity-Purified Goat Anti-Ricin Antibody Text./ R.M. Carter, M.B. Jacobs, G.J. Lubrano, G.G. Guilbault// Anal. Lett. 1995. - V. 28. - P. 1379 - 1386.

47. Konig, B. Detection of viruses and bacteria with piezoelectric immunosensors Text./ B. Konig, M. Gratzel// Anal. Lett. -1993. V. 26. -P. 1567- 1585.

48. Babacan, S. Evaluation of antibody immobilization methods for piezoelectric biosensor application Text./ S. Babacan, P. Privarnik, S. Letcher, A.G. Rand// Biosens. Bioelectron. 2000. - V.15. - P. 615 -621.

49. Barnes, C. Lectin coated piezoelectric crystal biosensors Text./ C. Barnes, C. D'Silva, J. P. Jones, T. J. Lewis// Sensors and Actuators B: Chemical.1992.-V. 7.-P. 347-350.

50. Quinn, J. The use of regenerable, affinity ligand-based surfaces for immunosensor applications Text./ J. Quinn, P. Patel, B. Fitzpatrick [et al]// Biosens.Bioelectron. 1999. - V. 14. - P. 587 - 595.

51. Okada, T. Application of peptide probe for evaluating affinity properties of proteins using quartz crystal microbalance Text./ T. Okada, Y. Yamamoto, H. M., I. Karube, H. Muramatsu// Biosens. Bioelectron. 2007. - V. 22. - P. 1480-1486.

52. Saha, S. Sandwich microgravimetric immunoassay: sensitive and specific detection of low molecular weight analytes using piezoelectric quartz crystal Text./ S. Saha, M. Raje, C.R. Suri// Biotechnol. Lett. 2002. - V.24. - P. 711-716.

53. Babacan, S. Piezoelectric Flow Injection Analysis Biosensor for the Detection of Salmonella Typhimurium J. Text./S. Babacan, P. Pivarmik, S. Letcher, A. Rand// Food Sci. 2002. -V. 67. P. 314-320.

54. Liu, M. Flow injection immunosensing of polycyclic aromatic hydrocarbons with a quartz crystal microbalance Text./ M. Liu, Q. X. Li, G. A. Rechnitz// Anal. Chim. Acta. 1999. - V. 387. - P. 29-38.

55. Halamek, J. Highly sensitive detection of cocaine using a piezoelectric immunosensor Text./ J. Halamek, A. Makower, P. Skladal, F. W. Scheller// Biosens. Bioelectron.-2002. V. 17.-P. 1045-1050.

56. Su, X.D. Piezoelectric quartz crystal based label-free analysis for allergy disease Text./ X.D. Su, F.T. Chew, S.F.Y. Li// Biosens. Bioelectron. -2000.-V.15.-P. 629-639.

57. Park, I.-S. Operational characteristics of an antibody-immobilized QCM system detecting Salmonella spp. Text./ I.-S. Park, W.-Y. Kim, N. Kim// Biosens. Bioelectron.- 2000. V. 15. - P. 167 - 172.

58. Zhang, S. L. A piezoelectric gene-sensor using acimomycin D-functionalized nano-microspheres as amplifying probes Text./ S. L. Zhang, T. Z. Peng, C. F. Yang// J. Electroanal. Chem. 2002. - V. 522. - P. 152

59. Wink, Th. Self-assembled Monolayers for Biosensors Text./ Th. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. van Bennekom// Analyst. 1997. - V. 122. - P. 43R-50R.

60. Skladal, P. Kinetic study of affinity interactions: comparison of piezoelectric and resonant mirror-based biosensors Text./ P. Skladal, J. Horacek//Anal. Lett. 1999.-V. 32.-P. 1519- 1529.

61. Фадеев, Ф.Ю. Жидкостной химически модифицированный кварцевый резонатор как иммуносенсор Текст./ Ф. Ю. Фадеев, А. А. Ельцов, Ю. К. Алешин, С. И. Малышенко, Г. В. Лисичкин// Ж. физич. химии -1994.-Т. 68., № 11.-С. 2071 -2075.

62. Barie, N. Covalent bound sensing layers on surface acoustic wave (SAW) biosensors Text./ N.Barie, M.Rapp // Biosens. Bioelectron. 2001. - V. 16. -P. 979-987.

63. Tang, A. H. J. Immunosensor for okadaic acid using quartz crystal microbalance Text./ A. H. J. Tang, M. Pravda, G. G. Guilbault, S. Piletsky, A. P. F. Turner// Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 471. - P. 33-40.

64. Liu, Y.-C. Comparison of Different Protein Immobilization Methods on Quartz Crystal Microbalance Surface in Flow Injection Immunoassay Text./ Y.-C.Liu, C.-M. Wang, K.-P. Hsiung // Anal. Biochem. 2001. - V. 299.-P. 130-135.

65. He, F.J. A TSM immunosensor for detection of M. tuberculosis with a new membrane material Text./ F.J. He, L.D. Zhang, J.W. Zhao, B.L. Hu, J.T. Lei// Sens. Actuators, B. 2002. - V. 85. - P. 284 - 290.

66. Storri, S. Surface modifications for the development of piezoimmunosensors Text./ S.Storri, T.Santoni, M.Minunni, M.Mascini// Biosens. Bioelectron. 1998. -V. 13. - P. 347 - 357.

67. Palaniappan, Al. Cyclodextrin functionalized mesoporous silica films on quartz crystal microbalance for enhanced gas sensing Text./ Al. Pdaniappan, Xu Li, F. Tay, J. Li, X. Su// Sensors and Actuators B: Chemical. 2006. - V. 119. - P. 220 - 226.

68. Chu, Xia. Simultaneous immunoassay using piezoelectric immunosensor array and robust method Text./ Xia Chu, Jian-Hui Jiang, Guo-Li Shen, Ru-Qin Yu//Anal. Chim. Acta. 1996. -V.336. - P. 185-193.

69. Химия привитых поверхностных соединений Текст./ Под ред. Г. В. Лисичкина. -М.: «Мир», 2003. 592 с. - ISBN 5-9221-0342-3.

70. Harsanyi, G. Polymer films in sensor applications: a review of present uses and future possibilities Text./ G. Harsanyi// Sens. Rev. 2000. -V. 20. P. 98-105.

71. Saber, R. Glow-discharge treated piezoelectric quartz crystals as immunosensors for HSA detection Text./ R. Saber, S. Mutlu, E. Piskin // Biosens. Bioelectron. 2002. - V. 17. - P. 727-734.

72. Gamier, F. Toward intelligent polymers: DNA sensors based onoligonucleotidefunctionalized polypyrroles Text. / F.Gamier, H.Korri-Yousouffi, P.Srivastava, B.Mandrand, T.Delair // Synth.Metals.-1999.-V.100.- P.89-94.

73. Carter, R. M. Quartz crystal microbalance detection of Vibrio cholerae 0139 serotype Text./ R. M. Carter, J. J. Mekalanos, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault// J. Immunol. Methods. 1995. - V. 187. -P. 121 - 125.

74. Su, X. Quartz tuning fork biosensor Text./ X. Su, C. Dai, J. Zhan, S. J. O'Shea// Biosens. Bioelectron. 2002. - V. 17. - P. 111-117.

75. Konig, B. Detection of human T-lymphocytes with a piezoelectric immunosensor Text./ B. Konig, M. Gratzel// Anal. Chim. Acta. -1993.-V. 281.-P. 13-18.

76. Konig, B. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of human erythrocytes Text./ B. Konig, M. Gratzel// Anal. Chim. Acta. -1993.-V. 276.-P. 329-333.

77. Konig, B. Long-term stability and improved reusability of a piezoelectric immunosensor for human erythrocytes Text./B. Konig, M. Gratzel// Anal. Chim. Acta. -1993. V. 280. - P. 37-41.

78. Konig, B. Human granulocytes detected with a piezoimmunosensor Text./ B. Konig, M. Gratzel//Anal. Lett. 1993.-V. 26. - P. 2313 - 2328.

79. EPA: Federal Register. Notices Text. 2004. - Vol. 69, No. 2. - P. 342.

80. Государственная фармакопея СССР Текст.: XI изд. М.: Медицина, 1987.-Вып. 1 и2.-С. 1081.

81. Handbook on the Implementation of EC Environmental Legislation Электронный ресурс. European Union Drinking Water Directive, 98/83/EC. - 2006. - Режим доступа: http://ec.europa.eu/ environment/ enlarg/handbook/water.pdf, свободный. Заглавие с экрана.

82. Досон, Р. Справочник биохимика Текст./ Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс-М.: «Мир», 1991.-544 с.

83. Sauerbrey, G.Z. Use a quartz vibration form weigh thin films on a microbalance Text./ G.Z. Sauerbrey // Z. Phys. 1959. - B. 155. - P. 206 -210.

84. Guilbault G.G. Nomenclature for automed and mechanized analysis Text./ G.G. Guilbault, M. Hjelm// Pure&Appl.Chem. 1989. - V.61, № 9. - P. 1657-1664.

85. Bhatia, R. Phase transitions in a methyl-terminated Monolayer Self-Assembled on Au{ 111} Text./ R. Bhatia, B. J. Garrison// Langmuir. -1997. -V. 13,No.4.-P. 765-769.

86. Джонсон, К. Уравнение Гамета Текст./ К. Джонсон М.: «Мир», 1977.240 с.

87. Azevedo, D. de A. Occurrence of nonylphenol and bisphenol-A in surface wi .ters from Portugal Text./ D. de A. Azevedo, S. Lacorte, P. Viana, D. Barcelo// J. Braz. Chem. Soc. 2001. Vol. 12. - P. 532 -537.

88. U. S. EPA: Methods for organic chemical analysis of municipal and industrial wastewaters Text. USA, 1995. - Part 40. - P. 136.

89. British Pharmacopoeia 2007Text./ British Pharmacopoeia Commission. -Stationery Office. 2006. -V. 1. P. 3500. - ISBN 10 - 0113227256.

90. Thompson, M. Thickness-shear-mode acoustic wave sensors in the liquid phase. A review Text./ M. Thompson, A. L. Kipling, W. C. Duncan-Hewitt, L. V. Rajakovic, B. A. Cavic-Vlasak// Analyst.- 1991. -V.l 16.- P. 881-890.

91. Er;min, S. A. Urinary cotinine fluoroimmunoassay for smoking status screening adapted to an automated analyzer Text./ S. A. Eremin, R. E. Coxon, D. L. Colbert, J. Landon, D. S. Smith// Analyst. 1992. - V. 117.-P. 697 - 699.