Определение ряда хлорорганических пестицидов иммунохимическими методами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Нартова Юлия Викторовна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЯДА ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химичесю

Воронеж - 2008

003170206

Работа выполнена на кафедре химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Липецкий государственный технический университет»

Научный руководитель. доктор химических наук, профессор

Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Защита состоится « 6 » июня 2008 г в 14— на заседании диссертации совета Д 212 038 19 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, г. Воронеж, Университетская пл, 1, ауд 290

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан «5» мая 2008 г

Евтюгин Геннадий Артурович доктор химических наук, доцент Шапошник Алексей Владимирович

Ведущая организация Российский химико-технологический

университет им Д И Менделеева

Ученый секретарь диссертационного совета

МЮ Крысин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность*. Проблема безопасности пищевых продуктов и сельскохозяйственного сырья является основным фактором, определяющим здоровье людей и сохранение генофонда Поэтому обостряются вопросы, связанные с объективностью контроля качества пищевых продуктов, кормов, продукции растениеводства и животноводства, в частности, с определением пестицидов, способных аккумулироваться в почве, воде, сырье и продуктах его переработки Наибольшей токсичностью характеризуются хлорорганические пестициды и продукты их метаболизма, отнесенные к стойким органическим загрязнителям из-за трудности деградации Некоторые представители этого класса запрещены к применению, но продолжают использоваться (алдрин и др ) Проблема контроля содержания пестицидов в объектах окружающей среды и пищевой продукции является сложной аналитической задачей, связанной с низкими концентрациями токсикантов и сложными процессами взаимодействия их с компонентами пробы Среди инструментальных методов контроля хлорорганических пестицидов наибольшее распространение находят хроматографические методы, обязательно включающие сложные способы пробоподготовки методами твердофазной, жидкостной или сверхкритической флюидной экстракции К недостаткам хроматографического определения пестицидов следует отнести длительность анализа, необходимость тщательной очистки экстракта, не всегда удовлетворительную селективность и чувствительность, высокую стоимость оборудования

Постоянное обновление перечня применяемых пестицидов требует разработки новых альтернативных методик определения токсикантов Иммунохимические методы анализа, характеризующиеся высокой селективностью и чувствительностью, положительно зарекомендовали себя при определении следовых концентраций ряда пестицидов и других биологически активных соединений (БАС) Они основаны на гомогенном и гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обуславливает высокоспецифичное определение аналита в сложных матрицах Так, метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа позволяет детектировать протекание иммунохимического взаимодействия

" Научный консультант по вопросам синтеза треисеров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа д х н , проф Еремин С А

Сокращения, используемые в тексте 5А2-Сру - 5-амино-2-хлорпиридин, А1а-МРА алахлормеркаптопропионовая кислота, АМРА - ацетохлормеркаптопропионовая кислота, BMPA -бутахлормеркаптопропионовая кислота, APTS - у-аминопропилтриэтоксисилан, BSA - бычий сывороточный альбумин, Cm,„ - предел обнаружения, Дтш - масса биорецепторного покрытия, СС -хлорангидрид циановой кислоты, DCC - Ы,Ы-дициклогексилкарбодиимид, EDAC - 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид, GA - глутаровый альдегид, NHS - N-гидроксисукцинимид, OVA альбумин яичного белка, PBS - фосфатный буферный раствор, STI - соевый трипсиновый ингибитор, S„ -интегральная массовая чувствительность, Sc - интегральная концентрационная чувствительность, АН ацетонитрил, Аг - антиген, Ат - антитело, ДМФА - диметилформамид, ПФИА - поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, ТГФ - тетрагидрофуран, N - число циклов измерений, к0 - константа скорости образования, кр - константа скорости разрушения, КЛф - константа аффинности, Кг - константа связывания трейсер-антитело

непосредственно в пробе, а с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров возможна регистрация образования гетерогенного иммунокомплекса практически в режиме реального времени Однако для определения изопротурона, алдрина, имидаклоприда, некоторых хлорацетанилидных пестицидов такие методы ранее практически не применялись

Поэтому проведение исследований, направленных на создание высокочувствительных, экспрессных и селективных методик определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и растительном сырье методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров актуально с научной и практической точки зрения

Настоящая работа является плановой научно-исследовательской работой кафедры химии ЛГТУ и поддержана грантом РФФИ № 06-03-96339_р_центр_а «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров», темпланом Минобрнауки РФ «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ», государственным контрактом № 02 444 11 7345 «.Способ определения бутахлора с помощью пъезокварцевого гшмуносенсора»

Цель исследования - изучение возможности применения гомогенного и гетерогенного иммунохимических методов анализа (поляризационный флуоресцентный иммуноанализ и пьезокварцевый иммуносенсор) и разработка методик определения ряда хлорорганических пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон) в объектах окружающей среды и пищевых продуктах

Для достижения поставленной цели было необходимо изучить методы иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на поверхности электродов пьезокварцевого сенсора,

исследовать аффинность и специфичность иммунореагентов, применяемых для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и при разработке пьезокварцевого иммуносенсора,

изучить влияние структуры синтезированных меченных флуоресцеином производные пестицидов (трейсеров) на аналитический сигнал в ПФИА,

исследовать кинетику гомогенной и гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело,

изучить влияние органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции,

оценить различные форматы иммуноанализа (конкурентный и сэндвич-анализ),

разработать методики определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с применением пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

Научная новизна работы:

показаны возможности и разработан общий подход конкурентного определения с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа хлорорганических пестицидов (ацетохлор, алахлор, бутахлор, алдрин, имидаклоприд),

определены условия формирования многослойных биорецепторных покрытий сенсоров, предназначенных для детектирования ацетохлора, бутахлора, алахлора, алдрина, имидаклоприда, характеризующихся высокой доступностью активных сайтов связывания, устойчивостью и невысокой массой,

показано влияние состава рецепторных покрытий на величину аналитического сигнала иммуносенсора при определении ряда хлорорганических пестицидов,

обоснованы условия применения сэндвич-анализа для высокочувствительного определения алдрина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора,

изучены особенности протекания гетерогенной иммунохимической реакции в присутствии органических растворителей и возможность применения экстракционных систем на основе гидрофильных растворителей для снижения предела обнаружения алдрина,

исследовано влияние структуры и природы трейсеров, применяемых при разработке методики ПФИА для определения алахлора, алдрина, изопротурона, на аналитический сигнал и ширину линейного диапазона Практическая значимость:

разработаны новые методики определения ряда хлорорганических пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа,

установлены константы аффинности, позволившие выбрать иммунореагенты для высокочувствительного и селективного определения пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон),

предложены способы получения биорецепторного покрытия сенсора для высокочувствительного и селективного определения хлорорганических пестицидов,

предложена экстракционная система на основе ДМФА, позволившая существенно снизить предел обнаружения алдрина,

оптимизирован алгоритм определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в режиме "dip and dry",

показано влияние структуры и природы трейсера на возможность определения пестицидов методом ПФИА

Научная новизна способа определения ацетохлора, бутахлора, алахлора с помощью пьезокварцевого иммуносенсора подтверждена положительным решением о выдаче патента (заявка № 2007112327/04(013387))

На защиту выносятся:

результаты исследования влияния способов иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на чувствительность определения пестицидов,

результаты кинетических и аффинных исследований гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности иммуносенсора и гомогенной иммунохимической реакции в растворе, сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-форматов анализа при определении алдрина,

зависимость аналитического сигнала и интервала определяемых содержаний алахлора, изопротурона, алдрина от структуры синтезированных флуоресцентных производных пестицидов при проведении поляризационного флуоресцентного иммуно'анализа,

результаты исследования влияния органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора,

методики определения пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора (ацетохлор, бутахлор, алахлор, имидаклоприд, алдрин) и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (алахлор, алдрин, изопротурон)

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации изложены на V Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), Региональной конференции «Внедрение в производство «чистых» технологий» (Липецк, 2005), Международных конференциях молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006», «Ломоносов-2007», «Ломоносов-2008» (Москва), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006), International Congress ICAS (Moscow, 2006), Всероссийской студенческой научно-технической конференции «Инженерные науки - защите окружающей среды» (Тула, 2006), VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2006» (Самара, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), XVII Российской Молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Краснодар, 2007), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007)

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 2 статьях, 17 тезисах докладов

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает 35 рисунков и 21 таблицу

Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 201 ссылку

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведена классификация и подчеркнута токсичность хлорорганических пестицидов, в том числе соединений, которые далее исследовались в диссертационной работе Дан критический анализ современных методов определения пестицидов с акцентом на известные хроматографические и иммунохимические методы Показано преимущество иммунохимических методов анализа, в частности, гомогенного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и иммуносенсорных технологий для контроля за содержанием пестицидов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах, растительном сырье

ОБЪЕКТЫ, ПРИБОРЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования выбраны (рис 1) ацетохлор

(гербицид «Трофи», Россия), бутахлор, алахлор («НеваЛаб», Россия),

изопротурон, алдрин ("Бщта-АЫпсЬ", США), имидаклоприд (ООО «Хромресурс», Россия)

н,с

CI

Ацетохлор (Ас) N—N0,

л

XX w

Бутахлор (But)

Алахлор (Ala)

Н,с

Н,С

\\ /

СН3

м

сн,

Имидаклоприд (Im) Алдрин (Aid) Изопротурон (1р)

Рис 1 Структурные формулы исследуемых пестицидов

Использованы следующие органические растворители - метанол (х ч, ОАО «Метафракс», Россия), этанол, диметилформамид, ацетон, хлороформ, тетрагидрофуран (х ч, «Реахим», Россия), ацетонитрил (о с ч , "Química", Испания) В качестве кросс-реагентов применяли глутаровый альдегид ("Reanal", Венгрия), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид, N-гидроксисукцинимид, ("Sigma-Aldnch", Германия), неорганические соли - NaCl, KCl, Na2HP04 I2H2O, КН2Р04 (хч

«Реахим», Россия) и органические реактивы - цистеамин, конканавалин А ("Sigma-Aldnch", Германия).

В работе применяли следующие иммунореагенты гаптен-белковые конъюгаты, полученные пришивкой аналита или его структурного аналога к белковой молекуле непосредственно (AlaMPA-BSA, AMPA-BSA, ВМРА-BSA, AlaMPA-STI, AMPA-STI, BMPA-STI, C4-BSA, C4-STI) или с помощью кросс-реагента (5A2-Cpy-GA-BSA, 5A2-Cpy-CC-BSA, 5A2-Cpy-GA-OVA, 5A2-Cpy-CC-OVA) Использованы овечьи сыворотки, содержащие поликлональные антитела к алахлору (Anti-Alachlor), кроличьи сыворотки, содержащие поликлональные антитела к ацетохлору (Anti-Ac-BSA Lot7, Anti-Ac-BSA Lot6) и бутахлору (Lora 3/4 Ant-BMPA-BSA), изопротурону (Anti-IP S41/B2), алдрину (Anti-Aldrin Rabbit), имидаклоприду (Anti-5A2-Cpy-CC-STT, Anti-5A2-Cpy-GA-STI), сульфатированный полисахарид каррагинан (фракция с содержанием сульфатных групп в диапазоне 20 -27%), выделенный из дальневосточных красных морских водорослей Floridae

Синтез трейсеров осуществляли карбодиимидным методом Очистку реакционной смеси осуществляли на пластинах для тонкослойной хроматографии "Silufol" (Чехия)

Приведена методика определения пестицидов в режимах "dip and dry" и проточно-инжекционном, описаны установки, применяемые для измерения аналитического сигнала сенсора В качестве сенсоров использовали пьезокварцевые резонаторы АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц с золотыми или серебряными электродами (ЗАО «ЭТНА», ОАО «Квант», Россия) с закрепленным на поверхности биорецепторным слоем

Для измерения поляризации флуоресценции использовали TDX-анализатор ("Abbott", США) В работе использованы спектрофотометр "Shimadzu UV-1602" (Shimadzu, Япония) и фотометр «Эксперт-003» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия)

Описана методика расчета констант скоростей образования и разрушения иммунокомплекса и констант аффинности, методики пробоподготовки объектов окружающей среды и пищевых продуктов

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение закономерностей гетерогенной иммунохимической реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора

Аналитическим сигналом гравиметрического пьезокварцевого иммуносенсора служит изменение частоты колебаний при образовании поверхностного иммунокомплекса за счет взаимодействия антигенов, иммобилизованных на поверхности его электродов, с антителами, присутствующими в растворе

На полноту протекания гетерогенной иммунохимической реакции существенное влияние оказывает способ иммобилизации рецепторных

молекул, обеспечивающий доступность активных сайтов связывания и продолжительность эксплуатации в жидких средах, природа применяемых биореагентов, влияющая на прочность образующегося иммунокомплекса, а также условия проведения реакции (стационарные или равновесные)

Влияние способа иммобилизации на качество биорецепторного покрытия сенсора. Для определения низкомолекулярных пестицидов на поверхности пьезокварцевого сенсора иммобилизовали гаптен-белковые конъюгаты или производные аналита Изучена возможность формирования многослойных покрытий, включающих получение подложки, прочно связанной с металлической поверхностью электрода резонатора, и пришивку биомолекул с помощью бифункциональных реагентов (табл 1)

Таблица 1 Способы получения рецепторного покрытия пьезокварцевого сенсора___

№ способа Подложка Кросс-реагент, условия иммобилизации Рецепторные молекулы

1 APTS GA, 30 мин Гаптен-белковый конъюгат

2 APTS DCC в С2Н5ОН, УФ-облучение, 60 мин Меркаптопропионовое производное хлорорганического пестицида

3 APTS NHS в С2Н5ОН, УФ-облучение, 60 мин Меркаптопропионовое производное хлорорганического пестицида

4 Конканавалин А 2 ч при комнатной температуре Гаптен-белковый конъюгат

5 Цистеамин (Ag-электрод) EDAC, 20 мин Гаптен-белковый конъюгат

6 Цистеамин (Аи-электрод) EDAC, 20 мин Гаптен-белковый конъюгат

7 Сульфатированный полисахарид GA, 20 мин Гаптен-белковый конъюгат

Методом пьезокварцевого микровзвешивания (табл 2) исследовано влияние природы подложки, применяемого кросс-реагента и технологии получения покрытия на аналитические характеристики сенсоров Регистрация послойного увеличения массы, определение интегральной массовой и концентрационной чувствительности позволили оценить емкость биорецепторного слоя по отношению к определяемому пестициду, возможность определения анализируемых соединений на уровне ПДК и ниже

Таблица 2 Характеристики покрытий сенсоров для определения ацетохлора

№ п/п Дшпл, мкг А£ Гц N

1 11,4 186±15 493,6 32,5 30

2 5,4 150±10 398,1 55,3 20

3 4,2 100±7 265,3 47,4 20

4 13,5 9±3 23,9 1,3 5

5 24,9 13±6 34,4 1,0 15

6 24,5 19±2 .50,3 1,6 17

7 23,8 131±9 104,8 11,0 21

Наиболее прочную связь с металлическим электродом обеспечивают покрытия на основе АРТБ, имеющие максимальное значение Яс и 5га за счет образования на поверхности модификатора стерически доступных аминогрупп, к которым пришиваются биомолекулы Природа бифункционального реагента существенно влияет на свойства получаемого рецепторного слоя Использование глутарового альдегида (способ 1) способствует получению гидролитически устойчивого биослоя на основе гаптен-белкового конъюгата вследствие образования прочных связей между аминогруппами АРТ8 и карбонильными группами глутарового альдегида, поэтому на модифицированных таким образом резонаторах возможно проведение до 30 циклов измерений без разрушения рецепторного слоя В то же время, высокая масса биослоя сужает диапазон определяемых концентраций токсикантов до 2 порядков

При применении в качестве кросс-реагентов дициклогексилкарбодиимида (способ 2) и Ы-гидроксисукцинимида (способ 3) получены покрытия на основе гаптенмеркаптопропионовой кислоты Связь между аминогруппами подложки на основе АРТБ и карбонильными группами рецепторной молекулы образуется только под действием УФ-излучения

При этом существенно сокращается продолжительность процесса иммобилизации (с 12 ч до 1 ч) Несмотря на то, что в этом случае снижается значение величина характеризующая удельную концентрацию функциональных групп в поверхностном слое, превышает соответствующее значение для способа 1 вследствие более низкой массы биослоя, Что связано с отсутствием на поверхности белковых молекул В то же время, покрытие на основе гаптен-белковых конъюгатов более устойчиво и позволяет определять ацетохлор с более высокой чувствительностью (предел обнаружения 0,02 нг/мл - способ 1, 0,8 нг/мл - способы 2,3)

На слое конканавалина А (способ 4) гаптен-белковые конъюгаты закрепляли непосредственно без применения кросс-реагента Достоинством

этого способа является меньшая продолжительность и трудоемкость, а к недостаткам следует отнести относительно высокую массу, толщину модификатора и невысокую устойчивость при эксплуатации в жидких средах, что ограничивает применение таких покрытий при определении остаточных количеств пестицидов

При получении подложки на основе цистеамина как на серебряных, так и на золотых электродах (способ 5, 6) и закреплении гаптен-белкового конъюгата с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида не удается получить биорецепторный слой с высокой концентрацией доступных активных сайтов связывания, что подтверждается почти в 10 раз более низким значением аналитического сигнала при определении ацетохлора (по сравнению со способом 1) Однако такое покрытие достаточно устойчиво при длительной эксплуатации в жидких средах

Применение в качестве подложки сульфатированных полисахаридов, содержащих не менее 20% сульфатных групп, приводит к получению устойчивого покрытия (21 цикл измерений) Увеличение содержания сульфатных групп в диапазоне 20 — 27% не оказывает существенного влияния на удельную емкость и чувствительность биослоя на основе гаптен-белкового конъюгата Более высокая адгезия полисахаридов к металлу по сравнению с конканавалином А может быть связана с линейным строением макромолекул и, следовательно, с большей доступностью сульфатных групп по сравнению с белковыми молекулами, у которых часть дисульфидных связей локализована внутри глобул

Исследование аффинности иммунореагентов. Определение значений констант скорости прямой и обратной реакций, а так же величин констант аффинности иммунореагентов имеет важнейшее значение, позволяющее управлять аналитическим процессом, влиять на чувствительность и селективность определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора Комплементарные пары иммунореагентов выбирали с учетом значения константы аффинности КАф, рассчитанной по методу Скэтчарда, как отношение констант скоростей образования и разрушения иммунокомплекса (табл 3)

Самое эффективное аффинное взаимодействие отмечено для следующих пар иммунореагентов 5A2-Cpy-CC-BSA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI и 5А2-Сру-CC-OVA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI, для которых наряду с высоким значением к0 характерно и самое низкое значение кр Такая закономерность характерна для пар иммунореагентов, при синтезе которых использованы кросс-реагенты СС и GA, белковая же молекула в составе конъюгата практически не влияет на величину КЛф Применение хлорацетанилид-белкового конъюгата без линкера, содержащего молекулу STI, приводит к более высокому значению КЛф по сравнению конъюгатом на основе BSA, что вероятно, связано с большей молекулярной массой и более объемной структурой BSA по сравнению с STI В тоже время присоединение BSA к гаптену через линкер, способствует возрастанию Клф, в то время как, пришивка STI через линкер снижает Клф Аффинность иммунореагентов,

применяемых для определения алахлора, в первую очередь зависит от структуры гаптена, в то время как природа линкера не влияет на сродство иммунореагентов Следует также отметить, что для реакций между гомологичными реагентами К^ф на 1-2 порядка выше по сравнению с аналогичными величинами для гетерологичных реагентов

Таблица 3 Значения константы аффинности для различных гаптен-белковых конъюгатов

Пара иммунореагентов ко, моль'1 л с'1 k„,cl .. КАф, моль"1 л

Ацетохлор

AMPA-BSA + Anti-Ac 1,4 10s 3,8 10"1 3,5 108

AMPA-BSA + Anti-Ac Lot5 3,1 107 2,4 10"2 1,3 109

AMPA-BSA + Anti-Ac Lot6 4,16 10" 2,3 10"2 1,8 10"

AMPA-BSA + Anti-Ac Lot7 0,7 107 6,0 10"3 1,2 10"

Бутахлор

BMPA-BSA + Ant-BMPA-BSA 0,9 107 1,4 10"2 6,8 108

BMPA-STI + Ant-BMP A-STI 8,1 10" 1,9 10"1 4,3 1012

Алахлор

C4-BSA + Anti-Alachlor 0,1 107 2,9 10"2 0,3 108

C4-STI + Anti-Alachlor 1,3 108 8,0 10"2 16,1 10s

Ala-MP A-STI + Anti-AIachlor 0,7 107 5,5 10"2 1,3 108

Ala-MPA-BSA +Anti-Alachlor 1,8 107 4,7 10"2 3,8 108

Имидаклоприд

5A2-Cpy-GA-OVA + Anti-5A2-Cpy-CC-STI 1,2 107 5,0 10"5 2,5 10"

5A2-Cpy-GA-OVA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI 6,2 108 8,0 10"4 7,7 10"

5A2-Cpy-CC-BSA + Anti-5A2-Cpy-CC-STT 4,5 105 0,1 4,1 106

5A2-Cpy-CC-BSA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI 2,1 109 3,9 10"5 5,5 1013

5A2-Cpy-GA-BSA + Anti-5A2-Cpy-CC-STI 0,2 107 2,0 10"6 1,0 1012

5A2-Cpy-CC-OVA + Anti-5A2-Cpy-GA-STI 4,7 108 1,2 10"5 3,9 1013

Алдрин

С A-B S A+Anti-Aldrin-Rabbit 1,8 10J 2,0 10"5 9,0 10'

CA-THY+Anti-Aldrin-Rabbit 3,0 104 3,0 m" 1,0 109

EP-BSA+Anti-Aldnn-Rabbit 3,7 105 7,6 10-5 4,9 10"

EP-BSA+LIB-CCD 2 2 Mab 3,4 108 1,0 10"2 3,2 10IU

EP-BSA+LIB-CCD 2 4 Mab 3,5 10' 1,7 10~4 2,0 10"

EP-BSA+LIB-CCD 2 5 Mab 5,2 107 3,0 10"4 1,7 10"

Установлена взаимосвязь константы аффинности с пределом обнаружения (табл 4) При применении иммунореагентов с КЛф порядка 1012 моль"1 л удается обнаруживать присутствие пестицидов на уровне 103 нг/мл

Таблица 4 Взаимосвязь предела обнаружения ацетохлора и бутахлора и константы аффинности_

Определяемое соединение Пара иммунореагентов КАф, М"' Стш, нг/мл

Ацетохлор АМРА-В8А + Апй Ас Ьо1б 1,8 10" 2 Ю-2

АМРА-В8А + Апй Ас 3,5 108 8 10"2

Бутахлор ВМРА-8Т1 + Ап1-ВМРА-8Т1 4,3 1012 2 10"3

ВМРА-В5А + АШ-ВМРА-В8А 6,8 108 5 10'2

Практически для всех исследованных иммунореагентов наблюдается снижение предела обнаружения пестицида с увеличением константы аффинности, то есть значение Каф характеризует не только прочность образуемого гетерогенного комплекса, но также может быть использовано в аналитической практике для прогнозирования предела обнаружения токсикантов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров

Поскольку применяемые в работе поликлонапьные антитела способны к перекрестным взаимодействиям со структурными аналогами, что может способствовать появлению ложных откликов, и, следовательно, снижению надежности определения целевого аналита в сложных матрицах, оценена перекрестная реактивность с помощью коэффициента перекрестного реагирования (ПР,%) со структурными аналогами (хлорацетанилидные гербициды, циклодиеновые инсектициды), продуктами деградации или веществами, которые могут присутствовать в пробе как побочные продукты синтеза (имидаклоприд), по отношению к определяемому соединению (табл 5)

ПР,% = 1С50(аишюО Ю0/1С5О(аналит), где 1С50 — концентрация, соответствующая 50%-ому ингибированию связывания соответствующего соединения

Было установлено, что поликлонапьные антитела против хлорацетанилидных гербицидов, неоникотиновых инсектицидов и циклодиеновых пестицидов характеризуются высокой специфичностью значения ПР, % не превышают 1 - 20% и даже в системе, содержащей равные концентрации, двух-, четырех-, восьми-, десятикратный избыток мешающего компонента в растворе, сохраняют постоянное значение Такие значения ПР,% приводят к заключению, что применяемые поликлональные антитела, выработаны на всю молекулу пестицида, а не на ее отдельные фрагменты

Таблица 5 Коэффициенты перекрестного реагирования циклодиеновых инсектицидов_

Пара иммунореагентов Соединение ПР, % Пара иммунореагентов Соединение ПР, %

с Алдрин 100,0 Алдрин 100,0

•а Гептахлор 9,2 РЭ Гептахлор 92

< Диалдрин 9,1 Диалдрин 93

«1 + (2 < Андрин 8,0 + т Андрин 99

Эндосульфан 8,5 ° п и Я Эндосульфа! 85

Эндосульфан 9,3 Эндосульфа! 91

сл И 1 & м диол > диол

Эндосульфан сульфат 19,9 о Эндосульфа! сульфат 80

Напротив, в случае необходимости оценки степени загрязнения образцов не одним токсикантом, а соединениями с близкими свойствами, была исследована возможность использования моноклональных антител, полученных к группе циклодиеновых пестицидов Коэффициент ПР, % в этом случае варьирует в интервале 80 - 100%, что свидетельствует о возможности применения этих антител для группового определения (табл 5) Поликлональные антитела, напротив, позволяют детектировать индивидуальное соединение в сложной пробе

Сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-форматов анализа при определении алдрина. Наибольший интерес при определении низкомолекулярных соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора представляют конкурентный и сэндвич-форматы анализа

При проведении анализа в конкурентном формате в анализируемую пробу, содержащую аналит, вводили фиксированное количество антител и выдерживали до образования гомогенного иммунокомплекса При контакте полученной пробы с биорецепторным слоем непрореагировавшие антитела взаимодействовали с иммобилизованными на поверхности электрода сенсора гаптен-белковыми конъюгатами с образованием поверхностного иммунокомплекса

Сэндвич-анализ осуществляли в две стадии Первая аналогична описанной для конкурентного формата, а на второй, при введении в пробу вторичных антител, формировали двойной иммунокомплекс с частью первичных антител, входящих в состав поверхностного иммунокомплекса

Регистрируемый аналитический сигнал сенсора в обоих случаях обратно пропорционален концентрации анализируемого соединения в пробе

Сравнение аналитических характеристик определения пестицидов в конкурентном и сэндвич-форматах (табл 6) показало, что наблюдается повышение чувствительности по сравнению с конкурентным режимом, в то же время интервал определяемых содержаний сохраняется постоянным

Таблица 6 Сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-анализа

Формат анализа Линейный диапазон, мкг/мл Опт. НГ/МЛ

Конкурентный 0,1-1,0 20,0

Сэндвич-анализ 0,1-1,0 9,0

Достоинством первого варианта анализа является меньшая продолжительность проведения определений вследствие меньшего числа стадий Применение же вторичных антител способствует повышению аналитического сигнала сенсора, связанного с утяжелением массы биорецепторного слоя вследствие образования вторичного иммунокомплекса и специфичности определений, особенно в случае применения поликлональных антител различной аффинности

Исследование влияния органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции

Поскольку гидрофильные органические растворители неоднозначно влияют на полноту протекания иммунохимической реакции исследовано влияния его природы и концентрации на эффективность взаимодействия конъюгатов хлорорганических пестицидов с соответствующими антителами Для этого изучено влияние природы и концентрации органического растворителя на аффинное взаимодействие антиген-антитело, условия выделения в самостоятельную фазу, количественные характеристики экстракции пестицидов в системах на основе гидрофильных растворителей, влияние количества высаливателя, присутствующего в экстракционной системе на сродство и константу аффинности иммунореагентов, обосновано соотношение объемов органического концентрата и фосфатного буферного раствора в пробе при проведении анализа

Кинетические характеристики иммунохимической реакции и константа аффинности иммунореагентов в присутствии органического растворителя позволили установить, что при увеличении содержания ацетонитрила на каждые 5 об % КАф снижается на порядок Присутствие диметилформамида в количестве свыше 5 об % способствует на порядок увеличению КАф Введение тетрагидрофурана не влияет на эффективность аффинного взаимодействия

Таким образом, выполненные исследования показывают, что введение в систему диметилформамида и тетрагидрофурана в концентрациях до 20 об % и ацетонитрила, в концентрациях до 5 об % не изменяет эффективность иммунохимического взаимодействивя и, следовательно, они могут быть использованы для экстракционного концентрирования пестицидов и последующего их определения непосредственно в органическом концентрате

Расчет КАф в системах, содержащих различное соотношение фосфатного буферного раствора и «органической» фазы показал негативное влияние на величину константы аффинности высаливателя -значение константы в системах на основе ДМФА снижается до 1,3-108 М-1. Однако и в этом случае КЛф возможно определения алдрина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора на уровне 20 мкг/мл.

Изменение соотношения объемов раствора PBS и органического концентрата на стадии пробоподготовки позволяет осуществлять дополнительное концентрирование определяемого соединения (рис. 2).

Д£ Гц

Cat (Anti-Aidrin Rabbit) = 20 мкг/мл - const

12 3 4

Рис. 2. Зависимость аналитического сигнала от отношения объемов РВБюрганический концентрат (мкл) для экстракционной системы ДМФА-Н20-К2С03:

1 -990:10; 2 -950:50; 3 - 900:100; 4 - 800:200.

При добавлении к 800 мкл PBS 200 мкл органического концентрата, полученного при применении экстракционной системы ДМФА-Н2О-К2СО3 наблюдается снижение предела обнаружения алдрина с 20 мкг/мл (без экстракции) до 0,5 мкг/мл, т.е. практически в 40 раз.

Изучение закономерностей гомогенной иммунохимической реакции

Условием поляризационного флуоресцентного иммуноанализа является возможность образования достаточно прочных иммунных комплексов между аналитом и антителами и трейсером и антителами. При этом должно выполняться условие КЛф>Кт на 1-2 порядка, поскольку, с одной стороны, антитела должны связаться в комплекс с гаптеном, меченым флуоресцентной меткой (Ат...Аг*), что обеспечивает измерение аналитического сигнала, а с другой стороны, при введении аналита, образовавшийся комплекс должен разрушиться для образования более прочного комплекса с ним Ат... Аг.

В работе использовали поликлональные (алахлор, изопротурон) и моноклональные (циклодиеновые пестициды) антитела. Кинетическая зависимость, построенная в координатах Скэтчарда для поликлональных антител имеет вид гиперболы, что позволило рассчитать константу аффинности высоко- (К'Аф) и низко- (К"лф) аффинной фракций антител как тангенс угла наклона прямолинейных участков зависимости отношения

концентрации связанной в комплекс формы антигена к концентрации свободной от концентрации связанной формы (рис 3) Для моноклональных зависимость имеет вид прямой, позволяющей рассчитать средневесовую КАф

Рис 3 Определение констант аффинности высоко- и низкоаффинной фракций поликлональных антител

Константы аффинности высоко- и низкоаффинной фракции антител для алахлора различаются практически на 2 порядка, поэтому активность антител по отношению к определяемому аналиту оценивали по средневесовому значению константы аффинности (Ка) Константы связывания трейсер-антитело всех применяемых пар иммунореагентов различаются на порядок (табл 7), что указывает на образование более прочных комплексов между аналитом и антителами и разрушение комплекса трейсер-антитело при введении аналита Аналогичные закономерности, установленные для хлорорганических пестицидов, справедливы и для изопротурона

Таблица 7 Константы аффинности и константы трейсера применяемых пар иммунореагентов_____

Соединение Применяемые иммунореагенты V" л Аф ; м-1 &Аф м1' КА, М"1 Кт, М"!

Алахлор С4-ЕБР + Апи-А1асЫог 1,0 106 0,8 108 5,1 108 5,1 107

Алдрин ССБЬЕОР + ЫВ-СС02 4 МАЬ 4,2 108 6,1 108 2,3 107

Изопротурон 01-ЕБР + АпИ-ГР 841/В2 9,7 105 2,1 108 1,1 108 2,0 107

Таким образом, наилучшие параметры анализа обеспечивает использование гомологичных пар иммунореагентов для циклодиеновых пестицидов и изопротурона и гетерологичных для алахлора Гомологичные антитела обладают более высокой аффинностью по отношению как к трейсерам, так и к аналиту Наблюдается выигрыш в чувствительности определения пестицидов с гомологичными антителами по сравнению с гетерологичными в 5-10 раз

Применение иммунохимических методов анализа для определения

пестицидов

Разработаны методики определения хлорорганических пестицидов в различных объектах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (табл 8)

Аналит Уравнение градуировочной функции Диапазон определяемых содержаний, нг/мл Cmm, нг/мл

Пьезокварцевый иммуносенсор

Ацетохлор 4/" =-72с+ 165 5,0 10"2— 2,0 2,0 10"2

Алахлор Af = -102с + 180 5,0 10"2 — 2,0 2,0 10"2

Бутахлор Af = -110с + 450 0,1 Ю-2-4,0 2,0 10"3

Имидаклоприд Af -4085с + 1426 1,0 10"2-1,0 4,0 Ю-3

Имидаклоприд* Af = -99с + 1023 1,0-100,0 0,4

Алдрин Л/ = -176с + 247 100,0-1000,0 20,0

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ

Алахлор тР = -10 21пс + 95 2 10,0-100,0 8,0

Изопротурон тР =-12 41пс + 205 6 1,0- 100000,0 0,1

Алдрин тР = -5 line+ 142 9 1,0-1000000,0 0,8

Андрин тР = -10 91пс + 176 3 100,0- 10000,0 19,0

Гептахлор тР = -10 41пс +185 0 100,0-10000,0 49,3

Эндосульфан сульфат m.P = -14.1Inc + 227 0 1000,0- 100000,0 348,4

Эндосульфан тР = -\Ъ 21пс + 206 5 100,0- 100000,0 54,4

Эндосульфан диол тР = -11 41пс + 1907 100,0- 100000,0 58,4

Диалдрин тР = -6 41пс + 156 3 1,0- 1000000,0 0,6

- анализ осуществляли в проточно-инжекционном режиме

Оптимизирована методика определения пестицидов методом "dip and dry", включающая нанесение пробы объемом 5-10 мкл на поверхность электрода, выдерживание в течение 2 мин до завершения иммунохимической реакции, промывание фосфатным буферным раствором для удаления несвязавшихся иммунореагентов, высушивание в токе теплого воздуха до постоянной массы и измерение аналитического сигнала Активность рецепторной поверхности восстанавливается при применении регенерирующего раствора, что позволяет осуществлять до 30 измерений на

одном сенсоре Такой алгоритм выполнения определений позволяет снизить расход иммунореагентов и повысить экспрессность определения

Сравнительная характеристика определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в проточно-инжекционном режиме и методом "dip and dry" показала, что во втором случае наблюдается на порядок более низкий предел обнаружения токсикантов

Правильность разработанных методик подтверждена методом "введено -найдено" Разработанные методики апробированы при определении пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах Методика определения имидаклоприда в образцах картофеля с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, апробирована при анализе картофеля, реализуемого через коммерческие структуры Проанализированы образцы почв после внесения гербицида ацетохлора через 7 (проба 1), 20 (проба 2), 30 (проба 3) дней после внесения (табл 9), образцы риса производства Таиланд (№1), США (№2), Россия (№3)

Таблица 9 Определение хлорацетанилидных гербицидов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды (п=3, Р=0,95) ___

Объект исследования, ПДК, нг/г № пробы С применением пьезокварцевого иммуносенсора sr Методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа sr

Введено, нг/г Найдено, нг/г Рассчитано, нг/г

Введено, нг/г Найдено, нг/г

Ацетохлор

Молоко ПДК=0,02 1 460' 460±12 0,00±0,03 0,05 0,0"' 459±3 0,05

2 480* 482±18 2,00±0,07 0,03 1,0"* 460±8 0,01

3 500' 500±16 0,00±0,03 0,07 10,0"' 471 ±6 0,05

Яблочный сок ПДК=0,02 1 230" 230±8 0,00±0,03 0,05 0,0"* 230±5 0,08

2 240" 241±5 1,00±0,02 0,03 10,0*" 240±8 0,05

3 250" 250±4 0,00±0,02 0,07 100,0'" 330±10 0,04

Почва ОДК=0,5 1 0,00 2,50±0,04 2,50±0,04 0,04 0,0 0,5±0,1 0,04

2 0,00 1,40±0,07 1,40±0,07 0,03 0,3 0,7±0,1 0,05

3 0,00 0,50±0,07 0,50±0,07 0,03 0,5 1,0±0,1 0,07

Бутахлор

Рис ПДК=0,04 1 0,05 0,05±0,01 (2,0±0,2) 10"4 0,07 100 100±10 0,05

2 0,05 0,06±0,01 (6,5±0,7) 10"4 0,10 100 100±8 0,07

3 0,05 0,05±0,01 те обнаружен - 100 100±2 0,09

Алахлор

Колбасные изделия ПДК=0,02 1 0,50 0,81±0,03 0,31±0,01 0,05 100 Ю1±1 | 0,02

2 0,50 0,69±0,02 0,19±0,01 0,03 100 100±5 0,05

3 0,50 0,60±0,03 0,10±0,01 | 0,07 100 100±4 0,04

Примечание - предварительное разведение пробы в 200 раз, - предварительное разведение пробы в 100 раз, - предварительное разведение пробы в 5 раз Результаты определения ацетохлора в молоке и яблочном соке приведены в мг/мл

Правильность разработанных способов подтверждена методом "введено-найдено" Методами математической статистики установлено отсутствие систематической погрешности при определении гербицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа может быть рекомендован для предварительного экспрессного скрининга пищевых продуктов или количественного определения в сильно загрязненных образцах (время единичного измерения не превышает 10 мин) Методики определения с помощью пьезокварцевого иммуносенсора могут быть рекомендованы для чувствительного определения всех исследованных пестицидов на уровне ПДК и ниже

ВЫВОДЫ

1 Изучены многослойные способы получения биорецепторного покрытия иммуносенсора для определения ацетохлора, бутахлора, алахлора, алдрина, имидаклоприда, основанные на предварительном формировании силоксановой подложки с последующим закреплением с помощью кросс-реагентов гаптен-белковых конъюгатов или под действием УФ-излучения карбоксильных производных определяемых соединений Такие покрытия обеспечивают максимальный аналитический сигнал сенсора, широкий линейный диапазон определяемых содержаний и позволяют осуществлять до 20-30 циклов измерения без снижения метрологических характеристик

2 Показана зависимость константы аффинности иммунореагентов от структуры гаптена, природы белковой молекулы и их соединения для реакции, протекающей в растворе и на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора Показана взаимосвязь предела обнаружения и константы аффинности, позволяющие использовать значение Кдф для прогнозирования предела обнаружения токсикантов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора величина КАф порядка 1012 моль'1 л обеспечивает определение бутахлора на уровне 2 10'3 нг/мл, а КАф порядка 108 моль'1 л позволяет определять 5 10"2 нг/мл

3 Оценена специфичность поли- и моноклональных антител к определяемым пестицидам, их структурным аналогам и продуктам деградации Показана возможность применения моноклональных антител для группового определения циклодиеновых инсектицидов и поликлональных - для высокоспецифичного определения индивидуальных пестицидов в сложных по составу матрицах

4 Теоретически обосновано и практически изучено влияние природы и концентрации органического растворителя на эффективность аффинных взаимодействий на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора Показана возможность предварительного экстракционного концентрирования алдрина методом жидкостной экстракции

диметилформамидом в присутствии высаливателя с последующим анализом непосредственно органического концентрата

5 Оптимизированы условия конкурентного определения пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд) методом "dip and dry" в жидких средах на уровне 0,002 - 20 нг/мл Отмечено повышение чувствительности и селективности определения алдрина в сэндвич-формате по сравнению с конкурентным режимом (предел обнаружения снижается с 20 до 9 нг/мл)

6 Разработаны методики селективного определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с применением пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, характеризующиеся экспрессностью (метод ПФИА) и высокой чувствительностью (пьезокварцевый иммуносенсор)

Работы, опубликованные по теме диссертации

1 Нартова, Ю В Пьезокварцевый иммуносенсор для определения ацето-хлора в водных средах [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, Т Н Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы - 2006 т 6 -Вып 5 - С 764-772

2 Нартова, Ю В Определение алахлора в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа [Текст] / Ю В Нартова, Т Н Ермолаева, М Р Флейшер, Р Абукнеша, С А Еремин // Журн аналит хим - 2008 - Т 63 - №5 - С 546 - 553

3 Нартова, Ю В Способ определения бутахлора с помощью пьезокварцевого иммуносенсора [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, Т Н Ермолаева // Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии Рос школа-конференция молодых ученых сб трудов - Пущино ИБФМ РАН, 2006 - С 68-70

4 Нартова Ю В Изучение деградации хлорацетанилидных гербицидов в почве [Текст] / Ю В Нартова, Т Н Ермолаева // Внедрение в производство «чистых» технологий сб научных трудов - Липецк, 2005 - С 54 -56

5 Нартова, Ю В Пьезокварцевый иммуносенсор для определения хлорацетанилидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, Т Н Ермолаева // Инженерные науки - защите окружающей среды Всерос студ науч-техн школы-конф сб трудов Тула, 2006 - С 140-144

6 Нартова, Ю В Тест-способ определения ацетохлора в жидких средах [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, Т Н Ермолаева // Экология ЦЧО РФ -2005 -№2(15) - С 35-38

7 Нартова, Ю В Гибридный метод определения хлорацетанилидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, Т Н Ермолаева // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии V Всерос конф молодых ученых тез докл - Саратов, 2005 - С 67

8 Нартова, Ю В Проточно-инжекционное определение сульфопрепара-тов и пестицидов в органических концентратах [Текст] / Ю В Нартова, ИВ Неробеева, ЕВ Мелихова, ЕН Калмыкова, ТН Ермолаева // Экстракция органических соединений III Международ конф тез докл - Воронеж, 2005 - С 308

9 Нартова, Ю В Пьезокварцевый иммуносенсор для определения хлор-ацетанилидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова // Ломоносов-2006 международ конф молодых ученых по фундаментальным наукам тез докл - Москва, 2006 - С 35

10 NartovaYuV Immunochemical Method of Détermination of chloracetam-lidic herbicides in the environmental objects [Text] / Yu V Nartova, S A Eremin, T N Ermolaeva // The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 Booc of abstracts -Moscow, 2006 - Vol II -P 359

11 Нартова, Ю В Пьезокварцевый иммуносенсор для определения хлор-ацетанилидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, T H Ермолаева // Экоаналитика-2006 VI Всерос конф тез докл Самара, 2006 - С 219

12 Сазонова Ю А Исследование способов иммобилизации ацетохлора на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора [Текст] / Ю А Сазонова, Ю В Нартова // Повышение эффективности металлургического производства XV Обл науч-техн конф тез докл - Липецк, 2006 - С 21

13 Калмыкова, Е H Применение сульфатированных полисахаридов для формирования биораспознающего слоя пьезокварцевых иммуносенсо-ров [Текст] / Е H Калмыкова, Ю В Нартова, T H Ермолаева // Химия и технология растительных веществ IV Всерос науч конф тез докл -Сыктывкар, 2006 - С 249

14 Нартова, Ю В Иммунохимические методы определения хлорацетани-лидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова // Ломоносов-2007 международ конф молодых ученых по фундаментальным наукам тез докл -Москва, 2007 - С 39

15 Нартова, Ю В Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения хлор-ацетанилидных гербицидов [Текст] / Ю В Нартова, С А Еремин, T H Ермолаева // Проблемы теоретической и экспериментальной химии XVII Рос Молодежной науч конф тез докл - Екатеринбург, 2007 -С 118-119

16 Нартова, Ю В Иммунохимические методы определения токсикантов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах [Текст] / Ю В Нартова, Е С Дергунова, С А Еремин, T H Ермолаева // Аналитика России 2007 II Всерос конф по анал химии тез докл - Краснодар, 2007 -С 263

17 Нартова, Ю В Современные иммунохимические методы определения пестицидов и эндокринных деструкторов [Текст] / Ю В Нартова, Е С Дергунова, С А Еремин, T H Ермолаева // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии тез докл - Москва, 2007 - С 188

18 Нартова, Ю В Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ ала-хлора в пищевых продуктах [Текст] / Ю В Нартова, Т Н Ермолаева, М Р Флейшер, Р Абукнеша, С А Еремин // Состояние здоровья населения ЦФО Актуальные проблемы неврологии: XX Межрегион науч -практ конф тез. докл. - Липецк, 2007. - С 426. 19. Фадеева, И.В. Пьезокварцевый иммуносенсор для определения алдрина в пищевых продуктах [Текст] /ИВ Фадеева, Ю В Нартова // Ломоно-сов-2008' международ, конф молодых ученых по фундаментальным наукам тез. докл - Москва, 2008 - С 71

Работы №1,2 опубликованы в изданиях, входящих в список ВАК

Автор благодарит начальника Липецкого областного бюро судебно-медицинской экспертизы Флейшера MP, R Abuknesha (King's College University of London), дбн Мягкову MA (Институт физиологически активных веществ РАН), кбн Жердева А В (Институт биохимии им АН Баха РАН), G Bonwick (University College Chester, UK), дбн Комарова A A (Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов), дхн Ермак ИМ (Тихоокеанский институт биоорганической химии РАН) за предоставленные иммунореагенты, Шрама ДА за оказанную техническую помощь, кхн, доц Мелихову Е В, студентов Фадееву ИВ, Щербинину ДА , Андрееву ГА , Косенкову ЕЕ за помощь при проведении исследований

Подписано в печать 04 05. 2008г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Ризография Уел печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ №360 ГОУ ВПО «Липецкий государственный технический университет» Типография ЛГТУ 398600 г Липецк, ул Московская, 30

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ СТРУКТУРА РАБОТЫ

I. Обзор литературы

1.1. Классификация пестицидов

1.2. Современные методы определения пестицидов

1.2.1. Инструментальные методы определения пестицидов

1.2.2. Иммунохимические методы определения пестицидов

II. Экспериментальная часть

11.1. Проведение измерений с применением пьезокварцевого 35 иммуносенсора

11.2. Проведение измерений методом поляризационного 41 флуоресцентного иммуноанализа

11.3. Исследование влияния органического растворителя

11.4. Пробоподготовка образцов для анализа

III. Изучение закономерностей гетерогенной иммунохимической 48 реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора

III. 1. Влияние способа иммобилизации на свойства биорецепторного покрытия сенсора

111.2. Кинетические исследования иммунохимических реакций 54 антиген-антитело

111.3. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту 60 протекания иммунохимических реакций

111.4. Исследование специфичности иммунореагентов

111.5. Сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич- 68 форматов анализа

IV. Изучение закономерностей гомогенной иммунохимической реакции 75 IV. 1. Влияние структуры иммунореагентов на характеристики

ПФИА пестицидов IV.2. Исследование кинетических закономерностей ПФИА пестицидов

V. Исследование влияния органического растворителя на полноту 88 протекания иммунохимической реакции

VI. Применение иммунохимических методов анализа для определения 97 пестицидов

VI. 1. Оптимизация условий определения пестицидов методом "dip 97 and dry"

VI.2. Определение пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора

VI.3. Сравнение методик определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа ВЫВОДЫ

Актуальность. Проблема безопасности пищевых продуктов и сельскохозяйственного сырья является основным фактором, определяющим здоровье людей и сохранение генофонда. Поэтому обостряются вопросы, связанные с объективностью контроля качества пищевых продуктов, кормов, продукции растениеводства и животноводства, в частности, с определением пестицидов, способных аккумулироваться в почве, воде, сырье и продуктах его переработки. Наибольшей токсичностью характеризуются хлорорганические пестициды и продукты их метаболизма, отнесенные к стойким органическим загрязнителям из-за трудности деградации. Некоторые представители этого класса запрещены к применению, но продолжают использоваться (алдрин и др.). Проблема контроля содержания пестицидов в объектах окружающей среды и пищевой продукции является сложной аналитической задачей, связанной с низкими концентрациями токсикантов и сложными процессами взаимодействия их с компонентами пробы. Среди инструментальных методов контроля хлорорганических пестицидов наибольшее распространение находят хроматографические методы, обязательно включающие сложные способы пробоподготовки методами твердофазной, жидкостной или сверхкритической флюидной экстракции. К недостаткам известных хроматографических методик определения пестицидов следует отнести длительность анализа, необходимость тщательной очистки экстракта, не всегда удовлетворительную селективность и чувствительность, высокую стоимость оборудования.

Постоянное обновление перечня применяемых пестицидов требует разработки новых альтернативных методик определения токсикантов. Иммунохимические методы анализа, характеризующиеся высокой селективностью и чувствительностью, положительно зарекомендовали себя при определении следовых концентраций ряда пестицидов и других биологически активных соединений (БАС). Они основаны на гомогенном и гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обуславливает высокоспецифичное определение аналита в сложных матрицах. Так, метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа позволяет детектировать протекание иммунохимического взаимодействия непосредственно в пробе, а с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров возможна регистрация образования гетерогенного иммунокомплекса практически в режиме реального времени. Однако для определения изопротурона, алдрина, имидаклоприда, ряда хлорацетанилидных пестицидов такие методы ранее практически не применялись.

Поэтому проведение исследований, направленных на создание высокочувствительных, экспрессных и селективных методик определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и растительном сырье методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров актуально с научной и практической точки зрения.

Настоящая работа является плановой научно-исследовательской работой кафедры химии ЛГТУ и поддержана грантом РФФИ № 06-03-963 39рцентра «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на гшмунохгшических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров»; грантом 05-03-39024-ГФЕНа «Иммуноаналитические системы на основе тест-полосок и коллоидного золота для определения пестицидов»', темпланом Минобрнауки РФ «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ»; государственным контрактом № 02.444.11.7345 «Способ определения бутахлора с помощью пьезокварцевого иммуносенсоров.

Цель исследования - изучение возможности применения гомогенного и гетерогенного иммунохимических методов анализа (поляризационный флуоресцентный иммуноанализ и пьезокварцевый иммуносенсор) и разработка методик определения ряда хлорорганических пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон) в объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

- изучить методы иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на поверхности электродов пьезокварцевого сенсора;

- исследовать аффинность и специфичность иммунореагентов, применяемых для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа и при разработке пьезокварцевого иммуносенсора;

- синтезировать меченные флуоресцеином производные пестицидов (трейсеры) и изучить влияние структуры трейсера на аналитический сигнал в ПФИА;

- исследовать кинетику гомогенной и гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело;

- изучить влияние органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции;

- оценить различные форматы иммуноанализа (конкурентный и сэндвич-анализ);

- разработать методики определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с применением пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Научная новизна работы:

- разработан общий подход и показаны возможности конкурентного определения с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа хлорорганических пестицидов (ацетохлор, алахлор, бутахлор, алдрин, имидаклоприд);

- определены условия формирования многослойных биорецепторных покрытий сенсоров, предназначенных для детектирования ацетохлора, бутахлора, алахлора, алдрина, имидаклоприда, характеризующихся высокой доступностью активных сайтов связывания, устойчивостью и невысокой массой; показано влияние состава рецепторных покрытий на величину аналитического сигнала иммуносенсора при определении ряда хлорорганических пестицидов; обоснованы условия применения сэндвич-анализа для высокочувствительного определения алдрина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора; изучены особенности протекания гетерогенной иммунохимической реакции в присутствии органических растворителей и возможность применения экстракционных систем на основе гидрофильных растворителей для снижения предела обнаружения алдрина; исследовано влияние структуры и природы трейсеров, применяемых при разработке методики ПФИА для определения алахлора, алдрина, изопротурона, на аналитический сигнал и ширину линейного диапазона. Практическая значимость: разработаны новые методики определения ряда хлорорганических пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора и методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа; установлены константы аффинности, позволившие выбрать иммунореагенты для высокочувствительного и селективного определения пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд, изопротурон); предложены способы получения биорецепторного покрытия сенсора для высокочувствительного и селективного определения хлорорганических пестицидов; предложена экстракционная система на основе ДМФА, позволившая существенно снизить предел обнаружения алдрина; оптимизирован алгоритм определения пестицидов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в режиме "dip and dry"; показано влияние структуры и природы трейсера на возможность определения пестицидов методом ПФИА.

Научная новизна способа определения ацетохлора, бутахлора, алахлора с помощью пьезокварцевого иммуносенсора подтверждена положительным решением о выдаче патента (заявка № 2007112327/04(013387)). На защиту выносятся:

- результаты исследования влияния способов иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов и аналитов на чувствительность определения пестицидов;

- результаты кинетических и аффинных исследований гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности иммуносенсора и гомогенной иммунохимической реакции в растворе;

- зависимость аналитического сигнала и интервала определяемых содержаний алахлора, изопротурона, алдрина от структуры синтезированных флуоресцентных производных пестицидов при проведении поляризационного флуоресцентного иммуноанализа;

- сравнительная характеристика конкурентного и сэндвич-форматов анализа при определении алдрина;

- результаты исследования влияния органического растворителя на полноту протекания иммунохимической реакции на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора;

- экстракционные системы для эффективного извлечения и концентрирования алдрина из водной фазы;

- методики определения ряда хлорорганических пестицидов в режиме "dip and dry";

- методики определения пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с помощью пьезокварцевого иммуносенсора (ацетохлор, бутахлор, алахлор, имидаклоприд, алдрин) и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (алахлор, алдрин, изопротурон).

Апробация работы. Отдельные разделы диссертации изложены на V Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005); III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005); Региональной конференции «Внедрение в производство «чистых» технологий» (Липецк, 2005); Международных конференциях молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008); Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006); International Congress ICAS (Moscow, 2006); Всероссийской студенческой научно-технической конференции «Инженерные науки - защите окружающей среды» (Тула, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2006» (Самара, 2006); XV Областной научно-технической конференции «Повышение эффективности металлургического производства (Липецк, 2006); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); XVII Российской Молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007); II Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Краснодар, 2007); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 2 статьях, 17 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 35 рисунков и 21 таблицу. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 201 ссылку.

ВЫВОДЫ

1. Изучены многослойные способы получения биорецепторного покрытия иммуносенсора для определения ацетохлора, бутахлора, алахлора, алдрина, имидаклоприда, основанные на предварительном формировании силоксановой подложки с последующим закреплением с помощью кросс-реагентов гаптен-белковых конъюгатов или под действием УФ-излучения карбоксильных производных определяемых соединений. Такие покрытия обеспечивают максимальный аналитический сигнал сенсора, широкий линейный диапазон определяемых содержаний и позволяют осуществлять до 20-30 циклов измерения без снижения метрологических характеристик.

2. Показана зависимость константы аффинности иммунореагентов от структуры гаптена, природы белковой молекулы и их соединения для реакции, протекающей в растворе и на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора. Показана взаимосвязь предела обнаружения и константы аффинности, позволяющие использовать значение КАф для прогнозирования предела обнаружения токсикантов с помощью пьезокварцевого иммуносенсора.

3. Оценена специфичность поли- и моноклональных антител к определяемым пестицидам, их структурным аналогам и продуктам деградации. Показана возможность применения моноклональных антител для группового определения циклодиеновых инсектицидов и поликлональных — для высокоспсцифичного определения индивидуальных пестицидов в сложных по составу матрицах.

4. Практически изучено и теоретически обосновано влияние природы и концентрации органического растворителя на эффективность аффинных взаимодействий на поверхности пьезокварцевого иммуносенсора. Показана возможность предварительного экстракционного концентрирования алдрина методом жидкостной экстракции диметилформамидом в присутствии высаливателя с последующим анализом непосредственно органического концентрата.

5. Оптимизированы условйй конкурентного определения пестицидов (ацетохлор, бутахлор, алахлор, алдрин, имидаклоприд) методом "dip and dry" в жидких средах на уровне 0,002 - 20 нг/мл. Отмечено повышение чувствительности и селективности определения алдрина в сэндвич-формате по сравнению с конкурентным режимом (предел обнаружения снижается с 20 до 9 нг/мл).

6. Разработаны методики селективного определения ряда хлорорганических пестицидов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах с применением пьезокварцевого иммуносенсора и поляризационного флуоресцентного иммунаанализа, характеризующиеся экспрессностью (метод ПФИА) и высокой чувствительностью (пьезокварцевый иммуносенсор).

1. Лунев, М.И. Мониторинг пестицидов в окружающей среде и продукции: эколого-токсикологические и аналитические аспекты Текст./ М.И. Лунев // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2005. - T. XLIX. - № 3. - С. 64-70.

2. Панин, А.Н. Проблема аналитического контроля безопасности кормов и продукции животноводства Текст./ А.Н. Панин, A.A. Комаров // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2005. - T. XLIX - № 3. - С. 71-82.

3. Мельников, H.H. Пестициды в современном мире Текст./ H.H. Мельников, Г.М. Мельникова // Сорос, образ, жур. 1997. - № 4. - С. 33 -37.

4. Liu, P.-Y. Phototransformation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins from photolysis of pentachlorophenol on soils surface Text./ P.-Y. Liu, M.-H. Zheng, X.-B. Xu // Chemosphere. 2002. - У. 46. - P. 1191-1193.

5. Клюев, H.A. Фенолы глобальные загрязнители экосферы и предшественники диоксинов (их аналитические определение) Текст./ H.A. Клюев, Г.В. Мальцева // Диоксины и супертоксиканты XXI века. -М.: Ин-т научной и,техн. инф. - 2001. - №6. - С. 173-212.

6. Persistent Organic Pollutants Электронный ресурс. 2004. - Режим доступа: http://www.caresd.net/site.html?en=l&id=374, свободный. Заглавие с экрана.

7. Грузинским винам вынесли последнее предупреждение Электронный ресурс. 2006. - Режим доступа: http://www.rosinvest.com/news/191524/, свободный. Заглавие с экрана.

8. Coleman, S. Comparative metabolism of chloroacetamide herbicides and selected metabolites in human and rat liver microsomes Text./ S. Coleman, R. Linderman, E. Hodgson, R.L. Rose // Env. Health Persp. 2000. -V. 108. -№ 12. - P. 1151 - 1157.

9. United States Environmental Protection Agency. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. Questions and Answers. Conditional Registration of Acetochlor// U.S. EPA. Washington. DC. 1994.

10. ГН 1.2.1987-06 «О введении в действие гигиенических нормативов» в продуктах питания / постановление главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 06.05.2003 № 92.

11. Salas, J.H. Organophosphorus pesticide residues in Mexican commercial pasteurized milk Text./ J.H. Salas, M.M. Gonzalez, M. Noa, N.A. Perez, G. Diaz, R. Gutierrez, H. Zazueta, I. Osuna // J. Agric. Food Chem. 2003. — V. 51. -P. 4468-4471.

12. Das, B. Organochlorine pesticide residues in catfish, Tachysurus thalass-ing (Ruppell, 1835), from the Soth Patches of the Bay of Bengal Text./ B. Das, Yu. Sharif, A. Khan, P. Das, S.M. Shaheen // J. Environ. Pollut. -2002.-V. 120.-P. 255 259.

13. Quaghebeneur, D. Pesticides in rainwater in Flanders, Belgium: result from the monitoring program 1997-2001 Text./ D. Quaghebeneur, B.De S met, E. De Wulf, W. Steurbaut // J. Environ. Monit. 2004. - V. 6. - P. 182 - 190.

14. Hines, C.J. Distributions and determinants of pre-emergent herbicide exposures among custom applicators Text./ C.J. Hines, J.A. Deddens, S.P.- ' 113

15. Tucker, R.W. Hornung // Ann. occup. Hyg. 2001. - V. 45. - N 3. - P. 227 -239.

16. Xi, Ya. Application of solvent sublation for the determination of organophos-phorus pesticide in vegetable by gas chromatography with a flame photometric detector Text./ Ya. Xi, H. Dong // Analytical Sciences. 2007. - V. 23. - P. 295-298.

17. МУК 4.1.1400-03. Определение остаточных количеств фипронила и его метаболита фипронил-сульфона в воде, почве, клубнях картофеля, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии от 24.06.2003.

18. López-Mesas, М. Analysis of pesticides in lanolin by gel permeation chromatography and gas chromatography Text./ M. López-Mesas, M. Crespi, J. Brach, J.P. Mullender // Analusis. 2000. - V. 28. - P. 159 -162.

19. Lohninger, A. Determination of Iriacylglycerols in serum by capillary gas chromatography with trinonadecanoylglycerol as internal standard Text./ A. Lohninger, L. Linhart, M. Landau, D. Glogar et all. // J. Anal. Chem. 1989. -V. 333.-N. l.-P. 83-96: ■

20. García-Reyes, J.F. Determination of pesticide residues in olive oil and olives Text./ J.F. García-Reyes, С. Ferrer, M.J. Gómez-Ramos, A.R. Fernández-Alba, A. Molina-Díaz//Trends Anal. Chcm. 2007. - V. 26. - P. 239-251.

21. Kronholm, J. Analytical extractions with water at elevated temperatures and pressures Text./ J. Kronholm, K. Hartonen, M.-L. Riekkola // Trends Anal. Chem. 2007. - V. 26. - P. 396 - 412.

22. Andreu, V. Determination of pesticides and their degradation products insoil: critical review and comparison of methods Text./ V. Andreu, Y. Pico // Trends Anal. Chem. 2004. - V. 23. - P. 772 - 789.

23. Sun, T. Determination of 17 kinds of banned organochlorine pesticides in water by activated carbon fiber-solid phase microextraction coupled with GC-MS Text./ T. Sun, J. Jia, D. Zhong, Ya. Wang // Analytical Sciences. 2006. - V. 22. - P. 293 - 298.

24. Vitanov, N.K. Monitoring river water in the lower Danube for artazine contamination Text./ N.K. Vitanov, K.I. Lekova, N.I. Dobreva // Acta Chromatographica. -2003. -N. 13. P. 230-242.

25. Namera, A. Simple analysis of arylamide herbicides in serum using head-space-solid phase microextraction and GC/MS Text./ A. Namera, T. Wa-tanable, M. Yashiki, Y. Iwasaki et all. // Forensic Science International. -1999. -V. 103. -P. 217-226.

26. Babu, R. Rajendran Distribution of PCBs, HCHs and DDTs, and their ecotoxicological implications in Bay of Bengal, India Text./ R. Babu, R.T. Imagawa, H. Tao, R. Ramesh // Environmental International. -2005. -V. 31.-P. 503 512.

27. Blasco, C. Assessment of pesticide residues in honey samples from Portugal and Spain Text./ C. Blasco, M. Fernández, A. Pena, C. Lino et all. // J. Agrie. Food Chem. -20.03. V. 51. - P. 8132 - 8138.

28. Bielejewska, A. HPLC separation of linezolid enantiomers using polysac-charide-based chiral stetionary phases Text./ A. Bielejewska, K. Duszczyk, J. Zukowsky // Acta Chromatographica. 2005. - N. 15. — P. 183 - 190.

29. Vodeb, L. HPLC-DAD with different types of column for determination of (3-cyfluthrin in pesticide formulations Text./ L. Vodeb, B. Petanovska-Ilievska // Acta Chromatagraphica. 2006. - N. 17.-P. 188 -201.

30. Shahtaheri, S.J. Evaluation of factors influencing recovery of herbicide MCPA from drinking water Text./ S.J. Shahtaheri, D. Stevenson // Iranian J. Publ. Health. 2001. - V. 30. - N. 1-2. - P. 15 - 50.

31. Blasco, C. Determination of fungicide residue in fruits and vegetable by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry Text./ C. Blasco, Y. Pico, J. Manes, G. Font // J. Chromatogr. 2002. - V. 947. - P. 227 - 235.

32. García-Reyes, J.F. Comprehensive screening of target, non-target and unknown pesticides in food by LC-TOF-MS Text./J.F. García-Reyes, M.D. Hernando, A. Molina-Díaz, A.R. Fernández-Alba // Trends Anal. Chem. -2007. -V. 26. P. 828-841.

33. Sabik, H. Stabiliti of herbicidea and ther degradation products on graph-itizcd carbon black extraction cartridges used for large volumes of surface water Text./ H. Sabik, R. Jeannot, E. Sauvard // Analusis. 2000. - V. 28.-P. 835 - 842.

34. Vega, A.B. Monitoring of pesticides in agricultural water and soil samplesfrom Andalusia by liquid chromatography coupled to mass spectrometry Text./ A.B. Vega, A.G. Frenich, J.L. Martinez Vidal // Anal. Chim. Acta. -2005.-V. 538.-P. 117- 127.

35. Soler, C. Recent trend in liquid chromatography-tandem mass spectrometry to determine pesticides and their metabolites in food Text./ C. Soler, Y. Picó // Trends Anal; Chem. 2007. - V. 26. - P. 103 - 115.

36. Lord, H.L. ín vivo study of triazine herbicides in plants by SPME Text./ H.L. Lord, M. Moder, P. Popp, J.B. Pawliszyn // Analyst. 2004. - V. 129. -P. 107- 108.

37. Macomber, C. Determination of the ethanesulfonate metabolite of alachlor in water by high-perfomance liquid chromatography Text./ C. Macomber, R.J. Bushway, L.B. Perkins, D. Baker et all. // J. Agrie. Food Chem. 1992. -V. 40. - P. 1450 - 1452.

38. Ortelli, D. Multiresidue analysis of 74 pesticides in fruits and vegetables by liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry Text./ D. Ortelli, P. Edder, C. Corvi // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 520. - P. 33 - 45.

39. Blasco, C. Solid-phase microextraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry to determine postharvest fungicide in fruit Text./ C. Blasco, G. Font, J. Manes, Y. Pico // J. Anal. Chem. 2003. - V. 75. - N. 14. -P. 3606-3615.

40. Palloch, P. Применение ЖХ-ХИАД-МС/МС с ионной ловушкой для анализа сложных смесей пестицидов в воде Электронный ресурс./ Р. Palloch, М. Pelzing, P. Ackermans // Режим доступа: www.bdal.com, свободный. Заглавие с экрана.

41. King, J.W. Derivatization reactions of carbamate pesticides in supercritical carbon dioxide Text./ J.W. King, Z. Zhang // Anal. Bioanal. Chem. -2002.-V. 374 (1). -P. 88-92.

42. McGarvey, B.D. Derivatization reactions applicable to pesticide determination by high-performance liquid chromatography Text./ B.D. McGarvey // J. Chromatogr. Bimed. appl. 1994. -V. 659. -N. 1-2. - P. 243 -257.

43. De Llasera, M.P.G. M. Presence of Carbamate Pesticides in Environmental Waters from the Northwest of Mexico: Determination by Liquid Chromatography Text./ M.P.G. De Llasera, M. Bemal-Gonzales // Wat. Res. 2001. - V.35.-N. 8.-P. 1933 1940.

44. Reuke, S. Thin-layer chromatography as a pilot thechnique for HPLC demonstrated with pesticide samples Text./ S. Reuke, H.E. Hauck // Fre-senius'j. Anal. Chem. 1995. -V. 351. -N. 8. -P. 739-744.

45. Brigante, M. Effect of positional isomerism on the abiotic degradation of pesticides: Case of m- and p-imazamethabenz-methyl Text./ M. Brigante, C. Emmelin, C. Ferronato, M. Delia Greca et all. // Chemosphere. -2007. -V. 68. -P. 464 -471.

46. Sherma, J. Thin-layer chromatography of pesticides a review of applications for 2002-2004 Text./ J. Sherma // Acta chromatogr. 2005. - N. 15.-P.5-30.

47. Picó, Yo. Capillary electrophoresis for the determination of pesticide residues

48. Text./ Yo. Picó, R. Rodrigues, J. Mañes // Trends Anal. Chem. 2003. - V. 22. -N. 3.-P. 133-151.

49. Rodrigues, R. Capillary zone electrophoresis for the determination of thiabendazole, prochloraz and procymidone in grapes Text./ R. Rodrigues, I. Boyer, G. Font, Yo. Picó // Analyst. 2001. - V. 126. - P. 2134 - 2138.

50. Rodrigues, R. Analysis of thiabendazole and procymidone in fruits and vegetablesby capillary electrophoresis electrospray mass spectrometry Text./ R. Rodrigues, Yo. Picó, G. Font, J. Manes // J. Chromatogr. - 2002. - V. 949. - P. 359-366.

51. Rodrigues, R. Off-line solid-phase microextraction and capillary electrophoresismass spectrometry to determine acaidic pesticides in fruits Text./ R. Rodrigues, J. Mañes, Yo. Picó // J. Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 452 - 459.

52. Núñez, O. Solid-phase extraction and sample stacking-capillary electrophoresis forthe determination of quarternary ammonium herbicides in drinking water Text./ O. Nunez, E. Moyano, M.T. Galceran // J. Chromatogr. 2002. - V. 946. - P. 275-282.

53. Caulum, M.M. Multi-analyte immunoassay using cleavable tags and microchipmicellular electrolcinetic chromatography Text./ M.M. Caulum, Ch.S. Henry // Analyst. 2006. - V. 131. - P. 1091 - 1093.

54. Haupt, K. Molecularly imprinted polymers in analytical chemistry Text./ K.

55. Haupt // Analyst. 2001. - V. 126. - P. 747 - 756.

56. Комарова, H.B. Практическое руководство по использованию систем капил-'лярного электрофореза «КАПЕЛЬ» Текст./ Н.В. Комарова, Я. С. Камен-цев. СПб.: ООО «Веда». - 2006.-212 с. - ISBN 5-903297-01-3.

57. Не, J. Determination of the fungicide validamycin A by capillary zone electrophoresis with indirect UV detection Text./ J. He, Ch. Shou-Wen, R. Li-Fang, G. Li-Li et all.//J. Agric.'-Food Chem. 2003. - V. 51.-N. 26.-P. 7523-7517.

58. Juan-Garcia, A. On-line preconcentration strategies for analyzing pesticides infruits and vegetables by micellar electrokinetic chromatography Text./ A. JuanGarcia, G. Font, Yo. Picy // J. Chromatogr. 2007. - V. 1153. - P. 104 - 113.

59. Colum, M. M. Multi-analyte immunoassay using cleavable tags and microchip micellular electrokinetic chromatography Text./ M. M. Colum, Ch. S. Henry // Analyst. 2006. - V. 131. - P. 1091 - 1093.

60. Hernández-Borges, J. Pesticide analysis by capillary electrophoresis Text./ J.

61. Hernández-Borges, S. Frías^Garcia, A. Cifuentes, M.A. Rodriguez-Delgado // J. Separat. Sc. 2004. - V. 27. - N. 12. - P. 947 - 963.

62. Chicharro, M. Determination of 3-amino-l,2,4-triazole(amitrole) in environmentalwaters by capillary electrophoresis Text./ M. Chicharro, A. Zapardiel, E. Bermejo, M. Moreno // Talanta. 2003. - V. 59. - N. 1. - P. 37 - 49.

63. Núñez, O. Capillary electrophoresis-mass spectrometry for the analysis of quarternary ammonium herbicides Text./ O. Núñez, E. Moyano, M. T. Galceran // J. Chromatogr. 2002. - V. 974. - P. 243 - 255.

64. Pejcic, B.The role of biosensors in the detection of emerging infectious diseases Text./ B. Pejcic, R. De Marco, G. Parkinson // Analyst. 2006. - V. 131. - P. 1079-1090.

65. Средства медицинской диагностики Электронный ресурс. 2006. - Режим доступа: http://www.lcnownow.ru, свободный. Заглавие с экрана.

66. Dorssers, L.C.J. Application of a Newly Developed ELISA for BCAR1 Protein for

67. Prediction of Clinical Benefit ôf Tamoxifen Therapy in Patients with Advanced Breast Cancer Text./ L.C.J. Dorssers, N. Grebenchtchikov, A. Brinkman, M.P. Look et all. // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - P. 1445 - 1447.

68. Майстренко, В.H. Эколого-аналитический мониторинг стойких органических загрязнителей Текст./ В.Н. Майстренко, Н.А. Клюев. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2004. - 323 е.: ил. - ISBN 5-94774-204-7.

69. Зырянов, В.В. Иммунохимические и биосенсорные методы анализа экотокси-кантов окружающей среды Текст./ В.В. Зырянов, М.Д. Гольдфейн // Эко-токсикологическая химия. 2002. - Т. 11. - № 1. — С. 45 - 53.

70. Еремин, С.А. Иммунохимические методы анализа гербицидов группы сим-1,3,5-триазинов Текст./ С.А. Еремин, Ж.В. Самсонова, A.M. Егоров // Успехи химии. 1994. - Т. 63. - № 7. - С. 638 - 649.

71. Watanabe, Е. Rapid and simple screening analysis for residual imidacloprid in agricultural products with commercially available ELISA Text./ E. Watanabe, H. Eun, K. Baba, T. Arao // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 521. - P. 45 - 51.

72. Mercader, J.V. Perfomance of two monoclonal immunoassay in mixtures of cross-reacting dithiophosphorus pesticides Text./ J.V. Mercader, A. Montoya // Talanta. 2007. - V. 74. - P. 45 - 51.

73. Kim, Yo.J. Enzyme-linked immunosorbent assay for the insecticides fenitrothion Influence of hapten conformation and sample matrix on assay perfomance Text./ Yo.J. Kim, Yo.Ah Kim, Yo. T. Lee, H.-S. Lee // Anal. Chim. Acta. -2007.-V. 591.-P. 45-51.

74. Kumar, M.A. Automated flow enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system for analysis of methyl parathion Text./ M.A. Kumar, R.S. Chouhan, M.S. Thalcur, B.E. Amita Rani et all. // Anal. Chim. Acta. 2006. - V. 560. - P. 30-34.

75. Frânelc, M. Antibody-based methods for surfactant screening Text./ M. Frânek, J. Zeravik, S. A. Eremin, J. Yakovleva et all. // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. -V. 371.-P. 456-466.

76. Liégeois, E. ELISA test, a new method to detect and quantify isoproturon in soil

77. Text./ E. Liégeois, Y. Dehon, B. de Brabant, P. Perry et all. // Sci. Total Environment. 1992. - V. 123-124.-P. 17-28.

78. Gabaldôn, J.A. Development of a sample extraction procedure for chlorpyrifos determination in food samples by immunoassay Text./ J.A. Gabaldôn, A. Ma-quieira, R. Puchades // Talanta. 2007. - V. 71. - P. 17 - 28.

79. Yang, J.-yi. Production and identification of high affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran Text./ J.-yi. Yang, Q. Wu, H. Wang, Ke Pan et all. // Agric. Sci. China. 2007. - V. 6. - P. 17 - 28.

80. Garcés-Garcia, M. Immunochemical determination of four organophosphorus insecticide residue in olive oil using a rapid extraction process Text./ M. Garcés-Garcia, E.M. Brun, R. Puchades, Â. Maquieira // Anal. Chim. Acta. 2006. -V. 556.-P. 347-354. . ■

81. Lee, W.Yo. Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the organophosphorus insecticide isofenphos Text./ W.Yo. Lee, E.K. Lee, Yo.C. Park, T. Chung et all. // Anal. Chim. Acta. 2006. - V. 557.-P. 169-178.

82. Wang, S.T. Preparation of a multi-hapten antigen and broad specificity polyclonal antibodies for a multiple pesticide immunoassay Text./ S.T. Wang, W. J. Gui, Yi R. Guo, G. N. Zhu // Anal. Chim. Acta. 2007 V. 587. - P. 287 - 292.

83. Male, S.K. Development of a class selective immunoassay for the type II pyre-throid insecticides Text./ S. K. Male, G. Shan, Hu-J. Lee, T. Watanabe et all. //

84. Anal. Chim. Acta. 2005. - V. 534. - P. 109- 120.

85. Zhu, G. Development of a direct competitive enzyme-linked immunoassay for carbofuran in vegetables Text./ G. Zhu, M. Jin, W. Gui, Yi. Guo et all. // J. Food Chem. 2008. - V. 107. - P. 1734 - 1742.

86. Wang, S. Enzyme immunoassay for the determination of carbaryl residues in agricultural products Text./ S. Wang, C. Yu, J. Wang // Food Addit Contam. -2005. V. 22. -N. 8. - P. 735 - 742.

87. He, Y. Advance of pesticide residue analysis techniques based on biological principle Text./ Y. He, Z. Gao, F. Chao // Wei Sheng Yan Jiu. 2004. - V. 33. -N. 1. - P. 112-114. . '

88. Watanabe, E. Immunoassay for iprodione: Key estimation for residue analysis and method validation with chromatographic technique Text./ E. Watanabe, Sh. Miyake // Anal. Chim. Acta. 2007. - V. 583. - P. 370 - 376.

89. Zherdev, A. V. Homogeneous enzyme immunoassay for pyrethroid pesticides and ther derivatives using bacillary alpha-amylase as label Text./ A.V. Zherdev, B.B. Dzantiev, J.N. Trubaceva // Anal. Chim. Acta. 1997. - V. 347. - P. 131 -138.

90. Холодов, В. А. Адсорбция гербицида ацетохлора различными типами почв Текст./ В. А. Холодов, Н, А. Куликова, И. В. Перминова, С. А. Еремин и др. // Почвоведение. 2005. - № 5. - С. 600 - 607.

91. Лунская, И.М. Разработка поляризационного флуороиммуноанализа 2,4-дихлорфеноксиуксуспой кислоты с использованием моноклональных антител Текст./ И.М. Лунская, С.А. Еремин, A.M. Егоров, В. Колар и др. // Агрохимия. 1993. - Т. 2. - С. 113 - 118.

92. Sanchez, F.G. Antibody production and development of a polarization fluoro-immunoassay for the herbicide triclopyr Text./ F.G. Sanchez, A.N. Diaz, A.F.G.

93. Eremin, S.A Fluorescence Polarization Immunoassays for Pesticides Text./ S. A. Eremin, D. S. Smith // Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 2003. - V. 6.-P. 79-99.

94. Дерябина, M.A. Определение гербицида ацетохлора методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа Текст./ М.А. Дерябина, Ю.Н. Яковлева, В А. Попова, С. А. Еремин // Журн. аналит. химии. 2005. - Т. 60. -№1.-С. 91-96.

95. Liu, G. Electrochemical stripping analysis of organosphate pesticides and nerve agents Text./ G. Liu, Yu. Lin // Electrochem. Commun. 2005. - V. 7. - P. 339 -343.

96. Suri, С. R. Immunosensors'for pesticide analysis: antibody production and sensor development Text./ C. R. Suri, M. Rajge, G. C. Varshney // Critical Rev. Biotechnology. 2002. - V. 22. - P. 15 - 32.

97. Solna, R. Amperometric screen-printed biosensor arrays with co-immobilised oxidoreductases and cholinesterases Text./ R. Solna, E. Dock, A Christenson, M. Winther-Nielsen et all. // Anal. Chim. Acta. 2005. - V. 528. N. 1. - P. 9 -19.

98. Dzantiev, B.B. Determination of the herbicide chlorsulfuron by amperometric sensor based on separation-free bienzyme immunoassay Text./ B.B. Dzantiev, E.V. Yazynina, A.V. Zherdev, Yu.V. Plekhanova et all. // Sens, and Act. B. -2004. V. 98.-P. 254-261.

99. Zacco, E. Electrochemical biosensing of pesticide residues based on affinity biocomposite platforms Text./ E. Zacco, R. Galve, M.P. Marco, S. Alegret et all. // Biosen. and Bioelectron. 2007. - V. 22. - P. 1707 - 1715.

100. Baumner, A.J. Development of a new immunosensor for pesticide detection: a disposable system with liposome-enhancement and amperometric detection Text./ A.J. Baumner, R.D. Schmid // Biosen. and Bioelectron. 1998. - V. 15.1. P. 519-529.

101. Budnikov, Н.С. Electrochemical biosensors for environmental control: problems and prospects Text./ H.C. Budnikov, G.A. Envtugyn // Intern. Congress on Analytical Chemistry. Moscow. - 1997 - P. 7.

102. Евтюгин, Г.А. Ферментативное определении сс-аминофосфонатов с помощью бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы Текст./ Г.А. Евтюгин, Е.Е. Стойков, Г.К. Будников, И.С. Антипин, А.И. Коновалов // Журн. ана-лит. хим. 1999.-Т. 54.--№3.-С. 321 -328.

103. Евтюгин, Г.А. Потепциометрический холинэстеразный биосенсор с мембраной, модифицированной каликс4.резорцинолареном [Текст]/ Г.А. Евтюгин, J1.A. Муслинкина, Г.К. Будников, Э.Х. Казакова // Журн. аналит. хим. 1999. - Т. 54. - № 4. - С. 418 - 423.

104. Evtugyn, G.A. Biosensors for the determination of environmental inhibitors of enzymes Text./ G.A.,Evtugyn, H.C. Budnicov, E.B. Nicolskaya // Russ. Chem. Rev. 1999. - V. 68. - N. 12. - P. 1041 - 1064.

105. Dzantiev, B.B. Development and comparative study of different immunoenzime techniques for pesticides detection Text./ B.B. Dzantiev, A.V. Zherdev, O.G. Romanenko, L.A. Sapegova // Intern. J. Environ. Anal. Chem. 1996. - V. 65. -P. 95 - 111.

106. Piccirilli, G.N. A novel flow-through fluorescence optosensor for the determination of thiabendazole Text./ G.N. Piccirilli, G.M. Escandar // Anal. Chim. Acta. 2007. - V. 601.-P. 196-203.

107. Newman, J. D.S. Optical organophosphate/phosphonate sensor based upon gold nanoparticle functionalized quartz Text./ J. D.S. Newman, J. M. Roberts, G.J. Blanchard // Anal. Chim. Acta. 2007. - V. 602. - P. 196 - 203.

108. Baldini, F. Time-resoJved absorption as optical method for herbicide detection Text./ F. Baldini, C. Domenici, A. Giannetti, D. Masci et all. // Sens, and Act. В.-2003,-V. 90.-P. 198-203.

109. Медянцева, Е.П. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы и перспективы Текст./ Е.П. Медянцева, Е.В. Хал-деева, Г.К. Будников // Журн. аналит. химии 2001. - Т. 56. - № 10. - С. 1015- 1031.

110. Valera, Е. Impedimetric immunosensor for atrazine detection using interdigitated fi-electrodes (IDfiE's) Text./ E. Valera, J. Ramôn-Azcôn, Â. Rodriguez, L.M. Castaner et all. // Sens, and Actuat. B: Chem. 2007. - V. 125. - P. 526 - 537.

111. Ramôn-Azcôn, J. An impedimetric immunosensor based on interdigitated fi-electrodes (ID|iE's) for the determination of atrazine residues in food samplesr

112. Text./ J. Ramôn-Azcôn, E. Valera, A. Rodriguez, A. Barranco et all. //Biosens, and Bioelectron. 2008. - V. 23. - P. 1376 - 1373.

113. Hleli, S. Atrazine analysis using an impedimetric immunosensor based on mixedbiotinylated self-assembled monolayer Text./ S. Hleli, C. Martelet, A. Abdel-ghani, N. Burais et all. // Sens, and Actuat. B. 2006. - V. 113. - P. 711 - 717.

114. Navrätilovä, I. The immunosensors for measurement of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid based on electrochemical impedance spectroscopy Text./1. Navrätilovä, P. Sklädal // Bioelectrochem. 2004. - V. 62. - P. 11 - 18.

115. Mauriz, E. Determination of carbaryl in natural water samples by a surface plasmon resonance flow-through immunosensor Text./ E. Mauriz, A Calle, A. Abad, A. Montoya et all. //-Biosen. and Bioelectron. 2006. - V. 21. - P. 2129 -2136.

116. Mauriz, E. Optical immunosensor for fast and sensitive detection of DDT and related compound in river water samples Text./ E. Mauriz, A Calle, J.J. Man-clus, A. Montoya et all. // Biosen. and Bioelectron. 2007. - V. 22. - P. 1410 — 1418.

117. Rajan Surface plasmon resonance based fiber-optic sensor for the detection of pesticide Text./ Rajan, S. Chand, B.D. Gupta // Sens, and Actuat. B. 2007. -V. 123. - P. 661 -666.

118. Sun, H. Piezoelectric quartz crystal sensor for rapid analysis of pirimicarb residues using molecularly imprinted Text./ H. Sun, Yi. Fung // Anal. Chim. Acta. 2006.-V. 576.-P. 67-76.

119. Pibyla, J. Development of piezoelectric immunosensors for competitive and direct determination of atrazine Text./ J. Pibyla, M. Hepel, J. Halameka, P. Scladal // Sens, and Actuators. 2003. - V. 91. - P. 333 - 341.

120. Karousos, N.G. Quartz crystal microbalance determination of organophosphorus and carbamate pesticides Text./ N.G. Karousos, S. Aoubdi, A. S. Way, S.M. Reddy // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 496. - P. 189 - 196.

121. Kim, N. High-sensitivity detection for model organophosphorus and carbamate pesticides with quartz crystal microbalance-precipitation sensor Text./ N. Kim, I.-S. Park, D.-K. Kim // Biosens. and Bielectr. 2007. - V. 22. - P. 1593 - 1599.

122. Lebedev, M. Yu. Development of the piezoelectric biosensor for acetochlor detection Text./ M. Yu. Lebedev, S.A. Eremin, P. Skladal // Anal. Lett. 2003. -V. 36. - N. 10. - P. 2443 - 2457.

123. Pribyl J. Development of piezoelectrc immunosensors for competitive and direct determination of atrazine Text./ J. Pribyl, M. Hepel, J. Halamek, P. Skladal. // Sens, and Actuators. 2003. - V. 91. - P. 333.

124. Sauerbrey, G.Z. Use a quartz vibration form weigh thin films on a microbalance Text. / G.Z. Sauerbrey // Z. Phys. 1959. - B. 155. - P. 206 - 210.

125. Ермолаева, Т.Н. ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫЕ СЕНСОРЫ: АНАЛИТИЧЕСКИЕ

126. ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ Текст.: монография / Т.Н. Ермолаева, Е.Н. Калмыкова. Липецк: ЛГТУ, 2007. - 190 с. - ISBN 978-588247-305-0.

127. Кнорре Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед. спец. вузов/ Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина 3-е изд., испр. - М.: Высш. шк. 2002. -479 е.: ил. - ISBN 5-06-003720-7.

128. Крикунова B.C. Разработка иммунохимических методов анализа хлорсо-держащих пестицидов в объектах окружающей среды Дис. . канд. хим. наук. М.: МГУ. - 2003. - 25 с.

129. Годнев, И.Н. Физическая химия / И.Н. Годнев, К.С. Краснов, Н.К. Воробьев и др. М.: ВШ. - 1982. - 687 с.

130. Каретников Г.С. Практикум по физической химии / Г.С. Каретников, H.A. Козырева, И.В. Кудряшов и др. М.: ВШ. - 1986. - 495 с.

131. Crooks, S. Detection of levamisole residues in bovine liver and milk by immunobiosensor Text./ S. Crooks, B. McCarney, I. Traynor, C. Thompson et all. // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 483. - P. 181 - 186.

132. Ильичева, Н.Ю. Холинэстеразные биосенсоры для определения гербицидапропанила / Н.Ю. Ильичева, P.M. Бейлинсон, Э.П. Медянцева, Г.К. Буд-ников и др. // Вестн. МГУ, Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43. - № 6. - С. 409 -412.

133. Воробьева, Л.А. Химический анализ почв: Учебник Текст./ Л.А Воробьева // М.: Изд-во МГУ, 1998. 272 с. - ISBN 5-211-03973-4.

134. Аналитическая химия. Проблемы и подходы: В 2 т: Пер. с англ. / Под ред. Р. Кельнера, Ж.М. Мерме, М. Otto, М. Видмера М.: «Мир»: ООО «Издательство ACT», 2004. - (Лучший зарубежный учебник). Т. 1. - С. 530 -ISBN 5-17-019774-8.

135. Ren, X. A new type of reusable piezoimimmosensor fabricated by a recombinant IgG-binding protein Text./'X. Ren, E. Kobatake, M. Aizawa // Analyst. 2000.-V. 125.-P. 669-671.

136. Карякин, A.A. Биосепсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики Текст./ А.А. Карякин, Е.А. Уласова, М.Ю. Ванягин, Е.Е. Карякина // Сенсор. 2002. - № 1. - С. 16 - 24.

137. Yakovleva, J. Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay Text./ J. Yakovleva, A. Lobanova, E. Shutaleva, M. Kourkina et all. // Anal. Bioanal. Chem. 2004. - V. 378. - P. 634.

138. Ермолаева, Т.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы Текст. / Т.Н. Ермолаева, Е.Н. Калмыкова // Успехи химии. 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 445 - 459.

139. Еремин, С.А. Иммунохимический анализ лекарств и органических соединений Текст./ С.А. Еремин // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1989.-Т. 34. - № 1. - С. 46 - 51.

140. Eremin, S.A. Design and development of a single-reagent polarization fluoroimmunoassay for methamphetamine Text./ S.A. Eremin, D.E. Schiavetta, H. Lotey, D.S. Smith et all. // Ther. Drug. Monit. 1988. - V. 10. - P. 327 - 332.

141. Setford, S.J. Organic Phase Immunosensors Text./ S.J. Setford, S. Kroger, A.P.F. Turner // Analusis. 1999. - V. 27. - N. 7. - P. 600 - 609.

142. Lu, В. Effects of acetonitrile on horseradish peroxidase (HRP)-anti HRP antibody interaction Text./ B. Lu, E. I. Iwuoha, M. R. Smyth, R. O'Kennedy // Biosen. and Bioelectron. 1997.-V. 12.-P. 619-625.

143. Ермолаева, Т.Н. ' Экстракция моно- и полифункциональных ароматических соединений гидрофильными растворителями общие закономерности и электрохимический анализ неводных сред Текст./ Дис. . докт. хим. наук. Москва: МГУ, 1999. 33 с.

144. Ермолаева, Т.Н. Закономерности образования экстракционных систем на основе гидрофильных растворителей Текст./ Т.Н. Ермолаева, Ю.Н. Комарова // Современные проблемы химии и технологи экстракции: Сб. ст. М. - 1999. - Т. II. - С. 82 - 88.

145. Ермолаева, Т.Н. Экстракционные системы на основе гидрофильных растворителей: выделение и концентрирование ароматических сульфосоединений Текст./ Т.Н. Ермолаева, Ю.Н. Комарова // Журн. прикл. химии. 2000. - Т. 73. - № 8. - С. 1280 - 1285.

146. Комарова, Ю.Н. Экстракция ароматических сульфосоединений гидрофильными растворителями Текст./ Дис. . канд. хим. наук. Липецк: ЛГПУ. 2000. - 20 с.

147. Мишина, А.В. Экстракция азотсодержащих фенолов гидрофильными растворителями закономерности и электроаналитическое определение в органических концентратах Текст./ Дис. . канд. хим. наук. Москва: МГЗИПП. - 1997. - 16 с.

148. Su, X. Piezoelectric quartz crystal based label-free analysis for allergy disease Text./ X. Su, F. T. Chew, S.F.Y. Li // Biosen. & Bioelectron. 2000. - V. 15. -P. 629 - 639.

149. Hong, S. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of alachlor and its degradation products by direct aqueous injection Text./ S. Hong, A.T. Lemley // J. Chromatogr. 1998. - V. 822. -N. 2. - P. 253 - 261.

150. ПДК содержания пестицидов в питьевой воде Электронный ресурс./ Режим доступа: http://www.water.ru, свободный. Заглавие с экрана.

151. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-water Quality // Originally published in Guidelines for drinking-water quality. -2003.-V. 2.-P. 1.