Новые решения в хроматографическом и фотометрическом анализе антоциановых пигментов из растительного сырья тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Ломова Татьяна Сергеевна

Новые решения в хроматографическом и фотометрическом анализе антоциановых пигментов из растительного сырья

02 00 02 - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж - 2007

ООЗ1743ЭТ

003174397

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная технологическая академия»

Научный руководитель доктор технических наук, профессор

Бол ото я Владимир Михайлович

Официальные оппоненты. доктор химических наук, профессор

Славинская Галина Владимирована

кандидат химических наук, доцент Рудакова Людмила Васильевна

Ведущая организация Липецкий государственный технический университет

Защита диссертации состоится 16 октября 2007 г в 14 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212 03819 в Воронежском государственном университете по адресу 394006, г Воронеж, Университетская площадь 1, в ауд № 439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212 038.19 Ь Крысин М Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Антоциановые пигменты (АЦ) обладают высокой биологической активностью и используются не только как пищевые натуральные красители, но и как биологически активные добавки Для пищевой и фармацевтической промышленности актуальной проблемой является разработка способов выделения и недорогих, экспрессных методик качественного и количественного анализа АЦ в растительном сырье, экстрактах и пигментсодержащих продуктах С этой точки зрения наиболее целесообразным является применение методов цветометрии, спектрофотометрии и планарной хроматографии Важнейшей стадией аналитического контроля является пробоподготовка, включающая в себя экстракцию и концентрирование аналита В этом плане интерес представляет метод колоночной хроматографии с применением неионогенных макропористых сорбентов, используемых для концентрирования биологически активных веществ

Работа выполнена в соответствии с планами НИР ВГТА по теме «Выделение, изучение состава и свойств природных и модифицированных биологически активных органических соединений из растительного сырья», с координационным планом Научного совета РАН по адсорбции и хроматографии 2004-2007 г (код 2 15 7 2, раздел «Синтез и исследование свойств полимерных сорбентов и носителей для хроматографии») Часть работы выполнена в рамках гранта РФФИ № 06-08-00448 «Разработка методов диагностики качества продукции по параметрам цветности с применением цифровых технологий»

Цель работы состояла в изучении условий хроматографического выделения и концентрирования антоциановых пигментов из разбавленных растворов с применением полимерного неионогенного сорбента на основе сверхсшитого полистирола и разработке комплекса методик количественного определения АЦ на основе методов цветометрии, спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии

Для достижения цели были поставлены следующие задачи

- провести анализ хроматографических и спектральных характеристик модельных антоциан-3-глюкозидов (АЦ-3-С1и), и АЦ выделенных из экстрактов выжимок ягод ежевики, черной смородины, черноплодной рябины и соцветий каркаде,

- установить закономерности сорбции и разделения АЦ пигментов на минеральных и органических сорбентах,

- выделить АЦ пигменты из красителей, полученных из природного сырья, методами тонкослойной и колоночной хроматографии,

- разработать методики количественного анализа антоциановых соединений в красителях с применением компьютерных технологий,

- выбрать условия длительного хранения АЦ

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем

- найдены условия разделения АЦ пигментов методами бумажной и тонкослойной хроматографии,

- предложены способы оценки качества и биологической ценности антоциансодержащих красителей с использованием ТСХ Методики защищены положительным решением о выдаче патента РФ (заявка № 2006121294/28(023118) «Способ оценки качества антоцианового красителя, полученного бескислотным способом»),

- разработан способ выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов с применением метода колоночной хроматографии на неионогенном сорбенте - Стиросорб-МХДЭ-100 Методика защищена патентом на изобретение РФ № 2302436 «Способ получения антоцианового красителя»,

- рассмотрены условия длительного хранения природных АЦ, в сорбированном состоянии с использованием макропористых неионогенных матриц,

- предложены новые подходы к получению градуировочных зависимостей для вычисления концентрации АЦ пигментов в водных и спиртовых растворах с применением сканера в качестве аналитического прибора

Практическая значимость работы. Приоритет, новизна и практическая значимость исследований подтверждена патентом на изобретение РФ и положительным решением на выдачу патента РФ

На основании проведенных исследований установлена целесообразность использования неионогенного сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100 для выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов (отходов плодово-ягодной промышленности) с целью получения концентрата, необходимого в пищевой и фармацевтической промышленности Методика разделения АЦ методом ТСХ позволяет не только выделять отдельные пигменты, но и делать выводы о качестве и биологической ценности анализируемого красителя Разработаны условия длительного хранения АЦ с использованием макропористых неионогенных матриц, позволяющие увеличить срок использования красителя без привлечения стабилизирующих добавок

Положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения условий разделения АЦ пигментов экстрактов растительного сырья методами планарной хроматографии,

новый способ извлечения и концентрирования АЦ из разбавленных растворов методом колоночной хроматографии с применением неионогонного макропористого сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100,

- цветометрические способы количественного анализа АЦ водных и этанольныч растворов

Апробация работы. Результаты работы доложены на II Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фарм образования» Фармобразование - 2005 (Воронеж, 2005 г), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС -2005 (Воронеж, 2005 г), Международной конференции «Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России» (Санкт-Петербург, 2005 г), III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» ФАГРАН-2006 (Воронеж, 2006 г), Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования Создание новых физиологически активных веществ» Фармобразование - 2007 (Воронеж, 2007 г), 61 региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006 г), VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии» (Казань 2007 г), на ежегодных отчетных конференциях, проводимых Воронежской государственной технологической академией (Воронеж 2005, 2006, 2007 г г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах входящих в перечень ВАК, 10 тезисов докладов, получен патент на изобретение РФ и положительное решение на выдачу патента РФ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы (207 наименований) и приложения В работе представлено 50 рисунков и 8 схем, содержит 30 таблиц, изложена на 162 страницах машинописного текста

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы В литературном обзоре подробно рассмотрены состав, строение и свойства АЦ пигментов, их содержание в различном растительном сырье Особое внимание уделено рассмотрению поведения АЦ в растворе и механизмам стабилизации окраски Представлены краткие сведения о существующих способах выделения пигментов из растительного сырья Отмечены способы концентрирования АЦ пигментов Представлены обобщенные данные условий анализа АЦ спектральными методами, способов разделения, выделения и концентрирования пигментов хроматографическими методами Дан их критический анализ, выявлены преимущества и недостатки, и на этом основании сформулированы цель и задачи исследования

Глава 2. Объекты и методы исследования. В общей форме приведены характеристики аналитов, применяемых сорбентов, растворителей, методик пробоподготовки и измерений, используемого аналитического оборудования и статистической обработки результатов

В работе использовали в качестве стандартов 3-глюкозиды мальвидина (Мс1), пеонидина (Рп), петунидина (РО и дельфинидина (БО Структурная формула пигментов представлена на рисунке 1

Пигменты находились в водном растворе, содержащем 13% (об) ацетонитрила, 10% (об) муравьиной кислоты Величина рН не превышала 1,5, при этом процент оксониевого катиона в растворе не меньше 94% В работе использовали два генетически связанных с АЦ соединения производных бензо-у-пирона - катехин и кверцетин Коммерческие образцы закуплены в ООО «Катроса» (Россия)

Краситель получали бескислотной спиртовой экстракцией из высушенных измельченных выжимок ягод черной смородины, ежевики, свежих и подгнивших плодов черноплодной рябины и соцветий каркаде

В работе использовали сорбент марки Стиросорб-МХДЭ-100 -сверхсшитый полимер стирола (рис 2). Степень сшивки 100% означает, что каждое фенольное кольцо полистирольной цепи вовлечено в образование сшивающего мостика Характеристики пористости макросетчатого полимера

Рис 1 Структурная формула антоциан-3-глюкозидов в форме катиона флавилия, где Х,=ОСН3, Х2=ОСН3 - ММ, Х,=ОСН3, Х2=Н -Рп, Х|=ОСН3, Х2=ОН - Р^ Х,=ОН, Х2=ОН

J I

А

В

внутренняя удельная поверхность Б^ЮОО м2/г, суммарный объем пор \У0=0,51 см2/г

Рис 2 Структура ~ мостиков сорбента -

н Стиросорб-МХДЭ-100

В планарной хроматографии работали с пластинами марок «Silufol», «Merk» и «Sorbfil» со слоем силикагеля, отличающегося физическими характеристиками, и бумагой Filtrak №11

Аппаратура. Оптическую плотность измеряли на КФК-2, СФ-46, СФ-56, pH контролировали на pH метре ЭВ-74, ИК-спектры регистрировали на Specord-IR-75, Инфралюм ФТ-02 и Фурье-спектрометре Verteks ВЭЖХ осуществляли на хроматографе Waters Milhpore с детектором 481 Lambda Мах (UV-Vis) Изображения сканировали планшетным сканером HP Scanjet 3570С и Genius ColorPage - SP2

Методики. Колоночная хроматография Водный раствор красителя с концентрацией АЦ пигментов (8-12 г/л) пропускали со скоростью 3 мл/мин через хроматографическую колонку d=l см со слоем сорбента (Стиросорб-МХДЭ-100) высотой 23 см до максимального насыщения Элюировали поглощенные пигменты 96% этанолом со скоростью 1,5 мл/мин Отбирали пробы объемом 1 мл

Планарная хроматография Пробы разделяли методом восходящей хроматографии в стеклянных камерах высотой 20-25 см и диаметром 15 см, предварительно заполненных 25 мл элюента Высота подъема растворителя на пластинах марки «Silufol» составляла 9 см, «Merk» - 5,5 см, «Sorbfil» -5 см на бумаге Filtrak №11 - 10 см В качестве растворителей применяли смеси н-бутанол - уксусная кислота - вода (БУВ) в объемном соотношении 4 15 (верхний слой) и н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода (АУВ) в объемном соотношении 2 1 1

В слое сорбента проводили идентификацию соединений фенольной природы специальными реагентами 10%-й спиртовой раствор фосфатно-молибденовой кислоты (ФМК), 5%-й раствор хлорного железа в метаноле, 1%-й раствор хлористого алюминия в этаноле, пары аммиака (25%, р=0,91 г/см3) Для количественного анализа АЦ в ТСХ хроматограммы красителей обрабатывали парами соляной кислоты, выделяемыми ее концентрированным раствором, для превращения АЦ в форму катиона флавилия

МО« /_, I

Для последующих спектрофотометрических исследований отдельные зоны АЦ вымывали раствором этанола, подкисленным 0,1 М НС1 (1 100, рН=1,7), дополнительные компоненты - этанолом Время между выделением и анализом не превышало 2 часов

Содержание красящих веществ в растворе красителя определяли по стандартному раствору сернокислого кобальта

Расчеты. Статистическая обработка экспериментальных результатов осуществлена в программах Origin 6 1 и Statgraphics Plus 3 0 Определение цветовых параметров окраски выполняли с применением программы, разработанной в среде математического пакета MathCAD Количественный анализ АЦ красителей в тонком слое сорбента был проведен с использованием программы «Sorbfil Videodensitometer»

Глава 3. Аналитические характеристики модельных растворов антонианов.

Нами проведена оценка эффективности хроматографирования АЦ-3-Glu в более 30 системах растворителей, используемых в планарной хроматографии

Отмечено, что на бумаге Filtrak № 11 в системах АУВ и БУВ пигменты сохраняют характерную окраску (Md-3-Glu и Pn-3-Glu - розовая, Pt-3-Glu и Df-3-Glu - синяя), и значения Rf не выходят за границу интервала 0,2-0,8

Несмотря на то, что система БУВ наиболее часто применяется в планарной хроматографии АЦ, нами установлено что лучшим элюентом является АУВ В этом растворителе неподвижная фаза целлюлозное волокно более эффективна, что характеризуется на порядок большими значениями N При хроматографировании АЦ-3-Glu в системе БУВ рассчитанные значения величины Н, характеризующей размывание хроматографической зоны, выше чем при хроматографировании в АУВ Например, для Pn-3-Glu в системе АУВ величина Rf=0,34, N=360, Н 103=10 см, а в БУВ - Rf =0,56, N=52, Н 103=30 см

Хроматографирование АЦ-3-Glu в системах БУВ и АУВ осуществляли на силикагеле - наиболее часто используемом в нормально-фазовой ТСХ адсорбенте Адсорбент (Si02 пН20) имеет на поверхности слабокислотные ОН-группы, способные удерживать вещества с основными свойствами с образованием Н-связей Разделение протекает преимущественно по адсорбционному механизму

Данные, представленные в таблице 1, позволяют по значениям Rf идентифицировать АЦ-3-Glu и сравнить эффективность использованых комбинаций сорбент-элюент

Таблица I

Хроматографические параметры антоциан-3-глюкозидов на пластинах со слоем силикагеля марок «БогЬЫ» и «5йи1о1» в системах растворителей АУВ и БУВ

АЦ-З-С1» Пластины марки «8|1и1о1» Пластины марки «8огЬШ»

АУВ БУВ АУВ

Иг \ Н 104, см 1*г N 11 10\ си IV N Н 10\ см

ОГ-3-С1и 0,21 320 60 - - - 0,25 220 50

Рп-3-С1и 0,27 540 40 0,72 1740 30 0,43 540 30

Р1-3-С1и 0,14 260 40 0,55 1020 40 0,20 120 60

М(1-3-С1и 0,25 600 40 0,71 1700 30 0,35 800 20

Отсутствие данных в таблице 1 о результатах хроматографирования АЦ-3-01и на пластинах марки «БогЫ)!» элюентом БУВ вызвано тем, что процесс хроматографирования в этих условиях описывается выпуклой изотермой сорбции, что несовместимо с качественным и тем более количественным анализом веществ в тонком слое сорбента На пластинах марки «БйиЫ» в БУВ зоны АЦ имеют правильную форму, пластины характеризуется более высокими значениями N и более низкими Н (за исключением М(1), чем при хроматографировании в АУВ Несмотря на это, с точки зрения универсальности элюента БУВ для хроматографирования пигментов выявлены недостатки, имеющие решающее значение А именно происходит обесцвечивание зоны 0£-3-01и, пигменты с Рп и Мс1 основой имеют близкие значения Поэтому при изучении состава и идентификации пигментов предпочтительнее использовать систему АУВ

Рассмотренные подвижные фазы отличаются хроматографическими характеристиками Сила элюента АУВ, рассчитанная по Снайдеру в условиях нормально-фазовой хроматографии, составляет 5,85, а БУВ - 7,26 Следовательно, растворимость и взаимодействие АЦ с молекулами растворителя выше в подвижной фазе БУВ Следствием этого являются более высокие значения 1*г в системе БУВ и наблюдаемая в некоторых случаях (пластины марки «БогЬЫ») деформация хроматографических зон

Количественный анализ, проводимый непосредственно на хроматограммах, предпочтительнее осуществлять на пластинах марки «БогЬЫ», разброс размера частиц сорбента относительно среднего значения которых 8-10 мкм, в то время как для пластин «5г1и1о1» - 5-40 мкм Так как при этом улучшается соотношение сигнал/шум, снижается предел детектирования и метод становится более чувствительным

Для спектров электронного поглощения всех АЦ-3-С1и характерно наличие двух максимумов первый - в области 280 нм и второй - в области 520 нм (рис 3 а)

R Md-3-Glu

3000 3500

v см 1

а б

Рис 3 а - Спектры поглощения антоцин-3-глюкозидов, СФ-56, б - ИК-спектр Md-3-Glu, Vertex 70 Водный раствор, содержащий 10% муравьиной кислоты, 13% ацетонитрила (рН=1,1)

Можно заметить, что в условиях эксперимента максимум поглощения в видимой области света АЦ-3-Glu с тремя электронодонорными заместителями в кольце В (Df-3-Glu, Pt-3-Glu, и Md-3-Glu) наблюдается при 526 нм Для Pn-3-Glu - пигмента с двумя электронодонорными группами -отмечено гипсохромное смещение второго максимума поглощения на 9 нм Смещение положения максимума Pn-3-Glu - следствие более низкой общей электронной плотности хромофорной системы по сравнению с трехзамещенными структурами Таким образом, положение максимума в видимой области спектра зависит от величины суммарного +М-эффекта заместителей

'0СНч Рис 4 Равновесные формы мальвидин-3-

'ОСН,

гликозида при рН~ 1,0-1,5

Хиноид

• но|-н+ + Н+Т - н о

« ' -ОС

Псевдоформа

Необходимо отметить, что равновесие между отдельными структурными формами АЦ при низких значениях рН=1,0-1,5 сдвинуто влево к катионной форме, однако присутствует от 1 до 6% хиноидных и карбинольной форм (рис 4)

Максимум поглощения в области 343 нм, наблюдаемый для раствора Мс!-3-С1и, можно объяснить переходами п—»л в хиноидном кольце ангидроформ Наблюдаются внутримолекулярные взаимодействия, объясняющие смещение полосы поглощения -С=0 группы в область длинных волн

Для ИК-спектров изучаемых АЦ-3-С1и характерно наличие максимумов поглощения при 1635-1614 и 1712-1699 см"', причем, первый, вызванный колебаниями двойной связи кислородного цикла, сопряженного с бензольным ядром, менее интенсивный по сравнению со вторым, который соответствует валентным колебаниям карбонильной группы в шестичленных циклах (циклогексанонах)

Гидроксильные группы в молекуле пигментов проявляются в длинноволновой области 3600-3000 см"1 и при 1220-1210 см"' В области 3235-3257 см"1 отмечена широкая и интенсивная полоса поглощения, имеющая вид огибающей кривой Можно полагать, что ее появление вызвано образованием межмолекулярных комплексов «вода АЦ-3-01и» за счет Н-связей между гидроксильными группами фрагментов А и В пигментов, гликозидной части молекул и воды Вторая группа характеристических полос в области 1220-1210 см"1 вызвана валентными колебаниями групп С-О и С-О-Н в фенолах Полученные спектры иллюстрируют возможность подтверждения наличия метоксильных групп в структуре пигментов по поглощению в области 2992-2851 см"' (две полосы), характерному для валентных колебания метильных и метиленовых групп, и по полосе средней интенсивности в области 1397-1390 см"' вследствие деформационных колебаний метальной группы (рис 3 б)

Глава 4. Выделение и анализ антоциановых красителей.

Представлены данные по определению содержания АЦ в красителях, полученных из ягод ежевики, черной смородины, черноплодной рябины и соцветий каркаде Отмечено, что концентрация пигментов в красителях из сырья хорошего качества составляет 45-55 г/л Черноплоднорябиновый краситель характеризуется наибольшим содержанием пигментов - 55 г/л Краситель, полученный из подгнивших ягод черноплодной рябины, представляет собой сиропообразную жидкость бурого цвета с концентрацией АЦ пигментов 13 г/л, что более чем в 4 раза ниже по сравнению с красителем, полученным из качественного сырья

Для изучения пигментного состава красителей и выделения отдельных компонентов использован метод ТСХ с применением в качестве подвижной фазы АУВ В этом случае основной характеристикой эффективности

процесса служит величина разрешающей способности R* Разделение двух соседних зон считается полным при R>1,5 Показано, что на пластинах «Silufol» достигается полное разделение пигментов красителей из плодового сырья (R*=l,6-2,1), а для разделения АЦ каркаде лучшими являются пластины марки «Sorbfil» (R =2,3)

Основные спектральные характеристики выделенных АЦ красителей и величина Rf представлены в таблице 2 По положению характеристических максимумов ï! и А." сделано предположение о строении антоцианидинового фрагмента (Ац) В спектрах АЦ отмечены дополнительные интенсивные максимумы в области 310-350 нм, характерные для ацилированных структур (А^ац) Рассчитанные величины отношений А-к ац/А >. тах > 48% позволяют предположить, что пигменты, за исключением АЦ черноплодной рябины с Rf=0,22, ацилированы фенольными кислотами Пигменты являются моногликозидами (С3) на основании того, что соотношения та\ /А/ гпах >50% и Амоо/Ах" тах >18 Методом ВЭЖХ, в условиях ОФ хроматографии, подтвержден пигментный состав красителей черноплодной рябины и каркаде Основными пигментами черноплодной рябины являются АЦ-3-Glu цианидина (Су), с остатками галактозы и арабинозы В красителе каркаде АЦ-3-GIu являются производными Df и Су

Таблица 2

Хроматографическая и спектральные характеристики антоцианов,

выделенных из спиртовых экстрактов антоциансодержащего сырья

Сырье Rr С2Н5ОН + HCI AU л Я 440 А , Л тах ^■Лац

нм к „.„ нм

А Я" тах % А Я" тах % л Я" тах %

Ежевика 0,24 280 538 су 22 96 -

0,31 280 538 30 110 55

0,36 280 533 56 240 140

Каркаде 0,28 276 536 су 44 120 60

0,38 271 545 Df 30 170 95

Черная смородина 0,19 277 550 Df 22 85 48

0,26 - 540 су 24 - 81

0,31 - 540 53 - 368

Черноплодная рябина 0,22 288 536 Су 24 215 38

0,28 - 536 21 - 63

Одним из преимуществ хроматографии в тонком слое сорбента является возможность идентификации веществ при помощи специальных реагентов Отмечено, что зоны пигментов красителей после обработки ФМК,

/

перекрывались сине-зелеными пятнами, хотя АЦ-3-Glu сохраняли характерную окраску. По всей видимости, окислению подвергаются остатки фенольных кислот, содержащиеся в молекулах АЦ. Тем самым подтверждается версия сложного строения АЦ. Отнесение веществ с отдельных зон хроматограмм к классу флавоноидов сделано на основании характерных реакций с проявителями на полифенольные соединения и по виду УФ-спектров. В экстракте каркаде это соединение с R|<-,=0,68, в экстракте т ежевики - Rif,~0,43 и черной смородины - Rw=0,67. Обнаруженные фенольные соединения позволяют сделать вывод о повышенной биологической ценности этих красителей.

На примере водных и этанол ьных растворов красителя каркаде рассмотрен подход к получению градуировочных зависимостей параметров цветности RGB от концентрации ЛЦ пигментов. В используемой цветовой модели цвет красителя определяется как точка в трёхмерном цветовом пространстве в координатах ¡рёх базовых цветовых компонентов по формуле:

С = rR i gG + ЬВ •

где: С - цветность вещества; т, g, b -доля красной, зелёной и голубой окраски, соответственно; fLG.B ~ орты векторов красного, зелёного и голубого цветов.

Значение каждого цветового компонента в RGB-модели измеряется в интервале от 0 до 255 усл. ед., что обусловливается исторически сложившейся архитектурой персональною компьютера.

Рисунок 5 демонстрирует функции отклика, полученные при измерении параметров цветности для 10 стандартных этанольных (а) л водных (б) растворов краен теля каркаде.

С. г/л

а б

Рис.5. Зависимость яркости каналов К, О, В от концентрации антоциановых пигментов (а) в этанольном и (б) водном растворе красителя каркаде

Из рис. 5.а. йидно, что при ш'Зрастанин концентрации АЦ пигментов этанолъных растворов значения параметров О и В уменьшаются почти линейно до определенного придела (С приблизительно до концентраций пигментов разной 10 г/л, В до - 20 г/л), после чего отклик становится почти независимым от концентрации. Функция отклика по параметру Я этанол ьных растворов возрастает в области малых концентраций примерно до 5 г/л, после чего имеет место искривление и отклик начинает почти линейно убывать для всех концентраций. Экспериментальные данные линейной части зависимостей использованы для нахождения параметров градуировочных функций, представленных на рис. 6.а. Т.о., цветометрические измерений показали, что все цветовые компоненты К. б, и В могут быть использованы для количественных измерений концентрации, наиболее широкий линейный диапазон имеет компонента К.

Для водных растворов отмечен отличный характер изменения параметров цветности (рис. 5.6). Яркость каналов С. В почти линейно убывает с увеличением концентрации пигментов во всем диапазоне концентраций. При уровне значимости 0,05 дисперсии коэффициентов градуировочной функции по С и В не отличаются значимо, что дает праио нахождения функциональной зависимости по объединенным данным СВ* (рис. 6.6), На рисунке 6 рабочая область концентраций по величине оптической плотности обозначена отрезками С=1"(А) на оси концентраций.

Рис.6, Градуировочные графики для нахождения концентрации АЦ (а) в этаиольных и (б) водных растворах красителя каркаде по параметрам цветности

Таблица 3 позволяет сравнить точность моделей по параметрам цветности и величине оптической плотности. Методики не отличаются по стадиям подготовки анализируемых образцов, аналитический сигнал измеряют при одной толщине поглощающего слоя (1=2 см). Отличаются методики только способом регистрации отклика. В первом случае это фото э л е ктр о к о л о р и м етр (КФК-2), а во втором сканер (НР 5сап|е! 3570С).

С. г','] г

С, 1Й

а

б

Пробу водного раствора АЦ (4,4 г/л) анализировали обоими методами, результаты сведены в таблице 3

Дисперсии данных по RGB намного выше дисперсии данных, полученных спектрофотометрическим методом F-тест показывает, что дисперсии не равны, т к значение F больше критического значения F (f|=5, f2=5, р=0,05) Если важна точность, то, очевидно, следует избрать спектрофотометрический метод С другой стороны, если важно не столько точность, сколько экономия времени и реактивов при выполнении анализа, очевидна ценность цветометрического подхода Статистически обосновано то, что разница между средними анализа, полученными спектрофотометрическим методом и RGB, не является значимой (t3=2,50<t (р=0,05, f=3))

Таблица 3

Результаты анализа водного раствора красителя каркаде с концентрацией АЦ 5,4 г/л спектрофотометрическим и цветометрическим

методами, р=0,05

Аналитический сигнал С±Д, г/л S, г/л

А 5,35±0,06 0,0712

GB" 8,42±2,50 3,0041

где А - оптическая плотность GB - параметры цветности

Таким образом, нами показано, что экономичная экспрессная цветометрическая методика определения концентрации АЦ может быть успешно использована в качестве альтернативы спектрофотометрической методике Ее преимуществом является низкая стоимость измерений, приборов (сканер или цифровая фотокамера), возможность анализировать непрозрачные и мутные растворы, твердые образцы, что весьма актуально для пищевой и фармацевтической промышленности

Установлено, что количественный анализ концентратов АЦ пигментов растительного сырья (С>90 г/л) возможен по результатам расчета видеоизображения хроматограммы программой «Sorbfil Videodensitometer», которая осуществляет расчет Rf и площади каждой зоны, исходя из положения, что размер и яркость пятна определяются количеством вещества в пятне

На хроматограммах красителя каркаде отчетливо видно две зоны АЦ пигментов, значение Rf, рассчитанное в программе «Sorbfil Videodensitometer», для первой зоны составляет 0,34, а для второй 0,41 Анализ полученных данных позволил установить линейную зависимость между суммарной площадью зон пигментов (S) и концентрацией АЦ (рис 7) Уравнение полученной функциональной зависимости имеет вид S=(128±7)*C

Рис 7 Градуировочный график для нахождения содержания АЦ пигментов в концентрате каркаде / методом ТСХ (элюент - АУВ,

к'=094 пластины марки - «Бйий}!») по

б=(128±7гс суммарной площади зон пигментов с

Яп=0,34 и Я(2=0,41

300

С ■/■

Глава 5 Выделение антоциановых пигментов методом колоночной хроматографии.

Установлено, что поглощение АЦ пигментов Стиросорбом-МХДЭ-100 из водной и спиртовой среды протекает с разной эффективностью отличия ярко выражены в характере кинетических кривых сорбции, полученных в статическом режиме, представленных на рисунке 8 Более крутым ходом кривой сорбции описывается поглощение АЦ пигментов из водных растворов За 10 часов процесса величина оптической плотности водного раствора красителя уменьшилась на 65%, а этанольного - на 15%

Рис 8 Кинетические кривые сорбции антоциановых пигментов каркаде из 96% этанольной (1) и водной (2) сред сорбентом Стиросорб-МХДЭ-100

Отмеченное явление можно объяснить с позиции межмолекулярных взаимодействий в системе растворитель-сорбат Представленные условия являются классическим примером обращенно-фазовой хроматографии в которой элюирующая сила воды характеризуется значением 0, те энергия сорбции минимальна Вследствие этого молекулы АЦ легко вытесняют молекулы воды с поверхностного слоя сорбента Для этанола элюирующая сила составляет 3,9, молекулы спирта значительно сильнее сорбируются на поверхности, что затрудняет поглощение АЦ

Нами отмечено, что более эффективно происходит поглощение АЦ при подкислении водных растворов Следовательно, в зависимости от равновесной формы АЦ их сорбционная активность на сверхсшитом сорбенте различна Поверхность сверхсшитого полимера не ведет себя как пассивная

неполярная фаза, что отмечено в работах В А Даванкова Возможно, что при сорбции АЦ наблюдаются селективные электрофильные взаимодействия (перенос заряда) положительно заряженных фрагментов молекул АЦ с л-электронной системой бензольных колец на поверхности сорбента

Установлено что при десорбции этанолом достигается концентрирование АЦ в 10-50 раз при степени извлечения 78-85% Молекулы растворителя вытесняют поглощенные АЦ в силу того, что этанол характеризуется не только сильным взаимодействием с поверхностью Стиросорба, но и с молекулами АЦ

Наряду со статическим режимом использован динамический способ поглощения АЦ на Стиросорбе-МХДЭ-100 Водный раствор объемом 500 мл с концентрацией АЦ пигментов красителя каркаде 11,2 г/л пропущен через слой сорбента Концентрация пигментов в объединенном водном элюате составила 9,6 г/л Объединением семи интенсивно окрашенных этанольных фракций объемом 1 мл получен раствор с концентрацией АЦ пигментов 112 г/л Концентрация АЦ в пропущенном водном растворе красителя черноплодной рябины, полученного из подгнивших ягод, составила 2,24 г/л В объединенном водном элюате - 1,09 г/л Пять окрашенных этанольных фракции по 1 мл объединили, получив концентрат с концентрацией АЦ 114 г/л

Таким образом, нами найден способ выделения красителей из разбавленных водных АЦ содержащих растворов, основанный на применении метода колоночной хроматографии с использованием неионогенного сорбента Стиросорб-МХДЭ-100

Спектральные характеристики, используемые для оценки качества выделенных экстракцией и концентрированием красителей из ягод черноплодной рябины и каркаде, представлены в таблице 4

Таблица 4

Спектральные характеристики этанольных растворов красителей полученных экстракцией и концентрированием, С(АЦ)=11 г/л

Сырье Способ выделения г," Г- щах Аз<,|)/А,пя1 Атах+А420 Атт/А420

Каркаде Экстракция 550 1,60 1,60 2,20

Концентрирование 550 1,50 0,80 2,30

Черноплодная Экстракция 550 1,60 1,10 1,10

рябина Концентрирование 540 0,40 0,80 4,90

где Ачоо/Ата,, - оценка относи тельного содержания примесей Ат„+Л42о - интенсивность общей окраски, А^/Адго - интенсивность красной окраски

Рассчитанные характеристики указывают на высокое качество красителей, выделенных предложенным способом. Продукт отличает более яркий красный цвет вследствие значительного снижения содержания окрашенных форм лейкоантоиианов и танинов (коричневые вещества). Особенно это проявляется при использовании некондиционного сырья (подгнившие ягоды черноплодной рябины). В результате происходит не только увеличение концентрации пигментов, но и уменьшение содержания примесей,

Методом ВЭЖХ установлено, что качественный состав АЦ-З-Ши в красителях, выделенных методом колоночной хроматографии, не отличается от состава красителей, выделенных экстракцией.

Нами обнаружен эффект стабилизации АЦ в водной среде (рН=5) при хранении в сорбированном состоянии на макропористом неионогешюм сорбенте Стироеорб-МХДЭ-100.

а б

Рис. 9. Спектры поглощения этанольных элюатов послс хранения красителей в сорбированном состоянии на Стиросорбе-МХДЭ-100, (а) -черно плодноряби новый, (б) - к аркаде. Условия хранения: I - на свету, 1=18-25°С; 2- в темноте, 1=18-25'С; 3 - в темноте, 1-5-8°С; (а) - б месяцев; (б) - 12 месяцев

АЦ концентрата черноплодной рябины, выделенные после хранения в течение 6 месяцев, сохранили характерную окраску. Спектры поглощения этанольных элюатов представлены на рис. 9.а, Концентраты после хранения в темноте при 5-8°С отличались темно-фиолетовой окраской. Отмечено увеличение интенсивности поглощения и батохромное смещение положения максимума в видимой области света на 45 нм по сравнению со спектрами свежего концентрата. Наблюдаемые изменения, по-видимому, связаны с эффектом стабилизации цвета при хранении АЦ в темноте при низких температурах посредством образования ко пигментов. Можно полагать, что устойчивость хиноидной формы в фазе сорбента (по сравнению с гомогенными растворами) повышается. Дополнительное подтверждение

получено методом ВЭЖХ Особенность методики заключалась в необходимости разбавлять элюаты, что послужило причиной распада комплексов, вследствие чего идентифицированы те же АЦ-3-С1и, что и в свежем красителе

Эффект стабилизации АЦ при хранении в течении 24 месяцев наблюдается только при низких температурах В спектрах поглощения окрашенных элюатов наблюдается максимум при 530 нм, гипсохромный сдвиг на 20 нм по сравнению с положением максимума для свежего концентрата (рис 9 б) Вместе с тем отмечен факт увеличения интенсивности красной окраски Величина соотношения Ащах^го равна 6,60, что почти в 3 раза выше, чем для элюата, выделенного сразу после сорбции Методом ВЭЖХ установлено, что концентрат каркаде не содержит моноформ Очевиден факт особого механизма стабилизации окраски пигментов

Информацию о распределении АЦ, выделенных из соцветий каркаде, по хроматографической колонке получили по характеру ИК и УФ спектров 16 этанольных фракций Пигменты первых фракций менее всех удерживаются сорбентом и вымываются элюентом

По виду УФ-спектров указанные фракции можно разделить на две группы К I группе можно отнести с 1 по 6 антоциансодержащие фракции, электронные спектры которых имеют три четко выраженных максимума при 275-282, 318-323 и 543-548 нм Ко II группе относятся фракции с 7 по 16 с основным поглощением в области 274-281 и 532-540 нм

Поглощение в области 274-282 нм может быть связано с переходами л—>л* хиноидных структур и фенольных колец АЦ молекул Поглощение 318-323 нм, очевидно, обусловлено переходами л—>л* в кислотном остатке пигментов ацилированных ароматическими кислотами Максимум в области 532-548 нм обусловлен я—»л* поглощением единой хромофорной системы л-связей АЦ

Таким образом, АЦ состав фракций I группы представлен преимущественно ацилированными пигментами По всей видимости, пигменты следующих фракций, прочнее удерживаемые сорбентом, неацилированы Заслуживает внимания гипсохромный сдвиг X ' в спектрах поглощения фракций II группы на 10-14 нм по сравнению с фракциями 1 группы, который свидетельствует об уменьшении числа гидроксильных групп в кольце В Следовательно, можно предположить, что пигментный состав фракций II группы представлен преимущественно АЦ, содержащими фрагмент Су-З-Ии, а 1 группы - В1'-3-С1и Так ассоциаты АЦ с О!" структурой образуют с молекулами этанола 3 водородных связи (кольцо В), соответственно и межмолекулярный комплекс «пигмент-этанол» движется быстрее по макропорам Стиросорба-МХДЭ-100, чем менее прочный комплекс «цианидинсодержащий АЦ-этанол», имеющий в составе две Н-связи (кольцо В) Таким образом, скорость движения по высоте сорбента АЦ

определяется строением пигментов и природой ассоцнатов с молекулами растворителя.

Более богатую информацию по свойствам антогщаяов дают ИК спектры (рис. 9). Установлено, что АЦ каждой фракции являются гликозидами. О присутствии гликозидированпых групп свидетельствуют пики при ] 566, 1526 и 1500 см*1, а также максимумы 1558-1136 см"1 и 840-820 см"1, характерные

колебаниям в кольце пиранозы. В ИК-спектрах 1-6 фракциях отмечены

о

полосы при 1736-1702 см"1 (\>С---о в подтверждающие то, что

пигменты ацилированы.

Следовательно, ацилированные гликозиды, антощ-ганидиновый фрагмент которых содержит большее число гидроксильных групп, слабее удерживаются сорбентом, чем молекулы н е а ци л и ро ва н н ы х глшеозидов, имеющих меньший размер. Можно сделать предположение, что в условиях эксперимента преобладает ситовый механизм сорбции АЦ.

Рис. 9. ИК спектр фракции 6, кремниевые пластины, 8ресога-Ш-75

4000 3000 ' 1000

V, см

Необходимо отметить, что спектр в области 3600-3120 см"1 имеет вид огибающей кривой. Это свидетельствует об образовании общих ассоциированных структур в системе «АЦ-этанол» с участием водородных мостиков. Необходимо отметить, что в литературе не обсуждается принадлежность полос поглощения для АЦ в рассматриваемой области. Полагаем, что здесь имеет место образование Н-сиязей между: оксониевым катионом и спиртовой группой этанола (3124-3112 см"1); фенольной группой и спиртовой группой (3246-3220 см"1); ацилъной группой и спиртовой группой (3380-3360 см"'); спиртовой группой этанола и ОН-группой гликозида (3422-3396 см"1); (3476-3462 см"1). При 3541-3502 см"' проявляются валентные колебания групп -ОН, участвующих в Н-связях с разу порядочной структурой.

Для расчета параметров водородных связей был использован принцип смещения валентных колебаний ОН-группы (Д\') различной степени связанности. Наиболее прочные Н-связи с молекулами этанола возникают между фенольнымн ОН группами, величина энергии связен от 32,42 до 33,26

кДж/моль Несколько слабее Н-связи, возникающие с кислородом

карбонильной группы кислотного остатка, Ен=24,91-23,01 кДж/моль

Остальные типы Н-связей характеризуются более низкой энергией

Выводы

1 _ Установлено, что наиболее эффективным элюентом для разделения

антоциановых пигментов методами планарной хроматографии является смесь растворителей н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода в объемном соотношении 2 11 На основе выполненных исследований предложен новый способ оценки качества антоциановых красителей

2 Исследованиями показано, что цветометрия с применением шкалы цветности RGB может быть использована для количественного анализа антоцианов в водных и этанольных растворах Сопоставление метрологических характеристик цветометрической и спектрофотометрической методик показало, что точность получаемых результатов сопоставима Поэтому в ряде случаев перспективным является использование экспрессной и экономичной цветометрии

3 Показано, что для количественного анализа концентратов антоциановых красителей методом тонкослойной хроматографии можно использовать программное обеспечение «Sorbfil Videodensitometer»

4 Разработан новый способ выделения антоциановых красителей из разбавленных водных растворов методом колоночной хроматографии с использованием макропористого неионогенного сорбента Стиросорб-МХДЭ-100 Достигается концентрирование пигментов в 10-50 раз при степени извлечения 78-85% Установлено высокое качество красителя

5 Впервые отмечен эффект стабилизации антоцианов при нахождении в сорбированном состоянии Наиболее сильный эффект стабилизации окраски отмечен в случае хранения при низких температурах

6 Выполнены расчеты энергетических параметров Н-связей гидратов антоциановых пигментов с использованием данных ИК спектроскопии, показывающие образование прочных комплексов антоциан-этанол Наиболее сильные Н-связи с молекулами этанола возникают между фенольными гидроксильными группами

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Ломова ТС Концентрирование экстракта антоцианового красителя из растительного сырья / Т С Ломова [и др ] // Мат-лы XLIII отчетной конференции за 2004 г Воронеж гос технол акад, Воронеж, 2005 г -I ч,-С 121-123

2 Ломова ТС Исследование антоциановых пигментов экстракта черноплодной рябины хроматографическими и спектральными методами / ТС Ломова, В M Болотов [и др ] // Пути и формы совершенствования фарм образования тез докл 2-ой Всерос науч -метод конф , Воронеж, 2005 г - Воронеж ВГУ, 2005, - С 302-304

3 Ломова Т С Пищевые антоциановые красители с повышенным содержанием красящих веществ /ТС Ломова, В M Болотов [и др ] // Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России тез докл Межд конф, Санкт-Петербург, 12-13 октября 2005 г - С П , 2005 - С 58

4. Ломова Т С Экстракция пищевых красителей из растительного сырья / Т С Ломова, В M Болотов [и др ] // Экстракция органических соединений тез докл III Межд конф, Воронеж, 17-21 окт 2005 г -В, 2005 -С 201

5 Ломова Т С Оценка качества антоциановых красителей /ТС Ломова, В M Болотов, В Ф Селеменев // Мат-лы XLIV отчетной конференции за

2005 г Воронеж гос технол акад, Воронеж, 2006 г - 1 ч, - С 186-187

6 Ломова Т С Разделение антоциановых пигментов сорбционными методами /ТС Ломова, В Ф Селеменев [и др ] // Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах тез докл III Всерос конф , Воронеж, 8-14 октяб 2006 г - В , 2006 - С 838840

7 Ломова Т С Концентрирование антоциановых пигментов хроматографическим способом /ТС Ломова, В M Болотов [и др ] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / Пятигорская гос фармац акад - Пятигорск,

2006 -Вып 61 -С 243-244

8 Разделение антоцианов, содержащихся в ежевике и каркаде, методом ВЭТСХ /ТС Ломова, В Ф Селеменев [и др ] // Сорбционные и хроматографические процессы -2006 -Т6, вып 6, ч 4.-С 1393-1398

9 Применение метода ТСХ для оценки качества антоцианового красителя/ Т С Ломова [и др ] // Изв ВУЗОВ Пищевая технология - 2007 - №1 - С 86-88

10 Ломова Т С Разделение и анализ пигментов, красного натурального красителя /ТС Ломова, В Ф Селеменев [и др ] // Интеграция науки и образовательного процесса Создание новых физиологически активных

веществ тез докл 3-й Всерос науч -метод конф, Воронеж 22-24 марта 2007 г - Воронеж ВГУ, 2007 - 4 1 -С 213-215

11 Ломова ТС Получение и анализ антоцианового красителя/ ТС Ломова, В Ф Селеменев, В M Болотов // Пищевые технологии тезис докл VIII Всерос конф молодых ученых с международным участием, Казань 2007г - Изд «Отечество», 2007 - С 350-352

12 Пат 2302436 Российская Федерация, МПК С 09 В 61/00 Способ получения антоцианового красителя 1 Болотов В M , Ломова ТС [и др ], заявитель и патентообладатель Воронеж гос ун-т - № 2005132873, заявл 25 10 05 , опубл 10 07 07, Бюл №19 - 4 с

13 Заявка 2006121294/28(023118) Российская Федерация, МПК G01N 30/90, С09В 61/00 Способ оценки качества антоцианового красителя полученного бескислотным способом / Селеменев В Ф, Ломова Т С [и др.], заявитель Ворон Гос тех-я академ , Ворон гос ун-т - заявл 15 06. 06

Работы № 8, 9 опубликованы в изданиях входящих в перечень ВАК

Подписано в печать Ц 09 2007 Уел печ л i,0 Тираж 100 экз Заказ 309

ГОУ ВПО Воронежская государственная технологическая академия (ВГТА)

Отдел полиграфии Адрес академии и отдела полиграфии 394000 Воронеж, пр Революции, 19

Основные принятые обозначения.

Введение.

ГЛАВА 1 Обзор литературы.

1.1 Строение и поведение антоцнановых пигментов в растворах.

1.2 Выделение антоцнановых красителей из растительного сырья.

1.3 Спектральные методы анализа антоцнанов.

1.4 Выделение и разделение антоцнановых пигментов хроматографическими методами.

1.5. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования.

2.1 Модельные образцы флавонондов.

2.2. Используемые сорбенты и их характеристики.

2.3 Дополнительные реагенты.

2.4. Аитоцнансодержащее сырье, используемое для выделения красителя.

2.5 Выделение красителей из антоцнансодержащего сырья.

2.6 Определение количества красящих веществ в натуральных красных пищевых красителях.

2.7 Определение рН натуральных пищевых красителей.

2.8 Получение градунровочной зависимости оптической плотности от концентрации антоцнановых пигментов.

2.9 Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения антоцнановых пигментов в спиртовых и водных растворах.

2.10 Бумажная хроматография.

2.11 Хроматография красителей и растворов индивидуальных антоцнан-3-глюкозндов в тонком слое сорбента.

2.12 Количественный расчет хроматограмм с применением программы «Sorbfll Videodensitometer».

2.13 Выявление неокрашенных фенольных компонентов красителей в тонком слое сорбента.

2.14 Препаративная ТСХ компонентов красителей, с последующим спсктрофотометрнческнм анализом выделенных веществ.

2.15 Анализ антоцнансодержащнх растворов методом ВЭЖХ.

2.16 Препаративное разделение антоцнановых пигментов методом ВЭЖХ.

2.17 УФ и видимая спектроскопия исследуемых веществ.

2.18 ИКС анализ изучаемых веществ.

2.19 Изучение условий сорбции антоцнановых пигментов в статических условиях.

2.20 Концентрирование антоцнановых пигментов красителя каркаде и черноплодной рябины нз разбавленных водных растворов.

2.21 Фракционирование антоцнановых пигментов красителя каркаде.

2.22 Условия хранения.

2.23 Дополнительное оборудование.

ГЛАВА 3. Аналитические характеристики модельных растворов антоцианов.

3.1 Планарная хроматография.

3.2 УФ и видимая спектроскопия.

3.3 ИК-спектроскопня.

Актуальность работы. Антоциановые пигменты (АЦ) обладают высокой биологической активностью и используются не только как натуральные пищевые красители, но и как биологически активные добавки. Для пищевой и фармацевтической промышленности актуальной проблемой является разработка способов выделения и недорогих, экспрессных методик качественного и количественного анализа АЦ в растительном сырье, экстрактах и пигментсодержащих продуктах. Важнейшей стадией аналитического контроля АЦ является пробоподготовка, включающая в себя экстракцию и концентрирование аналита. В этом плане интерес представляет метод колоночной хроматографии с применением неионогенных макропористых сорбентов, используемых для концентрирования биологически активных веществ.

Работа выполнена в соответствии с планами НИР ВГТА по теме «Выделение, изучение состава и свойств природных и модифицированных биологически активных органических соединений из растительного сырья», с координационным планом Научного совета РАН по адсорбции и хроматографии 2004-2007 г. (код 2. 15. 7. 2., раздел «Синтез и исследование свойств полимерных сорбентов и носителей для хроматографии»). Часть работы выполнена в рамках гранта РФФИ № 06-08-00448 «Разработка методов диагностики качества продукции по параметрам цветности с применением цифровых технологий».

Цель работы состояла в разработке комплекса методик качественного и количественного анализа АЦ с использованием спектрофотометрии, цветометрии, планарной и колоночной хроматографии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- выделить АЦ пигменты из красителей, полученных из природного сырья, методами тонкослойной и колоночной хроматографии;

- провести анализ хроматографических и спектральных характеристик модельных антоциан-3-глюкозидов (АЦ-3-01и) и АЦ, выделенных из экстрактов выжимок ягод ежевики, черной смородины, черноплодной рябины и соцветий каркаде;

- установить закономерности сорбции и разделения АЦ пигментов на минеральных и органических сорбентах;

- разработать методики количественного анализа антоциановых соединений в красителях с применением компьютерных технологий.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующем:

- найдены условия разделения АЦ пигментов методами бумажной и тонкослойной хроматографии;

- предложен способ оценки качества антоциансодержащих красителей с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ). Методика защищена положительным решением о выдаче патента РФ (заявка № 2006121294/28(023118) «Способ оценки качества антоцианового красителя, полученного бескислотным способом»);

- разработан способ выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов с применением метода колоночной хроматографии на неионогенном сорбенте - Стиросорб-МХДЭ-100. Методика защищена патентом на изобретение РФ № 2302436 «Способ получения антоцианового красителя»;

- рассмотрены условия длительного хранения природных АЦ, в сорбированном состоянии с использованием макропористых неионогенных матриц;

- предложены градуировочные зависимости по параметрам цветности для нахождения концентрации АЦ пигментов в водных и этанольных растворах. Прастическая значимость работы. Приоритет, новизна и практическая значимость исследований подтверждена патентом на изобретение РФ и положительным решением на выдачу патента РФ.

На основании проведенных исследований установлена целесообразность использования неионогенного сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100 для выделения АЦ пигментов из разбавленных водных растворов с целью получения концентрата, необходимого в пищевой и фармацевтической промышленности. Методика разделения АЦ методом ТСХ позволяет не только выделять отдельные пигменты, но и делать выводы о качестве и биологической ценности анализируемого красителя. Разработаны условия длительного хранения АЦ с использованием макропористых неионогенных матриц, позволяющие увеличить срок использования красителя без привлечения стабилизирующих добавок.

Положения, оыноснмые на защиту:

- оптимальные условия разделения АЦ пигментов экстрактов растительного сырья методами планарной хроматографии;

- способ концентрирования АЦ из разбавленных растворов методом колоночной хроматографии с применением неионогенного макропористого сорбента марки Стиросорб-МХДЭ-100;

- цветометрические способы количественного анализа АЦ водных и этанольных растворов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на II Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фарм. образования» Фармобразование - 2005 (Воронеж, 2005 г.); III Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС - 2005 (Воронеж, 2005 г.); Международной конференции «Научное обеспечение и тенденции развития производства пищевых добавок в России» (Санкт-Петербург, 2005 г.); III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» ФАГРАН-2006 (Воронеж, 2006 г.); Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» Фармобразование - 2007 (Воронеж, 2007 г.); 61 региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006 г.); VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии» (Казань 2007 г.); на ежегодных отчетных конференциях, проводимых Воронежской государственной технологической академией (Воронеж 2005,2006 г.г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, одна из которых в издании, рекомендованном ВАК РФ, 9 тезисов докладов, получен патент на изобретение РФ.

Основные результаты и выводы

1. Установлено, что наиболее эффективным элюентом для разделения антоциановых пигментов методами планарной хроматографии является смесь растворителей н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода в объемном соотношении 2:1:1. На основе выполненных исследований предложен новый способ оценки качества антоциановых красителей.

2. Исследованиями показано, что цветометрия с применением шкалы цветности RGB может быть использована для количественного анализа антоцианов в водных и этанольных растворах. Сопоставление метрологических характеристик цветометрической и спектрофотометрической методик показало, что точность получаемых результатов сопоставима.

3. Показано, что для количественного анализа концентратов антоциановых красителей методом тонкослойной хроматографии можно использовать программное обеспечение «Sorbfil Videodensitometer».

4. Разработан новый способ выделения антоциановых красителей из разбавленных водных растворов методом колоночной хроматографии с использованием макропористого неионогенного сорбента Стиросорб-МХДЭ-100. Достигается концентрирование пигментов в 10-50 раз при степени извлечения 78-85%. Установлено высокое качество красителя.

5. Впервые отмечен эффект стабилизации антоцианов при нахождении в сорбированном состоянии. Наиболее сильный эффект стабилизации окраски отмечен в случае хранения при низких температурах.

6. Выполнены расчеты энергетических параметров Н-связей сольватов антоциановых пигментов с использованием данных ИК спектроскопии, показывающие образование прочных комплексов антоциан-этанол. Наиболее сильные Н-связи с молекулами этанола возникают между фенольными гидроксильными группами антоцианов.

132

1. Барабой В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений / В.А. Барабой. Киев : Наукова думка, 1976. - 260 с

2. Francis F. J. Food colorants: Anthocyanins. Crit. Rev / F. J. Francis // Food Sei. Nutr. 1989, № 28. - C. 273-314.

3. Philpott M. Gould In Situ and In Vitro Antioxidant Activity of Sweetpotato anthocyanins / M. Philpott // J. Agrie. Food Chem. 2004. - V. 52, № 6. - P. 1511-1513.

4. Кострова И.Е. Применение натуральных пищевых ингредиентов в масложировой промышленности / И.Е. Кострова, И.А. Гринько, O.A. Уварова // Пищевая промышленность. 2002,- № 10. - С. 56-58.

5. Булдаков A.C. Пищевые добавки. Справочник / A.C. Булдаков. СПб.: «Ut», 1996.-240 с.

6. Носов A.M. Лекарственные растения официальной и народной медицины / A.M. Носов. М. : Изд-во Эксмо, 2005. - 800 с.

7. Дмитровский A.A. Экспериментальная витаминология / A.A. Дмитровский. Минск : Наука и техника, 1990. - 552 с

8. Орещенко A.B. Исследование новых антиоксидантов для производства напитков / A.B. Орещенко, JIM. Урусова, М.А. Грум-Гржимайло // Пищевая пром-сть. 1995. - № 9. - С.4.

9. Багхи Д. Антиангиогенные, антиоксидантные и антиканцерогенные свойства нового, богатого антоцианином препарата из экстракта ягод / Д. Багхи , К.К. Сен, М. Багхи, М. Аталай // Биохимия. 2004. - Т. 69, вып. 1. - С. 95-102.

10. Lister C.E. Pigments: Not just a pretty face / C.E. Lister, H.J. Simmonds // Proc. Nutr. Soc. N.Z. 1999. № 24. -P. 34-39

11. Гордон П. Органическая химия красителей / П. Гордон, П. Грегори М. : Мир, 1987.-344 с.

12. Джоуль Дж. Основы химии гетероциклических соединений / Дж. Джоуль, Г. Смит. М.: Мир, 1975. - 398 с.

13. Каррер П. Курс органической химии / П. Каррер. Л. : Госхимиздат, 1962. -1216 с.

14. Марч Дж. Органическая химия. Реакции, механизмы и структура.: в 4-х т. / Дж. Марч; пер. с англ. З.Е. Самойловой ; под ред. И.П. Белецкой. М.: Мир, 1988.-Т.4.-468 с.

15. Гудвин Т. Введение в биохимию растений : В 2-х т. / Т. Гудвин, Э.Т. Мерсер -М.: Мир, 1986.-Т. 2.-312 с.

16. Танчев С.С. Антоцианы в плодах и овощах. М.: Пищевая промышленность, 1980.-304 с.

17. Are anthocyanidins the immediate products of anthocyanidin synthase? / Jonathan J Turnbull etc. // The Royal Society of Chemistry. 2000. -P. 2473-2474

18. Словарь органических соединений: Справочник в 3-х т. / под ред. Хейльброна И., Бэнбери Г.М. М.: Ин. литература, 1949. Т. 1. - 1072 е., Т.2. -892 е., Т. 3.-978 с.

19. Скорикова Ю.Г. Полифенолы плодов и ягод и формирование цвета продуктов / Ю.Г. Скорикова.- М.: Пищевая пром-сть, 1973. 232 с.

20. Goto Т. Structure, Stability and Color Variation of Natural Anthocyanins / T. Goto // Progr. Chem. Org. Nat. Prod. 1987. - V. 52. - P. 113-158.

21. Timberlake C.F. Anthocyanins Occurence, Extraction and Chemistry / C.F. Timberlake // Food Chem. - 1980. - № 5. - P. 69-80.

22. Harborne J. B. Anthocianins and other flavonoids / J. B. Harborne, C. A. Williams // J. Natural Product Reports. 1998. - P. 631-652.

23. Pina F, Structural transformations of the synthetic salt 4',7-dihydroxyflavylium chloride in acid and basic aqueous solutions. Part 1 Ground state / F. Pina; M. Benedito, M. Lina, P. A. Joao, etc // An.Quim. - 1997.-V. 93.-P. 111-118.

24. Pina F. Photochromism of 4'-Methoxyflavylium Perchlorate. A "Write-Lock-Read-Unlock-Erase" Molecular Switching System / F. Pina, M. J. Melo, M. Maestri, R. Ballardini, V. Balzani // J. Am. Chem. Soc. 1997.-V. 119.-P. 5556

25. Photochromism of the Synthetic 4',7-Dihydroxyflavylium Chloride / P. Figueiredo etc. //J. Am. Chem.Soc. 1994.- V. 116.-P. 1249-1254.

26. Pina F. Photochemistry of 3,4-dimethoxy-7-hydroxyflavylium chloride. Photochromism and excited state proton transfer / F. Pina, L. Benedito, M. J. Melo, A. J. Parola, M. A. Bernardo // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1996.- V. 92.-№10.-P. 1693-1699.

27. Maestria M. Light and pH switching between the various forms of the 4'-methylflavylium cation / M. Maestria, F. Pina, A. Roque, P. Passaniti // J. Photochem. Photobiol. 2000,- V. 137.- № 1.- P. 21-28.

28. Pina F. Photochromic flavylium compounds as multistate/multifimction molecular-level systems / F. Pina, M. Maestri, V. Balzani // Chem. Commun. -1999.-P. 107-114.

29. Brouillard R. Mechanism of the Structural Transformations of Anthocyanins in Acidic Media / R. Brouillard, J.-E. Dubois. // J. Am. Chem. Soc- 1977.- V. 99.-P. 1359-1364.

30. Brouillard R. Chemistry of Anthocyanin Pigments. 2. Kinetic and Thermodynamic Study of Proton Transfer, Hydration, and Tautomeric Reactions of Malvidin 3-Glucoside / R. Brouillard, B. Delaporte. // J. Am. Chem. Soc- 1977.- V. 99.- P. 8461-8468.

31. Brouillard R. Origin of the exceptional colour stability of the Zebrina anthocyanin /R. Brouillard, B. Delaporte. //Phytochemistry.- 1981.-V. 20.-P. 143-155.

32. Cheminât A. PMR Investigation of 3-0-(b-D-glucosyl)malvidin. Structural Transformation in Aqueous Solutions / A. Cheminât, R. Brouillard. // Tetrahedron Lett.- 1986.- V. 27.- P. 4457-4460.

33. Brouillard R. The hemiacetal-cis-chalcone equilibrium of malvin, a natural anthocyanin / R. Brouillard, L. Jacques. // Canadian Journal of Chemistry.- 1990.-V. 68.-№ 5.-P. 5755-5761.

34. Photochromism of the Synthetic 4',7-DihydroxyfIavylium Chloride / P. Figueiredo etc. //J. Amer. Chem.Soc. 1994.- V. 116.- № 4.-P. 1249-1254.

35. Merlin J. C. Resonance Raman Spectroscopic studies of anthocyanins and anthocyanidins in aqueous solutions / J. C. Merlin, A. Statoua, J. P. Cornard, M. Saidi-Idrissi, R. Brouillard.//Phytochemistry.- 1994.-V. 35.-№ l.-P. 227-232.

36. Dangles 0. Kinetic and thermodynamic investigation of the aluminium-anthocyanin complexation in aqueous solution / O.Dangles, M. Elhabiri, R. Brouillard. // Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2.- 1994.-№12.- P. 2587-2596.

37. Anthocyanin-aluminium and -gallium complexes in aqueous solution. / M. Elhabiri etc. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 1997.- V. 2.- P. 355-362.

38. Ito F. Why do flavylium salts show so various colors in solution? Effect of concentration and water on the flavylium's color changes. /F. Ito, N. Tanaka, A. Katsuki, T. Fujii. //J. Photochem. Photobiol. A.- 2002. -V. 150. -P. 153-157.

39. Asen S. Anthocyanin, flavonol copigments, and pH responsible for larkspur flower color / S. Asen, R. N. Stewart, K. H. Norris // Phytochemistry. 1975. - V. 14. -P. 2677-2682.

40. Colour and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions / L. Cabrita etc. // Food Chem. 2000. - № 68. - P. 101-107.

41. Effect of caffeic acid on the color of red wine / J. Darias-Martin etc. // J. Agric. Food Chem. 2002. - № 50. - P. 2062-2067.

42. Chemistry of anthocyanin pigments. 2. Kinetic and thermodynamic study of proton-transfer, hydration, and tautomeric reactions of malvidin 3-glucoside / R.J. Brouillard etc. // R.J. Am. Chem. Soc. 1977. - № 99, - P. 8461-8468.

43. Coupling reactions between flavylium ions and catechin // M. T. Escribano-Bailon etc. // Phytochemistry. 1996. -№ 41. -P. 1585-1592.

44. Collins P. Recent developments of natural food colours / P. Collins, C. Timberlake // Overseal Foods, United Kingdom. 1993. - № 6. - P. 32-35.

45. Dangles O. Anthocyanin intramolecular copigment effect / O. Dangles, N. Saito, R. Brouillard // Phytochemistry. 1993. - № 34. - P. 119-124,

46. Cevallos-Casals B. A. Stability of anthocyanin-based aqueous extracts of Andean purple corn and red-fleshed sweet potato compared to synthetic and natural colorants / B. A. Cevallos-Casals, L. Cisneros-Zevallos // Food Chem. -2004. № 86.-P. 69-77.

47. Identification of anthocyanins of pinta boca (Solanum stenotomum) tubers / C. Alcalde-Eon etc. // J. C. Food Chem. 2004. - № 86. - P. 441-448.

48. Flavonoids from Eustoma grandiflorum flower petals / A. Sam etc. // Phytochemistry. 1986. - V. 25. - № 11. - P. 2509-2513.

49. Crosby N.T. Food colours // IARC Sci. Rubl. 1981. - № 40. - P. 311-312.

50. Boulton R. The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A critical review. / R. Boulton // Am. J. Enol. Vitic. 2001. -№ 52. - P. 6787.

51. Mirabel M. Copigmentation in model wine solutions: occurrence and relation to wine aging / M. Mirabel, C. Saucier, C. Guerra // Am. J. Enol. Vitic. 1999, - № 50.-P. 211-218.

52. Eiro M. J. Anthocyanin color behavior and stability during storage: Effect of intermolecular copigmentation / M. J. Eiro, M. J. Heinonen // Agric. Food Chem. -2002.-№50.-P. 7461-7466.

53. Effect of p-coumaric acid on the color in red wine / D. G. Bloomfield etc. // Mitt. Klosterneuburg. 2003. - № 53. - P. 195-198.

54. Structure of new anthocyanin-derived wine pigments / H. Fulcrand etc. // J. Chem. Soc.,Perkin Trans.- 1996.-№ l.-P. 1735-1739.

55. Hayasaka Y. Screening for potential pigments derived from anthocyanins in red wine using nanoelectrospray tandem mass spectrometry / Y. Hayasaka, R. E. Asenstorfer // J. Agric. Food Chem. 2002. - № 50. - P. 756-761.

56. Schwarz M. Isolation and structure of Pinotin A, a new anthocyanin derivative from Pinotage wine / M. Schwarz, G. Jerz, P. Winterhalter // Vitis. 2003. - № 42.-P. 105-106.

57. Czyzowska A. Changes to polyphenols in the process of production of must and wines from blackcurrants and cherries. Part II. Anthocyanins and flavanols / A. Czyzowska, E. Pogorzelski // Eur. Food Res. Technol. 2004. -V. 218. - P. 355359.

58. Schwarz M. Pathway leading to the formation of anthocyanin-vinylphenol adducts and related pigments in red wines // M. Schwarz, T. C. Wabnitz, P. Winterhalter // Agric. Food Chem. 2003. -№ 51. - P. 3682-3687.

59. Davies A. J. Copigmentation of simple and acylated anthocyanins with colorless phenolic compounds / A. J. Davies, G. Maza // J. Agric. Food Chem. 1993. - № 41.-P. 716-720.

60. Eiro M. J. Anthocyanin color behavior and stability during storage: Effect of intermolecular copigmentation / M. J. Eiro, M. J. Heinonen // Agric. Food Chem. -2002.-№50.-P. 7461-7466.

61. Kinetic and thermodynamic control of flavylium hydration in the pelargonidin-cinnamic acid complexation. Origin of the extraordinary, flower color diversity of Pharbitis nil / O. Dangles etc. // J. Am. Chem. Soc. 1993. -№ 115. - P. 31253132.

62. The stabilizing effect of the acyl group on the co-pigmentation of acylated anthocyanins with C-glucosylflavones / T. Hoshino etc. // Phytochemistry.-1980. -№, 19.-P. 663-667.

63. Effect of copigments and grape cultivaron the color of red wines fermented after the addition of copigments / M. Schwarz etc. // J. Agric. Food Chem. 2005. -V. 53 (21)-P. 8372-8382.

64. Davies A. J. Copigmentation of simple and acylated anthocyanins with colorless phenolic compounds / A. J. Davies, G. J Mazza // Agric. Food Chem. 1993. - № ,41.-P. 716-720.

65. Colour and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions / L. Cabrita etc. II Food Chem. 2000. - № 68. - P. 101-107.

66. Fossen T. Color and stability of pure anthocyanins influenced by pH including the alkaline region / T. Fossen, L. Cabrita, O.M. Andersen // Food Chem. -1998. № ,63.-P. 435-440.

67. Enhancement of red wine colour by pre-fermentation addition of copigments / J. Darias-Martin etc. // Food Chem. 2001. - № 73. - P. 217-220.

68. Yabuya Т. Stability of flower colors due to anthocyanin-flavone copigmentation in Japanese garden iris, Iris ensata Thunb / T. Yabuya, M. Saito, T. Iwashina, M. Yamaguchi // Euphytica. 2000. - № 115. - P. 1-5.

69. Организация производства красителей из отходов черноплодной рябины / Ф.Г, Нахмедов и др. // Консервная и овощесушильная промышленность. -1981.-№9.-С. 34-35.

70. Мурадов Н.С. Экстракция красящих веществ из растительного сырья. / Н.С. Мурадов, Т.Н. Дутова, JI.A. Рамазанова // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. - №4. - С. 21-27.

71. Нечаев А.П. Пищевая химия: Конспект лекций. В 2-х ч. / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Кочеткова, И. Б. Кобелева. М.: Издательский комплекс МГУПП, 1998.-4.2.-155 с.

72. Харламова О.А. Натуральные пищевые красители / О.А. Харламова, Б.В. Кафка. М., Пищевая промышленность, 1979. - 191с.

73. Скорикова Ю.Г. Получение антоциановых красителей из отходов сокового производства / Ю.Г. Скорикова // Обз. Инф. Агро. НИИТЭИПП. Сер. Консервная, овощесушильная и пищеконцентратная промышленность. -1997. вып. 3, с. 1-27.

74. Хайрутдинова А.Д. Разработка технологии антоциановых красителей из растительного сырья / автореф. дис. . канд. хим. наук / А.Д. Хайрутдиновой. Воронеж, 2004. - 24 с.

75. Кацерикова Н.В. Натуральные пищевые красители/ Н.В, Кацерикова, В.М. Позняковский. Новосибирск: Издательство «Экор», 1999. - 58 с.

76. Дурмишидзе С.В Флавоноиды и оксикоричные кислоты некоторых представителей дикорастущей флоры Грузии/ C.B. Дурмишидзе. Тбилиси : Мецниереба, 1981. - 197 с.

77. Блажей А. Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, Л. Шутый; перевод со словацк. А.Н. Сергеева; под ред. И. Селищева. М. : «Мир», 1977. - 239 с.

78. Клышев Л.К. Флавоноиды растений (распространение, физикохимические свойства, методы исследования) / Л.К. Клышев, В.А.,Бандюкова, Л.С. Алюкина. Алма-Ата: Изд. «Наука» КазССР, 1978. - 220 с.

79. Казицына Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ- , ИК- и ЯМР-спктроскопии в органической химии. М: Вешая школа, 1971. 264 с.

80. Тиноко И. Физическая химия. Принципы применения в биологических науках / И. Тиноко, К. Зауэр, Дж. Венг, Дж. Паглиси; пер. с англ. Е.Р. Разумовой; под ред. В.И. Горшкова. М: Техносфера, 2005. - 743 с.

81. Цупдель Г. Гидратация и межмолекулярное взаимодействие / Г. Цундель. -М: Мир, 1972. 404 с.

82. Пиментел Дж. Водородная связь / Дж. Пиментел, О. Мак-Клеллан. М: Наука, 1964.-462 с.

83. Райхард К. Растворители и эффекты среды в органической химии / К. Райхард. -М.: Мир, 1991. 763 с.

84. Казначеев А. В. Спектрофотометрическое определение ароматических и гетероциклических аминокислот в их смесях / А. В. Казначеев и др. // Журн. аналит. химии. 2000. - Т. 55. - № 4. - С. 375-377.

85. Коренман И. М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений / И. М. Коренман. М.: Химия, 1970. - 344 с.

86. Берштейн Н. Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии. / Н. Я. Берштейн, Ю. Л. Каминский. Л.: Химия, 1986. - 200 с.

87. Spectroabsorptiometric investigations of complexing reactions of polyhydroxylic flavylium compounds / D. S Veselinovi etc. // Agric. Food Chem. 1992.-№40.-P. 2337-2340.

88. Spectrophotometric study of anthocyan copigmentation reactions / J. M Baranac etc. // J. Agric. Food Chem. 1996. - V. 44 (5). - P. 1333-1336.

89. Spectrophotometric Study of anthocyan copigmentation reactions/ Jelisaveta M. Baranac etc. // J. Agric. Food Chem. 1997. - V. 45 (5). -P. 1694 -1697.

90. Asen, S. Co-pigmentation of anthocyanins in plant tissues and its effect on color // S. Asen, R. N. Stewart, К. H. Norris //. Phytochemistry. 1972. -№11.-P. 1139-1144.

91. Mazza, G. The mechanism of co-pigmentation of anthocyanins in aqueous solutions / G. Mazza, R. Brouillard // Phytochemistry. 1990. - № 29. - P. 10971102.

92. A spectrophotometric study of the copigmentation of malvin with caffeic and ferulic acids / D. Markovifc etc. // J. Agric. Food Chem. 2000. -№ 48. - P 55305536.

93. Spectrophotometric study of anthocyan copigmentation reactions / J. M. Baranac etc. // J. Agric. Food Chem. 1996. 44. - P 1333-1336.

94. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений / К. Наканиси. М: Мир, 1965. - 240 с.

95. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия / А. Смит; под. ред. А. А. Мальцева. М.: Мир, 1982. - 327 с.

96. Лизогуб А. П. Спектральный анализ в органической химии / А. П. Лизогуб. Киев: Изд-во Техника, 1964. - 232 с.

97. Беллами Л. Новые данные по ИК-спектрам сложных молекул / Л. Беллами; под ред. Ю. А. Пентина. М.: Мир, 1971. - 318 с.

98. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии: в 2 кн. / Ю.А. Золотов, E.H. Дорохова, В.И. Фадеева и др.; под ред. Ю.А. Золотова. М.: Высшая школа. - 1996. - Кн. 2 -Методы химического анализа. - 461 с.

99. Карякин A.B. Состояние воды в органических и неорганических соединениях / A.B. Карякин, Г.А. Кривенцова. М: Наука, 1973. - 174 с.

100. Жидкостная колоночная хроматография : в 3-х т. / И. Новак, Я. Янак, С. Вичар; под редакцией 3. Дейла и др. ; пер. с нагл. С.А. Орловского; под ред. В.Г. Березкина. -М.: Мир, 1978. Т. 1. - 554 е.; - Т. 2. - 471 с.

101. Березкин В.Г. Количественная тонкослойная хроматография. Инструментальные методы / В.Г. Березкин, Н.С. Бочаров. М.: Наука, 1980. -183 с.

102. Березкин В.Г. Что такое хроматография? (О новом подходе к определению хроматографии) / В.Г. Березкин. М.: Наука, 2003. - 76 с.

103. Кирхнер 10. Тонкослойная хроматография: в 2-х т. / Ю. Кирхнер ; пер. с англ. А.Ю. Кошевника ; под ред. В.Г. Березкина. М. : Мир, 1981. - Т. 1. -618 с.;-Т.2.-527 с.

104. Хроматография: практическое приложение метода: в 2 ч. / ред.Э. Хефтман ; пер. с анг. В.А. Родионова; под ред. В.Г. Березкина. М. :Мир, 1986 -ч. 2: -422 с.

105. Бражников В.В. Детекторы для хроматографии / В.В Бражников. М : Машиностроение, 1992. - 320 с.

106. Сумина Е.Г. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение: Учеб.-метод. пособие / Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина Н.В. Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 2002. -110 с.

107. Goiffon J.-P. High-performance liquid chromatography of red fruit anthocyanins / J.-P. Goiffon, M. Brun, M.-J. Bourrier // J. Chromatogr. A. -1991.- V. 537.-P. 101-121.

108. Goiffon J.-P. Anthocyanic pigment determination in red fruit juices, concentrated juices and syrups using liquid chromatography / J.-P. Goiffon, P.P. Moulyb, E.M. Gaydouc // Anal. Chim. Acta. 1999.- V. 382.-P. 39-50.

109. Tsao R. Optimization of a new mobile phase to know thecomplex and real polyphenols composition: towards a total phenolicindex using highperformance liquid chromatography / R Tsao, R.Yang. // J. Chromatogr. A. -2003.- V. 1018,- №1.- P. 29-40.

110. Liu X. Quantification and Purification of MulberryAnthocyanins with Macroporous Resins / X. Liu, G. Xiao, W. Chen,Y. Xu, J. Wu // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2004.-V. 5.-P. 326-331.

111. Vendramini A. Phenolic Compounds in Acerola Fruit (Malpighia punicifolia, L.) / A. Vendramini, L. Trugo // J. Braz.Chem. Soc. 2004.- V. 15.- № 5,- P. 326-331.

112. Vendramini A. Phenolic Compounds in Acerola Fruit (Malpighia punicifolia, L.) / A. Vendramini, L. Trugo // J. Braz.Chem. Soc. 2004.- V. 15,- № 5.- P. 326-331.

113. Mondello L. Determination of anthocyanins in blood orange juices by HPLC analysis / L. Mondello, A. Cotroneo, G. Errante, G.Dugo, P. Dugo // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.-2000.-V. 235.-P. 191-195.

114. Su Noh Ryu. High Performance Liquid ChromatographicDetermination of Anthocyanin Pigments in Some Varieties of BlackRice / Su Noh Ryu, Sun Zik Park, Chi-Tang Ho //J. Food Drag Anal.- 1998.-V. 6.-№ 4,- P. 729-736.

115. Revilla E. Comparison of Several Procedures Used for theExtraction of Anthocyanins from Red Grapes / E. Revilla, J.M. Ryan,G. Martin-Ortega. // J. Agric. Food Chem. 1998.- V. 46,-№ 11.- P.4592-4597.

116. Kiss G. A. C. Solid-phase extraction and high-performanceliquid chromatographic separation of pigments of red wines / G. A. C.Kiss, E. Forgacs, T. Cserhati, etc. // J. Chromatogr. A. 2000.- V. 889.-№ 1P. 51-57.

117. Johnston T.V. Separation of anthocyanin pigments in wine byLow Pressure Column Chromatography / T.V. Johnston, J. R. Morris.// J. Food Sci.- 1996.- V. 61.-№ l.-P. 109-111

118. Brandt K. Structure and biosynthesis of anthocyanins inflowers of Campanula / K. Brandt, T. Kondo, H. Aoki; T. Goto. // Phytochemistry. 1993.- V. 33.- № l.-P. 209-212.

119. Drdak M. Analysis of anthocyanins in red wines by high-perfortance liquid chromatography using butylamines in the mobilephase / M. Drdak, P. Daucik, J. Kubasky. //J. Chromatogr. 1990.- V. 504.- P. 207-209.

120. Merken H.M. Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones / H.M. Merken, G. R. Beecher. // J. Chromatogr. A. 2000,- V. 897.- P. 177-184.

121. Morais H. Column Liquid Chromatography Stability ofAnthocyanins Extracted from Grape Skins / H. Morais //Chromatographia. - 2002.- V. 56.- P. 173.

122. Atanasova V. Effect of oxygenation on polyphenol changesoccurring in the course of wine-making / V. Atanasova, H. Fulcrand,V. Cheynier, M. Moutounet // Anal. Chim. Acta. 2002.- V. 458.- P. 15-27.

123. Atanasova V. Structure of a new dimeric acetaldehydemalvidin 3-glucoside condensation product / V. Atanasova, H.Fulcrand, V. Cheynier, M. Moutounet // Tetrahedron Letters. 2002,-V. 43.-P. 6151-6153.

124. Froytlog C Combination of chromatographic techniques forthe preparative isolation of anthocyanins applied on blackcurrant(Ribes nigrum) fruits / C. Froytlog, R. Slimestad, O.M. Andersen. // J.Chromatogr. A. - 1998.- V. 825.- № 1.- P. 89-95.

125. Fossen T. Characteristic anthocyanin pattern from onions andother Allium / T. Fossen, O.M. Andersen, D.O. Ovstedal, A.T.Petersen, A. Raknes. //J. Food Sci. 1996,- V. 61.- № 4.- P. 703-706.

126. Francis G. W. Droplet counter-current chromatography ofanthocyanins / G. W. Francis, O.M. Andersen. // J. Chromatogr. -1984.-V. 283.-P. 445-448.

127. Andersen O. M. Simultaneous analysis of anthocyanins and anthocyanidins on cellulose thin layers / O.M. Andersen, G. W.Francis. //J. Chromatogr. -1985.-V. 318.-P. 450.

128. Andersen O. M. Anthocyanins in fruits of Vaccinium-uliginosum L (Bog Whortleberry) / O.M. Andersen // J. Food Sci. 1985.-V. 52.-№ 3.-P. 665.

129. Andersen O. M. NMR of anthocyanins assignments and effects of exchanging aromatic protons / A.T. Pedersen, O.M. Andersen, D.W. Aksnes, W. Nerdal // Magnetic Resonance in Chemistry.- 1993,- V. 31.- № 11- P. 972-976.

130. Andersen O. M. Acylated anthocyanins from petunia flowers /R. Slimestad, A. Aaberg, O.M. Andersen. // Phytochemistry.- 1999.-V. 50,- № 6 -P. 10811086.

131. Andersen O. M. Chromatographic separation of anthocyaninsin cowberry (Lingonberry) Vaccinium vites-idaea L / O.M. Andersen. //J. Food Sci.- 1985.-V. 50,-P. 1230.

132. Cabrita L. Colour and stability of the six commonanthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions / L. Cabrita, T.Fossen, O.M. Andersen. // Food Chem.-2000.- V. 68.-P. 101-107.

133. Fossen T. Delphinidin 3'-galloylgalactosides from blue flowersof Nymphaea caerulea / T. Fossen, O.M. Andersen. // Phytochemistry.- 1999.- V. 50.- № 7- P. 1185-1188.

134. Andersen O. M. Anthocyanins from Maize (Zea mays) and Reed Canarygrass (Phalaris arandinacea) / T. Fossen, R. Slimestad, O.M. Andersen. // J. Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.-№ 5- P. 2318-2321.

135. Vivar-Quintana, A. M. Anthocyanin-derived pigments and colour of red wines t A.M. Vivar-Quintana, C. Santos-Buelga, J.C. Rivas-Gonzalo. // Anal. Chirn. Acta.- 2002.- V. 458,- P. 147-155.

136. Kennedy J. A. Analysis of pigmented high-molecular-mass grape phenolics using ion-pair, normal-phase high-performance liquid chromatography / J.A. Kennedy, A.L. Waterhouse. //J. Chromatogr. A.-2000.- V. 866.-№ 1-P. 25-34.

137. Kennedy J. A. Composition of grape skin proanthocyanidins at different stages of berry development / J. A. Kennedy, Y. Hayasaka, S. Vidal, E.J. Waters, G.P. Jones. //J. Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.- № l l-P. 5348-5355.

138. Kennedy J. A. Changes in grape seed polyphenols during fruit ripening / J.A. Kennedy, M.A. Matthews, A.L. Waterhouse. // Phytochemistry.- 2000.- V. 55.-№ 1-P. 77-85.

139. Kennedy J. A. Analysis of proanthocyanidins by high-Performance gel permeation chromatography / J.A. Kennedy, A.W. Taylor. // Journal of Chromatography A.- 2003. V. 995.- № l -P. 99-107.

140. Дейнека В.И. Относительный анализ удерживания гликозидов цианидина / В.И. Децнека, A.M. Григорьев// Журн. Физ. Химии. 2004. - Т. 78. -№ 5. -С.923-926.

141. Дейнека В.И. Исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее основе / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, Л.А. Дейнека, Е.И. Шапошник, В.М. Староверов // Зав. лаб,- 2006,- № 3.- С. 16-20.

142. Дейнека В.И. Инкрементный подход в анализе антоцианов методом ВЭЖХ / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов, О.Н. Борозекно // Химия природ. Соедин. 2003.- № 2.- С. 137-139.

143. Дейнека В.И. ВЭЖХ в анализе антоцианов: исследование цианидиновых гликозидов плодов растений рода Prunus / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, О.Н. Борозенко, В.М. Староверов, М.А. Трубицын // Хим.-фарм. журн. -2004.-Т. 38.-№8.- С. 29-31.

144. Дейнека В.И. Определение антоцианов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Некоторые закономерности удерживания / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев// Журн. аналит. химии,- 2004.- Т. 59.- Вып. 3,- С. 305-309

145. Дейнека В.И. Удерживание антоцианов в обраценно-фазовой системе со смешанным элюентом ацетонитрил-муравьиная кислота-вода / В.И.

146. Дейнека, A.M. Григорьев // Журн. Физ. Химии. 2005.- Т. 19.- № 5.- С. 900903.

147. Штац В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография / В.Д. Штац, О.В Сахартова. Рига: Зинатне, 1988. - 391 с.

148. Hanai Т. Quantitative structure-retention relationships of phenolic compounds without Hammett's equations / T. Hahai // J. Chromatogr. A.- 2003.- V. 985.-№1.-P. 343-349.

149. Hanai T. Simulation of chromatography of phenolic compounds with a computational chemical method / T. Hanai // J. Chromatogr. A. 2004.- V. 1027.-№1,-P. 279-287.

150. Amic D. Application of topological indices to chromatographic data: Calculation of the retention indices of anthocyanins / D. Amic, D. Davidovic-Amic, N. Trinajstic. // J. Chromatogr. A. 1993. - V. 653.- №1.- P. 115-121.

151. Григорьев A.M. Влияние структуры полярных аналитов на факторы удерживания и селективность в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии: автореферат дис. . кандидата хим. наук/A.M. Григорьев. -Воронеж, 2006. 23 с.

152. Нейланд О.Я. Органическая химия / О.Я. Найланд. М.: Высш. шк., 1990. -750 с.

153. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ / И.М Коренман. М.: Химия, 1977. - 200 с.

154. Физико-химические основы сорбционных и мембранных методов выделения и разделения аминокислот / В.Ф.Селеменев и др. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 2001. - 294 с.

155. Цюрупа М.П. Сверхсшитый полистирол-новый тип полимерных сеток : автореф. дис. д-ра. хим. наук / М.П. Цюрупа. М: ИНЭОС АН СССР,1985. -46 с.

156. Поглощение окрашенных веществ из ферментационных растворов лизина «сверхсшитым» полистирольным сорбентом / М.П Цюрупа и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. - T. XXI, вып. 1. - С. 72-77

157. Санитароно-химические свойства сорбента Стиросорб-1БП, предлагаемого к использованию в производстве триптофана / Иванова Е.В. и др. // «Теория и практика сорбционных процессов». 1998. Вып. 23. - С. 343-347.

158. Лурье 10. Ю. Справочник по аналитической химии / Ю. Ю. Лурье. М.: Химия, 1989.-446 с.

159. Химическая энциклопедия: в 5 т./И. Л. Кнунеянц и др. М. : Советская энциклопедия, 1988. -Т. 1 - 626 с.

160. Садек П. Растворители для ВЭЖХ / П. Садек; пер. с англ. A.A. Горбатенко и Е.И. Ревиной. М. : БИОМ. Лаборатория знаний, 2006. - 704 с.

161. Рудаков О.Б. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюент в жидкостной хроматографии / О.Б. Рудаков, В.Ф. Селеменев. Воронеж : Изд. ВГУ, 2003 г.-240 с.

162. Рудаков О.Б. Растворитель как средство управления процессом в жидкостной хроматографии / О.Б, Рудаков. -Воронеж : ВГУ, 2003. -300 с.

163. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений / МН. Запрометов. М. : Высшая школа, 1974. - 214 с.

164. Ахназарова С.Л. Оптимизация эксперимента в химии и химической технологии / С.Л. Ахназарова, В.В. Кафаров. М. : Высш. Школа, 1978. -319 с.,

165. Шараф М.А. Хемометрика / М.А. ИГараф, Д.Л. Илимэн, Б.Р. Ковальски; пер. с англ. А.Н. Мариничевой, А.К. Чарыкова; под ред. И.К. Ибрагимова, А.К. Чарыкова. Ленинград: Химия, 1989. - 269 с.

166. Доерффель К. Статистика в аналитической химии / К. Доерффель. М. : Мир, 1994.-258 с.

167. Дрейнер Н. Прикладной регрессионный анализ: В 2-х кн./ Н. Дрейнер, Г. Смит. М.: Финансы и статистика, 1987. - Т. 1 - 365 с; Т. 2 - 351 с.

168. Дьяконов В. Mathcad 2000: учебный курс/ В. Дьяконов. СПб: Питер, 2000. - 592 с.

169. Разделение антоцианов, содержащихся в ежевике и каркаде, методом ВЭТСХ./ Т.С. Ломова, В.Ф. Селеменев и др. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. - Т.6, вып. 6, ч. 4. - С. 1393-1398.

170. Применение метода ТСХ для оценки качества антоцианового красителя/ Т.С. Ломова и др. // Изв. ВУЗОВ. Пищевая технология. 2007. - №1.- С. 86-88.

171. Применение сканера и компрьютерных программ цифровой обработки изображения для количественного определения сорбированных веществ / Ю.Л. Шишкин и др. // Ж. аналит. химия. 2004. - Т. 59, № 2. - С. 119-124.

172. Герасимов А. В. Применение программной обработки сканированных изображений хроматограмм в количественной планарной хроматографии / А. В. Герасимов // Ж. аналит. химия. -2004. Т. 59, № 2. С. 119-124.

173. Герасимов A.B. Применение компьютерной обработки хроматограмм при ТСХ-анализе тартразина / А. В. Герасимов // Ж. Аналит. Химия, 2003, Т. 58, № 3. С. 241-243.

174. Компьютерное зрение / Л. Шапиро, Дж. Стокман М. БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. -752 с.

175. Волынец М.П. Количественная тонкослойная хроматография в неорганическом анализе / М.П. Волынец. М.: Наука, 1993. - 226 с.

176. Кирилов Е.А. Цветоведение / Е.А. Кирилов. Л. : Легпромбытиздат, 1987. 128 с.

177. Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material. Mechanisms of retention / V. A. Davankov, C.S. Sychov, M.M. Ilyin, ЛюЩю Sochilina // J. Chromatography A., -2003.-V. 987. P. 67-75.

178. Даванков B.A. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии / В.А. Даванков, К.С. Сычев, М.М. Ильин // Заводская лаборатория. 2003. - Т. 69. - № 4. - С. 3-9.

179. Селеменев В.Ф. Меланоиды / В.Ф. Селеменев. Воронеж.: ВП/, 2004. -195 с.