Новые возможности монолитных пористых колонок в высокоэффективной жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

РЫБАЛКО МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МОНОЛИТНЫХ ПОРИСТЫХ КОЛОНОК В ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета им М.В Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Нестеренко Павел Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович

доктор химических наук, профессор Ланин Сергей Николаевич

Ведущая организация:

Институт физической химии РАН

Защита диссертации состоится '//ноября 2005 г. в 16 час 10 мин. в ауд 344 на заседании диссертационного совета Д501.001 88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В Ломоносова по адресу

119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ, химический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета

МГУ.

Автореферат разослан^ октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Торочешникова И.И

zg&L наш

lA'dty 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Традиционно используемая в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) колонка, представляет собой стальную, стеклянную или полимерную трубку, заполненную частицами сорбента Наиболее важной характеристикой хроматографической колонки является ее эффективность, которая обратно пропорциональна размеру частиц и прямо пропорциональна длине колонки, а также зависит от однородности набивки колонки и скорости пропускания элюента. Обычно для заполнения колонок используют сорбенты с частицами размером 5-10 мкм При уменьшении размера частиц с 5 до 1-3 мкм улучшается массообмен, что теоретически позволяет повысить эффективность разделения Однако уменьшение размера частиц сопровождается ухудшением проницаемости колонки, выражающимся в резком, обратно пропорциональном размеру частиц сорбента во второй степени увеличении давления на входе в колонку В свою очередь, оптимальное рабочее давление определяется прочностью матрицы сорбента и, обычно, не превышает 100-150 атм для сорбентов на основе силикагеля и 80-100 атм для органополимерных сорбентов, а также возможностями хроматографических насосов Поэтому использование колонок, заполненных частицами диаметром менее 3 мкм требует уменьшения длины колонки, и, следовательно, уменьшения ее эффективности (числа теоретических тарелок на колонку) Таким образом, эффективность набивной хроматографической колонки для аналитической ВЭЖХ лимитируется максимальным давлением на входе в колонку, которое определяется размером частиц

Стремление исследователей получить разделения на колонках, заполненных частицами 1-3 мкм большой длины положило начало развитию такого варианта хроматографии как жидкостная хроматография сверхвысокого давления, когда разделение проводят при давлении вплоть до 9000 атм Другое решение проблемы повышения эффективности разделения состоит в использовании принципиально новых сорбционных материалов, обладающих более высокой проницаемостью.

В конце 1990-х гг. ведущие производители хроматографических колонок освоили производство перспективных для решения этих проблем сорбентов, так называемых монолитных пористых колонок (МПК) МПК представляет собой непрерывную пористую структуру с бимодальным распределением пор Сквозные транспортные поры обеспечивают низкое давление на входе в колонку, а мезопоры, формирующие развитую поверхность с большой площадью, обеспечивают высокую эффективность и нагрузочную способность Эффективность кремнеземной монолитной колонки Chromolith RP 18е сравнима с эффективностью набивных колонок, заполненных частицами силикагеля размером 3 мкм, причем высокая скорость массообмена обеспечивает минимальные потери в эффективности разделения при высоких скоростях подвижной фазы Давление на входе в монолитную колонку Chromolith приблизительно в 6 раз меньше, чем для колонки, заполненной частицами размером 3 5 мкм при одинаковых размерах колонок Совокупность этих свойств позволяет выделить МПК как отдельную группу неподвижных фаз перспективных для использования в различных вариантах ВЭЖХ

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении свойств монолитных пористых CIM (Convective Interaction Media) дисков, на основе сополимера глицидилметакрилата и этилендиметакрилата, и МПК Chromolith RP 18е на основе силикагеля и реализа^ЛИ В^ЭЖХ

Конкретные задачи исследования в к; ючап^цспиптгил'

Ючал^ивли0ТЕКА

cn«<40wY'Hi J

Т г - t

- модифицирование метакрилатных С1М дисков различными ионообменными и комплексообразующими функциональными группами - диольными, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой,

- изучение гидродинамических свойств МПК - сопротивления потоку и эффективности в зависимости от скорости пропускания элюента и их сравнение со свойствами набивных колонок;

- установление зависимости эффективности МПК от вязкости элюента при высоких линейных скоростях;

- изучение ионообменных и комплексообразующих свойств монолитных дисков, модифицированных олигоэтиленаминами и аминокислотами,

- установление возможностей использования монолитных пористых дисков для динамического сорбционного концентрирования неорганических ионов и пептидов,

- разработка нового варианта апюирования при использовании подвижной фазы постоянного состава с градиентом потока элюента для разделения анионов в варианте ионной ВЭЖХ и для разделения гомологов органических соединений в варианте обращенно-фазовой ВЭЖХ,

- разработка методики определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных напитках, чае и кофе в изофлюентном режиме и с градиентом потока элюента.

Научная новизна. Синтезировано 6 типов монолитных пористых дисков, модифицированных диольными группами, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой Изучены их ионообменные свойства по удерживанию модельных органических соединений и неорганических анионов

При разделении анионов на С1М дисках впервые отмечен эффект улучшения эффективности разделения при увеличении скорости пропускания элюента при скоростях, значительно превышающих значения, соответствующие минимуму кривой Ван Деемтера При изучении гидродинамических свойств МПК на основе силикагеля установлено, что зависимости эффективности от линейной скорости элюента заметно отличаются от классического вида, описываемого уравнением Ван Деемтера Установлено, что при высоких скоростях элюента на МПК на зависимости появляется второй минимум Эффект зависит от размера молекулы сорбата и появляется при более низких линейных скоростях при использовании элюентов с большей вязкостью

Предложен новый вариант градиентной хроматографии при постоянной концентрации элюента, но с градиентом потока элюента Показаны преимущества этого метода при разделении сложных смесей - полиароматических углеводородов (ПАУ), ди-н-алкилфталатов и метилксантинов Наиболее эффективно использование этого приема для разделения смесей, компоненты которых сильно отличаются по удерживанию, а также гомологов органических соединений.

Предложен новый термин для разделения при постоянной скорости потока с элюентом постоянного состава - изофлюентное элюирование На ультракороткой колонке СИготоНШ РР 18е длиной 5 мм получено разделение 8-ми компонентной смеси ПАУ в изофлюентном режиме и с градиентом потока

Практическая значимость. Проведена оценка возможностей применения С1М дисков с различными функциональными группами для динамического сорбционного концентрирования ионов переходных металлов в варианте комплексообразовательной хроматографии, гистидин-содержащих пептидов в варианте лигандообменной хроматографии и для разделения неорганических анионов в варианте ионной хроматографии Показана возможность применения

CIM дисков, используемых в ВЭЖХ, для концентрирования переходных металлов с перистальтическим насосом

Показана перспективность использования градиента потока для сокращения времени разделения сложных смесей на примере разделения неорганических анионов в варианте ионной хроматографии и гомологов органических соединений - ПАУ и ди-н-алкилфталатов - в варианте ОФ ВЭЖХ Показаны преимущества использования ультракоротких монолитных колонок для разделения ПАУ в варианте ОФ ВЭЖХ в случае, когда эффективность обычной хроматографической колонки длиной 5-10 см избыточна

Разработана методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных напитках, чае и кофе на монолитной пористой колонке в изофлюентной ОФ ВЭЖХ и с градиентом потока Пределы обнаружения метилксантинов составляют 0.05 мкг/мл для теобромина и теофиллина и 0 1 мкг/мл для кофеина

На защиту выносятся следующие положения

- синтез монолитных пористых дисков новыми функциональными группами и изучение их ионообменных и комплексообразующих свойств;

- гидродинамические свойства монолитных метакрипатных CIM дисков и МПК на основе силикагеля Chromolith RP-18e различной длины и их сравнение с набивными колонками;

- улучшение эффективности МПК при высоких скоростях элюента, значительно превышающих оптимальные, зависимость этого явления от вязкости элюента,

- применение монолитных пористых CIM дисков для концентрирования переходных металлов и гистидин-содержащих пептидов,

- применение градиентов потока элюента для разделения анионов в варианте ионной хроматографии и для разделения ПАУ и ди-н-алкилфталатов в варианте ОФ ВЭЖХ, принцип выбора оптимального градиента потока,

- методика определения теобромина, теофиллина и теобромина в газированных напитках, чае и кофе в изофлюентных условиях и с градиентом потока элюента

Апробация работы Основные результаты диссертации изложены в публикациях и доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001», «Ломоносов-2003» и «Ломоносов-2004» (Москва), на Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002), на Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитический химии» (Краснодар, 2002); на 3-ем Международном симпозиуме по разделением в бионауках «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на Всероссийской конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004), на 28-ом Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрохроматографии (Лас Вегас, 2005), на 29-ом Международном симпозиуме HPLC-2005 (Стокгольм, 2005).

Публикации по работе По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 11 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (173 наименования) Работа изложена на 180 страницах печатного текста, содержит 52 рисунка и 46 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В первой главе диссертации рассмотрены способы получения пористых монолитов с различной химией поверхности, а также их пористые, механические, гидродинамические свойства Систематизированы данные о коммерчески выпускаемых МПК, условиях их эксплуатации и областях практического применения Представлены примеры использования МПК в ионной, обращенно-фазовой, аффинной хроматографии, капиллярной электрохроматографии На основании данных литературы сделан вывод о перспективности изучения свойств и использования МПК в различных областях ВЭЖХ

Экспериментальная часть

В работе изучены коммерчески выпускаемые монолитные пористые метакрилатные CIM диски (BIASeparations, Словения) и МПК на основе силикагеля марки Chromolith RP 18е (Merck, Германия) Основные характеристики изученных МПК представлены в табл 1 Комплексообразующие свойства монолитных CIM дисков, модифицированных олигоэтиленаминами, сравнивали со свойствами силикагеля Силохром С-120 (fl3TA-Si02), (d4 = 40 мкм, Sw=120 м2/г), помещенного в пластиковый патрон

Для модифицирования ДЭТА и ТЭТА CIM диск помещали в чистый амин на 24 часа при комнатной температуре Для модифицирования пролином, гидроксипролином и ИДК диск помещали в 7-8 мМ раствор соответствующего лиганда с pH 10-11 и встряхивали 24 ч при 60 °С Для получения CIM-Диол и для гидролиза непрореагировавших с аминокислотами эпоксидных групп, диски встряхивали в течение 3-х часов в 0 1 М HCl или H2SO4 при нагревании (50°С)

Таблица 1. МПК, использованные в работе и их основные характеристики

МПК Химия поверхности Матрица Форма и размеры (i*d, мм)

CIM

CIM-Диол* С1М-ЭДА диольные группы этилендиамин ГМА-ЭДМА Диск (3*16)

С1М-ДЭТА* диэтилентриамин

С1М-ТЭТА* триэтилентетрамин

CIM-Pro* ¿.-пролин

CIM-HyPro* L-гидроксипролин

С1М-ИДК* иминодиуксусная к* та

Chromolith

Chromolith RP 18 е С18 силикагель Цилиндр (5, 50 и 100x4 6)

Пористые свойства Условия эксплуатации

Амкро=1500 нм С*мезо=100 НМ Sy„=43 3 м2/г V=0 34 мл 'Гшах>10 МЛ/МИН Fpa6 = 5 мл/мин Ртш= 200 атм Рраб=50 атм pH 1-14

^„акро=2 МКМ ^мезо=13 НМ SM=300 м2/г Fmax-5 МЛ/МИН Ртах~ 200 атм pH 2-7 5 Тщах-45 С

'синтезированы в работе

В работе использовали хроматографическую систему, состоящую из насоса высокого давления Весктап 114М (США) или 8Ь|тас1ги 1.С-10АТ (Германия) с программируемой скоростью потока элюента, инжектора ЯЬеос1упе (США), детекторов спектрофотометрического 11у1согс1 Б 2238 (Швеция) или кондуктометрического СопсЭисМуэег 5300В (Швеция), системы сбора и обработки хроматографических данных «Экохром» или «Мультихром» (Россия)

ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНОЛИТНЫХ ПОРИСТЫХ колонок

Монолитные пористые колонки обладают большими каналоподобными транспортными порами, которые пронизывают монолит по всей длине На практике отличие МПК от пористых микрочастиц проявляется в гидродинамических свойствах, те в уменьшенном сопротивлении потоку и в сопротивлении массопереносу.

Сопротивление потоку. Сопротивление потоку С1М дисков и влияние модифицирования поверхности на эту характеристику оценено по зависимости давления на входе в колонку от скорости пропускания элюента Зависимости давления на входе в колонку от линейной скорости подвижной фазы для С1М-ДЭТА и С1М-Диол (рис 1) линейны во всем изученном интервале скоростей и описываются следующими уравнениями-

С1М-Диол р = (Ь±АЬ)и = (5 8±0.3)и (Р=0 95, т=12),

С1М-ДЭТА. р = (Ь±АЬ)и = (6.1±0 1 )и (Р= 0.95, т=16)

где р - давление на входе в колонку (атм), и - линейная скорость подвижной фазы (мм/с). Для С1М дисков и (мм/с) =0.295*Р (мл/мин) Тангенс угла наклона прямой (коэффициент Ь (атмс/мм) пропорционален сопротивлению колонки и одинаков в пределах погрешности. Таким образом, модифицирование поверхности ДЭТА достоверно не снижает проницаемость монолитных дисков

Рис. 1. Зависимость давления на входе в колонку от и элюента для С1М-ДЭТА (•) и С1М-Диол (о) Элюент дистиллированная вода

и, мм/с

Зависимость эффективности от линейной скорости пропускания элюента (кривые Ван Деемтера). Уменьшение эффективности разделения при увеличении скорости пропускания элюента связано с размыванием хроматографической полосы в колонке, в соединениях системы и в детекторе Размывание в МПК описывается расширенным уравнением Ван Деемтера или уравнением Родригеса, которое кроме вихревой (Л), продольной (В) диффузии и сопротивления массопереносу (С) учитывает вклад конвекции (К) Н = А + В/и + С и + К и. (1)

Для оценки сопротивления массопереносу С1М дисков получены зависимости ВЭТТ от линейной скорости элюента для С1М-Рго (рис. 2), которые хорошо описываются уравнением вида (1) Максимальное число теоретических тарелок на диск составляет 31 (табл. 2).

Н, мм

Рис. 2. Зависимости ВЭТТ от и 5 мМ янтарной кислоты для CIM-Pro

и, мм/с 2

Таблица 2. Координаты минимумов и значения параметра (С+К) для кривых Ван __ Деемтера (Р= 0.95) для С1М-Рго.___

Параметры итп, мм/с Н, мм (С+К), с R2 т /V, теор т/диск _ n --теор т/м

для Вг ~0 4-0 5 0 098 0 28±0 08 0 978 6 31 10 200

Сопротивление массопереносу колонок типа СЬгото1|№ ИР 18е оценено по зависимостям ВЭТТ для ПАУ разного размера (рис 3) В табл 3 приведены коэффициенты уравнения Ван Деемтера, рассчитанные из экспериментальных данных, а также литературные данные для различных ПАУ Во всех случаях наблюдается хорошее соответствие экспериментальных и литературных данных для монолитных колонок типа СЬготоМИ Р?Р-18е

Н, мкм

__□__CL-Л—О—

-Л—'

1 ^.¡Ti-t-»-*3 о

Рис. 3. Кривые Ван Деемтера для нафталина (1), антрацена (2), пирена (3), бензола (4), дибенз[а,/)]антрацена (5) ПФ ацетонитрил - вода (6040 об %). Колонка -Chromohth Performance RP-18е 100*4 6 мм

6 и, мм/с 8

Для ряда ПАУ коэффициент (С+К) одинаков в пределах погрешности Сравнение коэффициентов для набивной хроматографической колонки Competitor, заполненной частицами 5 мкм показало, что сопротивление массопереносу и вклад конвекции, для монолитной колонки в 2 - 3 раза меньше Согласно теории Родригеса, это свидетельствует о том, что скорость процесса сорбции - десорбции на монолитной колонке значительно выше и приблизительно одинакова для гомологов Сравнение коэффициентов (С+К) уравнения Родригеса для CIM дисков (табл 2) и колонки типа Chromohth RP 18е (табл 3), показало, что для CIM дисков этот параметр приблизительно в 50-100 раз больше, чем для Chromolith Скорее всего, это связано с более медленной скоростью массообмена

в случае ионного обмена, определяемой более сложным характером этого процесса, по сравнению с гидрофобными взаимодействиями

Таблица 3. Расчетные значения параметров А, В и (С+К) уравнения Родригеса для бензола и ПАУ (Р=0 95) Колонка - Chromolith Performance RP-18e 100x4 6 мм

Вещество A10s, м В ГсРТм (С+К) 10 3 с т 12~ ~ R2 Элюент

Бензол 1.7+0 6 1 5+0 4 2+1 0 927 acn-h2o (60 40 об %)

0 49±0 04' 2 8+0 4 1 33+0 06 18 0 995 0*996 "

0 5+0 22 4±1 5 0+0 4 10

Нафталин 0 6+0 4 0 8+0 3 2 6±0 9 12 0 829

Антрацен 1 4_i0 1 0.9±0.1 2.5±0 3 12 0 981

0 22±0 03' 0 48+0.01 1 95+0 04 19 0 999

Пирен 1 2+0 4 0 9+0 3 2.2+0.8 12 0 840

Д ибенз[а, Л]антрац ен 3.5±0 8 1 0+0 8 3+1 11 0 756

Трифенилен 0 98±0 031 1 34±0 07 3 0+0 1 38 0 958 сн3он- н2о (80 20 об %)

Перилен 0 2+0 2' 0 51+0 05 2 0±0 4 10 0 987 100%-ный СН3ОН

'данные литературы для Chromolith RP-18, для набивной колонки Competitor, размер частиц 5 мкм

ОСОБЕННОСТИ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА МОНОЛИТНЫХ ПОРИСТЫХ КОЛОНКАХ ПРИ ВЫСОКИХ СКОРОСТЯХ ЭЛЮЕНТА

Низкое сопротивление потоку МПК позволяет изучить зависимости ВЭТТ от и при скоростях элюента, значительно превышающих оптимальные значения Однако, до сих пор подробное изучение зависимостей ВЭТТ от скорости и от вязкости элюента не проводилось Для исследования зависимостей ВЭТТ от и при высоких скоростях элюента были выбраны 3 подвижные фазы, отличающиеся вязкостью, но имеющие одинаковую элюирующую способность, которую рассчитывали по уравнению'

й - ФФъ + Йэрг^орг. (2)

где 6, 5В, борг - параметр растворимости Гильденбранда для водно-органической ЛФ, воды и органического растворителя, соответственно (кал/мл), <рв, <рорг -объемные доли воды и органического растворителя в ПФ Состав элюентов и времена удерживания ПАУ в зависимости от элюента приведены в табл 4 Зависимости ВЭТТ от и (рис. 4) значительно отличаются от классических, описываемых уравнением Ван Деемтера Для ацетонитрилсодержащей подвижной фазы можно отметить выход кривой на плато в интервале скоростей от 0 8 до 1 25 см/с в случае нафталина Для более вязких изопропанольной и этанольной ПФ максимум смещается в область меньших линейных скоростей и достигается для ПФ, содержащей пропанол-2 при линейной скорости 0 3 см/с для всех сорбатов, для этанолсодержащей ПФ - при скорости 0 25 см/с

Таблица 4. Времена удерживания нафталина, антрацена и пирена для изоэлюентных подвижных фаз Колонка - Chromolith Performance RP-18e 100><4 6

Сорбат 60% ACN* /«(мин), Р=0 95, п= 65% этанол 3 58% пропанол-2

нафталин 3 93±0 09 3 6+0 1 3 46±001

антрацен 7 3±0 1 613±0 02 5 90±0 02

пирен 9 98±0 06 8 58±0 08 8 20±0 01

Рис. 4 Сравнение зависимос-|go ф ф ти ВЭТТ от и для различных

О #о • • ® ПФ Колонка Chromolith

['<■('> ° • • • SpeedRod RP-18e 50*4 6 мм

**°Og ПФ. этанол-вода (65 35 об %)

—ZtfkikfiJ*?. , ▼ ¥ (•), пропанол-2 - вода (58 42

?

▼ нафталин.

0 0 0 4 0 8 о, см/с 1 2

об %) (о), ацетонитрил-вода (60 40 об.%) (▼) Сорбат:

Для изученных ПФ были определены значения динамических вязкостей ц, плотности р и рассчитаны значения кинематической вязкости /7 (табл. 5) Полученные зависимости демонстрируют, что отклонения от классического вида кривой Ван Деемтера проявляются при более низких линейных скоростях в случае ПФ с большей вязкостью

Таблица 5. Значения динамической вязкости ц, плотности р и кинематической

____вязкости р для ряда элюентов_ _____

Состав ПФ п, сПуаз р, г/см3 и, Ст

ацетонитрил-вода 60 4сГоб % 0 70 0 864 ~ 081

этанол-вода 65 35 об % 2 24 0887 2 52

пропанол-2 - вода 58 42 об % 2 61 0 878 2 97

Улучшение эффективности, вызванное увеличением линейной скорости пропускания ПФ, происходит в результате эффекта вязкости растворителя, природа которого до конца не понятна Возможно, отклонения на кривых связаны с частичным переходом ламинарного течения в турбулентное Косвенным свидетельством возникновения турбулентного течения является вид зависимости давления на входе в колонку от линейной скорости элюента (рис 5) Согласно закону Хагена-Пуазейля, давление на входе в МПК прямо пропорционально средней ламинарной линейной скорости потока Отклонение зависимости от линейности говорит о возможности перехода ламинарного течения в

турбулентное Для наименее вязкой ПФ на основе ацетонитрила полученная зависимость линейна (&=0 9997) В случае зависимостей для этанольной и пропанольной ПФ происходит заметное отклонение от линейности при объемных скоростях превышающих 4 мл/мин Для элюентов на основе этанола и пропанола-2 наблюдаются 2 минимума при различных линейных скоростях, которые соответствуют максимальной эффективности колонки Хроматограммы разделения модельной смеси ПАУ при скоростях элюента, соответствующих первому и второму минимумам (рис 6), демонстрируют, что этот эффект позволяет сократить время разделения ПАУ в 7 раз

Рис. 5. Зависимости давления на входе в колонку от и Колонка СИготоШЬ 8реес1Р*ос1 РР-18е 50x4 6 мм ПФ ацето-нитрил-вода (60 40 об %) (•), этанол-вода (65 35 об %) (о), пропанол-2 - вода (5842об %)(Т)

10 75 мл/мин

1 2 см/с

Время, мин 1

Рис. 6. Хроматограммы модельной смеси ПАУ, полученные при скоростях, соответствующим минимумам зависимости ВЭТТ от и ПФ пропанол-2 - вода (58 42 об %) Колонка Chromolith Performance RP-18e 50»4 6 мм УФ (254 нм) 1-нафталин, 2 - антрацен, 3 - пирен

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГРАДИЕНТА ПОТОКА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ РАЗДЕЛЕНИЯ В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Обычно для уменьшения времени удерживания сильноудерживаемых сорбатов и, соответственно, сокращения времени анализа используют градиент концентрации компонента подвижной фазы с более высокой элюирующей способностью Такое разделение проводят при постоянной скорости потока элюента, т е в изофлюентом режиме (ко - равный, ПиепШт - поток, ¡зоАиеп(ит) Возможной альтернативой градиенту концентрации является градиент потока элюента В этом случае уменьшение времени сильноудерживаемых пиков происходит за счет постепенного увеличения объемной скорости элюента постоянного состава Для реализации этого приема достаточно одного насоса с программируемой скоростью потока, что упрощает систему по сравнению с системой создания концентрационного градиента Гидродинамические свойства монолитных колонок позволяют варьировать объемную скорость элюента в широком диапазоне от 1 до 10 мл/мин и более, при незначительных потерях в эффективности колонки Это дает возможность получить на МПК разделение с градиентом потока

Использование градиента потока в ионной хроматографии для разделения анионов. На основании изучения анионообменных свойств дисков, модифицированных пролином и гидроксипролином в зависимости от природы элюента, его концентрации и рН были выбраны условия для разделения анионов

в изофлюентном режиме При постоянной оптимальной скорости элюента - 1 мл/мин на С1М-НуРго получено разделение Вг, Г и СЫЭ" за 40 минут (рис 7, А) Эффективность разделения в изофлюентных условиях не превышает 5000 теор т/метр Разделение той же смеси анионов получено с применением градиента потока от 1 до 4 мл/мин (рис 7, Б) Градиент скорости потока элюента позволил сократить время разделения в 2-3 раза по сравнению с изофлюентным режимом, при этом высота пиков увеличилась в 4 раза

Сигнал,

10 20 Время, мин

Рис. 7. Разделение Вг", I и С^ без (А) и с градиентом потока (Б) на С1М-НуРго Элюент. 5 мМ янтарная кислота Профиль градиента потока - пунктирная линия Детектирование кон-дуктометрическое Концентрация аналитов - 2 мМ, объем пробы - 5 мкл

Разделение с градиентом потока можно рассматривать как изократическое по отношению к концентрации элюента Это дает возможность рассчитать эффективность разделения N Для этого вместо времени удерживания в формулах следует использовать значение объема удерживания а ширину пика представить как объем

элюента, прошедшего через колонку за данный период времени Относительное стандартное отклонение (Э,) значений объема удерживания анионов в случае градиента потока не превышает 0 03 Это подтверждает постоянство коэффициента распределения и возможность такого подхода к вычислениям Рассчитанные значения эффективности разделения и разрешения пиков (табл 6) при постоянной скорости и с градиентом потока демонстрируют аномальное увеличение эффективности в 2 раза при использовании градиента потока Аналогичный эффект отмечен и для разрешения пиков

Таблица 6. Влияние градиента потока на эффективность (Л/) и разрешение пиков

Анион Без градиента потока С градиентом потока

ЛГ «5 ЛГ я8

Вг 150 0 59 15 1 0 83

Г 125 0 48 22 2 0 71

сыв 12 3 - 28 0 -

Число теоретических тарелок на диск

Использование градиента потока элюента в ОФ ВЭЖХ для разделения гомологов органических соединений Полиароматические углеводороды. ПАУ принадлежат к классу органических веществ, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами и занесены в список наиболее опасных загрязнителей Из-за различия в гидрофобности хроматографическое определение ПАУ обычно проводят с градиентом концентрации органического растворителя

Оптимальный профиль градиента потока можно определить из закономерностей удерживания гомологов или ПАУ Хроматографический анализ в изократических условиях должен обеспечивать селективное разделение первых членов гомологического ряда и максимальную эффективность в изофлюентном режиме Поэтому, сначала необходимо определить оптимальный состав подвижной фазы и скорость ее подачи, удовлетворяющие описанным выше требованиям Профиль изменения градиента потока элюента во времени можно определить из закономерностей удерживания членов гомологического ряда Критерием выбора оптимального состава элюента является полное разрешение пиков слабоудерживаемых членов гомологического ряда, которое достигалось для элюента вода - ацетонитрил (40 60 об %) Оптимальная скорость для разделения ПАУ в изофлюентном режиме на колонке СИготоПШ РегГогтапсе ЯР 18е 100*4 6 мм и начальная скорость для градиента потока определяется минимумом на кривых Ван Деемтера и составляет 2 - 3 мл/мин

Для создания оптимального профиля градиента потока необходимо получить зависимость удерживания членов гомологического ряда от числа атомов углерода в молекуле ПАУр

1дК = а + Ьп, (3)

где п - число атомов углерода, а и Ь - коэффициенты Для гомологического ряда ПАУ зависимости 1д к от числа атомов углерода п{С) линейна (рис 8)

Рис. 8. Зависимость удерживания ПАУ от числа атомов углерода Элю-ент ацетонитрил-вода (60 40 об %) Колонка - Chromolith Performance RP-18e 100*4 6 мм

20 ,„.24 л (С)

В выбранных условиях была получена хроматограмма для бензола и модельной смеси восьми ПАУ в изофлюентном режиме при скорости 3 мл/мин (рис 9, А) и с линейным градиентом потока элюента от 3 до 6 мл/мин (рис 9, В) Начальная точка градиента - время выхода пика бензола (45 с), конечная - пика пирена (2 5 мин) Для сравнения была получена хроматограмма в изофлюентном режиме при максимальной скорости использованного ранее градиента потока - 6 мл/мин (рис 9, Б) Полученные хроматограммы демонстрируют, что при объемной скорости 3

мл/мин пики более высоких гомологов - бенз[э]пирена и дибенз[а,/7]антрацена -отстают на 2-3 мин, при скорости 6 мл/мин время разделения удается сократить в 2 раза, однако пики флуорантена и пирена плохо разрешаются Градиент потока позволяет полностью разделить все компоненты за 4 5 мин Сравнение пологого градиента с однократным увеличением скорости или шагом (рис 9, В-Г) показало, что пологий градиент потока элюента дает выигрыш во времени равный 6% и позволяет избежать резкой механической нагрузки в виде гидравлического удара на пористый материал колонки

0 1 2 3 4 5 6 7

Время, мин

Рис. 9. Разделение модельной смеси ПАУ в изофлюентных условиях [3 мл/мин (А)] и [6 мл/мин (Б)], с градиентом потока (В) и с шаговым увеличением скорости (Г) Профиль градиента потока - пунктирная линия Колонка СИготоМЬ Рег^огтапсе РР-18е 100*4 6 мм Элюент ацетонитрил -вода (60 40) УФ (254 нм) 1 - бензол, 2 -нафталин, 3 - аценафтен, 4 - антрацен, 5 - флуорантен, б - пирен, 7 - хризен, 8 -бенз[а]пирен, 9 - дибенз[а,/7]антрацен

Разделение ПАУ на ультракороткой монолитной колонке. В

аналитической практике часто возникают такие задачи, когда эффективность обычной хроматофафической колонки длиной 10-15 см является избыточной Ультракороткие МПК Chromolith RP-18e Guard Cartridge 5*4 6 мм, рекомендуемые производителем в качестве предколонок, дают новые возможности для развития экспресс-анализа В сочетании с фадиентом потока элюента время разделения может быть значительно сокращено

В оптимальных изофлюентных условиях (элюент - ацетонитрил/вода (40 60 об %), 3 мл/мин) была разделена модельная 8-ти компонентная смесь ПАУ за 6 мин (рис 10, А) Эта смесь также разделена с линейным градиентом потока элюента от 3 до 10 мл/мин (рис 10, Б) Начальная точка градиента - время выхода нафталина (0 5 мин), конечная - пика бенз[а]пиренз (3 мин)

Ди-н-алкилфталаты. Другим объектом исследования были выбраны эфиры о-фталевой кислоты Их широко используют в качестве пластификаторов в химической промышленности, а также в вакуумных насосах как малолетучие жидкости. Аналогично ПАУ, для разделения ди-н-алкилфталатов обычно используют градиент состава элюента На основании изучения удерживания ди-н-алкилфталатов (СгС8) от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе и от числа атомов углерода в алкильном радикале выбраны условия для

изофлюентного разделения и разделения с градиентом потока элюента Разделение в изофлюентном режиме (элюент - ацетонитрил/вода (70 30 об %), скорость 2 мл/мин) не является оптимальным и требует 26 мин (рис 11, А) Разделение с градиентом потока от 2 до 10 мл/мин позволило сократить время анализа с 26 до 8 мин (рис. 11, В) Начальная точка градиента потока - время выхода диэтилфталата (1 16 мин), конечная - ди-н-гептилфталата (4 5 мин) Следует отметить, что в отличие от ПАУ оптимальный профиль градиента потока при разделении фталатов описывается логарифмической зависимостью.

Рис. 10. Разделение модельной смеси ПАУ в изофлю-ентных условиях со скоростью 3 мл/мин (А) и с градиентом потока (Б) Профиль градиента потока - пунктирная линия Колонка: СИготоМИ ЯР-18е 5*4 6 мм Элюент ацетонит-рил - вода (40 60 об. %) УФ (254 нм) 1, 2 -примеси, 3-нафталин, 4 - аценафтен, 5 -антрацен, 6 - пирен, 7 - хри-зен, 8 - бенз[з]пирен.

1 _ 2 3 Время, мин

с,с.

Рис. 11. Разделение модельной смеси ди-н-алкилфталатов (Ci-C8) в изофлюентных условиях при скорости 2 мл/мин (А) и 6 мл/мин (Б) и с градиентом потока (В) Колонка Chromolith Performance RP-18e 100*4.6 мм. Элюент ацетонитрил - вода (70 30 об %) УФ (254 нм)

6 8 10 12 ' ' 25 Время, мин

Метилксантины. В настоящее время большое внимание уделяют контролю содержания алкалоидов группы метилксантинов в пищевых продуктах и лекарственных препаратах Важнейшими представителями этой группы

соединений являются теофиллин (ТФ), теобромин (ТБ) и кофеин (К) Эти соединения содержатся в кофе, какао и шоколаде Избыточное потребление ТФ, ТБ и К может вызвать побочные реакции и даже приводить к смерти Поэтому необходим контроль за содержанием метилксантинов в пищевых продуктах Кроме того, представляет интерес сравнение метрологических характеристик количественного определения в изофлюентных условиях и с градиентом потока

Удерживание ТБ, ТФ и К изучено в зависимости от концентрации ацетонитрила и от концентрации Н3Р04. Оптимальное разделение достигается с подвижной фазой состава ацетонитрил - 3 мМ Н3Р04 (5 95) На рис 12 представлены хроматограммы модельной смеси метилксантинов в изофлюентных условиях и с градиентом потока (начальная точка - «мертвое» время (1 35 мин); конечная - после выхода пика К (5 5 мин)) Относительное стандартное отклонение высот пиков в случае градиента потока не превышает 0 05

/

/

/3

/

I

10 15

8 Время, мин

F, мл/мин

61

3 55

1

5 Время, мин

Рис. 12. Разделение модельной смеси ТБ (0.77 мг/мл) (1), ТФ (0 73 мг/мл) (2) и К (1 мг/мл) (3) в изофлюентных условиях (1 мл/мин (А)) и с градиентом потока (Б) Колонка' Chromolith Performance RP-18e 100*4.6 мм УФ (280 нм) Градиент потока - пунктирная линия

Методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в чае, кофе и кофеинсодержащих энергетических напитках методом ОФ ВЭЖХ на колонке Chromolith Performance RP-18e 100*4 6 мм

Предложена методика определения ТБ, ТФ и К в энергетических напитках, чае и кофе. Разделение и определение проводили в изофлюентных и градиентных условиях Подвижная фаза - ацетонитрил - 3 мМ Н3РО4 (5 95) В изофлюентных условиях - скорость 1 мл/мин, в случае градиента потока изменяется следующим образом'

0-1 мин 1 мл/мин

1-3 5 мин от 1 до 3.5 мл/мин

3.5-6 мин от 3 5 до 8 мл/мин

Идентификацию хроматографических пиков проводили, сравнивая их времена удерживания fo с fR теобромина, теофиллина и кофеина на хроматограмме модельной смеси Содержание индивидуальных веществ в образце определи по градуировочным графикам зависимости высоты хроматографического пика от концентрации вещества. Метрологические характеристики методики определения метилксантинов представлены в табл 7 Хроматограмма образца мате

метилксантинов представлены в табл 7 Хроматограмма образца мате представлена на рис 13, результаты определения метилксантинов в энергетическом напитке Adrenaline Rush, в растворимом кофе и мате - в табл 8

Таблица 7. Характеристики методики определения метилксантинов в

Характеристика скорость ПФ -1 мл/мин С градиентом

ТБ ТФ К ТБ ТФ К

с„, мг/мл 0 026 0 023 0 012 0 035 0 020 0 061

ст1П, мкг/мл 0 046 0 046 0 094 0 051 0 055 0 12

й* 0 999 0 999 0 999 0 999 0 999 0 996

/I

/

10

15

Время, мин

J F, мл/мин

5 Время, мин

Рис. 13. Хроматограмма образца мате в изофлюентных условиях при скорости 1 мл/мин (А) и с фадиентом потока (Б) ПФ - ацетонитрил - 3 мМ Н3Р04 (5 95) УФ (280 нм) Градиент потока - пунктирная линия Объем пробы - 5 мкл Теобромин (7), теофиллин (2) и кофеин (3)

Таблица 8. Содержание теобромина, теофиллина и кофеина в напитках (Р=0 95,

п=3)

Объект Определяемый ксантин, мг/г

Теобромин Теофиллин Кофеин

Adrenaline rush +(< с„) - 0.34±0 011 0 29±0 052 0 З43

Растворимый кофе4 - 5±31 6±12 30±51 32±52 -

Мате4 4±21 3±22 21 ±21 22±22 18±11 13±62 -

1изофлюентные условия, скорость ПФ 1 мл/мин градуировочная зависимость по высоте пика 2градиент потока, градуировочная зависимость по высоте пика 'содержание кофеина, указанное производителем, 4в пересчете на сухой порошок

ПРИМЕНЕНИЕ МОНОЛИТНЫХ С1М ДИСКОВ ДЛЯ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ Концентрирование переходных металлов на С1М дисках, модифицированных олигоэтиленаминами. Как правило, прямое определение следовых количеств переходных и тяжелых металлов невозможно без предварительного концентрирования этих металлов из растворов Сорбционное концентрирование с использованием комплексообразующих сорбентов является одним из наиболее эффективных способов решения этой задачи Были выбраны С1М диски, модифицированные олигоэтиленаминами - ЭДА, ДЭТА и ТЭТА Сорбционная емкость по переходным металлам, определенная в статических условиях, составляет 3 36, 1 86 и 0.71 ммоль/г, соответственно.

О, мл/г 90

60

30

С1М-ЭДА

О, МЛ/г 90

60|-30 0

С1М-ТЭТА

1тЛст [ту

рн

О, мл/г 90

п(Н)

от

"N¡(11) Мп(И)

гп(М)

ст^

^Со(11) Сс1(11)

8 рН

Со(И) "Сс1(11) ^¡у!п(11)

Рис. 14. Зависимости сорбции переходных металлов от рН 02 М ацетатный буфер, объем пробы 10 мл (сме= 50 мкг/мл), и = 0 4 см/мин

Изучены комплексообразующие свойства сорбентов и проведено сравнение со свойствами матрицы и с силикагелем вЮг-ДЭТА (сорбционная емкость по Си(И) - 0 12 ммоль/г) Проведенные исследования демонстрируют, что С1М диски, модифицированные олигоэтиленаминами характеризуются высокими значениями коэффициентов распределения О для переходных металлов (рис 14) Следует отметить, что для С1М-ЭДА, С1М-ДЭТА и С1М-ТЭТА зависимости О от рН смещены в более щелочную область относительно зависимостей для ДЭТА-вЮг, что связано с взаимодействием аминогрупп с остаточными силанольными группами на поверхности силикагеля Это обусловливает сорбцию переходных металлов на силикагеле в более кислой области относительно С1М дисков Однако на ДЭТА-

БЮг значения О не превышают 10 мл/г, а на С1М дисках достигают 90 мл/г Несмотря на высокие коэффициенты распределения, полученные для переходных металлов на модифицированных С1М дисках, одного С!М диска недостаточно для обеспечения количественной сорбции (рис 15) Для концентрирования следовых количеств переходных металлов необходимо использовать более длинные колонки, состоящие из 2-х и более дисков

ДЭТА-БЮ

Рис. 15. Зависимости степени извлечения Я Си(И) от рН раствора для С1М-Диол, и гп(И) на С1М-ДЭТА, С1М-ТЭТА, С1М-ЭДА и для ДЭТА-ЭЮг Условия как на рис 14

Концентрирование гистидин-содержащих пептидов на С1М диске методом металло-хелатной хроматографии. Металло-хелатная хроматография - это разновидность лигандообменной хроматографии, предназначенная для разделения белков. Белки, содержащие остатки гистидина способны образовывать координационные связи с ионами переходных металлов Этот метод обеспечивает количественное выделение белков и пептидов без нарушения их структуры и обладает исключительно высокой селективностью Активные центры сорбента, на которых происходит сорбция, представляют собой систему ион переходного металла -иминодиацетатная группа (рис 16) Наиболее стабильными являются поверхностные комплексы иминодиуксусной кислоты (ИДК) с медью(И).

О

СН2

-14': — \

-о

СИ? II

о

Си(Н)-

о

сн2

н—соо-

Рис. 16. Комплекс ИДК-Си(П) на поверхности сорбента.

Природа сорбента, то есть матрица, тип и плотность расположения функциональных групп, существенно влияет на его селективность Для изучения селективности к гистидин-содержащим пептидам был выбран монолитный С1М-ИДК диск и для сравнения 3 коммерческие набивные колонки, модифицированные ИДК, но имеющие различную матрицу Свойства изученных сорбентов представлены в табл 9

Таблица 9. Свойства сорбентов, применяемых для выделения гистидин-____содержащих пептидов _______

Колонка Матрица d4, мкм L dn

CIM -ИДК ГМА-ЭДМА, монолит 1500 нм и 100 нм

HiTrap Chelating Высокосшитая агароза 34 -

Poros 20МС СТ-ДВБ 20 -

TSK Chelate-5PW Метакрилат 10 -

Селективность выбранных сорбентов была изучена для трансферрина, подвергнутого гидролизу Профили элюирования представлены на рис 17 Для колонки TSK Chelate-5PW наблюдали самый большой пик, относящийся к удерживаемым пептидам. Предполагается, что эта колонка удерживает наибольшее количество пептидов. Это подтверждено результатами масс-спектрометричекого анализа (табл 10) Однако эта колонка имеет ряд недостатков - некоторые из удерживаемых пептидов не содержат гистидин, и удерживаются за счет неспецифических взаимодействий, что усложняет дальнейшее исследование Недостатком колонки на основе агарозы является высокое давление на входе в колонку. Количество пептидов, удерживаемых HiTrap Chelating и TSK Chelate-5PW приблизительно одинаково Poros удерживает пептиды очень слабо Монолитный CIM диск, модифицированный ИДК проявляет селективность к гистидин-содержащим пептидам близкую к селективности таких популярных в металло-хелатной хроматографии сорбентов как TSK-гель и агароза Для элюирования пептидов с CiM-ИДК достаточно использовать самый простой способ - понижение рН Для CIM-ИДК давление на входе в колонку при скорости 1 мл/мин не превышает 3-4 атм Повышение скорости пропускания элюента позволит сократить продолжительность металл-хелатного разделения пептидов в несколько раз.

Рис. 17. Профили элюирования гистидин-содержащих пептидов трансферрина на различных колонках Элюент -01 М ацетат натрия (рН 4). Колонки. CIM-ИДК (a), HiTrap Chelating (б), Poros 20МС (в), TSK Chelate-5PW (г).

20 25 Время, мин

Таблица 10. Влияние матрицы сорбента на удерживание гистидин (Н) -__содержащих пептидов трансферрина ___

Масса пептида Последовательность Н|Тгар СИеЫтд С1М диск Рогов ТЭК СЬе1а1е-5ры

1196.53 исаьэннек + + + *

1010 44 САЬБННЕК + + + *

2550 27 рЛГОЕУКОСН1АС!\Л/Р8НТ\Л/АЯ + + + +

2233 12 рСАСОУАП/КНвТ! РЕ N1АЫК + + + +

2070 03 ЕОи\МЕиША(2ЕНРСК + + * +

1587.76 КРУЕЕУАМСНЬАЯ + + + +

1413 71 Е1.1_ЫОА<2ЕНРСК + + + +

1276 63 ЕР<21_Р38РНСК + + + +

1273 65 ШПРЕМЬАМК + + + +

964 53 АРМНА\Л/ТЯ + + + +

874 44 рвАНСРЬК + + + +

1166 59 НСПЛ/РОИТССК + + +

987 46 рКЕАСУНК + + +

1690 83 ЮСН1-АС!УР8НТ\Л/АЯ + + +

1016 49 IKSCHTGI.GR или КЭСНТАУСЯ + + +

1318 57 ЛЛГСАУБЕНЕАТК + +

1209 51 ЬовРРЮНМК + +

744 33 (еасунк + +

700 32 ||_мнср + +

Примечание (+) пептиды элюируются 0 1 М ацетатом натрия (рН 4) * - пептиды элюируются 50 мМ имидазолом (рН 7)

ВЫВОДЫ

1 Синтезированы и изучены монолитные пористые метакрилатные С1М диски, модифицированные олигоэтиленаминами для динамического сорбционного концентрирования ионов переходных металлов в варианте комплексообразовательной хроматографии,- модифицированные иминодиуксусной кислотой - для концентрирования гистидин-содержащих пептидов в варианте лигандообменной хроматографии, модифицированные аминокислотами - для разделения анионов в варианте ионной хроматографии Полученные сорбенты не уступают по селективности традиционно используемым в этих вариантах ВЭЖХ сорбентам.

2 Изучены зависимости эффективности метакрилатных С1М дисков и монолитных колонок на основе силикагеля СИготоНШ ЯР 18е различной длины от линейной скорости ПФ Рассчитаны коэффициенты уравнения Ван Деемтера для этих зависимостей и показано, что потеря эффективности на МПК (коэффициент (С+К) уравнения Родригеса) при увеличении линейной скорости ПФ в 2-4 раза меньше, чем для набивных колонок, заполненных частицами с диаметром более 5 мкм

3 Установлено, что при высоких линейных скоростях элюента на МПК происходит отклонение зависимости ВЭТТ от классического вида, выражающееся в появлении плато или второго минимума Проявление эффекта зависит от размера молекулы сорбата и от вязкости элюента Преимущества эффекта продемонстрированы на примере разделения модельной смеси ПАУ

4. Предложен новый способ градиентного элюирования для гомологов органических соединений и сложных смесей, компоненты которых сильно отличаются по удерживанию, - разделение с градиентом потока элюента Преимущества этого способа по сравнению с изофлюентным вариантом показаны на примере разделения анионов в ионной хроматографии и ПАУ и ди-н-алкилфталатов в ОФ ВЭЖХ Использование градиента потока на МПК позволяет сократить продолжительность анализа в несколько раз при минимальных потерях эффективности разделения и сохранении разрешения пиков до базовой линии Сформулирован принцип создания оптимального градиента потока элюента для разделения гомологов

5 Впервые для разделения использована ультракороткая монолитная колонка Chromolith RP 18е длиной 5 мм Возможности такой колонки показаны на примере разделения 8-ми компонентной модельной смеси ПАУ в изофлюентном варианте и с градиентом потока.

6 Разработана методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных водах, в чае и кофе в изофлюентных условиях и с градиентом потока, которая не уступает по чувствительности известным методикам с УФ детектором при длине волны 280 нм

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1 Воронков А Э , Рыбалко М.А. Монолитные комплексообразующие сорбенты для концентрирование переходных металлов / Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001». Москва, 10-13 апреля 2001 года С 9

2 Рыбалко М А, Нестеренко П Н Комплексообразующие свойства монолитных CIM дисков с закрепленными олигоэтиленаминами Материалы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматофафии» Москва, 2002 С. 84.

3. Рыбалко М.А, Нестеренко П Н Сорбция переходных металлов на монолитных CIM дисках, модифицированных олигоэтиленаминами / Материалы Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии» Краснодар, 6-11 октября 2002 года С

4 Рыбалко МА Разделение неорганических анионов на CIM диске, модифицированном L-гидроксипролином. / Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2003» Москва, 15-18 апреля 2003 года С. 41

5 Rybalko М А , Ren D , Penner N А , Slentz В Е , Inerovicz D , Nesterenko Р N., Regnier F Influence of matrix of iminodiacetic acid-immobilized sorbents on recovery of histidine-containing'peptides by immobilized metal affinity chromatography / Abstr 3rd Int Symposium on Separations in BioSciencies «100 years of chromatography» Moscow, 13-18 May 2003. P 155

6 Rybalko M A , Nesterenko P N Anion-exchange properties of monolithic CIM disk modified by L-hydroxyproline / Abstr 3rd Int Symposium on Separations in BioSciencies «100 years of chromatography» Moscow, 13-18 May 2003 P 238

7 Рыбалко M A , Нестеренко П.Н Использование градиента потока элюента для ВЭЖХ гомологов органических соединений / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы» Москва, 15-19 марта 2004 года. С.

8 Рыбалю М А Применение градиента потока элюента в различных вариантах ВЭЖХ / Материалы Международной конференции студентов и

аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» Москва, 12-15 апреля 2004 года С 33

9 Ren D.Y , Penner N.A , Slentz В E., Inerowicz H D , Rybalko M , Regnier F E // Contributions of commercial sorbents to the selectivity in immobilized metal affinity chromatography with Cu(ll). // J Chromatogr A 2004 V. 1031 P 87-92

10 Nesterenko PN, Rybalko M.A. The use of continuous flow-gradient for separation of inorganic anions on monolithic disk // Mendeleev Commun 2004 V 14 №3. P. 121-122

11 Рыбалко MA., Порус M.B., Нестеренко П.Н ВЭЖХ полиароматических углеводородов на монолитной колонке с использованием градиента потока элюента. / Материалы VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2004». Новосибирск, 6-11 октября 2004 г

12. Нестеренко П.Н., Рыбалко М.А Разделение гомологов органических соединений с применением градиента потока элюента на монолитной пористой колонке. // Журн. аналит химии. 2005 Т. 60 № 4 С 398-403

13. Nesterenko PN., Rybalko MA, Paull В Significant viscosity dependent deviations from classical van Deemter theory in liquid chromatography with porous silica monolithic columns //Analyst. 2005. V 130. N°6. P. 828-830

14. Nesterenko P N , Rybalko M.A Turbulent flow liquid chromatography in porous monolithic columns. I Scientific program of 28th Int. Symposium on Capillary chromatography and electrophoresis Las Vegas, 22-25 May 2005

15 Nesterenko P N , Rybalko M A , Paull В Significant viscosity dependent deviations from classical van Deemter theory in liquid chromatography with porous silica monolithic columns.//Analyst. 2005 V 130. № 6 P 828-830

16 Nesterenko PN , Paull В , Rybalko MA The chromatographic performance of monolithic columns under flow gradient and turbulent liquid chromatography modes / Scientific program of 29th Int. Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC-2005 Stockholm, Sweden, 26-30 June 2005.

17 Нестеренко П.Н, Рыбалко M.A. Применение ультракоротких монолитных пористых колонок и градиента потока элюента для хроматографического разделения полиароматических углеводородов. // Доклады РАН 2005 Т 404 № 3. С. 348-351

Подписано к печати 14.10.05г. Объем 1,4 п.л. Заказ 133- Тираж 100

ООП Физ ф-та МГУ.

№18 8 4 2

РНБ Русский фонд

2006-4 21597

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОРИСТЫЕ МОНОЛИТЫ В ВЭЖХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Предпосылки и история возникновения монолитных колонок.

1.2. Способы получения пористых монолитов.

1.2.1. Органополимерные пористые монолиты («молдинг»-синтез).

1.2.1.1. Влияние температуры полимеризации.

1.2.1.2. Влияние состава порогена.

1.2.1.3. Влияние сшивающего агента.

1.2.1.4. Получение монолитов большого диаметра.

1.2.1.5. Полимеризация в водном растворе.

1.2.2. Получение монолитов на основе силикагеля (золь-гель процесс).

1.2.3. Спекание микрочастиц.

1.2.4. воспроизводимость получения различных монолитов.

1.3. Свойства монолитных пористых колонок.

1.3.1. Пористые свойства.

1.3.2. Механические и гидродинамические свойства.

1.3.3. Массообмен и динамические свойства.

1.4. Модифицирование поверхности пористых монолитов.

1.4.1 .Химическое модифицирование.

1.4.1.1. Модифицирование органополимерных колонок.

1.4.1.2. Модифицирование поверхности колонок на основе силикагеля.

1.4.2. Динамическое модифицирование.

1.5. Промышленно выпускаемые монолитные колонки и их применение.

• 1.5.1. Монолитные пористые CIM диски.

1.5.2. Макропористые полимерные монолитные колонки.

1.5.3. Трубчатые монолитные колонки с радиальным течением (CIM колонки).

1.5.4. Колонки на основе сжатого полиакриламидного геля.

1.5.5. Монолитные колонки на основе силикагеля (Chromolith).

1.6. Области применения монолитных колонок.

1.6.1. Ионообменная хроматография.

1.6.2. Обращеннофазовая жидкостная хроматография.

1.6.3. Аффинная хроматография.

1.6.4. Капиллярная электрохроматография.

1.6.5. Биореакторы и твердофазное детектирование.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реагенты и растворы.

2.2. Колонки и сорбенты.

2.3. Аппаратура.

2.4. Методика эксперимента.

2.4.1. Модифицирование поверхности CIM диска диэтилентриамином и триэтилентетрамином

2.4.2. Гидролиз эпоксидных групп ГМА-ЭДМА матрицы.

2.4.3. Модифицирование CIM дисков аминокислотами.

2.4.4. Определение максимальной сорбционной емкости монолитной колонки по Zn2+.

2.4.5. спектрофотометрическое определение ионов металлов.

2.4.6. Образование комплексов иминодиуксусная кислота - медь (II) на поверхности сорбентов

2.4.7. Концентрирование гистидин-содержащих пептидов методом металло-хелатной хроматографии.

2.4.8. Расчет эффективности колонки.

2.4.9. Приготовление образцов чая, кофе и других напитков.

2.4.9.1. Пробоподготовка чая, мате и молотого кофе.

2.4.9.2. Пробоподготовка растворимого кофе.

Ф 2.4.9.3. Пробоподготовка кофеинсодержащих газированных напитков.

ГЛАВА 3. ПРИМЕНЕНИЕ МОНОЛИТНЫХ CIM ДИСКОВ ДЛЯ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ.

3.1. ионообменные и комплексообразующие свойства монолитных пористых cim дисков, модифицированных олигоэтиленаминами.

3.1.1. химия поверхности cim дисков в зависимости от модифицирования.

3.1.2. гидродинамические свойства CIM дисков.

3.1.3. кислотно-основные свойства CIM дисков с различными функциональными группами.

3.1.4. Статическая емкость сорбентов по сорбции переходных металлов.

3.1.5. комплексообразующие свойства.

3.2. концентрирование гистидин-содержащих пептидов на cim диске методом металло-хелатной хроматографии.

3.2.1. свойств а сорбентов.

3.2.2. выбор условий элюирования.

3.2.3. концентрирование гистидин-содержащих пептидов трансферрина на различных сорбентах.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГРАДИЕНТА ПОТОКА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ РАЗДЕЛЕНИЯ В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

4.1. использование градиента потока в ионной хроматографии для разделения анионов.

4.1.1. ионообменные свойства cim дисков, модифицированных а-аминокислотами.

4.1.1.1. Влияние природы элюента, его концентрации ирН.

4.1.2. анионообменные свойства cim дисков, модифицированных олигоэтиленаминами.

4.1.3. зависимость эффективности разделения от скорости подвижной фазы.

4.1.3.1.Эффективность CIM дисков, модифицированных олигоэтшенаминами и аминокислотами

4.1.3.2. Эффективность CIMколонки, состоящей из нескольких CIM дисков.

4.1.4. оптимизация условий разделения.

4.1.4.1. Разделение анионов с применением градиента потока.

4.1.4.2. Влияние градиента потока на эффективность разделения и разрешение пиков.

4.2. использование градиента потока элюента в обращеннофазовой хроматографии для разделения гомологов органических соединений.

4.2.1. полиароматические углеводороды.

4.2.1.1. Выбор условий для разделения ПАУ с градиентом потока.

4.2.1.2. Разделение ПАУ с градиентом потока.

4.2.2. разделение пау на ультракороткой монолитной пористой колонке с градиентом потока элюента.

4.2.2.1. Выбор условий для разделения ПАУ в изофлюентных условиях и с градиентом потока.

4.2.2.2. Разделение ПАУ с градиентом потока.

4.2.3. ди-н-алкилфталаты.

4.2.3.1. Выбор условий для разделения ди-н-алкилфталатов.

4.2.3.2. Разделение ди-н-алкилфталатов с градиентом потока.

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ МЕТИЛКСАНТИНОВ В НАПИТКАХ.

5.1. Выбор условий для разделения теобромина, теофиллина и кофеина.

5.2. Определение тебромина, теофиллина и кофеина в напитках.

ГЛАВА 6. ОСОБЕННОСТИ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ ВЫСОКИХ СКОРОСТЯХ ЭЛЮЕНТА НА МОНОЛИТНЫХ ПОРИСТЫХ КОЛОНКАХ.

6.1. Влияние вязкости подвижной фазы на вид кривой Ван Деемтера.

6.2. Использование отклонения от кривой Ван Деемтера классического вида для улучшения эффективности разделения полиароматических углеводородов.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Актуальность темы. Традиционно используемая в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) колонка, представляет собой стальную, стеклянную или полимерную трубку, заполненную частицами сорбента. Наиболее важной характеристикой хроматографической колонки является ее эффективность, которая обратно пропорциональна размеру частиц и прямо пропорциональна длине колонки, а также зависит от однородности набивки колонки и скорости пропускания элюента. Обычно для заполнения колонок используют сорбенты с частицами размером 5-10 мкм. При уменьшении размера частиц с 5 до 1-3 мкм улучшается массообмен, что теоретически позволяет повысить эффективность разделения. Однако уменьшение размера частиц сопровождается ухудшением проницаемости колонки, выражающимся в резком, обратно пропорциональном размеру частиц сорбента во второй степени увеличении давления на входе в колонку [ 1 ]. В свою очередь, оптимальное рабочее давление определяется прочностью матрицы сорбента и, обычно, не Ф превышает 100-150 атм для сорбентов на основе силикагеля и 80-100 атм для органополимерных сорбентов, а также возможностями хроматографических насосов. Поэтому использование колонок, заполненных частицами диаметром менее 3 мкм требует уменьшения длины колонки, и, следовательно, уменьшения ее эффективности (числа теоретических тарелок на колонку). Таким образом, эффективность набивной хроматографической колонки для аналитической ВЭЖХ лимитируется максимальным давлением на входе в колонку, которое определяется размером частиц.

Стремление исследователей получить разделения на колонках, заполненных частицами 1-3 мкм большой длины положило начало развитию такого варианта хроматографии как жидкостная хроматография сверхвысокого давления [ 1, 2], когда разделения проводят при давлении вплоть до 9000 атм. Другое решение проблемы повышения эффективности состоит в использовании принципиально новых сорбционных материалов, обладающих более высокой проницаемостью.

В конце 1990-х гг. ведущие производители хроматографических колонок А освоили производство перспективных для решения этих проблем сорбентов, так называемых монолитных пористых колонок (МПК). МПК представляет собой непрерывную пористую структуру с бимодальным распределением пор. Сквозные транспортные поры обеспечивают низкое давление на входе в колонку, а мезопоры, формирующие развитую поверхность с большой площадью, обеспечивают высокую эффективность и нагрузочную способность [3]. Эффективность кремнеземной монолитной колонки Chromolith RP 18е сравнима с эффективностью набивных колонок, заполненных частицами силикагеля размером 3 мкм, причем высокая скорость массообмена обеспечивает минимальные потери в эффективности разделения при высоких скоростях подвижной фазы [4]. Давление на входе в монолитную колонку Chromolith приблизительно в 6 раз меньше, чем для колонки, заполненной частицами размером 3.5 мкм при одинаковых размерах колонок [5]. Совокупность этих свойств позволяет выделить МПК как отдельную группу неподвижных фаз перспективных для использования в различных вариантах ВЭЖХ.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении свойств монолитных пористых CIM (Convective Interaction Media) дисков, на основе сополимера глицидилметакрилата и этилендиметакрилата, и МПК Chromolith RP 18е на основе силикагеля и реализации их преимуществ в ВЭЖХ. Конкретные задачи исследования включали:

- модифицирование метакрилатных CIM дисков различными ионообменными и комплексообразующими функциональными группами - диольными, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой;

- изучение гидродинамических свойств МПК - сопротивления потоку и эффективности в зависимости от скорости пропускания элюента и их сравнение со свойствами набивных колонок;

- установление зависимости эффективности МПК от вязкости элюента при высоких линейных скоростях;

- изучение ионообменных и комплексообразующих свойств монолитных дисков, модифицированных олигоэтиленаминами и аминокислотами;

- установление возможностей использования монолитных пористых дисков для динамического сорбционного концентрирования неорганических ионов и пептидов;

- разработка нового варианта элюирования при использовании подвижной фазы постоянного состава с градиентом потока элюента для разделения анионов в варианте ионной ВЭЖХ и для разделения гомологов органических соединений в варианте обращенно-фазовой ВЭЖХ;

- разработка методики определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных напитках, чае и кофе в изофлюентном режиме и с градиентом потока элюента.

Научная новизна. Синтезировано 6 типов монолитных пористых дисков, модифицированных диольными группами, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой. Изучены их ионообменные свойства по удерживанию модельных органических соединений и неорганических анионов.

При разделении анионов на CIM дисках впервые отмечен эффект улучшения эффективности разделения при увеличении скорости пропускания элюента при скоростях, значительно превышающих значения, соответствующие минимуму кривой Ван Деемтера. При изучении гидродинамических свойств МПК на основе силикагеля установлено, что зависимости эффективности от линейной скорости элюента заметно отличаются от классического вида, описываемого уравнением Ван Деемтера. Установлено, что при высоких скоростях элюента на МПК на зависимости появляется второй минимум. Эффект зависит от размера молекулы сорбата и появляется при более низких линейных скоростях при использовании элюентов с большей вязкостью.

Предложен новый вариант градиентной хроматографии при постоянной концентрации элюента, но с градиентом потока элюента. Показаны преимущества этого метода при разделении сложных смесей -полиароматических углеводородов (ПАУ), ди-«-алкилфталатов и метилксантинов. Наиболее эффективно использование этого приема для

разделения смесей, компоненты которых сильно отличаются по удерживанию, а также гомологов органических соединений.

Предложен новый термин для разделения при постоянной скорости потока элюентом постоянного состава — изофлюентное элюирование.

На ультракороткой колонке Chromolith RP 18е длиной 5 мм получено разделение 8-ми компонентной смеси ПАУ в изофлюентном режиме и с градиентом потока.

Практическая значимость. Проведена оценка возможностей применения CIM дисков с различными функциональными группами для динамического сорбционного концентрирования ионов переходных металлов в варианте комплексообразовательной хроматографии, гистидин-содержащих пептидов в варианте лигандообменной хроматографии и для разделения неорганических анионов в варианте ионной хроматографии. Показана возможность использования CIM дисков, применяемых в ВЭЖХ, для концентрирования переходных металлов с перистальтическим насосом.

Показана перспективность использования градиента потока сокращения времени для разделения сложных смесей на примере разделения неорганических анионов в варианте ионной хроматографии и гомологов органических соединений - ПАУ и ди-я-алкилфталатов - в варианте ОФ ВЭЖХ. Показаны преимущества использования ультракоротких монолитных колонок для разделения ПАУ в варианте ОФ ВЭЖХ в случае, когда эффективность обычной хроматографической колонки длиной 5-10 см избыточна.

Разработана методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных напитках, чае и кофе на монолитной пористой колонке в изофлюентной ОФ ВЭЖХ и с градиентом потока. Пределы обнаружения метилксантинов составляют 0.05 мкг/мл для теобромина и теофиллина и 0.1 мкг/мл для кофеина.

На защиту выносятся следующие положения - синтез монолитных пористых дисков новыми функциональными группами и изучение их ионообменных и комплексообразующих свойств;

- гидродинамические свойства монолитных метакрилатных CIM дисков и МПК на основе силикагеля Chromolith RP-18e различной длины и их сравнение с набивными колонками;

- улучшение эффективности МПК при высоких скоростях элюента, значительно превышающих оптимальные, зависимость этого явления от вязкости элюента;

- применение монолитных пористых CIM дисков для концентрирования переходных металлов и гистидин-содержащих пептидов;

- применение градиентов потока элюента для разделения анионов в варианте ионной хроматографии и для разделения ПАУ и ди-н-алкилфталатов в варианте ОФ ВЭЖХ, принцип выбора оптимального градиента потока;

- методика определения теобромина, теофиллина и теобромина в газированных напитках, чае и кофе в изофлюентных условиях и с градиентом потока элюента.

Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в публикациях и доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001», «Ломоносов-2003» и «Ломоносов-2004» (Москва); на Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); на Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитический химии» (Краснодар, 2002); на 3-ем Международном симпозиуме по разделениям в бионауках «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на Всероссийской конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004); на 28-ом Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрохроматографии (Лас Вегас, 2005), на 29-ом международном симпозиуме HPLC-2005 (Стокгольм, 2005).

Публикации по работе. Основные результаты диссертации изложены в следующих статьях:

1. Ren D.Y., Penner N.A., Slentz В.Е., Inerowicz H.D., Rybalko M., Regnier F.E. // Contributions of commercial sorbents to the selectivity in immobilized metal affinity chromatography with Cu(II). // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1031. P. 87-92.

2. Nesterenko P.N., Rybalko M.A. The use of continuous flow-gradient for separation of inorganic anions on monolithic disk. // Mendeleev Commun. 2004. V. 14. № 3. P. 121-122.

3. Нестеренко П.Н., Рыбалко M.A. Разделение гомологов органических соединений с применением градиента потока элюента на монолитной пористой колонке. // Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60. № 4. С. 398-403.

4. Nesterenko P.N., Rybalko М.А., Paull В. Significant viscosity dependent deviations from classical van Deemter theory in liquid chromatography with porous silica monolithic columns. // Analyst 2005. V. 130. № 6. P. 828-830.

5. Нестеренко П.Н., Рыбалко M.A. Применение ультракоротких монолитных пористых колонок и градиента потока элюента для хроматографического разделения полиароматических углеводородов. Доклады РАН. 2005. Т. 404. № 3. С. 348-351. и тезисах:

1. Воронков А.Э., Рыбалко М.А. Монолитные комплексообразующие сорбенты для концентрирование переходных металлов. Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001». Москва, 10-13 апреля 2001 года. С. 9.

2. Рыбалко М.А., Нестеренко П.Н. Комплексообразующие свойства монолитных CIM дисков с закрепленными олигоэтиленаминами. Тезисы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии». Москва, 2002. С. 84.

3. Рыбалко М.А., Нестеренко П.Н. Сорбция переходных металлов на монолитных CIM дисках, модифицированных олигоэтиленаминами. Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии». Краснодар, 6-11 октября 2002 года. С.

4. Рыбалко М.А. Разделение неорганических анионов на CIM диске, модифицированном Ьтгидроксипролином. Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2003». Москва, 15-18 апреля 2003 года. С. 41.

5. Rybalko М.А., Ren D., Penner N.A., Slentz B.E., Inerovicz D., Nesterenko P.N., Regnier F. Influence of matrix of iminodiacetic acid-immobilized sorbents on recovery of histidine-containing peptides by immobilized metal affinity chromatography. Abstr. 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies «100 years of chromatography». Moscow, 13-18 May 2003. P.155.

6. Rybalko M.A., Nesterenko P.N. Anion-exchange properties of monolithic CIM disk modified by L-hydroxyproline. Abstr. 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies «100 years of chromatography». Moscow, 13-18 May 2003. P. 238.

7. Рыбалко M.A., Нестеренко П.Н. Использование градиента потока элюента для ВЭЖХ гомологов органических соединений. Тезисы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва, 15-19 марта 2004 года. С.

8. Рыбалко М.А. Применение градиента потока элюента в различных вариантах ВЭЖХ. Тезисы Me жду нар одной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004». Москва, 12-15 апреля 2004 года. С. 33.

9. Рыбалко М.А., Порус М.В., Нестеренко П.Н. ВЭЖХ полиароматических углеводородов на монолитной колонке с использованием градиента потока элюента. Тезисы VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2004». Новосибирск, 6-11 октября 2004 г.

10. Nesterenko P.N., Rybalko М.А. Turbulent flow liquid chromatography in porous monolithic columns. Scientific program of 28th Int. Symposium on Capillary chromatography and electrophoresis. Las Vegas, 22-25 May 2005.

11. Nesterenko P.N., Paull В., Rybalko M.A. The chromatographic performance of monolithic columns under flow gradient and turbulent liquid chromatography modes. Scientific program of 29th Int. Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC-2005. Stockholm, Sweden, 26-30 June 2005.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (173 наименования). Работа изложена на 180 страницах печатного текста, содержит 52 рисунка и 46 таблиц.

выводы

1. Синтезированы и изучены монолитные пористые метакрилатные CIM диски, модифицированные олигоэтиленаминами ;цчя динамического сорбционного концентрирования ионов переходных металлов в варианте комилексообразователыюй хроматографии; модифицированные иминодиуксусной кислотой - для концентрирования гистидин-содержащих пептидов в варианте лигандообмепной хроматографии, модифицированные аминокислотами - для разделения анионов в варианте ионной хроматографии. Полученные сорбенты пе уступают по селективности традиционно используемым в этих вариантах ВЭЖХ сорбентам.

2. Изучены зависимости эффективности мстакрилатных CIM дисков и монолитных колонок па основе силикагеля Chromolith RP 18е различной длины от линейной скорости ПФ. Рассчитаны коэффициенты уравнения Ван Деемтера для этих зависимостей и показано, что потеря эффективности на МПК (коэффициент С уравнения Ван Деемтера) при увеличении линейной скорости ПФ в 2-4 раза меньше, чем для набивных колонок, заполненных частицами с диаметром более 5 мкм.

3. Установлено, что при высоких линейных скоростях элюента на МПК происходит отклонение зависимости ВЭТТ от классического вида, выражающееся в появлении плато или второго минимума. Проявление эффекта зависит от размера молекулы сорбата и от вязкости элюента. Преимущества эффекта продемонстрированы па примере разделения модельной смеси ПАУ.

4. Предложен новый способ градиентного элюнрования для гомологов органических соединений и сложных смесей, компоненты которых сильно отличаются по удерживанию, - разделение с градиентом потока элюента. Преимущества этого способа по сравнению с гпофлюентным вариантом показаны на примере разделения анионов в ионной хроматографии и ПАУ и ди-«-алкилфталатов в ОФ ВЭЖХ. Использование градиента потока на МПК позволяет сократить продолжительность анализа в несколько раз при минимальных потерях эффективности разделения и сохранении разрешения пиков до базовой линии. Сформулирован принцип создания оптимального градиента потока элюента для разделения гомологов.

5. Впервые для разделения использована ультрокороткая монолитная колонка Chromolith RP 18е длиной 5 мм. Возможности такой колонки показаны на примере разделения 8-ми компонентной модельной смеси ПАУ в изофлюентном варианте и с градиентом потока.

6. Разработана методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных водах, в чае и кофе в изофлюепгиых условиях и с градиентом потока, которая не уступает по чувствительности известным методикам с УФ детектором при длине волны 280 нм.

1. MacNair J.E., Lewis K.S., Jorgenson J.W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 983989.

2. MacNair J.E., Patel K.D., Jorgenson J.W. Ultrahigh-pressure reversed-phase capillary liquid chromatography: isocratic and gradient elution using columns packed with 1.0-jim particles. //Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 700-708.

3. Al-Bokary M., Cherrak D., Guiochon G. Determination of the porosities of monolithic columns by inverse size-exclusion chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 975. P. 275-284.

4. Hatsis P., Lucy C.A. Improved sensitivity and characterization of high-speed ion chromatography of inorganic anions. //Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 995-1001.

5. Schafer C., Cabrera K., Lubda D., Sinz K., Cunningham D. HPLC columns: The next great leap forward-Part 2. // American Laboratory. 2001. P. 25-26.

6. Josic D., Strancar A. Application of membranes and compact, porous units for the separation of biopolymers. // Ind. Eng. Chem. Res. 1999. V. 38. P. 333-342.

7. Keulemans, A. I. M. 221. 1967. London. Gas chromatography 1966. The Institute of Petroleum.

8. Hileman F.D., Sievers R.E., Hess G.G., Ross W.D. In Situ Preparation and Evaluation of Open Pore Polyurethane Chromatographic Columns. // Anal. Chem. 1973. V. 45. P. 1126-1130.

9. Tennikova T.B., Svec F., Belenkii B.G. High-performance membrane chromatography: highly efficient separation method for proteins in ion-exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase modes. // J. Chromatogr. 1993. V. 646. P. 279-288.

10. Hjerten S., Liao J.-L. High-performance liquid chromatography on continuous polymer beds. // J. Chromatogr. 1989. V. 473. P. 273-275.

11. Svec F., Frechet J.M.J. Continuous Rods of Macroporous Polymer as High-Performance Liquid Chromatography Separation Media. // Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 820-822.

12. Fields S. Silica xerogel as continuous column support for high performance liquid chromatography. //Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 2709-2712.

13. Minakuchi H., Nakanishi K., Soga N., Ishizuka N., Tanaka N. Octadecylsilylated porous silica rods as separation media for reversed-phase liquid chromatography. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 3498-3501.

14. Minakuchi H., Nakanishi К., Soga N., Ishizuka N., Tanaka N. Effect of skeleton size on the performance of octadecylsilylated continuous porous silica columns in reversed-phase liquid chromatography. //J. Chromatogr. A. 1997. V. 762. P. 135-146.

15. Ericson C., Liao J.-L., Nakazato K., Hjerten S. Preparation of continuous beds for electrochromatography and reversed-phase liquid chromatography of low-molecular-mass compounds. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 767. P. 33-41.

16. Fujimoto C., Kino J., Sawada H. Capillary electrochromatography of small molecules in polyacrylamide gels with electroosmotic flow. // J Chromatogr. A. 1995. V. 716. P. 107-113.

17. Fujimoto C., Fujise Y. Fritless packed columns for capillary electrochromatography: Separation of uncharged compounds on hydrophobic hydrogels. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 2753-2757.

18. Palm A., Novotny M. Macroporous polyacrylamide/poly(ethylene-glycol) matrixes as stationary phases in capillary electrochromatography. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4499-4507.

19. Peters E.C., Petro M., Svec F., Frechet J.M.J. Molded rigid polymer monoliths as separation media for capillary electrochromatography. 1.Fine control of porous properties and surface chemistry. // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 2288-2295.

20. Peters E.C., Petro M., Svec F., Frechet J.M.J. Molded rigid polymer monoliths as separation media for capillary electrochromatography. Effect of chromatographic conditions on the separation. // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 2296-2302.

21. Svec F., Frechet J.M.J. Modified poly(glycidyl methacrylate -co-ethylene dimethacrylate) continuous rod columns for preparative-scale ion-exchange chromatography of proteins. // J Chromatogr. A. 1995. V. 702. P. 89-95.

22. Wang Q., Svec F., Frechet J.M.J. Macroporous polymeric stationary-phase rod as continuous separation medium for reversed-phase chromatography. // Anal. Chem. 1993. V. 65. P. 2243-2248.

23. Gusev I., Huang X., Horvath C. Capillary columns with in situ formed porous monolithic packing for micro high-performance liquid chromatography and capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 855. P. 273-290.

24. Svec F., Frechet J.M.J. Molded rigid monolithic porous polymers:an inexpensive, efficient, and versatile alternative to beads for the design of materials for numerous applications. // Ind. Eng. Chem. Res. 1999. V. 38. P. 34-48.

25. Svec F., Frechet J.M.J. Kinetic control of pore formation in macroporous polymers. The formation of "molded" porous materials with high flow characteristics for separations or catalysis. // Chem. Mater. 1995. P. 707-715.

26. Tanaka N., Araki T. Polymer-Based Packing Materials for RPLC. // Advances in Chromatography. 1989. V. 30. P. 81.

27. Coufal P., Cihak M., Suchankova J., Tesarova E., Bosakova Z., Stulik K. Methacrylate monolithic columns of 320 mm I.D. for capillary liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 946. P. 99-106.

28. Hoegger D., Freitag R. Investigation of mixed-mode monolithic stationary phases for the analysis of charged amino acids and peptides by capillary electro chromatography. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1004. P. 195-208.

29. Huang X., Horvath C. Capillary zone electrophoresis with fluid-impervious polymer tubing inside fused-silica capillary. //J. Chromatogr. A. 1997. V. 788. P. 155-164.

30. Liao J.-L., Chen N., Ericson C., Hjerten S. Preparation of continuous beds derivatized with one-step alkyl and sulfonate groups for capillary electrochromatography. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 3468-3472.

31. Podgornik A., Barut M., Strancar A. Construction of large-volume monolithic columns. //Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 5693-5699.

32. Peters E.C., Svec F., Frechet J.M.J. The preparation of large diameter "molded" porous polymer monoliths and the control of pore structure homogeneity. // Chem. Mater. 1997. V. 9. P. 1898-1902.

33. Hoegger D., Freitag R. Acrylamide-based monoliths as robust stationary phases for capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 914. P. 211-222.

34. Hjerten S. Standard and capillary chromatography, including elecrtochromatography, on continuous polymer beds (monoliths), based on water-soluble monomers. // Ind. Eng. Chem. Res. 1999. V. 38. P. 1205-1214.

35. Ishizuka N., Minakuchi H., Nakanishi K., Soga N., Hosoya K., Tanaka N. Chromatographic Properties of Miniaturized Silica Rod Columns. // J. High Resol. Chromatogr. 1998. V. 21. P. 477-479.

36. Tang Q., Xin В., Lee M.L. Monolithic columns containing sol-gel bonded octadecylsilica for capillary electrochramatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 837. P. 35-50.

37. Dulay M., Kulkarni R., Zare R. Preparation and characterization of monolithic porous capillary columns loaded with chromatographic particles. // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 5103-5107.

38. Malik A., Hayes J., Wang S., Chong S., Corbett G., and Cramer J. 19th International Symposium on Capillary Chromatography and Electrophoresis. 1997.

39. Ishizuka N., Minakuchi H., Nakanishi K., Soga N., Tanaka N. Designing monolithic double-pore silica for high-speed liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 797. P. 133-137.

40. Nakanishi, K. and Soga, N. Inorganic porous materials and process for making same. US pat. 5,624,875. 1997.

41. Nakanishi K., Minakuchi H., Soga N., Tanaka N. Double pore silica gel monoliths applied to liquid chromatography. // J. Sol-Gel Sci. and Technol. 1997. V. 8. P. 547-552.

42. Ishizuka N., Kobayashi H., Minakuchi H., Nakanishi K., Hirao K., Hosoya K., Ikegami Т., Tanaka N. Monolithic silica columns for high-efficiency separations by high-performance liquid chromatography. // J Chromatogr. A. 2002. V. 960. P. 85-96.

43. Svec F. Porous monolith: the newest generation of stationary phases for HPLC and related methods. // LC-GC Europe. 2003. P. 2-6.

44. Asiaie R., Huang X., Farnan D., Horvath C. Sintered octadecylsilica as monolithic column packing in capillary electrochromatography and micro high performance liquid chromatography. // J Chromatogr. A. 1998. V. 806. P. 251-263.

45. Kele M., Guiochon G. Repeatability and reproducibility of retention data and band profiles on six batches of monolithic columns. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 960. P. 1949.

46. Iberer G., Hahn R., Jungbauer A. Monoliths as stationary phases for separating biopolymers-forth generation chromatography sorbents. // LC-GC Europe. 2000. P. 8895.

47. Freeman D.H., Poinescu J.C. Particle porosimetry by inverse gel permeation chromatography. //Anal. Chem. 1977. V. 49. P. 1183-1188.

48. Jerabek K. Determination of pore volume distribution from size exclusion chromatography data. // Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 1595-1597.

49. Jerabek K. Characterization of swollen polymer gels using size exlusion chramatography. //Anal. Chem. 1985. V. 57. P. 1598-1602.

50. Горбунов A.A., Скворцов A.M. О молекулярно-массовых зависимостях в хроматографии полимеров. // Высокомол. соед. Сер. А. 1980. Т. 22. С. 1137-1145.

51. Горбунов А.А., Соловьева Л.Я., Пасечник В.А. Определение характеристик пористой структуры сорбентов методом гель-проникающей хроматографии полимеров. // Высокомол. соед. Сер. А. 1984. Т. 26. С. 967-973.

52. Warren F.V., Bidlingmeyer J., Bidlingmeyer B.A. Determination of pore size distribution of liquid chromatographic column packings by gel permeation chromatography. //Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 950-957.

53. Kaltenbrunner 0., Jungbauer A., Yamamoto S. Prediction of the preparative chromatography performance with a very small columns. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 760. P. 41-53.

54. Tennikov M.B., Gazdina N.V., Tennikova T.B., Svec F. Effect of porous structure of macroporous polymer supports on resolution in high-performance membrane chromatography of proteins. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 55-64.

55. Leinweber F.C., Tallarek U. С hromatographic performance of monolithic and particulate stationary phases. Hydrodynamics and adsorption capacity. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1006. P. 207-228.

56. Wang Q., Svec F., Frechet J.MJ. Reversed-phase chromatography of small molecules and peptides on a continuous rod of macroporous poly(styrene-co-divinylbenzene). // J. Chromatogr. 1994. V. 669. P. 230-235.

57. Wang Q., Svec F., Frechet J.M.J. Hydrophilization of porous polystyrene-based continuous rod columns. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 670-674.

58. Vodopivec M., Berovic M., Jancar J., Podgornik A., Strancar A. Application of Convective Interaction Media disk with immobilised glucose oxidase for on-line glucose measurements. //Analyt. Chim. Acta. 2000. V. 407. P. 105-110.

59. Podgornik A., Barut M., Jancar J., Strancar A. Isocratic separation on thin glycidil methacrylate-ethylenedimethacrylate monoliths. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 848. P. 5160.

60. Sykora D., Svec F., Frechet J.MJ. Separation of oligonucleotides on novel monolithic columns with ion-exchange functional surfaces. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 297-304.

61. Platonova G.A., Pankova G.A., Il'lina I.Y., Vlasov G.P., Tennikova T.B. Quantitative fast fractionation of a pool of polyclonal antibodies by immunoafflnity membrane chromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 852. P. 129-140.

62. Muller W. New ion exchangers for the chromatography of biopolymers. // J. Chromatogr. 1990. V. 510. P. 133-140.

63. Bamford C.H., Al-Lamee K.G. Polymer surface functionalization and grafting by a simple and inexpensive method. // Macromol. Rapid Commun. 1994. V. 15. P. 379-384.

64. Bamford C.H., Al-Lamee K.G. Studies of polymer surface functionalization and grafting for biomedical and other applications. // Polymer. 1994. V. 35. P. 2844-2852.

65. Mino G., Kaizerman S. A new method for the preparation of graft copolymers. Polymerization initiated by eerie ion redox system. // J. Polym. Sci. 1958. V. 31. P. 242243.

66. Peters E.C., Svec F., Frechet J.M.J. Termally responsive rigid polymer monoliths. // Adv. Mater. 1997. V. 9. P. 630.

67. Sugrue E., Nesterenko P., Paull B. Iminodiacetic acid functionalised monolithic silica chelating ion exchanger for rapid determination of alkaline earth metal ions in high ionic strength samples. //Analyst. 2003. V. 128. P. 417-420.

68. Sugrue E., Nesterenko P., Paull B. Ion Exchange Properties of Monolithic and Particle Type Iminodiacetic Acid Modified Silica. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 921-930.

69. Hatsis P., Lucy C.A. Ultra-fast HPLC separation of common anions using a monolithic stationary phase. //Analyst. 2002. V. 127. P. 451-454.

70. Victory D., Nesterenko P., Paull B. Low-pressure gradient micro-ion chromatography with ultra-short monolithic anion exchange column. // Analyst. 2004. V. 129. P. 700-701.

71. Guo Y., Yan Z., and Fritz J.S. High-speed ion chromatography of anions on monolithic column coated with cationic surfactant. IICS Simposium. Trier, Germany, 2004. P. 52-53.

72. Xu Q., Tanaka K., Mori M., Helaleh M.I.H. Monolithic octadecylsilyl-silica gel column for the high-speed ion chromatographic determination of acidity. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 997. P. 183-190.

73. Xu Q., Tanaka K., Mori M., Ikedo M. Dodecylsulfate-coated monolithic octadecyl-bonded silica stationary phase for high-speed separation of hydrogen, magnesium and calcium in rainwater. // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1026. P. 191-194.

74. Xu Q., Tanaka K., Mori M., Helaleh M.I.H., Hu W., Hasebe K., Toada H. Monolithic ODS-silica gel column for determination of hydrogen, sodium, ammonium and potassium in acid rain by ion chromatography. // Chromatographic 2003. V. 57. P. 19-22.

75. Paull В., Riordain C.O., Nesterenko P.N. Double gradient ion chromatography on a short carboxybetaine coated monolithic anion exchanger. // Chem. Comm. 2005. P. 215217.

76. Connolly D., Paull B. Fast ion chromatography of common inorganic anions on a short ODS column permanently coated with didocyldimethylammonium bromide. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 953. P. 299-303.

77. Svec, F., Bleha, M, Tennikova, Т. В., and Belenkii, B. G. Macroporous polymeric membranes for the separation of polymers and a method of their application. U.S. Pat. 4,889,632. 1989.

78. Cabrera K., Wieland G., Lubda D., Nakanishi K., Soga N., Minakuchi H., Unger K.K. SilicaROD-A new challenge in fast high-performance liquid chromatography separations. // Trends in Analytical Chemistry. 1998. V. 17. P. 50-53.

79. BIA Separations.http://www.biaseparations.com. 2005.

80. Merck KGaA.Chromolith columns.http.7/www.chromolith.com . 2005.

81. Cabrera K., Lubda D., Sinz K., Schafer C. HPLC columns: the next great leap forward.Part 1. // American Laboratory. 2001. V. 33. P. 40-41.

82. Web page: http://wwwlconchrom.de. 2005.

83. Sepragen innovators in separation technology, http://www.sepragen.com. 2005.

84. Bio-Rad Laboratories.http://www.biorad.com. 2005.

85. Swift Columns.http://www.swiftcolumns.com. 2005.

86. LC Packings. A Dionex Company, http://www.lcpackings.com. 2005.

87. Tennikova T.B., Belenkii B.G., Svec F. High-Performance Membrane Chromatography. A Novel Method of Protein Separation. // J. Liquid Chromatogr. 1990. V. 13. P. 63-70.

88. Tennikova T.B., Bleha M., Svec F., Almazova T.V., Belenkii B.G. High-Performance Membrane Chromatography of Proteins. // J Chromatogr. 1991. V. 555. P. 97-107.

89. Josic D., Reusch J. High-performance membrane chromatography of serum and plasma membrane proteins. // J Chromatogr. 1992. V. 590. P. 59-76.

90. Reif О., Freitag R. Characterization and application of strong ion-exchange membrane adsorbers as stationary phases in high-performance liquid chromatography of proteins. // J Chromatogr. 1993. V. 654. P. 29-41.

91. Connolly D., Victory D., Paull B. Rapid, low pressure, and simultaneous ion chromatography of common inorganic anions and cations on short permanently coated monolithic columns. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 912-920.

92. Vodopivec M., Podgornik A., Berovic M., Strancar A. Application of convective interaction media (CIM) disk monolithic columns for fast separation and monitoring of organic acid. // J. Chrom. Sci. 2000. V. 38. P. 489-495.

93. Cabrera K., Wieland G., Lubda D., Nakanishi K., Soga N., Minakuchi H., Unger K.K. SilicaROD-A new challenge in fast high-perfprmance liquid chromatography separations. // Trends in Analytical Chemistry. 1998. V. 17. P. 50-53.

94. Peters E.C., Petro M., Svec F., Frechet J.M.J. Molded rigid polymer monoliths as separation media for capillary electrochromatography. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 3646-3649.

95. Oefner P., Huber C.G. A decade of high-resolution liquid chromatography of nucleic acids on styrene-divinylbenzene copolymers. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 782. P. 27-55.

96. Tanaka N., Nagayama H., Kobayashi H., Ikegami Т., Hosoya K., Ishizuka N., Minakuchi H., Nakanishi K., Cabrera K, Lubda D. Monolithic silica columns for HPLC, micro-HPLC, and CEC. // J. High Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 111-116.

97. Peters E.C., Lewandowski K., Petro M., Svec F., Frechet J.M.J. Chiral electrochromatography with "molded" rigid monolithic capillary column. // Anal. Commun. 1998. V. 35. P. 83.

98. Pursch M., Sander L.C. Stationary phases for capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 887. P. 313-326.

99. Xie S., Svec F., Frechet J.M.J. Rigid porous polyacrylamide-based monolithic columns containing butil methacrylate as a separation medium for the rapid hydrophobic interaction chromatography of proteins. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 775. P. 65-72.

100. Ponten E., Viklund C., Irgum K., Bogen S.T., Lindgren A.N. Solid-phase chemiluminescence detection reactors based on in situ polymerized methacrylate materials. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 4389-4396.

101. Xu Q., Mori M., Tanaka K., Ikedo M. Ion chromatographic determination of hydroxide ion on monolithic reversed-phase silica gel columns coated with nonionic and cationic surfactants. //J. Chromatogr. A. 2004. V. 1041. P. 95-99.

102. Unger, S., Schmitz, D., and Viehweger, К. H. Determination of Trace Levels of Perchlorate Using 1С with Conductivity Detection and a Special Monolithic Column. IICS symposium. Trier, Germany, 2004.

103. Scancar J., Milacic R. A novel approach for speciation of airborne chromium by convective-interaction media fast-monolithic chromatography with alectrothemal atomic-absorption spectrometric detection. // Analyst. 2002. V. 127. P. 629-633.

104. Svec F., Peters E.C., Sykora D., Frechet J.MJ. Design of the monolithic polymers used in capillary electrochromatography columns. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 887. P. 329.

105. Cabrera K., Lubda D., Eggenweiler H.M., Minakuchi H., Nakanishi K. A new monolithic-type HPLC column for fast separations. // J. High Resol. Chromatogr. 2000. V. 23. P. 93-99.

106. Castellary M., Sartini E., Fabiani A., Arfelly G., Amati A. Analysis of wine phenolics by high-performance liquid chramatography using a monolithic type column. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 965. P. 51-64.

107. Nesterenko P.N. Silica-bonded L-hydroxyproline and its application to the separation of inorganic anions. // J. High Resol. Chromatogr. 1991. V. 14. P. 767-768.

108. Нестеренко П.Н. Высокоэффективная комплексообразовательная хроматография ионов металлов. Диссертация на соискание уч. степ, доктора химических наук. М.: МГУ. 1999.

109. Иванов А.В., Фигуровская В.Н., Иванов В.М. Молекулярная абсорбционная спектроскопия комплексов 4-(2—пиридилазо)резорцина как альтернатива атомно-абсорбционной спектроскопии. // Весн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1992. Т. 33. С. 570-574.

110. Chen Q., Мои S., Нои X., Ni Z. Simultaneous determination of caffeine, theobromine and theophylline in foods and pharmaceutical preparations by using ion chromatography. //Analyt. Chim. Acta. 1998. V. 371. P. 287-296.

111. Chen Q., Wang J. Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 937. P. 57-64.

112. Yu L., Hartwick R.A. Zwitterionic stationary phases in HPLC. I I J. Chrom. Sci. 1989. V. 27. P. 176-185.

113. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии: Справочное издание. М.: Химия; 1989. 448с.

114. Kalalova Е., Radova Z., Svec F., Kalal J. Complexes of bivalent ions with reaction products of the copolymer glycidil methacrylate ethylenedimethacrylate with 2-hydroxyethyl, ethyl and diethylamine. // Europ. Polymer J. 1977. V. 13. P. 293-297.

115. Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В. Кислотно-основные свойства кремнезема, химически модифицированного аминопропилэтоксисиланом. // Журн. физич. химии. 1981. Т. 55. С. 1352-1354.

116. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Сердан А.А., Староверов С.М. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М.: Химия.; 1986. 248с.

117. Suzuki Т.М., Yokoyama Т. Preparation and complexation properties of polystyrene resins containing diethylenetriamine derivatives. // Polyhedron. 1984. V. 3. P. 939-945.

118. Нестеренко П.Н., Иванов A.B. Комплексообразующие свойства полибуфферионообменника ПБИ-94 и их использование для разделения переходных металлов. //Весн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1992. Т. 33. С. 574-578.

119. Нестеренко П.Н., Иванов А.В., Галева Н.А. Комплексообразующие и кислотно-основные свойства силикагелей с привитыми олигоэтиленаминами. // Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52. С. 814-820.

120. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation. // Nature (London). 1975. V. 258. P. 598-599.

121. Даванков B.A., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир; 1989. 292 с.

122. Ren D., Penner N.A., Slentz B.E., Mirzaei H., Regnier F. Evaluating immobilized metal affinity chromatography for the selection of histidine-containing peptides in comparative proteomics. // J. Proteome Res. 2003. V. 2. P. 321-329.

123. Wang S., Zhang X., Regnier F. Quantitative proteomics strategy involving the selection of peptides containing both cysteine and histidine from trypric digests of cell lysates. //J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 153-162.

124. Hansen P., Lendeberg G., Andersson L. Immobilized metal ion affinity chromatography of synthetic peptides. Binding via the a-amino group. // J. Chromatogr. 1992. V. 627. P. 125-135.

125. Gonzalez L, Yuln G., Volonte M.G. Determination of cyanocobalamin, betamethasone, and diclofenac sodium in pharmaceutical formulations, by high performance liquid chromatography. // J. Pharm. Biomed. Analysis. 1999. V. 20. P. 487.

126. Ramaiya A, Karnes H.T. Simultaneous measurement of serotonin and paroxetine in rat brain microdialysate by a single-pump column-switching technique. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 691. P. 119.

127. Houdiere F., Fowler P.W.J., Djordjevic N.M. The combination of column temperature gradient and mobile phase flow gradient in microcolumn and capillary column high-performance liquid chromatography. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 2589.

128. Moore L.K., Synovec R.E. Axial thermal gradient microbore liquid chromatography flow programming. //Anal. Chem. 1993. V. 65. P. 2663-2670.

129. Cabrera K. Applications of silica-based monolithic HPLC columns. // J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 843-852.

130. Lubda D., Cabrera K, Kraas W., Schaefer C., Cunningham D. New developments in the application of monolithic HPLC columns. // LC-GC Europe. 2001. V. 14. P. 2.

131. Rodrigues A.E. // LC-GC. 1993. V. 6. P. 20.

132. Rodrigues A.E. Permeable packings and perfusion chromatography in protein separation. //J. Chromatogr. B. 1997. V. 699. P. 47-61.

133. McCormick M.J. Determination of total sulfur in fuel oils by ion chromatography. //Analyt. Chim. Acta. 1980. V. 121. P. 233-238.

134. Paull В., Nesterenko P.N. New possibilities in ion chromatography using porous monolithic stationary-phase media. // Trends in Analytical Chemistry. 2005. V. 24. P. 295-303.

135. Nesterenko P.N. Application of amino acid-bonded silicas as ion exchangers for the separation of anions by single-column ion chromatography. // J. Chromatogr. 1992. V. 605. P. 199-204.

136. Рабинович B.A., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. Л.: Химия; 1977. 220с.

137. Li J., Fritz J.S. Novel polymeric resins for anion-exchange chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 793. P. 231-238.

138. Kiseleva M.G., Kebets P.A., Nesterenko P.N. Simultaneous ion chromatographic separation of anions and cations on poly(aspartic acid) functionalized silica. // Analyst. 2001. V. 126. P. 2119-2123.

139. Simko P. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat products and smoke flavouring food additives. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 770. P. 3-18.

140. Makela M., Pyy L. Effect of temperature on retention time reproducibility and on the use programmable fluorescence detection of fifteen polycyclic aromatic hydrocarbons. // J. Chromatogr, A. 1995. V. 699. P. 49-57.

141. Nieva-Cano M.J., Rubio-Barroso S., Santos-Delgado M.J. Determination of PAH in food samples by HPLC with fluorimetric detection following sonication extraction without sample clean-up. //Analyst. 2001. V. 126. P. 1326-1331.

142. Lai F., White L. Automated precolumn concentration and high-performance liquid chromatographic analysis of polynuclear aromatic hydrocarbons in water using a single pump and a single valve. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 962. P. 11-20.

143. Siouffi A.M. S ilica gel-based monoliths prepared by the sol-gel method: facts and figures. // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1000. P. 801-818.

144. University of Saarland, http://www.uni-saarland.de. 2005.

145. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне; 1988. 388 с.

146. Felix G., Thienpont A., Dentraygues P. Synthesis of acceptor bonded phases for donor acceptor liquid chromatography for РАН. // Chromatographia. 1992. V. 34. P. 177-181.

147. Пеннер H.A. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Диссертация на соискание уч. степ, кандидата химических наук. М. МГУ. 2000.

148. Агеев А.Н., Яшин Я.И. Закономерности удерживания эфиров о-фталевой кислоты в жидкостной хроматографии. // Журн. аналит. химии. 1989. Т. 44. С. 16321635.

149. Horie Н., Kohata К. Analysis of tea components by high-performance liquidbchromatography and high-performance capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 425-438.

150. Lee B.L., Ong S.N. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 439-447.

151. Lopez-Martinez L., Lopez-de-Alba P.L., Garcia-Campos R., De Leon-Rodriguez L.M. Simultaneous determination of methylxanthines in coffees and teas by UV-Visspectrophotometry and partial least squares. // Analyt. Chim. Acta. 2003. V. 493. P. 8394.

152. Fernandez P.L., Lopez A., Pablos F., Gonzalez A.G., Martin M.J. The use of catechins and purine alkaloids as descriptors for the differentiation of tea beverages. // Microchim. Acta. 2003. V. 142. P. 79-84.

153. Harms J., Schwedt G., Fresenius J. // J. Anal. Chem. 1994. V. 350. P. 93.

154. Pretorius V., Smuts T.W. Turbulent flow chromatography: a new approach to faster analysis. //Anal. Chem. 1966. V. 38. P. 274-281.

155. Knox J.H. Evidence for turbulence and coupling in chromatographic columns. // Anal. Chem. 1966. V. 38. P. 253-261.

156. McGuffin V.L. Chromatography. In: Heftmann E., editor. Amsterdam: Elsevier; 2004.

157. Waters. Chromatography columns and supplies catalog 2003-2004. Catalog. 2003.

158. Li J., Carr P.W. Accuracy of empirical correlations for estimating diffusion coefficients in aqueous organic mixtures. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 2530-2536.

159. Mikhail S.Z., Kimel W.R. Densities and viscosities of methanol-water mixtures. // J. Chem. and Ing. Data. 1961. V. 6. P. 533-537.

160. HPLC. High Performance liquid chromatography. Macherey-Nagel. Catalog. 2005.

161. Cho B.-R., Lee Y.-J., Kim J.-B. Electric conductance of dilute solutions of lithium, sodium and potassium chloride in isopropanol-water mixtures. // J. Korean Chem. Soc. 1976. V. 20. P. 260-265.

162. Wensink E.J.W., Hoffmann A.C., van Maaren P.J., van der Spoel D. Dynamic properties of water/alcohol mixtures studied by computer simulation. // J. Chem. Phys. 2003. V. 119. P. 7308-7317.

163. Engelhardt H., Gotzinger A. On the reproducibility of Chromolith RP columns. // Chromatographia. 2004. V. 60. P. 207-211.

164. Paull В., Roux С., Dawson M., Doble P. Rapid screening of selected organic explosives by high performance liquid chromatography using reversed-phase monolithic columns. //J. Forensic Sci. 2004. V. 49. P. 1181-1186.