Новый химико-ферментативный метод получения оптически-активных альфа-аминокислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РГ6 ОД

: 7 '..'' российская академия наук

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯ им,А.И» НЕСМЕЯНОВА

На правах рукописи УДК 547.466.22:54?.9.577.1.5

ФИЛЕВА Нина Владимировна

ЯОШЯ ХИМНКО-ФЕРМЕИТАТИГОНЬЙ! МЕТОД ПОЛУЧЕШШ опггачЕски-Аетивныха-Амшюгагают.

Специальность 02.00.03. - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте элементоорганических соединена! им. А.Н.Несмеянова РАН.

Научные руководители -

доктор химических наук, профессор Ю.Н.Белоконь;

член-корр. АН Республики Кыргызстан, доктор химических науь

З.Б.Бакасова.

Консультант - кандидат химических наук К.А.Кочетков. Официальные оппоненты: доктор химических наук В.К.Швядас; кандидат химических наук В.К.Латов.

Ведущая оргьшзация:

Ыг-.ковский химико-технологический Институт

иы.Д.И.Менделеева, кафедра промышленной биотехнологии.

Защита диссертации состоится ¿¿¿сР/ц*^ 1993 год^ в часов на заседании Специализированного совета К 002.62.02 при Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН по адресу:

117913, Ыосква, ГСП 1, В-334, Ленинский проспект, 4?. С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат разослан ^ 1993 г.

Ученый секретарь ' Л

Специализированного совета ' /«к п ^//(Л / доктор химических наук г Г и.Я.Григорьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Потребность в энантиомерно чистых a-аминокислотах (АК) постоянно растет, поскольку они не только служат исходными соединениями в синтезе фармацевтических препаратов, пищевых и агрохимических форм, но и являются ценными хиральными синтонами для многочисленных асимметрических синтезов.

Использование производных простейших аминокислот Gly и Ala в каталитических и стехиометрических методах асимметрического синтеза разнообразных белковых и небелковых аминокислот - интенсивно развивающаяся область органической химии. Однако» несмотря на большое в настоящее время число примеров химического асимметрического синтеза а-амикокислот, в промышленном масштабе оя реализован лишь в единичных случаях. В связи с этим разработка новых методов получения a-аминокислот остается актуальной.

Весьма перспективным для синтеза различных аминокислот может служить новый подход, заключающийся в химико-ферментативном пути, сочетающем в себе сравнительно простой химический синтез необходимых субстратов для последующего стереоселективного ферментативного превращения в оптически активные конечные продукты. Такими перспективными субстратами могут служить основания Шиффа эфвров аминокислот. Эта соединения, с одной стороны, могут быть подучены из оснований Шиффа простевших аминокислот Gly a Ala и в то же время сравнительно легко гидролизуются до эфвров аминокислот и карбонильного соединения. Кроме того они обладают высокой СЗ-кислотностью. которая более чем на 3 порядка выше СН-кислотности оснований Шиффа свободных аминокислот. Это позволяло надеяться на возможность осуществления в процессе энантиоселективного ферментативного гидролиза асимметрического превращения типа 2-го рода, что должно приводить к получении из исходного рацемического соединения в основном одного энантиомера аминокислоты.

Основания Шиффа эфяров АК в отличие от самих аминокислот хорошо растворимы в органических растворителях, и поэтому для практической реализации такого процесса мы полагали использовать последние достижения ферментативной химии - применение гидролитических субстратов, таких как c-химотрипсин, в водно-органических смесях.

Цельп работы является разработка нового общего химико-фериентативного метода получения ряда оптически активных аминокислот как белковой, так и небелковой природы.

Для реализации этой цели в работе ставились следующие конкретные задачи;

1) получить широкий набор потенциальных субстратов для ферментативного гидролиза - оснований Шиффа эфиров D,L-аминокислот с альдегидами и кегонаыи, как прямым путей из эфиров соответствующих D, L-аминокислот и карбонильных соединений, так и «-С алкилированиеы оснований Шиффа эфиров простейших г тинокислот - Gly и Ala;

2) разработать условия ферментативного гидролиза полученных субстратов до оптически чистых аминокислот;

3) изучить условия рацемизации и химического гидролиза полученных субстратов в среде используемого для ферментативной реакции растворителя;

4) осуществить, в случае реализации 3-х первых пунктов, получение оптически активных аминокислот ферментативный методом с одновременно идущей рацемизацией остающегося в растворе другого энантиоыера основания Шиффа эфира аминокислоты.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Получены и исследованы 20 потенциальных субстратов для ферментативного гидролиза - оснований Шиффа эфиров ряда D,L-аминокислот с альдегидами и кетоиади.

Изучены условия алкилировакия ряда оснований Шиффа эфиров глицина в межфазвых хиралышх а ахиральних условиях.

Каталитическим асимметрическим алкилированиеы эфира основания Шиффа аланииа в условиях иехфазного катализа получен а-метил-L-Phe с оптическим выходом 2?%.

Найдены и обоснованы условия проведения ферментативной . реакции в среде органический растворитель-вода в отсутствие буфера, позволяющие существенно облегчить выделение . L-амянокислоты.

Рааработая новнй общий химико-ферментативный метод получения ряда оптически активных аминокислот.

Предложен метод получения L-Phe ga основания Шяффа этилового эфира D,L-Phe и п-хлорбензальдвгнда с одновременно идущей рацемизацией основания Шнффа эфира D-Phe в растворе.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи. Часть результатов исследования била представлена на II Республиканском совещании по асимметрическим реакциям (Телавп, 1989) в на международном симпозиуме "Modern Enzymology: Problems and Trends" (Санкт-Петербург, 1992).

Структура и pfaeM..p&OQ.THL

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из трех глав.

Первая глава посвящена обзору литературных донных по синтезу а-аминокяслот с использованием Шиффорых основании аминокислот с карбонильными соедннешшш, а также, по ферментативному расшеплетго рацематов 8 знантноиерм L-аминокислот.

Во второй главе изложены результата экспериментальных ЕсследоваппО, п дается пх обсуждение. -

В третьей глава приведено описание эксперимента.

Диссертация содержит 19 таблиц, 7 рисунков, 211 вашенованлй ютнров&нвоз литературы.

: СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение основаниаШнффа афнров аиинскйслот с ароаагачзсгашз кетонаия н их ферментативный гйдродяз.

Для получения основании Шнффа замещенных бензофенонов был разработав метод пряного получения на этилового эфира аминокислоты в соответствующего бонзофенона при кипячении в смеси EtOH в п-ксялола (1:2 по объему) в токе аргона (схема 1). Приемлемое значение коавврсни (>60£) достигается ллвь при использовании специальной насадив Соксслета с осушителем. - Так были получены кетимины эфира D.L-феннлаланнна (38)-(41).

Ферментативный гидролиз легко доступного субстрата -основания Шиффа эфира D.L-фенилаланина с бензофеноном, в

условиях энантиоселективного гидролиза эфиров аминокислот а-хнмотрипсином практически не идет.

Схема 1.

EtOH/n-ксилол -л. 9H2-Ph (1:2) (Ql Clfe-Ph ^H-COOEt ♦ 0-C -> C-N-CH-COOEt

ffl2 cSL &-*■>

da

• R1-R2-H (38); Ri-H, (39);

Rl-OH, R2-H (40); fy-OH. tfe-CIb (41). Существе :но ускорить ферментативный гидролиз под действием каталитических добавок и использования замещению бензофеноиов не удалось (си. таблицу 1). Выход L-Phe tí' превышает 7%.

Таблица 1.

Катализируемый а-химотрипсиноы гидролиз оснований '"иффа этилового эфира D,L-Phe с производными Оенэофенона Ph()C-N-CH (CH2PI1) -СООЕta), Ссубст. -0.120 М.

. н Rl Катал, добав. 10и.% Время ч. L-AK(осадок) выход е.е.% хим-Я8* (L) Шиз раствора) выход е.е, хим.(D)

1 Ph - 7 0 0 (100) 0

3 Ph KP 35 1.0 19.0 56,0 1.5

Б o-HO-Ph - 7 5,5 95,0 71,0 2.8

€ o-HO-Ph - 41 6.5 92,5 72,5 2.0

7 o-HO-Phb) - 43 6,0 83,0 62.5 6,0

В o-HO-Ph CuCl 43 6,5 92,5 92,5 4.0

9 o-HO-Ph Н3ВО3 33 7.0 96,5 47,5 5,0

1С o-HO-Ph DABCO 48 7,0 49,5 19,0 2,0

a)' - Гидролиа проводили в системе СН3СН/Н2О (17,5:1 по ' объему) при 20°С. Значения химических выходов приведены из

суммарного расчета на 100£ БД-РЬе, т.е. 50% Ь-РИе и 50% О-РИе.

b) - Гидролиз проводили в системе СНС1з/Й20-1/5.

Мы испытали и другой возможный подход к получению оптически активных аминокислот из кетиминов рацемических аминокислот - их асимметрическое алкилирование в межфазных условиях.

2. Каталитическое асимметрическое алкилирование оснований Шиффа в условиях межфазного катализа.

Первоначально была предпринята попытка алкилирования устойчивых кетиминов эфира глицина в присутствии межфазных хиральных катализаторов заряженных медных комплексов с хиральными основаниями Шиффа, полученных взаимодействием салицилового альдегида с хиральными диаминами на основе Ь-пролина. Можно было предположить, что карбанион основания Шиффа войдет в координационную сферу иона Си(II), и таким образом окажется в хиральном окружении в ходе алкилирования. Однако, оказалось, что хиралыше катализаторы на основе комплексов Си(11) дают минимальное значение оптического выхода. Лучший результат - около 3% е.е. для Ь-РЬе с катализатором (55). В то же время катализ алкилирования бромистым бензилом в присутствии бензилцинхонидиний хлорида (57) приводит к получению продуктов с оптическим выходом 25%. Большие оптические выходы до 271, были получены с катализатором (57) при алкилировании бромистым бензилом основания . Шиффа этилового эфира О.Ь-аланина с бензальдегидом.

Таким образом, нам не удалось эффективно использовать стабильные кетимины эфиров аминокислот в реакциях асимметрического алкилирования и ферментативного гидролиза до оптически активных соединений.

Поэтому мы в дальнейшем изучили возможность ферментативного гидролиза с основаниями Шиффа эфиров АК с различными бензальдегидами, имеющими более лабильную С-Н связь, и которые, согласно данным ПМР, в чистом виде

СН^СНу^Н

НВСС1 (57)

устойчивы при О^С в течение нескольких месяцев. Для их получения необходимо было разработать удобные способ синтеза ха доступных »фиров глицина.

3. Алкилирование основание Шиффа атилового эфира глицина с

альдегидами.

На примере реакции эфира Н-бензилиденглицина с бромистым бвиаклом (схема 2) мы изучили условия алкили^ования в присутствии оснований и небольших количеств межфазных катализаторов в различных растворителях, поскольку, как мы показали, алкилирование по известным литературным методика^ В безводных условиях с поташом и содой в качестве осгований пр: водит к получению лзшь продукта бис-алхилироваиия.

Схема 2.

РЬСЙгВг, Г, СЦ2С12 №Р11 РЬСН-Н-СН2-С00Е1;—-:-:—->РЬСН-М-Г СООЕ1

(10) или СНзСН

бцгРь (47а)

CB2Ph продукт бис-

CH2Ph * PhCH0<——1-PhCH-N-CH-COOEt алкилирования

СЖ-СООН (4?)

ННг продукт моно-

алкилировання

Алкилирование исходного основания Шиффа (10) в системе - CH3CN/EOH (твердый) также правело к получению » основном продукта бкс-алкнлирования. При переходе к водным растворам щелочи наблюдается возрастание выхода продукта моно-алкилировавия. Лучшие результаты были получены при алкилировании эфнра N-беиаилиденглишна бромистым бензилом с использованием 30%-иой водной щелочи (НаОН) й бензнлтрнэтнламмония хлорида (ТЕВАС) в качестве 'катализатора. Было выделено 47% моно-алкилированного продукта.

В этих условиях хоропо идет ыоно-алкилирование и другими реагентами. Tax, при реакция с п-фторбензилбромидом выход продукта алкилирования составлял 48%.

Этот подход был использован для получения оснований ■яффа вфира фенилалашша а с - другими альдегидами. Выход

продукта моно-алкилирования для основания Шиффа этилового эфира глицина с салициловым альдегидом - 48%; для п-хлорбензальяегида - 427.; для пивалоилового альдегида -2872.

Основания Шиффа эфиров АК с рядом альдегидов также были получены и прямим путем из свободных эфиров АК. Эти соединения полностью идентичны продуктам, полученым алкилированием производных глицина.

4. Изучение гидролиза С-М связи оснований Шиффа эфиров аминокислот (диссоциация а- карбонильного соединения и эфира

аминокислоты).

Прежде чем исследовать ферментативный гидролиз оснований: Шиффа эфиров АК, необходимо было изучить устойчивость С-Н связи этих соединений в водно-органических средах, их способность к диссоциации до эфира РЬе и альдегида (схема 3). Контроль за этим процессом легко осуществлять методом ПМР по уменьшению сигнала альдиминного протона и увеличенив сигнала альдегидного протона, а соотношение интегральных интенсивностей этих сигналов в равновесной смеси говорит о ее составе.

Схема 3.

СЧ3СН/Ц2О

х-сб^см-рн-ахт г

СНгРЬ

Х-Н, С1, N02.

Изучение методом ПНР гидролиза оснований Шиффа этилового эфира рацемического РЬе с п-хлорбензальдегидом до исходных компонентов в среде СН3СН/Б2О (17,5:1 по объему) показало, что диссоциация, в соответствии со схемой 3, подчиняется кинетике обратимых реакций 2-го порядка, причем прямая реакция соответствует псевдопервому порядку, а обратная -второму (см. рис. 1), с константой равновесия 0,0102 Ы. Одновременно - представлена полулогарифмическая анаморфоза этой криво. По наклону прямой было найдено для соединения (49) среднее значение к1. равное 3,0x1 (Г® с"1 и к2-2,9x10*3 М"1хс~1. Аналогично для основания Шиффа этилового эфира фенилаланина с Сензальдегядом (47)

счгРи

> £н-С00Е1 + Х-фЩСНО НЧЗ

к1-1.1 Ю^с"*, к2-8,7*10"^ М'^хс"** с константой равновесия 0,0128 11.

Такиы образом, синтезированные нами основания Шиффа эфиров аминокислот с замещенными бензальдегидами в смешанных водно-органических смесях легко диссоциируют до свободного эфира АК и карбонильного соединения, причем в равновесии, устанавливающемся довольно быстро, за несколько часов при 20^С и, например, для основания Шиффа этилового эфира Р,Ь-Р11е с п-хлорбензальдегидом (49) с концентрацией 0,256 и, содержится 81% альдиыина и 19% свободного эфира. Следовательно, при данной концентрации субстрата в растворе мы имеем небольшое количество ^еакционноспособного свободного фира аминокислоты, что, с одной стороны, уменьшает возможность образования побочных продуктов и в тохе время этого количества вполне достаточно для проведения ферментативного гидролиза.

Рис. 1. Кинетическая кривая обратимой диссоциации основания Шиффа этилового эфира Б,Ь-РЬе с п-СЬС^ЩСНО (49), . полученная методой ПМР И полулогарифмическая анаморфоза этой кривой.

В дальнейшем основания Икффа эфиров АК были изучены в реакциях энантноселективного ферментативного гидролиза в различных водно-органических смесях.

5. Энантиоселективный ферментативный гидролиз сложноэфйрной группы оснований Шиффа эфиров а-аминокислот.

5.1. Энантиоселективный ферментативный гидролиз основания

Шиффа. образованного бензальдегидом н этиловым эфиром 0,Ь-фенилаланина, влияние растворителя, концентрации субстрата р

тнг"1 фермента.

На примере основания Шиффа эфира рацемического фенилаланина с бензальдегидом мы изучили влияние состава водно-органического растворителя на скорость 8 стереоселективность ферментативного гидролиза (схема 4).

Схема 4.

В таблице 2 представлены результаты ферментативного гидролиза оснований Шиффа эфиров Б,Ь-РЬе с бензальдегидом в-химотрипсином в двухфазной системе СЖЛз/^О, в которой растворимы все компоненты реакционной смеси. Химотрипсин и образовавшийся Ь-РЬе находятся в водной фазе, а остальные компоненты реакционной смеси - в органической фазе. Как видно, гидролиз можно проводить с хорошими химическими выходами и высокой зиантиомерной чистотой и в отсутствие буфера. Однако, ввиду образования эмульсии, выделение Ь-РЬе затруднено и О-энантиоыер, остающийся в растворе СН&з, не является достаточно чистым.

Наиболее эффективным оказалось использование однофазной системы типа СВ3С11/В2О (17,5:1 по объему).

Процентное содержание воды в этом растворителе (5, 4%. по объему) подобрано таким образом, чтобы, с одной стороны, ее количества было ба достаточно для прохождения гидролиза, а, с другой стороны, концентрация воды была бы мала и не

фермент КН.т''

РЬСН-Н-СН-СООЕ! --

СН2-РЬ НгО

или орг. р-ль/цго

позволяла существенно растворять конечный продукт гидролиза - аминокислоту, выпавшую в осадок. Действительно, удалось провести этот эксперимент в присутствии а-химотрипсина (с-4,3x10"^ Ы), который не растворим в СН3СН/Н2О- Через некоторое время образуется объемный белый осадок, который очень легко отделяется от раствора. Анализ осадка и. раствора показал, что в осадке находится чистый L-энантиомер, а раствор содержит, по данным ПМР, Оензальдегид и D-энантиомер основания Шиффа эфира фенилаланина. D-Phe мохет быть выделен из фильтрата после химического гидолиза водной HCl.

Таблица 2.

Каталиэируе: jB а-химотрипсином энантиоселективный гидполиэ основания Шиффа этилового эфира D, L-фенилаланина с бензальдегидом (47) в смешанных водно-органических растворителях®', Ссубст. -0,120 М .

н Органический растворитель/ Н2Р ("о объему) Время реакции, X L-Ш осадок) выход, е.е. хим..Я®' % D-AK(hi р-ра) выход, е. е. хим.%

1 CHCI3/H2O, 1:5 7 32 97.0 30 . 38.0

2 CHCI3/H2O. 1:5Ь> 7 35 86.0 42 21.0

3 CHCI3/H2O. 1:5°) 7 <40 99.0 <40 98.0

4 DUS0/H20, 9:1 7 39 76.0 - 13.0

5 Et20/H20. 1:3,3 7 48 84.5 15 46.5

6 MeCH/HgO, 17,5:1 24 38 98.5 37 95.0

7 МеСЫ/Н20, 17,5:1й 24 24 98.5 18 91.0

в МеН02/Н20. 23:2 30 20 98.0 - -

a) - Выход определен после очистки и выделения на ионообменной смоле КУ-2 (в Н*-форма). Контроль методом ГХХ, внутренний стандарт - или 1-1-Ьеи. Энантиомерний лзбытои (е.е.) определен методом энантиомерной ГХХ.

b) - С добавлением в водную фазу фосфатного буфера, рН в.

c) - Гидролиз метилового эфира ЭД-РЬе.

(1) - Гидролиз без предварительной перегонки.

Энантиомерная чистота продукта ферментативного гидролиза практически ве зависит от того, каким способом получено основание Шиффа эфира АК-алкилированием С1у-проиэводного или

непосредственно из эфира рацемического Phe. Однако, желательным условием проведения эксперимента является перегонка альдимина в вакууме, так как непосредственное использование реакционной смеси, лишь отфильтрованной от солей, приводит к уменьшении химического выхода как L-, так и D-AK.

Как видно, эта методика является достаточно простой и открывает путь для синтеза как L-, так и D-аминок..олот, исходя из производных глицина.

С практической точки зрения важным аспектом является проверка стабильности а-химотрнпсина в среде СЦ3СЙ/Н2О (17,^:1 по объему). На рис. 2 показано увеличение выхода* L-Phe в стандартной смеси, где постоянное количество основания Шиффа эфира рацемического фешчаланина добавлялось каждые 24 часа в реакцию, содержащую постоянное первоначальное количество а-химотрипсина.

Рис. 2. Изменение выхода ЬРЬе во времени при гидролизе в-химотрипсином основания Шиффа этилового эфиреи с бензальдегидом.- ^

Пунктирная линия показывает теоретически возможный выход Ь-РЬе из одной загрузки. Однако, количество Ь-РЬе, образовавшегося за 48 к 72 часов, значительно превышает эту величину. Следовательно, и через 72 часа от нв"ала эксперимента в-химотрипсин по-прежнему сохраняет свою активность и может быть использован в водно-органической среде в течение нескольких суток.

В табякцз 3 представлены результаты ферментативного гидролиза Шкффового основания эфира фенилаланина с бензальдегндом, полученные нами при использовании протосубтилина, пекарских дрожжей, липазы PPL, а-химотрипсина.

Как в&дно, доступные ферментные препараты, такие как дрожжи, не обладают должной субстратной специфичностью, а дешевый протосубтилин дает низкие химические выходы. Лучшие результаты достигаются в случав а-химотрипсина. Использование нами а-химотрипсина связано с его субстратной специфичностью, сравнительной устойчивостью в водно-органических средах, а также его доступностью.

Таблица 3.

Ферментативный энантиоселективный гидролиз основания Шиффа этилового эфира D,L-фенилаланиьа с бензальдегидом различными ферментами, Ссунет.-О,120 М.

фермент Органический растворитель/ вода (по объему) Время, ч. L-Phe Выход е. е. хим.,% %

химот-- рипсин CH3CN/H2O» 17,5:1 24 38,0 98,5

химот-рипсин CHCI3/H2O, 1:5й) 7 35,0 86,0

липаза PPL (Й3СН/Н2О. 17,5:1 45 0 0

протосуб-тилмн * СНС13/Й2О. 7 17,0 90,5

пекарские дрожжи CHCI3/H2O, 24 11,0 76,0

а) - С добавлением в водную фаз; фосфатного буфера.

5.3. Эиаитиоселективный ферментативный гидролиз эфиров альднминов ряда аминокислот.

Под действием а-хшотипсина в среде СНзСН/НгО (1?45;1 по объему) мы изучили ферментативный гидролиз ряда полученных субстратов - оснований Шиффа эфиров аминокислот с бензальдегидом (таблица 4).

Таблица 4.

Гидролиз оснований Инффа эфиров аминокислот (АК) х-Сб^сн-н-ат-сооЕг, Ссубст.-ол20 м.

АК X R Время, ч. L-AK(осадок) выход, е.е. хим.,% % D-АМиз р-ра) выход, е.е. хш.,% %

Ala H CH3 108 37,5 85,0 46,0 36,0

Ph-Ser H HO-CH(Ph) 123 0 - - -

NVal H CH3(CH2)2 208 33,5 92,5 40,0 40,5

Trp H 104 40,0 7 ,0 -

Ph-Gly H Ph 240 28,5 88,5 40,5 5,5

Ph-Glya> H Ph 215 17,0 4,5 40,0 2,0

Ph-Clyb> C1 Ph 228 36,0 5,0 36,5 2,0

n-F-Phe H a-F-C6H4CH2 20 39,0 99,5 - -

o-F-Phe H 0-F-C6H4CH2 20 21,0 98,5 30,0 49,5

a-Me-Phe H c) .200 29,0 99,5 30,0 29,5

а) -" Реакцию вели с добавлением каталитических количеств

DABC0.

b) - Гидролиз основания Шиффа этилового эфира D-фенилглицина с ц-хлорбензальдегидом.

c) - Гидролиз основания Шиффа этилового эфира D,L-a-метил-феиилаланина с бензальдегидом.

Как видно, результат гидролиза зависит не только от применяемой системы растворителей, но и от субстрата. В условиях эксперимента для расщепления основания Шиффа эфира рацемического Phe с бензальдегидом удается получить ряд оптически активных а-аминокислот - о- и п-F-Plje, Trp, NVal, Ala, причем, как и следовало ожидать, ферментативный гидролиз производных алифатических аминокислот идет на порядок медленнее, чем ароматических. Тг.кхе в результате длительного гидролиза других неспецифических для

а-химотрипснна субстратов с более низкими выходами, но с высокой энантиомерной чистотой выделены небелковые «-Ме-Рйе и фенилглмшш (см. таблицу 4).

Основание Шмффа эфира фенилглицина в реакции энантноселективного ферментативного гидролиза гс-химотрипсином в изученной среде ведет себя неооычно. Несмотря на высокий химический, выход, обращает внимание результат с низкой энанти'омерной чистотой Б-аминокислоты, выделенной из раствора (см. таблицу 4). Присутствие основания диазобициклооктана (ЬАБСО) приводит к еще большему падению энантиомерной чистоты Б-АК, выделенной из раствора. Кроме того, в этом случае рацемнзуется и Ь-аминокислота, выпадающая в осадок. Аналогичный результат получен в случае гидролиза основания Шиффа эфира фенилглицина с п-хлорбензальдегидом.

Эти данные свидетельствуют о том, что проведение асимметрическо. о превращения типа 2-го рода может быть решено на примере Шиффовых оснований эфиров других аминокислот, СН-кислогность которых ниже СН-кислотности основания Шиффа эфира фенилглицина, например, О.Ь-РЬе. Для этого необходимо только, чтобы выпавшая Ъ-аминокислота не рацемизовалась, а Ю-энантиомер, находящийся в растворе, легко рацемизовался с образованием рацемической смеси, из которой снова получается Ь-энантиомер, выпадающий в осадок.

5.4. Асимметрическое превращение эфира альдимина С,Ь-фенилаланина в Ь-фенилаланин.

Вначале была изучена рацемизация полученных оснований Шиффа эфиров О.Ъ-РЬе в растворе с целью последующего проведения' асимметрического превращения. Исследовано поведение основания Шиффа этилового эфира Ц-РЬе с рядом бензальдегндов в среде ацетонитрил/вода в присутствии БАВСО. Показано, что основание Шиффа этилового эфира Ь-РЪе с бензальдегидом в присутствии ПАВСО практически не рацемязуется.

При введении электроакцепторных заместителей (п-С1) в бензилиденог^е кольцо СН-кислотне-ть основания Шиффа увеличивается. Так, основан-е Шиффа эфира фенялаланина, полученное из п-хлорбензальдегида, рацемнзуется под действием 10% ЮАВСО при растворении в смеси СНзСТЛ£>0-17,5:1

(по объему). Контроль за ходом рацемизации осуществляли измерением зависимости изменения угла вращения основания Оиффа этилового эфира L-Phe с п-хлорбензальдегндом (49) от времени при 578 нм а растворе CH3CN/H2O. Исследуемый раствор предварительно выдерживали 24 часа для достижения равновесия между альдимином и свободным эфиром А.К, затем добавляли основание (DA.BCO). Константа рацемизации состпляет кэфф.-2,9х10"®с~^. Следовательно, в данных условиях одновременно идут процессы диссоциации (схема 3) и рацемизации (схема 5).

Схема 5.

снгРЬ вн снгРЬ вн cifeph

(L)- CH-COOEt < -9-COOEt ---> (D)- CH-COOEt

Ы-СНС6Н4С1 В" H-CHC5H4CI ЕГ H-CHCfcfyCl

Таким образом, нами установлено, что использование оснований Шиффа эфиров АК с активированными бензофенонакч позволяет даже под действием слабых основания рацемизовать в реакционной массе остающийся, например, после ферментативной реакции, D-энантиомер основания Шиффа этилового эфира' аминокислоты* н тем самым осуществить асимметрическое превращение в ходе ферментативного процесса.

С целью реализаций такого процесса в дальнейшем изучили энантиоселектквный ферментативный гидролиз

реакцйонноспособных оснований Шиффа этилового эфира рацемического фенилаланина (48),(49),(51),(53) с рядом альдегидов - п-хлорбензальдегидом, п-нитробензальдег&дом, пивалоиловым альдегидом, салициловым альдегидом (см. таблицу 5).

Как видно из данных таблицы 5, за счет одновременно идущих в условиях реакции процессов - химической диссоциации с разрывом альдюшнной связи (схема 3), рацемизации самого альдимина (схема 5) и ферментативного гидролиза освободившегося эфира (схема 4). равиовесиое соотношение между D- и L-экантиоиерамн удается сместить и превратить более 50% рацемата основания Шиффа эфира D,L-Phe в п-хлорбензальдегида в L-Phe (см. обдую схему 6).

Таблица 5.

Ферментативный гидролиз оснований Шиффа эфцров фенилаланина с различными замещенными бензальдегидами Х-СбН4~СН-Н-СН(СН2Рй)С00ЕЬ при катализе я-химотрипсином в системе СНзСН/Н20-17,5:1 (по сбьему), Ссубст.!20 М.

Время DABC0 Ь-АК (осадок) D-AK (из раствора)

н X ч. 7. выход хим. е.е.Я выход хим. е.е.,%

к суб- % (Ь-конфи- % (конфи-

страт} гурация) гурация)

1 N02 7 0 15,0 99,5 41.5 30,5(D)

2 ю2 28,5 10 24,5 8,5 13,0 7,0(0)

3 С1 21 10 59,5 87,5 14,5 3,0(L)

4 С1 24 5 30,0 92,5 41,5 14,0(D)

5 С1 212 7 33,5 25,0 41,5 1.5(L)

6 На) 25 0 49.0 99,5 41.0 4.OÍD)

7 Clb> 85 7 60,0Ь> 96,5 14,0 28,0(D)

8 ClO 100 100 63,0°) 94,0 35,0 38,0(D)

9 d) 22 0 48,0 98,5 40,5 86,0(D)

а) - Гидролиз основания Шиффа бензилового эфира фенилаланина с бензальдегидом.

b) - Используемый растворитель-(СЦз)2С-0/Цг0, 17,5:1 (по объему). Химический выход Ь-АК - суммарный. Химический выход Ь-РЬе, находящегося наряду с основанием Шиффа С,Ь-РЬе в растворе, составил по данным ГХХ 7,5%.

c) - Используемый растворительЧ-ВиОН/ДгО, 17,5:1 (по объему). -Химический выход Ь-АК - суммарный. Химический выход Ь-Р11е, находящегося наряду с основанием Шиффа С,Ь-РЬе в растворе, составил по данным ГХХ 11%

(1) - Гидролиз основания Шиффа этилового эфира фенилаланина с пивалоиловым альдегидом (СНз)зССН-Н-СН(СЩ2Р11)СООЕ1.

Для подтверждения того, что в растворе действительна происходят рацемизация производного эфира фенилаланина, мц провела в изученных условиях ферментативный гидролиз в присутствии Ь,4% 1)20 в СЯ3СН. Как следует из спектра ПМР (см. рис. 3), за счет рацемизации, постоянно идущегв раствс- э, для производного' РЬе, и прекращающейся для Ь-РИе,

выпадающего в осадок, процент вхождения дейтерия по а-углеродному атому в аминокислоту, выделенную из раствора, больше, чем в осадке.

•Рис.Э. Результат изучения дейтерообмена по а-углеродному центру D.L-Phe в ходе проведения ферментативного гидролиза основания Шкффа его эфира с П-С1-С6Н4СНО в смеси C[2H]3CN/[2H]20-17,5:1 (по объему) в присутствии DABCO (10 иол.Я); спектр ЕЫР (200 МГц), эталон - ГЫДС, а) обогащенного дейтерием D-Phe, выделенного нз раствора; б) обогащенного дейтерием L-Phe (осадок).

Так, в L-Phe, выпадающие S осадок, входило 40% дейтерия (по «-углеродному центру), а в производном D„L-Phe, остающемся а растворе, ухе 60% дейтерия (также по a-углеродному центру). Это одйозначно доказывает наличие всех упомянутых процессов в растворе (схема 6).

Схема 6.

Н Н £й2?Ь БАВСО Н РЬСф Н

х овг уу оЕг

II

ш, снгРй снзслл*>о н .сцгРь ск^ндсно ♦ л-> х! Л

с-химот- ЦгН 0Е1 рипснв ОН

осадок Ь-РЬе, е.е>98%

в ряде случаев небольшого избытка 1,-энактаомера в растворе ыы объясняем неполным выпадением Ь-анантиомера в осадок, что подтверждено аналитически. К сожалении, з изученных условиях переход эфира ВД-фенилалатана в Ь-фенилаланин но происходит полностью, вероятно зваду частичного ингибирования фермента основанием.

Использование другой системы растворителей (СЦз^С-О/ЦэО (17,5:1 по объему) г ЫЗиОН/Н^О (17,5:1 по обьему) позволило довести химический выход Ь-фенилаланива до 60% п 63% (соответственно) (см. таблицу 5).

Такш образом, оптимальными условиями проведения процесса _ ферментативного гидролиза альдимянов эфнров аминокислот является применение альдимкнов с п-хлорбензальдегидом в смешанном водно-органической растворителе с катализатором ЦАВОО, что не только облегчает отделение выпавшей аминокислоты от реакционной смесн, во и осуществляет рацемизацию остатка альдишна в этой смеси. Это позволяет» в случае использования альдимина эфира БД-РЬе, за сутки выделить до 60-63% Ь-РЬе, в расчете на исходный рацемат. Можно надеяться, что даль"-зйпее развитие работ в этом направлении, включая подбор нового типа ферментов, иммобилизацию а-химотрипсина или применение других алый вдов, среди которых перспективен пивалоиловый

альдегид, позволит разработать новый простой технологически приемлемый подход к синтезу энаятиомерно чистых белковых и пебелковых аминокислот.

ВЫВОДИ

1. Получены к исследованы 20 потенциальных субс.ратов для ферментативного гидролиза - основания Шиффа эфиров ряда D.L-аминокислот с альдегидами и кетонаыи.

2„ Изучены условия алкилирования ряда оснований Шиффа афиров глицина в условиях иехфазкого катализа хиральными и* 1 ахиральныии катализаторами.

3. Разработан новый обсий химико-Ферментативный метод получения ряда оптичесс«-активных аминокислот из простейших аминокислот - глицина (Glу) и аланнна (Ala).

Найдены и обоснованы условия проведения ферментативной реакции в среде органический растворитель -вода в отсутствие буфера, позволявшие существенно облегчить выделение L-аминокислоты.

5. Изучены условия обратимого гидролиза и рацемизации ряда подученных субстратов*

6. Предложен метод асимметрического превращения основания Шиффа этилового эфира D,L-фенилаланина с п-хлорбензальдегндоы ферментативным гидролизом L-энантиомера с одновременно идущей рацемизацией основания Шиффа остающегося эфира D-фешлаланнна в растворе.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Белокоиь D.H., Кочетков К.А., Тараров В.И., Савельева Т.Ф., Филева Н.В., Сапоровска^ Черногяаэова H.H., Бакасова З.Б., Велико^ ,tl. Хтгако-ферыентатавнып метод получения оптически чистых D- и L-ароматяческях аминокислот из глвдива// 2-е Республиканское совещание по асимметрическим реакциям, Телавн, тезисы док., 1989, с.23.

2. Белоконь Ю.8., Кочетков К.А., Тараров В.И,, Савельева Т.Ф., Филева Н.В., Гарбалинская Н.С., Сапоровская М.Б., Райт А.Г., Бакасова 3.Б. Новый метод химика-ферментативного получения оптически чистых

L-аыинокислог из глицина// Бйоорг. шam, 1991» Т.17, N 6, с.773-778.

3. Кочетков К.А*» Белокош. D.H., Фняева Н.В., Иконников Н„С., Орлова C.i., Бакасова З.В, Основания Шиффа эфиров а-аминокислот - субстраты для анэиматического получения оптически-актшша а-аминоадслот// Биоорг. эашия, 1993, Т.19, N 1, с.130-132.

4. Belokon' Y.N., Kochetkov К.А., Fileva H.V.» Tararov V.l., Ikonnikov U.S., Orlova S.A., Savelleva T.F., Bakasova 2.B. Schiffs Bases of a-Aoino Acids Esters as Substrates for the Enzymatic Resolution of L-o-Amino Acids// International Conference "Modern Bnzymology; Problems Trends", St.Peterburg-1992; Proceedings» ifova Science. ЛЛ», 1993, in press.

УЧАСТОК ШОЖИТЕЛЬНОЙ ГЕХННКИ они Р6МН ПОДЛ. К ЛЕЧАТ И^^ЭАК РАйЮОзК 1.