Обнаружение продуктов трансформации отравляющих веществ жидкостной хромато-масс-спектрометрией тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Браун Аркадий Владимирович

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ ТРАНСФОРМАЦИИ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005058730

Москва 2013

1 6 МАЙ 2013

005058730

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Родин Игорь Александрович

Официальные оппоненты

Лебедев Альберт Тарасович, доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, профессор кафедры органической химии Химического факультета

Григорьев Андрей Михайлович, кандидат химических наук, Белгородское бюро судебно-медицинской экспертизы, химик-эксперт

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Защита состоится 15 мая 2013 г. в 15 ч 00 мин в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88. по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ.

Автореферат разослан 11 апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.88, кандидат химических наук

Торочешникова И. И.

Общая характеристика работы Введение

Актуальность темы Обнаружение биологически активных компонентов в смесях сложного состава, к которым относятся биологические жидкости (кровь, моча и т.д.) является наиболее сложной задачей аналитической химии и требует использования современных высокоинформативных методов исследования. Одним из наиболее мощных и универсальных способов исследования структуры неизвестных веществ является метод жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС(-МС)), сочетающий в себе возможность проведения высокоселективного разделения исследуемых смесей, достоверное обнаружение неизвестных веществ и высокую чувствительность.

Конвенция о запрете разработки, производства, хранения и использования химического оружия (КЗХО) вступила в силу 29 апреля 1997. Согласно положениям КЗХО, страны, подписавшие данное соглашение, обязаны уничтожить все запасы химического оружия (ХО). Отравляющее вещество определяется как соединение, которое за счет химического воздействия на живой организм может привести к летальному исходу, вызвать временный выход из строя и/или причинить вред человеку или животным.

Список токсических веществ и их прекурсоров, для которых должны существовать надежные методики идентификации и обнаружения, указаны в Приложениях 1-3 КЗХО. Эти Приложения включают тысячи химических соединений, в частности, большую часть из них составляют органические вещества с различными физико-химическими свойствами: кислоты, основания, соединения с группами, содержащими гетероатомы фосфора, серы, фтора и/или хлора. В качестве объектов исследования выбраны четыре класса соединений, являющиеся основными продуктами трансформации нервно-паралитических ОВ (диалкилтаурины и О-алкилметилфосфоновые кислоты), иприта (продукты разложения под действием фермента р-лиазы) и люизита (2-хлорвиниларсоновая и 2-хлорвиниларсонистая кислоты), обладающие свойствами полярных соединений и относящиеся к нелетучим веществам.

Использование методов хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить надежное обнаружение и определение продуктов деструкции ОВ, однако методы ГХ-МС(-МС) не являются достаточно универсальными для обнаружения и определения основных классов продуктов трансформации ОВ, поскольку обладают существенными ограничениями по летучести и термостабильности определяемых веществ. При этом отдельные процедуры пробоподготовки весьма продолжительны (несколько часов), а ряд операций (смыв остатков аналита, дериватизация) приводят к появлению неконтролируемых погрешностей при количественном анализе. В связи с этим чрезвычайно перспективным представляется использование прямых (не требующих длительной и сложной пробоподготовки) методов анализа, среди которых наибольший интерес вызывает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС-МС). С развитием технологий появились новые возможности методов ВЭЖХ, в частности, в настоящее время быстро развивается вариант ульраВЭЖХ, работа при повышенном давлении в системе (более 500 bar), который позволяет существенно сократить время анализа и добиться высоких значений эффективности разделения, а совершенствование методов масс-спектрометрического детектирования позволяет проводить селективное обнаружение и определение следовых количеств веществ (на уровне пг/мл) с минимальными требованиями к процедуре очистки от мешающих определению примесей.

В записке технического секретариата Организации по Запрещению Химического Оружия (ОЗХО) (ЕС- 42/S/4) указывается, что в КЗХО предусматривается отбор и анализ

биомедицинских проб, источником которых являются люди и животные (пробы крови, мочи, кала, тканей и т.д.), при проведении расследований предполагаемого применения химического оружия. Такой анализ имеет целью установить, действительно ли люди или животные, которые, как предполагается, подверглись воздействию боевых отравляющих веществ в ходе нападений с применением ХО, подверглись воздействию ОВ и, если подверглись, то какими были эти ОВ. В тех случаях, когда доступ к месту предполагаемого применения ХО задерживается или невозможен, анализ биомедицинских проб, взятых у подвергшихся воздействию ОВ людей или животных, может оказаться единственным источником информации.

Цель работы состояла в разработке и оценке аналитических возможностей экспрессных высокочувствительных способов обнаружения и определения токсичных химикатов в объектах со сложной матрицей методами прямого (без использования реакций дериватизации) жидкостного хромато-масс-спектрометрического анализа, позволяющих надежно устанавливать факт применения отравляющих веществ.

В ходе данной работы в качестве объектов исследований выбраны продукты трансформации двух основных классов боевых отравляющих веществ - нервно-паралитического (продукты трансформации зарина, зомана, УХ и Ю/Х) и кожно-нарывного действия (метаболиты иприта и продукты гидролиза люизита).

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

1. Исследование хроматографического разделения в варианте прямого ВЭЖХ анализа и характера ионизации и фрагментации в варианте масс-спектрометрического детектирования продуктов трансформации ОВ: класса диалкилтауринов и О-алкилметилфосфоновых кислот (продукты разложения нервно-паралитических ОВ), метаболитов иприта, которые образуются в живых организмах под действием фермента Р-лиазы, двух основных продуктов разложения люизита в объектах окружающей среды и живых организмов.

2. Оптимизация пробоподготовки и выбор условий пробоподготовки, обеспечивающих эффективную очистку от примесей, мешающих определению анализируемых соединений, в образцах сложного состава (моча, кровь).

3. Создание и апробация способов хромато-масс-спектрометрического обнаружения и определения продуктов трансформации ОВ методами прямого ВЭЖХ анализа в объектах окружающей среды (сточные воды, талый снег и т.д.) и биологических жидкостях, искусственно загрязненных продуктами трансформации ОВ, позволяющих надежно выявлять факт применения ОВ.

4. Изучение процессов выведения продуктов трансформации ОВ из живого организма после получения лабораторными крысами несмертельных доз ОВ для оценки ретроспективности разработанных подходов и представление их в виде зависимостей концентраций исследуемых маркеров в биологических жидкостях от времени с момента интоксикации.

Научная новизна Получены масс-спектры электрораспылительной ионизации и химической ионизации при атмосферном давлении исследуемых соединений.

Предложен способ обнаружения продуктов окислительной деструкции нервно-паралитических отравляющих веществ - 2-(Ы,Ы-диалкиламино)-этансульфоновых кислот -методами капиллярного зонного электрофореза с УФ-детектированием (КЗЭ-УФ) и ВЭЖХ-МС.

Выбраны условия разделения продуктов разложения зарина, зомана, УХ, ЯУХ, люизита и иприта в варианте обращенно-фазовой (ультра)ВЭЖХ-МС(-МС), позволяющие проводить

экспрессное обнаружение данных веществ, с использованием которых достигнуты рекордно низкие пределы обнаружения продуктов трансформации зомана, 11УХ, зарина и УХ, составляющие 0.1, 0.4, 0.5 и 0.8 нг/мл для пинаколил метилфосфоновой кислоты, изобутил метилфосфоновой кислоты, изопропил метилфосфоновой кислоты и этил метилфосфоновой кислоты соответственно.

Разработан экспрессный подход без использования трудоемкой процедуры дериватизации, позволяющий проводить обнаружение и определение двух основных продуктов разложения люизита - хлорвиниларсоновой и хлорвиниларсонистой кислот - методом ВЭЖХ-МС-МС в образцах крысиной мочи с пределами обнаружения 3 и 0.5 нг в 1 мл мочи соответственно.

По результатам определения содержания продуктов трансформации ОВ в биологических жидкостях лабораторных крыс после интоксикации нервно-паралитическими ОВ и ипритом установлен вид распределения концентраций соответствующих продуктов трансформации во времени. Показана высокая ретроспективность разработанных подходов.

Практическая значимость Разработан способ обнаружения и определения четырех диалкиламино)-этансульфоновых кислот в объектах окружающей среды методом ВЭЖХ-МС, наличие которых косвенно подтверждает факт применения или использования веществ класса ОВ У-газов.

Предложен способ пробоподготовки биологических жидкостей (мочи и крови), обеспечивающий эффективную очистку пробы от мешающего влияния матрицы при определении исследуемых соединений.

Показано, что использование метода прямого ВЭЖХ-МС-МС анализа позволяет проводить надежное обнаружение и определение двух основных продуктов разложения люизита -хлорвиниларсновой и хлорвиниларсонистой кислот в образцах крысиной мочи после введения несмертельной дозы люизита внутривенно с пределами обнаружения 3 нг/мл и 0.5 нг/мл соответственно.

Разработаны чувствительные способы надежного обнаружения и определения продуктов трансформации зарина, зомана, УХ, ИУХ, иприта и люизита методами прямого ультраВЭЖХ-МС(-МС) анализа в биологических жидкостях, искусственно загрязненных выбранными продуктами трансформации ОВ и после интоксикации несмертельными дозами ОВ лабораторных животных. В рамках ежегодных межлабораторных испытаний ОЗХО успешно апробирован способ обнаружения и идентификации четырех продуктов разложения нервно-паралитических ОВ (алкил метилфосфоновых кислот) и двух продуктов трансформации иприта, которые образуются под действием фермента р-лиазы (1,1'-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этана] и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана) в образцах человеческой мочи, искусственно загрязненной данными веществами.

Использование предложенных способов обнаружения и определения продуктов трансформации ОВ позволило установить закономерности выведения продуктов трансформации зарина, зомана, УХ, ИУХ, иприта и люизита из организма лабораторных крыс, подвергшихся воздействию ОВ, и оценить ретроспективность разработанных подходов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты исследования ионизации и фрагментации маркеров применения боевых отравляющих веществ (сера-, фосфорсодержащих и т.д.) в условиях электрораспылительной ионизации и химической ионизации при атмосферном давлении.

2. Условия пробоподготовки при определении исследуемых продуктов трансформации ОВ в объектах сложного состава (моча, кровь).

3. Условия хроматографического разделения и детектирования восьми продуктов разложения нервно-паралитических ОВ методом прямого (ультра)ВЭЖХ анализа с использованием масс-спектрометрического детектирования. Результаты определения данных соединений в реальных объектах.

4. Результаты применения метода ВЭЖХ-МС-МС для обнаружения и определения трех метаболитов иприта, которые образуются в живых организмах под действием фермента р-лиазы.

5. Результаты разделения двух основных продуктов разложения люизита -хлорвиниларсонистой (ХВАК) и хлорвиниларсоновой (ХВАОК) кислот - в варианте ВЭЖХ-МС-МС, без использования общепринятой для данного класса соединений процедуры дериватизации. Результаты определения ХВАК и ХВАОК в реальных объектах.

6. Подходы, позволяющие проводить надежное обнаружение и определение продуктов трансформации двух основных классов ОВ в объектах окружающей среды и биологических жидкостях, и результаты их применения при выявлении закономерностей выведения продуктов трансформации ОВ из организма лабораторных крыс, подвергшихся воздействию несмертельными дозами ОВ.

Апробация работы Результаты работы докладывались на Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар, Россия), Международной симпозиуме «36А International Symposiumon High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques» (2011, Будапешт, Венгрия), III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (2011, Краснодар, Россия), IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2011» (2011, Санкт-Петербург, Россия), Международной конференции «8th annual LC/MS/MS work shop on environmental applications and food safety» (2012, Барселона, Испания), Всероссийской конференции с международным участием по аналитической спектроскопии(2012, Краснодар, Россия), Пятый Съезд ВМСО (IV Всероссийская Конференция с Международным Участием «Масс-Спектрометрия и ее Прикладные Проблемы») (2011, Москва, Россия), научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии МГУ имени М. В. Ломоносова.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 статей в российских и зарубежных журналах и 7 тезисов докладов.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и включает 91 рисунок, 48 таблиц и список цитируемой литературы из 150 наименований.

Основное содержание работы

В первой главе представлен обзор литературы, в котором описаны пути трансформации ОВ, рассмотрены и систематизированы работы, посвященные исследованиям обнаружения и определения основных классов ОВ (нервно-паралитических ОВ, сернистых и азотистых ипритов, мышьяк-содержащих ОВ) и продуктов их разложения в объектах окружающей среды и биологических жидкостях живых организмов методами ВЭЖХ и ГХ.

Во второй главе диссертации перечислены реагенты и аппаратура, которые применялись в ходе исследования. В работе использовали следующее хроматографическое оборудование: жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором LCMS-2010A (Shimadzu, Япония), система капиллярного электрофореза «Капель-105М» («Люмэкс», Россия), жидкостной хроматограф Agilent 1100 (США) с МС-МС- детектором Varian 1200 (США), соответственно, жидкостной хроматограф Ultimate 3000 (Dionex, США) с гибридным тандемным масс-спектрометрическим детектором Q TRAP 3200 (АВ SCIEX, Канада),

жидкостной хроматограф Ultimate 3000 (Dionex, США) с гибридным тандемным масс-спектрометрическим детектором Q Trap 3200 (АВ SCIEX, Канада).

В работе использовали следующие хроматографические колонки: Kromasil 100 С18 (1.0x250 мм), диаметр зерна сорбента 5 мкм (HiChrom, Великобритания), Sinergi-HydroRP (150*2,1 мм), диаметр зерна сорбента 5 мкм (Phenomenex, США), Synergi Polar (250x2 мм), диаметр зерна сорбента 4 мкм (Phenomenex, США), Acclaim С18 (250 х 2 мм), диаметр зерна сорбента 2.2 мкм (Dionex, США), Sinergi Polar (150x2 мм), диаметра зерна сорбента 4 мкм (Phenomenex, США), Zorbax Stable Bond С-18Е (150x2 мм), диаметра зерна сорбента 5 мкм (Agilent, США), кварцевые капилляры для КЗЭ с поливиниловым покрытием внутренним диаметром 50 и 75 мкм.

Третья глава посвящена разработке способов обнаружения и определения основных продуктов трансформации зарина, зомана, VX и RVX, а также продуктов окислительной деструкции V-газов (диалкилтауринов) - нервно-паралитических ОВ.

На первом этапе исследовали вещества - диметилтаурин (ДМТ), 2-(диэтиламино)-этансульфоновую кислоту (диэтилтаурин, ДЭТ), 2-(дипропиламино)-этансульфоновук> кислоту (дипропилтаурин, ДПТ) и 2-(диизопропиламино)-этансульфоновую кислоту (диизопропилтаурин, ДИТ), продукты окислительной трансформации ОВ класса V-газов, которые представляют собой органические вещества амфотерной природы и проявляют свойства слабых органических кислот (по сульфогруппе) и слабых оснований (за счет протонирования атома азота) в варианте ВЭЖХ-МС для создания арбитражного подхода обнаружения исследуемых соединений на низком уровне содержаний (нг/мл). Диалкилтаурины проявляют свойства органических оснований, легко протонируются в слабокислой среде, образуя положительно заряженные ионы, а также могут образовывать отрицательно заряженные ионы за счет проявления кислотных свойств.

Для выбора оптимальных настроек детектирования масс-спектрометра сравнивали интенсивности откликов детектора при исследовании стандартных растворов диалкилтауринов (концентрация компонетов 1 мкг/мл). Для сравнения отношений сигнал/шум, достигаемых при использовании разных вариантов ионизации и полярности использовали типичные параметры работы масс-спектрометрического детектора, рекомендуемые производителем. При использовании данных настроек масс-анализатора, и варьируя тип источника и полярность регистрируемых ионов (использовали электрораспылительную ионизацию (ЭРИ) и химическую ионизацию при атмосферном давлении (ХИАД)), максимальное соотношение сигнал/шум (т.е. максимальная чувствительность) достигается при использовании ХИАД в варианте регистрации положительных ионов, что, по-видимому, связано с наличием атомов серы и азота в структуре диалкилтауринов, которые способны легко протонироваться.

Для выбора характеристичных ионов для детектирования диалкилтауринов изучали масс-спектры, получаемые в условиях ХИАД (+) (рис. 1) и выбирали пики ионов для детектирования, которые имеют наибольшую интенсивность. В спектрах всех диалкилтауринов наиболее интенсивны сигналы протонированных молекул, для ДМТ и ДЭТ фрагментация незначительна (на спектре присутствуют молекулярные ионы с m/z 154 и 182, соответственно), а в случае ДПТ и ДИТ в масс-спектрах присутствуют ионы-продукты, образующиеся при отщеплении сульфогруппы (с m/z 128 для обоих изомеров). Масс-спектры ДПТ и ДИТ, являющиеся изомерами, крайне схожи. В таблице 1 представлены выбранные характеристичные ионы для каждого вещества.

Рис. 1. Масс-спектры ДМТ (А), ДЭТ (Б), ДПТ (В), ДИТ (Г), полученные в режиме химической ионизации при атмосферном давлении в варианте регнстрапии положительных ионов.

Показано, что для всех изученных веществ максимальный отклик детектора достигается при использовании кислых подвижных фаз, а величина аналитического сигнала выходит на плато при рН 5,4, что, по-видимому, связано с увеличением доли протонированных ионов в кислой области рН.

Таблица 1. Выбранные ионы для детектирования диалкилтауринов в варианте ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием

Вещество Характеристичный ион, m/z

ДМТ 154

ДЭТ 182

ДПТ 210

ДИТ 210

На следующем этапе работы проводили разработку условий хроматографического разделения диалкилтауринов. Благодаря наличию гидрофобных свойств, диалкилтаурины могут быть успешно разделены в условиях обращено фазовой ВЭЖХ. Для разделения полярных органических веществ с невысокой гидрофобностью хорошо подходят эндкепированные колонки, например Zorbax Stable Bond С-18Е, которую использовали в настоящей работе. Ранее показано, что для оптимального выхода по ионизации необходимо использование слабокислых подвижных фаз. Однако чтобы диалкилтаурины удерживались на обращенно-фазовых колонках, необходимо использовать такую величину рН, при которой диалкилтаурины существуют преимущественно в незаряженной форме. Данному критерию также отвечает значение рН 5,4, при котором достигается приемлемая эффективность ионизации исследуемых веществ.

При использовании буферного раствора с рН 5,4 также достигаются значения хроматографических параметров (коэффициенты емкости находятся в диапазоне 2-7), удерживание происходит преимущественно за счет гидрофобных взаимодействий, достигается высокая селективность разделения. Таким образом, использование аммонийно-ацетатного буферного раствора с рН 5,4, хорошо совместимого с масс-спектрометром, позволяет успешно реализовывать хроматографическое разделение.

8

В таблице 2 представлены хроматографические параметры диалкилтауриновы в выбранных условиях. Использование предложенной программы обеспечивает полное разделение смеси с необходимой эффективностью за приемлемое время.

Таблица 2. Параметры хроматографического разделения в оптимизированных условиях при определении ДМТ, ДЭТ, ДПТ и ДИТ_

Вещество Время удерживания, мин Разрешение, R„,„+i Эффективность, ТТ/м

ДМТ 1,5 1,4 35000

ДЭТ 1,8 2 40000

ДПТ 2.5 2,5 50000

ДИТ 3.6 - 50000

В выбранных оптимальных условиях определения ДМТ, ДЭТ, ДПТ и ДИТ построены градуировочные зависимости для компонентов анализируемой смеси в диапазоне концентраций 0,05- 10 мкг/мл, рассчитаны пределы обнаружения и метрологические характеристики анализа (табл. 3). Предложенный подход характеризуется высокой чувствительностью, хорошими метрологическими характеристиками определения. Данный метод опробован при анализе растворов смесей анализируемых веществ в реальных пробах воды (проверка правильности подхода методом введено — найдено). В качестве объектов для исследования выбирали образцы воды, существенно отличающиеся по ключевым параметрам, характеризующим химический состав - концентрациям металлов, анионов, органических веществ и другим показателям. Полученные хроматограммы совершенно идентичны -мешающее влияние отсутствует.

Таблица 3. Метрологические характеристики разработанного подхода определения диалкилтаурипов методом ВЭЖХ-МС

Вещество Уравнение градуировочного графика R2 Предел обнаружения, мг/л Диапазон определяемых концентраций, мкг/г s„ %

ДМТ S = 4,1 х 105хС 0,99 0,015 0,05- 10 11

ДЭТ S = 5,1 х 103х С 0,99 0,015 0,05- 10 12

ДПТ S = 5,4 х 10'х С 0,99 0,025 0,05- 10 14

ДИТ S = 3.9х 105х С 0,99 0,025 0,05- 10 12

Следующим этапом работы являлась разработка чувствительного и экспрессного способа обнаружения и определения следовых количеств основных продуктов трансформации зарина, зомана, VX и RVX (О-изопропилметилфосфоновой кислоты (иПрМФК), О-пинаколилметилфосфоновой кислоты (ПинМФК), О-этилметилфосфоновой кислоты (ЭМФК) и О-изобутилметилфосфоновой кислоты (иБутМФК) соответственно) методом ВЭЖХ-МС.

Чтобы исключить ложные результаты анализов, ОЗХО ежегодно ужесточает требования, предъявляемые к способам обнаружения маркеров ФОБ, в связи с чем в данной главе описана разработка высокочувствительного селективного способа определения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК с использованием метода ультраВЭЖХ-МС-МС (работа при давлении в системе более 500 bar), который позволяет существенно сократить время анализа и добиться высоких значений эффективности разделения, а с использованием варианта тандемного масс-спектрометрического детектирования появляется возможность определения следовых количеств веществ на уровне 100 пг/мл.

Оптимизация условий определения иПрМФК, ПинМФК и иБутМФК в варианте одномерного МС детектирования. Известно, что наиболее эффективное масс-

9

спектрометрическое детектирование основных маркеров фосфорсодержащих отравляющих веществ (ФОВ) зарина, зомана и RVX достигается с использованием отрицательной ионизации, поэтому для разработки условий детектирования применяли именно этот тип ионизации. Оптимизацию условий масс-спектрометрического детектирования проводили в режиме прямого ввода, непосредственно вводя растворы стандартов алкилметилфосфонатов в источник ионизации прибора, минуя хроматографическую колонку.

Для масс-спектров исследуемых соединений характерны интенсивные пики анионов, соответствующие потере кислого протона молекулой алкилметилфосфоновой кислоты. Кроме того, в масс-спектре полученных соединений присутствуют малоинтенсивные пики, отвечающие фрагментному иону, структура которого отвечает разрыву связи А1к-0 и приводит к образованию иона метилфосфоновой кислоты.

Таким образом, для достижения максимальной чувствительности определения иБутМФК, иПрМФк и ПинМФК в качестве ионов для селективного масс-спектрометрического детектирования в режиме регистрации выделенных ионов выбраны: для иПрМФК - 95, 137; для иБутМФК-95,151; для ПинМФК - 95, 179;

Оптимизация условий детектирования иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК в варианте тандемного МС-МС аначиза. На стадии проведения оптимизации условий тандемного масс-спектрометрического детектирования проводили установление влияния параметров, отвечающих за настройки масс-спектрометра в масс-детекторе (потенциал декластеризации, входной потенциал на нулевом квадруполе масс-анализатора, энергия фрагментация и др.) и выбор оптимальных пар ионных переходов для масс-спектрометрического детектирования иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

Работу проводили в режиме прямого ввода с использованием шприцевого насоса (использовали водно-ацетонитрильные растворы иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК с концентрацией 1 мкг/мл). В масс-спектрах растворов иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК присутствуют депротонированные молекулярный ионы иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК с m/z 137, 179, 123 и 151 соответственно (режим регистрации отрицательных ионов). Образование молекулярных ионов вероятней всего происходит за счет депротонирования кислотных групп иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

После выбора оптимальных настроек первого квадруполя, позволяющего получать максимальную интенсивность пиков молекулярных ионов исследуемых соединений, проводили исследование влияния энергии фрагментации в камере соударения масс-спектрометра на характер спектра ионов-продуктов, образующихся при распаде молекулярных ионов иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК и интенсивность пиков образующихся ионов-продуктов. На рисунке 2 представлены масс-спектры ионов-продуктов иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК, полученные в режиме регистрации отрицательных ионов в варианте электрораспылительной ионизации, при этом использовали оптимальные параметры работы селективного масс-анализатора. Наиболее интенсивными ионными реакциями оказались m/z 137 -> 95, m/z 137 —> 79, при определении иПрМФК, m/z 179 —► 95, m/z 179 -» 79, при определении ПинМФК, m/z 123 —► 95, m/z 123 —► 79, при определении ЭМФК и m/z 151 —> 95, m/z 151 —» 79, при определении иБутМФК. Фрагментация иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК идет с образование иона метилфосфоновой кислоты с m/z 95 и иона-продукта с m/z 79.

\z i. 'Ъг

1;: ».о- i § J -fer ..........X- „ , t-»-»

Рис. 2. Спектр ионов-продуктов депротонироваиных молекул ЭМФК (А), иБутМФК (Б), иПрМФК (В) и ПинМФК (Г). Режим электрораспылительной ионизации в варианте регистрации отрицательных ионов.

Разработка условий хроматографического разделения ачкил метилфосфоновых кислот в варианте ВЭЖХ-МС. В процессе разработки оптимальных условий хроматографического разделения сравнивали эффективность хроматографического разделения (число теоретических тарелок на колонку для каждого эфира метилфосфоновой кислоты) на сорбенте обращенно-фазовой колонки колонки Synergi Hydro-RP (содержит полярные остатки на матрице сорбента) при использовании различных программ градиентного элюирования, разных температур термостатирования колонок и при использовании в качестве компонентов подвижной фазы растворов с различными значениями рН. Критерием выбора оптимальной хроматографической системы являлось достижение максимальной эффективности. На рисунке 3 представлена хроматограмма стандартной водной смеси иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК, полученная в оптимальных условиях разделения в варианте ВЭЖХ-МС.

Разработка условий хроматографического разделения ачкил метилфосфоновых кислот в варианте ультраВЭЖХ-МС-МС. В качестве неподвижной фазы при одновременном разделении иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК использовали колонку с обращено-фазовым сорбентом Acclaim RSLC. Поскольку иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК являются кислотами, для того, чтобы уменьшить степень размывания пиков и подавить диссоциацию кислот в качестве подвижных фаз использовали 0.5 % водный раствор муравьиной кислоты и 0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. При хроматографическом определении иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК использовали программу градиентного элюирования, в условиях которой коэффициенты емкости иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК составили 3.9, 5.6, 2.0 и 4.7 соответственно, и являются приемлемым для метода хроматографического анализа. В таблице 4 представлены хроматографические параметры при разделении иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

ПинМФК

5аш>

X О)

s

а:_

рпН О

иБутМФК

иПрМФК

Время, мин

Рис. 3. Хроматограмма по полному ионному току стандартного раствора иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК (200 нг/мл). Колонка: Synergi Hydro-RP 150 х 2.1 мм, 5 мкм; Подвижная фаза А - 0.5 % раствор муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В -0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле; скорость потока 0.2 мл/мин; градиентное элюировапие (0-2 мин - 5 % В, 2- 15 мин - 5%-100% В, 15-20 мпн- 100 % В, 20- 30 мин100%-5% В, 30- 35 мин -5% В). Режим регистрации выделенных ионов иПрМФК, ПинМФК и иБутМФК.

На рисунке 4 представлена хроматограмма стандартного водного раствора, содержащего иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК, полученные в выбранных условиях хромато-масс-спектрометрического определения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

Далее, проводили разработку процедуры пробоподготовки образцов крови при определении алкилметилфосфоновых кислот в варианте ВЭЖХ-МС. В настоящее время наиболее эффективной техникой проведения пробоподготовки при анализе биопроб признана твердофазная экстракция (ТФЭ). Данный метод характеризуется высокой технологичностью и удобством. Для достижения необходимой чувствительности определения необходимо разработать процедуру ТФЭ, которая характеризуется эффективным удалением мешающих компонентов пробы и высокими степенями извлечения определяемых соединений.

Таблица 4. Хроматографические параметры иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК. При расчетах использовали величину мертвого времени равного 0.60 мин.

Параметр ЭМФК иПрМФК ПинМФК иБутМФК

Время удерживания, мин 2.0 3.9 5.6 4.7

Разрешение пиков, R„,„+i 11.8 5.3 - 5.1

В^емя.мин

Рис. 4. Хроматограмма стандартного водного раствора содержащего по 20 нг/мл нПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК. Колонка: Acclaim С18 250 х 2 мм, 2.2 мкм; Подвижная фаза А - 0.5 % раствор муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В -0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитрнле; скорость потока 0.45 мл/мин; градиентное элюирование (0.00 - 1.5 мин - 2 % В, 1.51- 8.00 мин - 2%-100% В, 8.018.30 мин- 100 % - 2 % В). Режим регистрации выбранных реакции иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

Для решения поставленной задачи исследовали поведение иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК в варианте ТФЭ, были выбраны картриджи Strata, содержащие сорбенты четырех разных типов - сорбент на основе гидрофобизированного силикагеля с привитыми додецильными группами и эндкепингом Strata С 18Е, сорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола Strata SDB-L, анионообменный сорбент на основе четвертичных аммонийных оснований Strata SAX и картридж смешанного типа Strata Screen А, содержащий анионообменный сорбент и обращенно-фазовый сорбент.

Для разработки процедуры ТФЭ использовали человеческую плазму, полученную от разных доноров. В каждую порцию плазмы вносили добавку смеси стандартов основных исследуемых маркеров ФОВ зарина, зомана и RVX в количествах, необходимых для создания содержания данных соединений на уровне 200 нг/мл плазмы. В таблице 5 представлены сравнительные данные по значениям степеней извлечения определяемых веществ, достигаемые с использованием различных схем пробоподготовки. Использование картриджа Strata SDB-L позволяет достигать наиболее приемлемых значений степеней извлечения (более 50 %), что обусловило выбор схемы пробоподготовки с использованием данного типа картриджей как оптимального для проведения ТФЭ на стадии пробоподготовки плазмы.

С использованием предложенных схем масс-спектрометрического детектирования, хроматографического разделения и пробоподготовки определены значения пределов обнаружения иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК в плазме человека, которые составили 4 нг, 1 нг и 0.6 нг в 1 мл, соответственно.

В ходе исследования иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК методом ультраВЭЖХ-МС-МС проводили оптимизацию процедуры пробоподготовки образцов мочи. Для этого образец мочи подщелачивали раствором аммиака до рН 8-9, чтобы перевести иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК в анионы, которые плохо удерживаются на выбранных сорбентах картриджей, далее пробу пропускали через картридж.

Таблица 5. Сравнение степеней извлечения алкилметилфосфоновых кислот из плазмы, искусственно загрязненной иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК, с использованием картриджей для ТФЭ различного типа. Схема пробоподготовки представлена в тексте (п=3, Р=0.95)_

Параметр Strata С 18Е Strata SDB-L Strata SAX Strata Screen А

Степень извлечения„прмФК, % <5 59±7 27±5 15±4

Степень извлечениЯиБугМФК, 32±7 120±20 32±5 30±5

Степень извлечениящшМФК, % 140±30 91±9 43±6 52±7

На этапе оптимизации процедуры пробоподготовки исследовали влияние типа сорбента картриджа на пропускание иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК. В ходе работы провели очистку образцов мочи на двух типах картриджей: Strata Screen С (смешанный сорбент с лигандами С8 и катионно-обменными группами) и Strata SDB-L (сорбент сополимера стирола и дивинилбензола). Критерием выбора оптимального картриджа является максимальное пропускание иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК через сорбент картриджа.

Расчет величины пропускания иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК проводили относительно содержания иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК в стандартном водном растворе до процедуры пробоподготовки. Наилучших результатов удалось достигнуть при использовании картриджа Strata SDB-L, для которого величина пропускания иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК составила более 85%, в случае картриджа Strata Screen С значения пропускания данных соединений не превышают 80 % и характеризуются худшими величинами воспроизводимости анализа.

В таблице 6 представлены метрологические характеристики разработанного подхода определения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК в образцах человеческой мочи, искусственно загрязненных иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК. Предел обнаружения разработанного способа находили как минимальное содержание определяемого вещества в пробе, которое может достоверно регистрироваться (отношение сигнал/шум для хроматографического пика не меньше 3).

Таблица 6. Метрологические характеристики разработанного подхода определения продуктов трансформации ФОВнПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК в модельных образцах человеческой мочи

Параметр ЭМФК иПрМФК ПинМФК иБутМФК

Уравнение градуировочной зависимости у- площадь хроматографического пика (отн. ед.) С-концентрация анализируемого вещества, (нг/мл) у=47*С у=60хС у=300*С у=93*С

Я, коэффициент корреляции 0.999 0.999 0.999 0.999

Предел обнаружения Ст;п, нг/мл 0.8 0.5 0.1 0.4

Диапазон линейности градуировочной зависимости, нг/мл 2-2000 1-1000 1-1000 1-1000

В четвертой главе представлена разработка способа аналитического контроля содержания трех основных метаболитов иприта, образующихся под действием фермента ß-лиазы - 1,1'-сульфошшбис[2-8-(Ы-ацетилцистеинил) этана] (СБАЦЭ), 1,1'-сульфонилбис-[2-

(метилсульфинил)этана] (СБМСЭ) и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана (МСМТЭСЭ) методами (ультра)ВЭЖХ-МС-МС в режиме электрораспылительной ионизации. В ходе оптимизации условий масс-спектрометрического детектирования проводили исследования влияния напряжение в камере соударений на характер и интенсивность пиков ионов, образующихся при фрагментации положительно заряженных молекулярных ионов СБАЦЭ, СБМСЭ и МСМТЭСЭ. В случае СБАЦЭ максимальной интенсивности пиков образующихся фрагментных ионов удается достичь в варианте регистрации отрицательных ионов, при этом наиболее интенсивными оказались сигналы ионов со значениями m/z 127 и 163,5, которые соответствуют фрагментам иона-предшественника СБАЦЭ. В дальнейшем указанные ионы использовали в качестве характеристичных при детектировании СБАЦЭ в варианте регистрации выбранных реакций (m/z 443m/z 127 и m/z 443 m/z 163.5). В ходе исследования фрагментации СБМСЭ и МСМТЭСЭ наиболее интенсивными ионными переходами оказались m/z 247 —> 183, m/z 247 —> 119, при определении СБМСЭ, m/z 231 —» 75, m/z 231 —» 167, при определении МСМТЭСЭ.

В качестве колонки для хроматографического определения СБАЦЭ в варианте ВЭЖХ была выбрана колонка с сорбентом Synergi Polar RP. Данная фаза характеризуется высокой эффективностью для сильнополярных веществ и оптимальна для различных азотсодержащих органических соединений, а колонка диаметром 2 мм и мелкодисперсный сорбент позволят минимизировать размывание пиков.

Для выяснения оптимального значения pH варьировали значения pH и программу градиентного элюирования по ацетонитрилу таким образом, чтобы добиться максимальной эффективности, чувствительности и оптимального коэффициента емкости (1-5). Сильно выраженное влияние pH на удерживание и чувствительность детектирования связано с тем, что в структуре СБАЦЭ присутствуют многочисленные группы кислотной и основной природы, поэтому при небольшом изменении кислотности происходит перепротонирование различных функциональных групп и переход вещества из одной протонированной формы в другую, сильно отличающиеся друг от друга. Оптимальным следует признать значение pH подвижной фазы 5,4, при котором достигается максимальная эффективность разделения СБАЦЭ, что, по-видимому, связано с тем, что СБАЦЭ существует в виде гидрофобного цвиттер-иона, хорошо удерживающегося на колонке и легко ионизирующегося в отрицательной области.

С использованием стандартных растворов СБАЦЭ провели оценку метрологических характеристик разработанного способа. Разброс времен удерживания определяемого компонента не превышает 0,3 минуты, а предел обнаружения - 0,5 нг/мл.

В ходе разработки способа разделения МСМТЭСЭ и СБМСЭ методом (ультра)ВЭЖХ в качестве неподвижной фазы использовали колонку с обращено-фазовым сорбентом Acclaim RSLC. Для того чтобы увеличить долю заряженных частиц МСМТЭСЭ и СБМСЭ в камере ионизации в ходе анализа, в качестве подвижных фаз использовали 0.5 % водный раствор муравьиной кислоты и 0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле, которые способствуют образованию протонированных положительно заряженных молекул МСМТЭСЭ и СБМСЭ. При хроматографическом определении МСМТЭСЭ и СБМСЭ использовали программу градиентного элюирования, в условиях которой коэффициенты емкости (к) МСМТЭСЭ и СБМСЭ составили 7.3 и 2.4 соответственно, и являются приемлемыми для

метода хроматографического анализа. В таблице 7 приведены хроматографические параметры при разделении МСМТЭСЭ и СБМСЭ.

Таблица 7. Хроматографические параметры МСМТЭСЭ и СБМСЭ. При расчетах использовали величину мертвого времени равную 0.60 мин

^^^^^^Параметры Соединение " ____ Время удерживания, мин Разрешение пиков, Rn,n+1 Селективность

мсмтэсэ 4.96 - 3.1

СБМСЭ 2.01 16.1 3.1

На рисунке 5 представлена хроматограмма стандартного водного раствора, содержащего МСМТЭСЭ и СБМСЭ, полученная при использовании оптимальных условий хромато-масс-спектрометрического определения МСМТЭСЭ и СБМСЭ.

На следующем этапе работы проводили оптимизацию процедуры пробоподготовки, позволяющую проводить надежное обнаружение и определение СБАЦЭ, МСМТЭСЭ и СБМСЭ в образцах мочи. В случае определения СБАЦЭ опробовали несколько схем твердофазной экстракции, в частности, твердофазную экстракцию на удерживание и на пропускание с использованием картриджей типа Strata SDB-L (полимерный сорбент на основе стирол-дивинилбензольного сополимера), Strata С 18 Е (обращено фазовый силикагель с радикалами С 18 и полярным эндкепингом) и Strata SCREEN-C (смешанный обращенно-фазовый-катионнообменный сорбент). Оказалось, что высокая полярность СБАЦЭ и существование в заряженной форме не позволяют добиться высоких степеней извлечения определяемого вещества, таким образом, твердофазная экстракция на удерживание не подходит для проведения пробоподготовки. Результаты исследования содержания СБАЦЭ в элюате при использовании картриджа Strata С 18 Е близко к 100 % позволяет предположить, что в этом варианте на патроне удерживаются мешающие компоненты, а определяемое вещество беспрепятственно проходит через патрон. Пропускание образца мочи через патрон приводило к его полному обесцвечиванию, что косвенно свидетельствует об эффективности подобной очистки пробы. На этапе оптимизации процедуры пробоподготовки исследовали влияние типа сорбента кардриджа на пропускание МСМТЭСЭ и СБМСЭ. В ходе работы образец мочи подкисляли раствором уксусной кислоты до рН 2.5, чтобы перевести МСМТЭСЭ и СБМСЭ в катионы, которые плохо удерживаются на сорбентах картриджей, затем проводили очистку образцов мочи на двух типах картриджей: Strata Screen С (смешанный сорбент с лигандами С8 и привитыми катионно-обменными сульфогруппами) и Strata SDB-L (сорбент сополимера стирола и дивинилбензола). Критерием выбора оптимального картриджа является максимальное пропускание МСМТЭСЭ и СБМСЭ через сорбент. Наилучшие результаты получаются при использовании картриджа Strata SDB-L, для которого величин пропускания МСМТЭСЭ и СБМСЭ составляет более 85%, в случае картриджа Strata Screen С значения пропускания данных соединений не превышают 80 % и характеризуются худшими величинами воспроизводимости анализа.

>■ >tC <Х *МГ<М И ПА««f. 2*1.йиИ О Li« 1Ь. iiOMiit from Samp* iX> пояr» «tri iJOMiill. (rfi'.Üliii,^ ¿OW ¡Ь.*Л <?urt» Spt**, Max. й»!И 0 cn>

Ьотн.ед. МСМТЭСЭ

СБМСЭ

зякю

Й^емя^мЛн'

Рис. 5. Хроматограмма стандартного водного раствора 20 нг/мл СБМСЭ и 20 нг/мл МСМТЭСЭ в оптимальных условиях хромато-масс-спектрометрического определения данных метаболитов иприта. Колонка: Acclaim С18 250 х 2 мм, 2.2 мкм; Подвижная фаза А - 0.5 % раствор муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В -0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетопитрпле; скорость потока 0.45 мл/мин; градиентное элюирование (0.00 - 1.5 мин - 2 % В, 1.51- 8.00 мин - 2%-100% В, 8.01-8.30 мин-100 % - 2 % В). Режим регистрации выделенных ионных переходов СБМСЭ и МСМТЭСЭ (верхняя хроматограмма). Режим регистрации выбранной реакции СБМСЭ m/z 247 —► 183 (нижняя хроматограмма).

В выбранных условиях (ультра)ВЭЖХ-МС-МС анализа трех метаболитов иприта в образцах мочи оценены метрологические характеристики разработанных подходов, которые представлены в таблице 8.

Пятая глава диссертации посвящена разработке способа обнаружения и определения двух основных продуктов трансформации люизита - 2-хлорвиниларсонистой кислоты (ХВАК) и 2-хлорвиниларсоновой кислоты (ХВАОК) методом ВЭЖХ-МС-МС.

Таблица 8. Метрологические характеристики разработанного подхода определения продуктов трансформации иприта МСМТЭСЭ и СБМСЭ в модельных образцах человеческой мочи

Параметр СБАЦЭ СБМСЭ МСМТЭСЭ

Уравнение градуировочной зависимости у- площадь хроматографического пика (отн. ед.) С-концентрация анализируемого вещества, (нг/мл) у=52*С у=23хС у=44хС

Я, коэффициент корреляции 0.999 0.999 0.999

Предел обнаружения Стш, нг/мл 0.5 2 1

Диапазон линейности градуировочной зависимости, нг/мл 2-2000 5-5000 2-2000

На стадии проведения оптимизации условий тандемного масс-спектрометрического детектирования проводили установление влияния параметров, отвечающих за настройки масс-спектрометра в масс-детекторе (потенциал декластеризации, входной потенциал на нулевом квадруполе масс-анализатора, энергия фрагментация и др.) и выбор оптимальных пар ионных переходов для масс-спектрометрического детектирования ХВАК и ХВАОК. В масс-спектре стандартного водного раствора ХВАК присутствует интенсивный пик с m/z=213, который предположительно представляет собой аддукт ХВАК с присутствующей в растворе муравьиной кислотой. В случае исследования ХВАОК в масс-спектре присутствует интенсивный пик молекулярный ион ХВАОК с m/z=185. На рисунке 6 приведены масс-спектры ионов-продуктов ХВАК и ХВАОК, полученные при фрагментации ионов с m/z=213 и m/z=185 соответственно. Наиболее интенсивными ионными переходами оказались 213 —> 169 в случае ХВАК и 185 —» 123 и 185 —» 149 в случае ХВАОК, которые в дальнейшем использовали для обнаружения и определения данных соединений в варианте ВЭЖХ-МС-МС. Образование этих фрагментов происходит с разрушением связей С-О иона адцукта ХВАК и молекулярного иона ХВАОК.

На следующем этапе работы исследовали разделение ХВАК и ХВАОК методом ВЭЖХ. Поскольку ХВАК и ХВАОК обладают различной кислотностью, в ходе определения ХВАК и ХВАОК использовали различные программы градиентного элюирования, в условиях которых удается добиться приемлемых значений хроматографических параметров разделения этих кислот. В таблице 9 представлены программы градиентного элюирования, которые использовали при хроматографическом определении ХВАК и ХВАОК, в условиях которых коэффициенты емкости (к) ХВАК и ХВАОК составляют 5.6 и 0.7, соответственно. Чтобы уменьшить размывание пиков ХВАК и ХВАОК в ходе анализа, в качестве подвижной фазы использовали 0.5 % водный раствор муравьиной кислоты, которая подавляет диссоциацию кислот и в растворе преимущественно существуют незаряженные формы ХВАК и ХВАОК. (расчетные значения рКа,хвАк=4.5,. рКа,хвАОК=3.0, согласно программе ACD/ChemSketch 10.0).

■ -t •ЛЯ-Я,'* ********

ш А * i \ Б

« \—1 X / \

! *" ■Л H »

i: \ ч | i: 7(т i! г

. • ч » * » .» « * "

Piic. 6. Спектр ионов-продуктов депротонированных молекул ХВАК (А), и ХВАОК (Б). Режим электрораспылителыюй ионизации в варианте регистрации отрицательных ионов.

Далее проводили оптимизацию процедуры пробоподготовки мочи при определении ХВАК и ХВАОК, для этого исследовали влияние типа сорбента картриджа на пропускание ХВАК и ХВАОК. В ходе работы подщелачивали аммиаком до рН=9 для того, чтобы перевести ХВАК и ХВАОК в анионы, которые плохо удерживаются на сорбентах картриджей, и, далее, проводили очистку образцов мочи на двух типах картриджей: Strata Screen С (смешанный сорбент с

лигандами С8 и катионно-обменными группами) и Strata X (сорбент с привитыми группами сульфобензоловой кислоты, обладающий катионно-обменными свойствами). Критерием выбора оптимального картриджа является максимальное пропускание ХВАК и ХВАОК через сорбент. Наилучших результатов удается достигнуть при использовании картриджа Strata Screen С, для которого величина пропускания ХВАОК составляет более 60% и ХВАК более 90 % соответственно. Использование картриджа Strata X приводит к значительным потерям ХВАК и ХВАОК на сорбенте картриджа, что неприемлемо при определении следовых количеств ХВАК и ХВАОК в пробах мочи.

Таблица 9. Условия хроматографического разделения при определении ХВАК в водных растворах и в модельных образцах человеческой мочи. Подвижная фаза А - 0.5 % раствор муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В - ацетонитрил

Объем вводимой пробы 0.020 мл;

Температура термостата колонки 20 °С;

Скорость подачи элюента 0.30 мл/мин;

Программа градиентного элюирования при определении ХВАК 0.00-2.00 мин - 10% В, 2.01- 9.00 мин - 10%-60%В, 9.01-10.50 мин- 60 % В, 10.51-10.80 мин- 60%-10% В, 10.81-11.80 мин- 10% В

Программа градиентного элюирования при определении ХВАК 0.00 - 2.00 мин - 5 % В, 1.51- 7.00 мин - 5%-70% В, 7.01-9.50 мин- 70 % В, 9.51-9.80 мин- 70%-5% В, 9.8111.80 мин - 5 % В

На этапе оценки метрологических характеристик работы проводили анализ образцов человеческой мочи, искусственно загрязненной ХВАК и ХВАОК. На основании полученных данных предел обнаружения в образцах человеческой мочи составил 0.3 нг/мл для ХВАК и 3 нг/мл для ХВАОК.

В шестой главе приведена апробация разработанных подходов обнаружения и определения исследуемых продуктов разложения ОВ в объектах окружающей среды и биологических жидкостях живых организмов.

Для апробации разработанного способа определения продуктов окисления V-газов методом ВЭЖХ-МС готовились модельные пробы с различным содержанием целевых веществ в различных водных объектах. Обнаружение считалось достоверным при условии превышения отношения сигнал/шум значения 3:1 для характеристичных пиков соединений, отклонении времени удерживания от стандартного не более 10% при использования режима детектирования по выделенным характеристичным ионам. Результаты апробации в полной мере подтверждают работоспособность разработанного хромато-масс-спектрометрического способа определения продуктов окисления V-газов диалкилтауринов и позволяют проводить надежное обнаружение данных веществ в сточных водах (рис. 7).

Для апробации разработанного способа определения алкиловых эфиров метилфосфоновой кислоты методом ВЭЖХ-МС проанализировали образцы плазмы крови крыс, получавших внутривенно различные ФОВ в количестве соответствующем Vi LD50 для крысы, отобранные у выживших крыс через различные промежутки времени после инъекции ОВ. Апробация разработанного подхода проводилась на пробах гп vivo, проанализированных методом ВЭЖХ-МС, результаты анализа по каждой из проб приведены в таблице 10.

Таким образом, присутствие соответствующего маркера ФОВ достоверно установлено во всех пробах. Определение маркеров ФОВ удалось провести во всех пробах кроме пробы 48 часовой плазмы крысы получавшей RVX.

Время,"мин

Рис. 7. Хроматограмма образца речной воды с добавкой смеси 0.1 мкг/мл диалкнлтауринов, полученная в оптимальных условиях хромато-масс-спектрометрического определения данных соединений. Колонка Zorbax Stable Bond С-18 Е. Подвижная фаза: А - 20 мМ ацетата аммония (рН 5,4), В - ацетоннтрил. Программа элюирования: 0-5 мин - 5 % В, 5-7 мин - 5-50 % В, 7-8 мин - 50% В, 8-10 мин 5 % В. Скорость подачи подвижной фазы - 0.45 мл/мнн. Режим регистрации выделенных иопов ДМТ, ДЭТ, ДПТ, ДИП.

По полученным данным построены кривые выведения продуктов трансформации ФОВ для крыс (рис. 8). Аппроксимация полученных данных степенной функцией характеризуется высокими значениями коэффициентов корреляции. Таким образом, предложенный подход характеризуется высокой чувствительностью и позволяет проводить определение маркеров ФОВ в плазме вплоть до двух суток после отравления несмертельными ('Л LD50) дозами нервно-паралитических отравляющих веществ, хранящихся на складах Российской Армии -зарином зоманом и российским VX (RVX). Кроме того, данный способ может быть успешно использован для установления типа ОВ, воздействию которого подвергся пострадавший.

Для проведения экспериментальной оценки применимости разработанного хромато-масс-спектрометрического подхода определения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК и двух метаболитов иприта МСМТЭСЭ и СБМСЭ методом ультраВЭЖХ-МС-МС в образцах биоматериалов анализировали модельные образцы человеческой мочи, искусственно загрязненных иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК, иБутМФК, МСМТЭСЭ и СБМСЭ. Апробация разработанного подхода проходила в рамках межлабораторных испытаний ОЗХО и заключалась в обнаружении иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК, иБутМФК, МСМТЭСЭ и СБМСЭ в зашифрованных пробах человеческой мочи.

Пробы готовили и анализировали согласно разработанной процедуре пробоподготовки. Для повышения достоверности проводимых исследований также анализировали холостые образцы - пробы человеческой мочи, не содержащие иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК, иБутМФК, МСМТЭСЭ и СБМСЭ. На рисунке 9 представлена хроматограмма человеческой мочи, в котором удалось обнаружить ПинМФК. В ходе испытаний удалось обнаружить в четырех зашифрованных пробах иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и СБМСЭ. Полученные данные полностью подтверждены независимым ГХ-МС-МС анализом с применением реакции дериватизации с гептафторбутирилимидазолом, который проводился в сторонней аккредитованной лаборатории.

Таблица 10. Результаты ВЭЖХ-МС анализа проб in vivo при определении продуктов трансформации зарина, зомана и RVX (п=3, Р=0.95)

Номер пробы Тип ФОВ Время, прошедшее между инъекцией ОВ и отбором пробы Маркер ФОВ Концентрация маркера в пробе, нг/мл

А-1 Зарин 1 час иПрМФК 13±2

А-2 Зоман 1 час ПинМФК 13±4

А-3 RVX 1 час иБутМФК 5±1

А-4 Зарин 6 часов иПрМФК 8±1

А-5 Зоман 6 часов ПинМФК 7.5±0.8

А-6 RVX 6 часов иБутМФК 2.3±0.5

А-7 Зарин 24 часа иПрМФК 5.6±0.5

А-8 Зоман 24 часа ПинМФК 3.2±0.3

А-9 RVX 24 часа иБутМФК 1.3±0.1

А-10 Зарин 48 часов иПрМФК 4.4±0.7

А-11 Зоман 48 часов ПинМФК 1.9±0.2

А-12 RVX 48 часов иБутМФК ~ 1.0*

* Примечание: Содержание маркера находится на уровне предела обнаружения, поэтому вычисление площади пика затруднительно

Рис. 8. Фармакокинетические кривые продуктов трансформации ФОВ для крыс (А - иПрМФК, Б - иБутМФК, В - ПинМФК). Вертикальная ось содержания маркеров имеет размерность нг/мл.

Для проведения экспериментальной оценки применимости разработанного хромато-масс-спектрометрического способа определения метаболита СБАЦЭ исследовали образцы биопроб лабораторных крыс, получавших несмертельную дозу иприта. Использование предложенного подхода позволило добиться большой ретроспективное™ анализа - достоверное обнаружение

метаболита иприта осуществляется в образцах мочи, полученной на 22 день после проведения интоксикации (рис. 10).

Таким образом, показана высокая эффективность разработанного способа анализа для подтверждения факта воздействия иприта на организм млекопитающих.

í то/ге о^вю: £

и (Tute

ПинМФК

всоо.о зом.о

Впрмя.мин

Рнс. 9. Хроматограмма образца человеческой мочи, искусственно загрязненной алкилметиловыми кислотами, полученная при регистрации ПинМФК. Колонка: Acclaim С18 250 х 2 мм, 2.2 мкм; Подвижная фаза А - 0.5 % раствор муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В -0.5 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле; скорость потока 0.45 мл/мин; градиентное элюирование (0.00 - 1.5 мин - 2 % В, 1.51- 8.00 мин - 2%-100% В, 8.01-8.30 мин- 100 % - 2 % В). Режим регистрации выделенных ионных переходов нПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК.

700Í 600^

Ct

i «Xh

° З&У Ж»i

loen

СБАЦЭ

¡MásÁmMAAJ^

т

Т

i ¿ ¿ * Врем», мим

Рис. 10. Хроматограмма образца крысиной мочи, полученная при определении СБАЦЭ через 15 дней с момента интоксикации несмертельной дозой иприта. Колонка: Synergi Polar RP 250x2 мм, 4 мкм; Подвижная фаза А - 20 мМ аммонийно-ацетатного буфера в воде с рН 5.4, подвижная фаза В -ацетонитрил; скорость потока 0.3 мл/мин; градиентное элюирование (0.00 - 2 мин - 2 % В, 2- 5 мин - 2%-20% В, 5-6 мин- 20 % - 90 % В, 6-8 мин- 90 % В, 8-10 мин- 2 % В). Режим регистрации выделенных ионных переходов СБАЦЭ.

На этапе апробации подхода обнаружения и определения ХВАК и ХВАОК методом ВЭЖХ-МС-МС проводили анализ образцов крысиной мочи, отобранных в разные дни после получения дозы люизита in vivo. Крыс подвергали воздействию люизита в различных дозах:

22

0.25 1Л35о и 0.1 ЬЭзо- В результате исследования не удалось обнаружить ХВАК в пробах, однако на следующий день после заражения люизитом в образцах мочи крыс наблюдается интенсивный пик ХВАОК, который соответствует содержанию 20 мкг/мл. На основании полученных данных можно сделать предположение, что люизит в организме крыс в течение первого дня с момента заражения превращается в ХВАОК через стадию образования ХВАК. Таким образом, данный способ позволяет проводить селективное и чувствительное определение ХВАК и ХВАОК (пределы обнаружения составили 0.5 нг и 3 нг в 1 мл мочи для ХВАК и ХВАОК, соответственно) в моче в течение 3 дней с момента интоксикации 0.25 ЬБ50 люизитом.

Выводы

1. Установлены закономерности ионизации продуктов трансформации зарина, зомана, УХ, К УХ и люизита в условиях электрораспылительной ионизации и химической ионизации при атмосферном давлении. В масс-спектрах исследованных соединений присутствуют интенсивные пики молекулярных ионов и характеристичные фрагментные ионы, использование которых позволяет проводить надежное обнаружение продуктов трансформации БОВ.

2. Выбраны условия разделения 4 маркеров нервно-паралитических ОВ, 3 маркеров иприта и 2 маркеров люизита в вариантах ВЭЖХ и ультраВЭЖХ. Предложены способы хроматографического разделения четырех диалкилтауринов (продуктов окислительной трансформации У-газов) методами КЗЭ-УФ и ВЭЖХ-МС и двух продуктов гидролиза люизита - хлорвиниларсонистой и хлорвиниларсоновой кислот методом обращено-фазовой хроматографии методом ВЭЖХ-МС-МС.

3. Разработаны условия хромато-масс-спектрометрического анализа и оценены метрологические характеристики подходов определения продуктов трансформации ФОВ (О-изопропилметилфосфонат, О-пинаколил-метилфосфонат, О-изобутилметилфосфонат и О-этилметилфосфонат), продуктов окислительной деструкции У-газов (диалкилтауринов), продуктов трансформации люизита (2-хлорвиниларсоновой и 2-хлорвиниларсонистой кислот) и продуктов трансформации иприта под действием фермента р-лиазы (СБАЦЭ, МСМТЭСЭ и СБМСЭ) в растворах стандартов и биологических жидкостях, искусственно загрязненных продуктами трансформации ОВ. Пределы обнаружения: диалкилтаурины - 15-25 нг/мл, остальные вещества- 0.1-5 нг/мл.

4. Разработанные способы апробированы: показано, что данные подходы позволяют проводить надежное обнаружение и определение исследуемых продуктов разложения ОВ в образцах биологических жидкостей (мочи и крови) лабораторных животных, которые подверглись воздействию несмертельными дозами нервно-паралитических ОВ, иприта и люизита. В рамках межлабораторных испытаний ОЗХО полученные данные по обнаружению продуктов трансформации зарина, зомана, УХ, ЯУХ и иприта в образцах человеческой мочи полностью подтвердились и совпали с результатами анализа в сторонней аккредитованной лаборатории.

5. Получены кривые выведения О-изопропилметилфосфонат, О-пинаколил-метилфосфонат, О-изобутилметилфосфонат из организма лабораторных крыс в течение первых двух суток после интоксикации ФОВ и оценена ретроспективность предложенных подходов. В случае определения метаболита иприта СБАЦЭ удается проводить надежное обнаружение маркера в образце крысиной мочи после 22 дней с момента интоксикации 5 мг/кг иприта. При анализе образцов мочи на присутствие маркеров люизита после интоксикации 0.1

LDso люизита сделано предположение, что люизит в организме крыс в течение первого дня с момента заражения превращается в ХВАОК через стадию образования ХВАК.

Список публикаций по теме диссертации:

1. A.B. Браун, И.А. Родин, O.A. Шпигун, Е.И. Савельева, И.В. Рыбальченко, C.J1. Болотов, Г.М. Родченков. Обнаружение маркеров нервно-паралитических отравляющих веществ методом жидкостной хроматомасс-спектрометрии. // Масс-спектрометрия. 2011. Т. Т.8. № 1. С. 45 - 50.

2. A.B. Браун, И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, O.A. Шпигун, И.В. Рыбальченко. Обнаружение хлорвиниларсонистой кислоты - маркера применения люизита методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии. // Масс-спектрометрия. 2011. Т.8. № 3. С. 217-222.

3. A.V. Braun, I.A. Rodin, E.I. Savelieva, I.V. Rybalchenko, I.A. Ananieva, O.A. Shpigun. Rapid method for the detection of metabolite of sulfur mustard l,l-sulfonylbis[2-S-(N-acetylcysteinyl)ethane] in plasma and urine by liquid chromatography-negative electrospray-tandem mass spectrometry. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2011. V. 34, № 16. P. 1676-1685.

4. A.V. Braun, I.A. Rodin, A.N. Stavrianidi, I.V. Rybalchenko, O.A. Shpigun. Lewisite metabolites detection in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // Journal of Chromatography B. 2011. V.879. №32. P. 3788-3796.

5. A.B. Браун, P.C. Смирнов, И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, O.A. Шпигун, И.В. Рыбальченко. Определение 2-(диалкиламино)-этансульфоновых кислот в водных объектах методом капиллярного электрофореза с прямым спектрофотомегрическим детектированием. //Заводская лаборатория. 2012. Т. 78. №4. С. 16-21.

6. A.B. Браун, И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, O.A. Шпигун, И.В. Рыбальченко. Обнаружение маркеров нервно-паралитических отравляющих веществ методом ультра- высокоэффективной жидкостной хроматографии -тандемной масс-спектрометрии. // Аналитика и контроль. 2012. Т. 16. № 3. С. 248-253.

7. A.V. Braun, I.A. Rodin, I.V. Rybalchenko, O.A. Shpigun. «A Rapid Method for the Detection of Metabolite of Sulfur Mustard l,l'-Sulfonylbis[2-S-(N-Acetylcysteinyl)Ethane] in Biofluids via LC-MS/MS» // International Congress on Analytical Sciences. Kyoto, Japan. 21-26 May, 2011.

8. A.V. Braun, I.A. Rodin, A.N. Stavrianidi, I.V. Rybalchenko, O.A. Shpigun. «Rapid Method for the Detection of Metabolite of Lewisite - 2-Chlorovinylarsonous Acid in Urine by Liquid Chromatography-Negative Electrospray-Tandem Mass Spectrometry» // 36 111 International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. Budapest, Hungary. 19-23 June, 2011.

9. A.V. Braun, I.A. Rodin, I.A. Anan'eva, I.V. Rybalchenko, O.A. Shpigun. «A Rapid Method for the Detection of Metabolite of Sulfur Mustard l,r-Sulfonylbis[2-S-(N-Acetylcysteiny!)Ethane] in Biofluids via LC-MS/MS» // 36 lh International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. Budapest, Hungary. 19-23 June, 2011.

10. A.B. Браун, И.А. Родин, И.А. Ананьева, O.A. Шпигун, И.В. Рыбальченко. «Использование современных гибридных методов для определения маркеров применения отравляющих веществ» // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии». Краснодар. 2-8 октября 2011 г.

11. A.V. Braun, I.A. Rodin, O.A. Shpigun, A.N. Stavrianidi, I.V. Rybalchenko. «Rapid method for the detection of metabolite of nerve agents in urine by liquid chromatography-negative electrospray-tandem mass spectrometry» // 8й1 Annual LC/MS/MS Workshop on Environmental Applications and Food Safety. Barcelona, Spain. 2-4 July, 2012. P. 211.

12. AB. Браун, И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, O.A. Шпигун, И В. Рыбальченко. «Обнаружение маркеров фосфорорганических отравляющих веществ методом жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием» // Тезисы Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием. Краснодар. 23 - 29 сентября 2012 г. С. 186.

13. A.B. Браун, И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, O.A. Шпигун, И.В. Рыбальченко. «Жидкостная хромато-масс-спектрометрия продуктов трансформации боевых отравляющих веществ» // Тезисы Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием. Краснодар. 23 - 29 сентября 2012 г. С. 203.

Подписано в печать «08» апреля 2013 г. Тираж 100 экз. Усл.п.л. 1,0 Заказ №65 Отпечатано в типографии «Реглет» 119606, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

04201356362 на правах рукописи

Браун Аркадий Владимирович

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ ТРАНСФОРМАЦИИ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н., с.н.с. Родин И.А.

Москва 2013

Оглавление

Введение................................................................................................................................................................8

Глава 1. Обзор литературы................................................................................................................................13

1.1 Методы обнаружения и определения нервно-паралитических ОВ....................................................14

1.1.1 Газовая хроматография и газовая хромато-масс-спектрометрия.................................................15

1.1.2 Жидкостная хромато-масс-спектрометрия.....................................................................................19

1.1.3 Капиллярный электрофорез.............................................................................................................30

1.2 Методы обнаружения и определения сернистых и азотистых ипритов.............................................33

1.2.1 Газовая хроматография.....................................................................................................................33

1.2.2 Газовая хроматография - масс-спектрометрия...............................................................................33

1.2.3 Жидкостная хроматография..............................................................................................................34

1.2.4 Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия.........................................................................35

1.3 Методы обнаружения и определения мышьяк-содержащих ОВ........................................................38

1.3.1 Газовая хроматография и газовая хромато-масс-спектрометрия...............................................38

1.3.2 Жидкостная хроматография и жидкостная хромато-масс-спектрометрия..................................41

1.4 Методы обнаружения и определения других ОВ..................................................................................42

1.5 Использование реакций дериватизации................................................................................................43

1.5.1 Газовая хроматография.....................................................................................................................43

1.5.2 Жидкостная хроматография..............................................................................................................44

1.5.3 Недостатки дериватизации...............................................................................................................44

Глава 2. Оборудование, материалы, техника эксперимента..........................................................................46

2.1 Оборудование и материалы....................................................................................................................46

2.2 Техника эксперимента..............................................................................................................................48

2.2.1 Схема эксперимента по определению диалкилтауринов методом капиллярного зонного электрофореза............................................................................................................................................48

2.2.2 Схема эксперимента по определению продуктов трансформации фосфорорганических отравляющих веществ в биосредахметодом ВЭЖХ-МС..........................................................................48

2.2.3 Схема эксперимента по определению продуктов трансформации фосфорорганических отравляющих веществ в биосредахметодом ВЭЖХ-МС-МС...................................................................49

2.2.4 Схема эксперимента по определению хлорвиниларсонистой и хлорвиниларсоновой кислот в биосредахметодом ВЭЖХ-МС-МС.............................................................................................................49

2.2.5 Схема эксперимента по определению 1,1'-сульфонилбис[2-5-(1\1-ацетил-цистеинил)-этана] в биосредах методом ВЭЖХ-МС-МС............................................................................................................50

2.2.6 Схема эксперимента по определению 1Д'-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этана] и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана в биосредах методом ВЭЖХ-МС-МС............50

Глава 3. Разработка способов обнаружения и определения продуктов трансформации нервно-паралитических OB.........................................................................................................................................52

3.1 Разработка способа определения продуктов окисления V-газов методом капиллярного зонного электрофореза................................................................................................................................................53

3.1.1 Выбор условий разделения и детектирования диалкилтауринов................................................53

3.1.2 Выбор длины волны для прямого детектирования........................................................................55

3.1.3 Влияние напряжения, концентрации и pH рабочего буферного раствора..................................57

3.1.4 Оценка метрологических характеристик разработанного способа определения диалкилтауринов методом КЗЭ-УФ...........................................................................................................60

3.1.5 Изучение мешающего влияния матрицы и проверка правильности разработанного подхода 61

3.2 Разработка способа определения продуктов окисления V-газов методом ВЭЖХ-МС......................63

3.2.1 Выбор условий масс-спектрометрического детектирования........................................................64

3.2.2 Выбор условий хроматографического разделения диалкилтауринов.........................................67

3.2.3 Оценка метрологических характеристик.........................................................................................69

3.2.4 Изучение мешающего влияния матрицы и проверка правильности разработанного подхода 69

3.3 Разработка процедуры обнаружения продуктов трансформации фосфорорганических отравляющих веществ в биосредах методом ВЭЖХ-МС.............................................................................71

3.3.1 Разработка условий масс-спектрометрического детектирования иПрМФК, ПинМФК и иБутМФК в методе ВЭЖХ-МС......................................................................................................................................71

3.3.2 Разработка условий хроматографического разделения алкил метилфосфоновых кислот в методом ВЭЖХ-МС......................................................................................................................................73

3.3.3 Разработка процедур пробоподготовки плазмы при определении иПрМФК, иБутМФК и ПинМФК.......................................................................................................................................................79

3.4 Разработка подхода одновременного определения характеристичных продуктов трансформации ФОВ ультра ВЭЖХ-МС-МС...............................................................................................................................83

3.4.1 Оптимизация условий масс-спектрометрического детектирования иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК......................................................................................................................................................84

3.4.2 Выбор условий хроматографического разделения иПрМФК, ПинМФК, ЭМФК и иБутМФК методом ультраВЭЖХ.................................................................................................................................90

3.4.3 Оптимизация процедуры пробоподготовки образцов мочи при определении алкил метилфосфоновых кислот методом ультраВЭЖХ-МС-МС.......................................................................92

Глава 4. Разработка способов аналитического контроля продуктов трансформации сернистого иприта в биопробах............................................................................................................................................................95

4.1 Разработка подхода хромато-масс-спектрометрического определения 1,Г-сульфонилбис[2-5-(М-ацетилцистеинил) этана]................................................................................................................................96

4.1.1 Оптимизация масс-спектрометрического детектирования СБАЦЭ...............................................96

4.1.2 Оптимизация условий хроматографического разделения СБАЦЭ................................................99

4.1.3 Оптимизация условий пробоподготовки при определении СБАЦЭ...........................................100

4.1.4 Экспериментальная оценка чувствительности обнаружения продуктов трансформации сернистого иприта в биопробах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием...................................................................102

4.2 Разработка подхода одновременного хромато-масс-спектрометрического определения 1,Г-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этана] и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана ........................................................................................................................................................................104

4.2.1 Оптимизация условий масс-спектрометрического детектирования СБМСЭ и МСМТЭСЭ........104

4.2.2 Выбор условий хроматографического разделения МСМТЭСЭ иСБМСЭ в варианте ультраВЭЖХ ....................................................................................................................................................................108

4.2.3 Оптимизация процедуры пробоподготовки образцов мочи при определении МСМТЭСЭ и СБМСЭ методом ультраВЭЖХ-МС-МС.....................................................................................................109

Глава 5. Разработка способа обнаружения и определения продуктов трансформации люизита методом ВЭЖХ-МС-МС.....................................................................................................................................................112

5.1 Разработка способа одновременного обнаружения и определения ХВАК и ХВАОК методом ВЭЖХ-МС-МС............................................................................................................................................................112

5.1.1 Выбор условий масс-спектрометрического детектирования ХВАК и ХВАОК.............................112

5.1.2 Оптимизация условий хроматографического разделения ХВАК и ХВАОК.................................117

5.1.3 Оптимизация процедуры пробоподготовки образцов мочи при определении ХВАК и ХВАОК методом ВЭЖХ-МС-МС.............................................................................................................................119

5.1.4 Апробация разработанного подхода при определении ХВАК и ХВАОК в образцах мочи........125

Глава 6. Апробация разработанных способов обнаружения и определения продуктор трансформации ОВ.......................................................................................................................................................................128

6.1 Результаты апробации разработанного подхода определения диалкилтауринов методом КЗЭ-УФ ........................................................................................................................................................................128

6.2 Результаты апробации разработанного подхода определения диалкилтауринов методом ВЭЖХ-МС...................................................................................................................................................................128

6.3 Апробация способа определения алкил метилфосфоновых кислот ВЭЖХ-МС на пробах «Invivo» 129

6.4 Экспериментальная апробация способа обнаружения и определения алкил метилфосфоновых кислот методом ультраВЭЖХ-МС-МС.........................................................................................................135

6.5 Апробация способа обнаружения и определения СБАЦЭ методом ВЭЖХ-МС-МС..........................139

6.6 Апробация способа одновременного определения МСМТЭСЭ и СБМСЭ в моче методом ультраВЭЖХ-МС-МС......................................................................................................................................143

6.7 Апробация способа обнаружения ХВАК и ХВАОК в биологических жидкостях методом ВЭЖХ-МС-МС...................................................................................................................................................................145

Выводы Литература

Список используемых сокращений

АТД автоматическая термическая десорбция

АЭД атомно-эмиссионное детектор

ВПМС времяпролетный масс-анализатор

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ультраВЭЖХ ВЭЖХ при повышенном давлении

микроВЭЖХ микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография

ГХ газовая хроматография

ДИТ 2-(диизопропиламино)-этансульфоновая кислота

ДМТ диметитаурин

ДМТЛ 2,3-Димеркаптотолуолом

ДПТ 2-(дипропиламино)-этансульфоновая кислота

ДФАЦ дифениларсин цианид

ДФАХ дифениларсин хлорид

ДЭТ 2-(диэтиламино)-этансульфоновая кислота

иБутМФК О-изобутилметилфосфоновая кислота

иПрМФК О-изопропилметилфосфоновая кислота

КЗХО конвенция о запрете разработки, хранения и использования химического

оружия

КЗЭ капиллярный зонный электрофорез

КЭ капиллярный электрофорез

МС масс-спектрометрия

МСМТЭСЭ 1 -метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этан

МФК метилфосфоновая кислота

ОВ отравляющие вещества

ОЗХО организации по запрещению химического оружия

ПДТ 1,3-пропандитиол

ПинМФК О-пинаколилметилфосфоновая кислота

ПМФК О-н-пропилметилфосфоновая кислот

ППФД пульсирующий пламенно-фотометрический детектор

ПФД пламенно-фотометрический детектор

СБАЦЭ 1,Г-сульфонилбис[2-8-(М-ацетилцистеинил) этана]

СБМСЭ 1,1 '-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этан]

ТБДМС третбутил диметилсилан

ТФМЭ твердофазная микроэкстракция

ТФЭ твердофазная экстракция

УФ ультрафиолетовый

ФОВ фосфорсодержащие отравляющие вещества

ХВАК 2-хлорвиниларсонистая кислота

ХВАО 2-хлорвинил арсин оксид

ХВАОК 2-хлорвиниларсоновая кислота

ХИ химическая ионизация

ХИАД химическая ионизация

хо химическое оружие

эдт 1,3- этилдитиол

эзд электрон-захватный детектор

эи электрпонная ионизация

ЭМФК О-этилметилфосфоновая кислота

ЭРИ электрораспылительная ионизация

Введение

Актуальность темы Обнаружение биологически активных компонентов в смесях сложного состава, к которым относятся биологические жидкости (кровь, моча и т.д.) является наиболее сложной задачей аналитической химии и требует использования современных высокоинформативных методов исследования. Одним из наиболее мощных и универсальных способов исследования структуры неизвестных веществ является метод жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС(-МС)), сочетающий в себе возможность проведения высокоселективного разделения исследуемых смесей, достоверное обнаружение неизвестных веществ и высокую чувствительность.

Конвенция о запрете разработки, производства, хранения и использования химического оружия (КЗХО) вступила в силу 29 апреля 1997. Согласно положениям КЗХО, страны, подписавшие данное соглашение, обязаны уничтожить все запасы химического оружия (ХО). Отравляющее вещество определяется как соединение, которое за счет химического воздействия на живой организм может привести к летальному исходу, вызвать временный выход из строя и/или причинить вред человеку или животным.

Список токсических веществ и их прекурсоров, для которых должны существовать надежные методики идентификации и обнаружения, указаны в Приложениях 1-3 КЗХО. Эти Приложения включают тысячи химических соединений, в частности, большую часть из них составляют органические вещества с различными физико-химическими свойствами: кислоты, основания, соединения с группами, содержащими гетероатомы фосфора, серы, фтора и/или хлора. В качестве объектов исследования выбраны четыре класса соединений, являющиеся основными продуктами трансформации нервно-паралитических ОВ (диалкилтаурины и О-алкилметилфосфоновые кислоты), иприта (продукты разложения под действием фермента (3-лиазы) и люизита (2-хлорвиниларсоновая и 2-хлорвиниларсонистая кислоты), обладающие свойствами полярных соединений и относящиеся к нелетучим веществам.

Использование методов хромато-масс-спектрометрии позволяет проводить надежное обнаружение и определение продуктов деструкции ОВ, однако методы ГХ-МС(-МС) не являются достаточно универсальными для обнаружения и определения основных классов продуктов трансформации ОВ, поскольку обладают существенными ограничениями по летучести и термостабильности определяемых веществ. При этом отдельные процедуры пробоподготовки весьма продолжительны (несколько часов), а ряд операций (смыв остатков аналита, дериватизация) приводят к появлению неконтролируемых погрешностей при количественном анализе. В связи с этим чрезвычайно перспективным представляется использование прямых (не требующих длительной и сложной пробоподготовки) методов анализа, среди которых наибольший интерес вызывает метод

высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС-МС). С развитием технологий появились новые возможности методов ВЭЖХ, в частности, в настоящее время быстро развивается вариант ульраВЭЖХ, работа при повышенном давлении в системе (более 500 bar), который позволяет существенно сократить время анализа и добиться высоких значений эффективности разделения, а совершенствование методов масс-спектрометрического детектирования позволяет проводить селективное обнаружение и определение следовых количеств веществ (на уровне пг/мл) с минимальными требованиями к процедуре очистки от мешающих определению примесей.

В записке технического секретариата Организации по Запрещению Химического Оружия (ОЗХО) (ЕС- 42/S/4) указывается, что в КЗХО предусматривается отбор и анализ биомедицинских проб, источником которых являются люди и животные (пробы крови, мочи, кала, тканей и т.д.), при проведении расследований предполагаемого применения химического оружия. Такой анализ имеет целью установить, действительно ли люди или животные, которые, как предполагается, подверглись воздействию боевых отравляющих веществ в ходе нападений с применением ХО, подверглись воздействию ОВ и, если подверглись, то какими были эти ОВ. В тех случаях, когда доступ к месту предполагаемого применения ХО задерживается или невозможен, анализ биомедицинских проб, взятых у .подвергшихся воздействию ОВ людей или животных, может оказаться единственным источником информации.

Цель работы состояла в разработке и оценке аналитических возможностей экспрессных высокочувствительных способов обнаружения и определения токсичных химикатов в объектах со сложной матрицей методами прямого (без использования реакций дериватизации) жидкостного хромато-масс-спектрометрического анализа, позволяющих надежно устанавливать факт применения отравляющих ве