Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии

Кочнова, Елизавета Александровна

Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Кочнова, Елизавета Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии»

Автореферат диссертации на тему "Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии"

На правах рукописи

Кочнова Елизавета Александровна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОФИЛЯ ЭНДОГЕННЫХ СТЕРОИДОВ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

02.00.02 - Аналитическая химия

005010662

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 ФЕВ Ш

Москва - 2012

005010662

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Антидопинговый центр».

Научный руководитель: кандидат химических наук,

Родченков Григорий Михайлович Федеральное государственное унитарное предприятие «Антидопинговый центр»

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

Бродский Ефим Соломонович Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

кандидат химических наук, Родин Игорь Александрович

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, кафедра аналитической химии

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное

предприятие "Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека" Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург

Защита состоится 22 февраля 2012 г. в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат дисертации размещен на сайте Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова: www.chem.msu.ru и на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

/¿/с/ Торочешникова И.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Употребление анаболических стероидов распространено в спорте, и по этой причине они внесены в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Тестостерон относится к наиболее часто выявляемым эндогенным анаболическим стероидам, но при установлении случаев его употребления возникает ряд проблем. Тестостерон вырабатывается в организме человека в больших количествах, а любые принятые эндогенные стероиды активно метаболизируют с образованием многочисленных продуктов. С точки зрения антидопингового контроля такие препараты являются сложно определяемыми, и большинство современных методов не способно достоверно выявить факт их употребления уже через 36 часов после приема. Исключение составляет метод газовой хрома-тографии-сжигания-изотопной масс-спектрометрии (ГХ/С/ИМС), но этот анализ не распространен из-за дороговизны и сложности пробоподготовки. Для выявления приема синтетических эндогенных стероидов предложено использовать определение стероидного профиля, то есть количественное определение совокупности концентраций и соотношений стероидов. Впервые использовать стероидный профиль для выявления применения тестостерона было предложено еще около 30 лет назад, однако проблема выявления приема запрещенных эндогенных стероидов не решена и в настоящее время. Для обнаружения применения различных эндогенных стероидов существует несколько критериев, установленных ВАДА, однако наибольшее диагностическое значение имеет только один - соотношение концентраций тесто-стерона/эпитестостерона (Т/Е). Однако одного данного соотношения недостаточно, поскольку применение запрещенных в спорте прогормонов может оказывать значительное влияние на спортивную форму, оставаясь при этом «незаметным» для лабораторий допинг-контроля. Данная ситуация показывает, что используемая методика определения приема стероидов тестостеронового ряда может быть улучшена за счет мониторинга ряда других перспективных соотношений.

С 2007 года ВАДА ввело понятие «атипического» результата, то есть сейчас любая аккредитованная лаборатория при обнаружении некоторых несоответствий пробы стандартным параметрам обязана сообщить об «атипическом» результате. В таком случае будут изучены и сравнены предыдущие и последующие пробы спортсмена. Чтобы упростить решение этой проблемы, ВАДА предложило составлять индивидуальный стероидный паспорт и собирать данные по концентрациям и соотношениям эндогенных стероидных гормонов для каждого спортсмена, что впоследствии позволит установить индивидуальные нормы, составляющие часть так называемого «Биологического паспорта спортсмена». «Биологический паспорт спортсмена» состоит из трех модулей. Первый - паспорт крови - существует с 2009 года, второй - стероидный - планируется создать в 2012 году, а эндокринный - к 2014 году.

В настоящее время существуют следующие критерии ВАДА: соотношение Т/Е >4, концентрации тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е) > 200 нг/мл, концентрации

андростерона (А) и этиохоланолона (Этио) > 10000 нг/мл и концентрация дегидро-эпиандростерона (ДГЭА) > 100 нг/мл. Проба, в которой наблюдается превышение одного или нескольких данных параметров считается атипической и подвергается дальнейшему анализу методом ГХ/С/ИМС.

Традиционно для определения эндогенных стероидов используется метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), позволяющий разделять большое количество исследуемых соединений за один анализ. Для успешного определения эндогенных стероидов методом ГХ-МС необходимо проведение предварительной дериватизации для перевода исследуемых соединений в соответствующие летучие производные. Данный подход позволяет определять большинство эндогенных стероидов на уровне 10 нг/мл в реальных образцах.

В настоящее время антидопинговые лаборатории определяют не более восьми эндогенных стероидов, причем данные по условиям их определения очень противоречивы - авторы предлагают различные условия для гидролиза, проводят построение градуировочных зависимостей с использованием разных матриц, а чаще всего даже не указывая их. При определении популяционных норм для концентраций эндогенных стероидов не всегда используется нормировка на плотность мочи, что приводит к повышенной вариативности полученных данных. В последнее время в литературе появились данные, что традиционно изучаемый стероидный профиль, состоящий из восьми стероидов и их соотношений, не чувствителен к приему новых прогормонов, поэтому необходимо определять дополнительные эндогенные стероиды, которые впоследствии могут стать новыми маркерами приема запрещенных препаратов.

Цели работы заключались в:

1. разработке способа выявления факта употребления эндогенных стероидов, основанного на определении в моче ряда эндогенных стероидов, а именно андрогенов, эстрогенов и прогестинов;

2. составлении индивидуального стероидного профиля, представляющего совокупность концентраций и соотношений исследуемых стероидов, изучении его стабильности во времени;

3. определении популяционных и индивидуальных границ для соотношений и концентраций эндогенных стероидов;

4. поиске новых наиболее значимых маркеров приема эндогенных стероидов.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• разработать способ анализа мочи на стероидный профиль, заключающийся в ферментативном гидролизе, жидкостно-жидкостной экстракции и дериватизации эндогенных стероидов с последующим определением этих веществ методом ГХ-МС;

• провести сравнение коэффициентов чувствительности градуировочных графиков, полученных при различных условиях, и выбрать оптимальные матрицы для построения градуировочных зависимостей всех исследуемых эндогенных стероидов;

• провести метрологическую аттестацию разработанного способа определения эндогенных стероидов;

• провести анализ образцов, получаемых от ВАДА в рамках межлабораторного сравнения результатов, и статистически сравнить полученные данные с другими лабораториями, аккредитованными ВАДА;

• провести анализ статистически значимого количества проб мочи российских спортсменов и получить значения концентраций и соотношений исследуемых стероидов для данной специфической популяции, а затем установить популя-ционные пределы для основных концентраций и соотношений эндогенных стероидов российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• разработать программный модуль, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать доверительные интервалы для каждого спортсмена с учетом его собственных параметров стероидного профиля, при содействии факультета Вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (ВМК МГУ);

• провести апробацию разработанной методики и программного модуля на реальных образцах мочи;

• найти новые значимые маркеры приема эндогенных стероидов с помощью программного пакета

• установить популяционные пределы для найденных новых маркеров приема эндогенных стероидов и внести данные параметры в разработанную методику.

Научная новизна. Разработана методика определения стероидного профиля мочи, состоящая из количественного определения 43 эндогенных стероидов. Получены масс-спектры электронной ионизации триметилсилильных производных всех исследуемых соединений, причем часть спектров получена впервые. В работе показаны преимущества и недостатки построения градуировочных графиков с использованием различных матриц мочи. Показано, что основным преимуществом использования в качестве матрицы мочи, из которой предварительно удалены неконъгированные стероиды, является повышение точности определения стероидного профиля.

На основе определения стероидного профиля более 5000 проб мочи спортсменов и описательной статистики установлен вид распределения концентраций и соотношений всех исследуемых стероидов. Показано, что вид популяционного распределения соотношения Т/Е сильно отличается в зависимости от пола.

На основании проведенных систематических исследований установлены популяционные пределы для определяемых параметров стероидного профиля. Показано,

что популяционные пределы для российских спортсменов заметно различаются в зависимости от пола, вследствие чего данный фактор предложено использовать при анализе. Выявлены аналитические перспективы использования данного подхода для повышения чувствительности определения стероидного профиля.

Разработан программный модуль Вауе$1ап Вютагкеге, позволяющий вычислять индивидуальные пределы для разнообразных параметров стероидного профиля, используя теорему Байеса. Использование индивидуальных границ для концентраций или соотношений эндогенных стероидов вместо популяционных при определении приема запрещенных препаратов позволяет увеличить время их детектирования в целом в 2 раза.

Применение одного из подходов хемометрики, реализованного в программе 81аЙБЙса в сочетании с разработанной программой Вауез1ап Вютагкеге, позволило найти новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов. Использование данного подхода позволило увеличить время детектирования приема запрещенных препаратов в среднем в 3 раза, а в некоторых случаях в 5 раз по сравнению с использованием традиционных маркеров, предложенных ВАДА.

Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решить проблему определения эндогенных стероидов в моче человека. Изученные матрицы для построения градуировочных зависимостей позволяют выбрать наиболее подходящие условия для проведения градуировки, обеспечивающие наибольшую точность при проведении количественного определения эндогенных стероидов.

Разработанный программный модуль позволяет составлять индивидуальный гормональный паспорт с учетом собственного метаболизма и особенностей стероидного профиля.

Предложенная методика определения стероидного профиля мочи человека в течение более чем трех лет используется в Федеральном государственном унитарном предприятии «Антидопинговый центр» (ФГУП АДЦ). За это время проанализировано более 5000 проб спортсменов.

Также разработанная методика используется при анализе проб добровольцев, участвующих в проекте «Марс 500» во время 105-ти и 520-ти суточной изоляции. Показана зависимость экскреции половых стероидных гормонов от солевой диеты, стресса и других факторов внешнего воздействия.

На защиту выносятся:

• сравнение матриц для построения градуировочных зависимостей и выбор оптимальной;

• метрологически аттестованный способ определения стероидного профиля мочи и внесение методики определения эндогенных стероидов в область аккредитации ФГУП АДЦ;

• установленные референсные пределы для российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• программный модуль Bayesian Biomarkers, позволяющий вычислять индивидуальные границы для параметров стероидного профиля в зависимости от пола, возраста, вида спорта и других параметров;

• методология выявления приема эндогенных стероидов с использованием установленных референсных пределов, а также разработанного программного модуля, и соответствующие им времена определения приема допинговых препаратов;

• новые маркеры приема запрещенных эндогенных стероидов и соответствующие им сроки определения приема допинговых препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 28-ой рабочей встрече по проблемам антидопингового контроля (7-12 марта 2010 г., Кёльн, Германия), на московском семинаре по аналитической химии (28 октября 2009 г. Москва, Россия), на III Всероссийской конференции «Аналитика России» (27 сентября - 3 октября 2009 г., Краснодар, Россия) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (14 - 18 апреля, 2008 г., Клязьма, Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов. Подана заявка №2011109874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы.

Материал диссертации изложен на 169 страницах, содержит 41 таблицу и 83 рисунка. Список литературных источников состоит из 111 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исходные вещества, аппаратура и техника эксперимента

Работу проводили на газовом хроматографе фирмы Agilent модели 6890N с масс-спектрометром модели 5973inert и автосамплером модели ALS 7683. Для оптимального разделения эндогенных стероидов была выбрана колонка Restek Rxi -lms, 12 м длина, 0.20 мм внутренний диаметр, 0.33 мкм толщина неподвижной фазы. Исходя из летучести триметилсилильных производных стероидов и температур кипения используемых реагентов нами выбрана следующая температурная программа: начальная температура 188°С, подъем со скоростью 2°С/мин до 232°С, подъем со скоростью 12°С/мин до 300°С, изотерма 5.33 мин. Выбор данной температурной программы с низкой скоростью подъема в начальной стадии обусловлен большим количеством эндогенных стероидов, имеющих аналогичные масс-спектры и примерно одинаковые хроматографические свойства. Объем вводимой пробы 2 мкл в режиме деления потока (1:10), температура инжектора - 280°С. Газ-носитель -гелий (0.6 мл/мин). Температура источника ионов - 230°С, температура переходной линии - 290°С, квадруполя - 150°С, скорость сканирования - 1.69 циклов в секунду,

диапазон масс в режиме полного сканирования - 50-600 а.е.м. В качестве исследуемых соединений выбрали 43 эндогенных стероида.

Разработка способа определения эндогенных стероидов в моче Определение времен удерживания и характеристичных ионов. Для определения относительных времен удерживания использовали времена удерживания определяемых веществ и внутреннего стандарта. Для определения времен удерживания каждого соединения, а также для выбора характеристичных ионов анализировали триметилсилильное (ТМС) производное каждого стандартного образца в режиме полного сканирования. Получены масс-спектры электронной ионизации для каждого соединения и выбраны характеристичные ионы для последующего анализа в режиме селективной регистрации ионов. Времена удерживания определяемых соединений и характеристичные ионы приведены в табл. 1.

Таблица 1. Времена удерживания и характеристичные ионы (m/z), RRT - относительное время удерживания, ММ - молекулярная масса

Соединение (в виде ТМС-производного) RT, мин ММ RRT m/z

метилтестостерои (ВС) 22.12 446 1.000 301 446

5а-андрост-16-ен-За-ол 7.61 346 0.344 241 256

За,5-цикло-5а-андростан-бр-ол-17-он 1 10.38 432 0.469 432 417

5Р-андростан-За,17а-диол 12.78 436 0.578 256 241

4-андростен-За, 17а-диол 13.02 434 0.589 434 405

5 р-авдростан-зр, 17а-диол 13.36 436 0.604 129 256

5 а-андростан-3 а,17а-дио л 13.52 436 0.611 331 346

5р-андростан-3,17-дион 13.51 432 0.611 275 290

андростерон (А) 15.53 434 0.702 434 419

этиохоланолон (Этио) 15.74 434 0.712 434 419

5а-андростан-3 а, 17р-диол (5a3al7ß) 16.01 436 0.724 241 256

5р-андростан-За,17Р-диол (5ß3al7ß) 16.18 436 0.732 241 256

5-андростсн-Зр,17а-диол 16.78 434 0.758 239 344

5а-андростан-3 Р ,17а-диол 16.85 436 0.762 241 421

дегидроэпиандростерон (ДГЭА) 17.44 432 0.788 432 417

11 -оксо-этиохоланолон 17.52 520 0.792 505 415

эпиандростерон 17.61 434 0.796 419 434

5а-андростан-3,17-дион 17.98 432 0.813 275 432

5-андростен-Зр, 17р-диол 17.99 434 0.814 239 344

5а-андростан-3 р, 17Р-диол 18.17 436 0.821 421 436

эпитестостерон (Е) 18.23 432 0.824 432 2

7а-ОН-дегидроэпиандростерон 18.45 520 0.869 415 430

эстрон 18.50 414 0.836 414 399

дигидротестостерон (ДГТ) 18.81 434 0.850 434 405

андростендион 18.92 430 0.855 430 415

эстрадиол 19.11 416 0.864 416 285

1 Метаболит ДГЭА

2 - вещества, для определения которых достаточно одного селективного иона

Соединение (в виде ТМС-прошводиого) ИТ, мин ММ т/г

метнлтестостерон (ВС) 22.12 446 1.000 301 446

тестостерон (Т) 19.49 432 0.881 432 -

бр-ОН-андростерон 19.58 522 0.88 522 507

бр-ОН-этиохоланолон 19.81 522 0.89 522 507

11р-ОН-андростерон (ИрОНА) 20.03 522 0.905 522 168

11р-ОН-этиохоланолон (ИрОНЕ) 20.17 522 0.912 522 168

4р-ОН-дегидроэпиандростерон 21.82 520 0.986 520 415

7р-ОН-дегидроэпиандростерон 21.94 520 0.985 415 520

1 ба-ОН-андростерон 22.38 522 1.007 507 522

прегнандиол 22.69 464 1.026 117 269

7-оксо-дегидроэпиандростерон 23.15 518 1.039 518 503

прегнантриол 23.33 552 1.055 255 435

бр-ОН-тестостерон 23.72 520 1.072 520 505

4-андростен-6а-ол-3,17-дион 23.82 518 1.070 518 -

1 бр-ОН-дегидроэпиандростерон 24.27 520 1.090 505 520

эстриол 24.56 504 1.110 504 345

тетрагидрокортизол 26.65 634 1.205 562 -

тетрагидрокортизон 26.86 636 1.215 636 -

холестерин 26.84 458 1.214 329 368

При выборе характеристичных ионов для каждого соединения руководствовались следующими принципами: 1 - наибольшая интенсивность, 2 - селективность. Количественное определение стероидов основывается на соотношении площадей выбранного целевого иона и внутреннего стандарта, в то время как второй ион используется для подтверждения или идентификации соединения. После определения времени удерживания и выбора характеристичных ионов установлено, что для некоторых соединений достаточно одного иона для качественного и количественного определения. О присутствии вещества в пробе судят по наличию пиков всех выбранных ионов в установленное время выхода, причем соотношения интенсивно-стей ионов должны совпадать со значениями масс-спектра, приведенного в библиотеке, либо полученного для стандартного вещества.

Построение градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов. При построении градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов наибольшей сложностью является выбор подходящей матрицы. В настоящее время не существует коммерчески доступной сертифицированной мочи с точно известными концентрациями эндогенных стероидов, в связи с этим значительное влияние на полученные значения концентрации оказывает матрица, выбранная для проведения градуировки. Нами исследованы следующие матрицы: контрольная моча (метод добавок), «свободная моча» -моча из которой предварительно удалены неконъюгированные стероиды, моча после тведофазной экстракции (ТФЭ), детская моча, вода и метанольные растворы стандартов. Строили градуировочный график, по оси у откладывая отношения пло-

щади пика исследуемого соединения к площади пика внутреннего стандарта, а по оси х отношения концентраций исследуемого соединения к внутреннему стандарту. Полученный таким образом тангенс угла наклона кривой является коэффициентом чувствительности для определенного вещества. Эксперимент по выбору матрицы для построения градуировочных зависимостей проводили без гидролиза, чтобы стероиды, содержащиеся в виде конъюгатов в «свободной моче» не повлияли на результат эксперимента. Поскольку эндогенные стероиды присутствуют в заметном количестве даже в свободной фракции мочи, статистически оценивали только коэффициенты чувствительности, полученные для каждого соединения в каждой матрице, пренебрегая свободным членом. Для сравнения использовали значения, полученные с использованием контрольной мочи по методу добавок. Для построения градуировочных зависимостей брали по 3 аликвоты 5-ти точек разного уровня концентраций. Данный эксперимент повторяли 3 раза. Полученные коэффициенты чувствительности для основных эндогенных стероидов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Коэффициенты чувствительности для основных эндогенных стероидов. 1 - контрольная моча, 2 - «свободная моча», 3 - моча после ТФЭ, 4 - детская

№ Соединение 1 2 3 4 5 6

1 Т 2.39±0.03 2.41±0.03 2.38±0.04 2.42±0.07 2.13±0.06 2.06±0.07

2 Е 2.19±0.03 2.33±0.04 2.23±0.03 2.27±0.04 2.03±0.07 1.86±0.06

3 5аЗа17р 0.35±0.04 0.38±0.05 0.36±0.05 0.37±0.05 0.26±0.08 0.3Н0.07

4 5р3а17р 0.24±0.04 0.26±0.04 0.24±0.05 0.25±0.06 0.19±0.07 0.21±0.08

5 11РОНА 0.42±0.02 0.42±0.02 0.42±0.02 0.39±0.03 0.40±0.03 0.40±0.04

6 ИРОНЕ 0.47±0.03 0.46±0.02 0.46±0.03 0.44±0.03 0.44±0.04 0.43±0.03

7 ДГЭА 0.97±0.04 1.03±0.05 0.99±0.05 0.99±0.07 1.03±0.08 0.77±0.07

8 ДГГ 0.54±0.03 0.54±0.03 0.50±0.05 0.54±0.04 0.45±0.05 0.50±0.07

9 А 0.84±0.04 0.83±0.03 0.89±0.04 0.94±0.04 0.91±0.05 0.82±0.05

10 Этио 0.82±0.03 0.86±0.03 0.89±0.03 0.87±0.04 0.87±0.06 0.83±0.05

Как видно из табл. 2, коэффициенты чувствительности большинства соединений для матриц 2, 3 и 4 довольно близки к коэффициентам в контрольной моче, тогда как матрицы 5 и 6 (вода и метанольные растворы стандартов) являются неудовлетворительными, поскольку значимо отличаются от контрольной мочи для основной группы стероидов.

Различия между тремя матрицами, такими как «свободная» моча, «ТФЭ» моча и детская моча оказались не столь значительными, что говорит об их возможном использовании. В результате для проведения дальнейших экспериментов была выбрана матрица «свободная моча» из-за простоты и дешевизны пробоподготовки, а также из-за минимального суммарного отклонения коэффициентов чувствительности. С использованием данной матрицы получены уравнения градуировочной зависимости для всех исследуемых соединений. Вид полученных градуировочных зависимости для всех исследуемых соединений, диапазон определяемых концентраций, а также коэффициенты корреляции приведены в табл. 3.

Эффективность гидролиза и степень извлечения

Использование для гидролиза p-глюкуронидазы E.coli позволяет определять стероиды в свободной и глюкуронидной фракциях. Хотя сульфатную фракцию можно проанализировать после гидролиза смесью ферментов из Helix Pomatia, данная смесь приводит к многочисленным побочным эффектам. В связи с этим лаборатории антидопингового контроля не используют данный фермент для анализа стероидов. По этой же причине в официальном техническом документе ВАДА предписывается использовать для гидролиза p-глюкуронидазу E.coli с целью расщепления только глюкуронидов стероидов.

Для проверки эффективности гидролиза к различным образцам мочи добавляли 04-андростерона глюкуронид и DS-этиохоланолон в соотношении 1:1 (в пересчете на свободный андростерон). После проведения гидролиза в течение 1.5 часов при 57°С рассчитывали степень гидролиза (СГ) по следующей формуле:

СГ=Сю.а/СШ-е-100%, где Cd4-a _ концентрация Б4-андростерона, a CD5-e - концентрация D5-этиохоланолона.

Полученные таким образом значения для различной мочи не показали значительных отклонений от 100%, что свидетельствует о полном гидролизе.

Для установления степени извлечения к 6-ти различным образцам «свободной мочи», добавляли исследуемые соединения на уровне 50 нг/мл, после чего проводили экстракцию, как описано выше. Одновременно те же 6 образцов были проэкстра-гированы и в органический слой были добавлены калибраторы в тех же концентрациях - полученные таким способом значения были приняты за 100% экстракции. Степень экстракции для каждого соединения рассчитывали как отношение концентраций, полученных в первом эксперименте, к концентрациям со 100% степенью экстракции. Процедура экстракции выполняется с помощью диэтилового эфира, который является более эффективным, чем менее полярные растворители, например н-пентан. Степень извлечения для каждого исследуемого соединения приведена в табл. 3. Как и ожидалось, наиболее полярные соединения, содержащие в своей структуре большее число атомов кислорода, извлекаются диэтиловым эфиром хуже, чем менее полярные соединения.

Таблица 3. Диапазон определяемых концентраций, вид градуировочных кривых, коэффициенты корреляции (R2) и степень экстракции всех определяемых соединений, где К — квадратичная зависимость, JI — линейная зависимость

№ Соединение Диапазон, нг/мл Вид кривой R2 Степень извлечения

1 тестостерон 5-500 К 0.999 92 ±4

2 эпитестостерон 5-500 К 0.999 89 ±6

3 5а-андростан-За, 17Р-диол 5-500 Л 0.998 90 ± 14

4 5 [5-андростан-З а, 17р-дио л 5-500 Л 0.998 97 ± 12

5 11 (5-ОН-андростерон 5-500 к 0.998 72 ±4

№ Соединение Диапазон, нг/мл Вид кривой Степень извлечения

6 11 Р-ОН-этиохоланолон 5-500 К 0.998 80 ±5

7 дегидроэпиандростерон 5-500 К 0.999 85 ±8

8 дигидротестостерон 5-500 К 0.996 89 ±8

9 андростерон 100-10 000 К 0.998 97 ±5

10 этиохоланолон 100-10 000 К 0.998 95 ±7

11 прегнандиол 100-10 000 Л 0.999 80 ±20

12 прегнантриол 100-10 000 к 0.997 90 ± 11

13 холестерин 100-10 000 л 0.998 91 ±9

14 5а-андростан-3,17-дион 5-500 л 0.998 90 ± 14

15 5р-андростан-3,17-дион 5-500 л 0.996 84 ± 10

16 андростендион 5-500 л 0.999 82 ±8

17 11 -оксо-этиохоланолон 5-500 л 0.999 80 ± 11

18 бр-ОН-тестостерон 5-500 л 0.999 87 ±9

19 эпиандростерон 5-500 л 0.998 70 ± 12

20 эстрадиол 5-500 л 0.999 70 ± 14

21 эстриол 5-500 л 0.998 70 ± 13

22 эстрон 5-500 л 0.998 74 ± 12

23 За,5-цикло-5а-андростан-6р-ол-17-он 5-500 к 0.995 87 ±5

24 5а-андрост-16-ен-За-ол 5-500 л 0.999 90 ±25

25 тетрагидрокортизол 100-10 000 л 0.995 84 ±5

26 тетрагидрокортизон 100- 10 000 л 0.994 90 ± 17

27 5-андростен-Зр, 17Р-диол 5-500 л 0.999 75 ± 11

28 4-андростен-6а-ол-3,17-дион 5-500 к 0.996 75 ± 12

29 5а-андростан-Зр, 17р-диол 5-500 л 0.999 75 ±15

30 5р-андростан-За, 17а-диол 5-500 л 0.998 70 ±12

31 5р-андростан-ЗР, 17а-диол 5-500 л 0.999 60 ±13

32 4-андростен-За, 17а-диол 5-500 л 0.999 70 ±14

33 5а-андростан-За, 17а-диол 5-500 л 0.999 85 ±9

34 5-андростен-Зр, 17а-диол 5-500 л 0.999 70 ±13

35 5а-андростан-3 Р, 17а-диол 5-500 л 0.999 85 ±9

36 1 ба-ОН-андростерон 5-500 к 0.996 76 ±11

37 16Р-ОН- дегидроэпиандростерон 5-500 к 0.994 91 ±3

38 4р-ОН-дегидроэпиандростерон 5-500 к 0.995 90 ±5

39 7а-ОН-дегидроэпиандростерон 5-500 к 0.998 85 ±4

40 7-оксо-дегидроэпиандростерон 5-500 к 0.993 85 ±6

41 7р-ОН-дегидроэпиандростерон 5-500 к 0.994 83 ±7

42 бр-ОН-андростерон 5-500 к 0.994 83 ±8

43 бр-ОН-этиохоланолон 5-500 к 0.993 80 ±11

В связи с тем, что в моче одни и те же стероиды выводятся в концентрациях, которые могут различаться в 100 и более раз, возникает необходимость одновременно определять как высокие, так и низкие концентрации. При этом использование кривой первого порядка в качестве градуировочного графика приводит к увеличе-

нию ошибки в области высоких концентраций при повышении точности в области низких концентраций и наоборот. По всей видимости, это связано с тем, что построенные прямые, несмотря на достаточно высокий коэффициент корреляции, представляют собой не идеальную прямую. В связи с этим для повышения точности анализа на всем диапазоне определяемых концентраций для некоторых соединений были выбраны градуировочные кривые второй степени, что заметно повысило точность определения для всех уровней концентрации.

Метрологическая аттестация разработанного способа анализа. Правильность (п=18) была определена как процентная разница между средним и теоретическим значением (метод «введено - найдено»). Повторяемость (п=6 в течение одного дня) и воспроизводимость (п=18 в течение нескольких дней и разными лаборантами) рассчитывали как относительное стандартное отклонение, выраженное в процентах. Каждая градуировочная кривая построена на 5 уровнях концентрации. Данные уровни концентрации различаются в зависимости от соединения. Для всех стероидов градуировочные кривые имеют коэффициент корреляции не хуже 0.99.

Заключение об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных ВАДА. Межлабораторная сходимость результатов. Исследование, направленное на межлабораторное сравнение данных по стероидному профилю, проводили следующим образом: 10 образцов мочи были направлены для анализа стероидного профиля в различные лаборатории, аккредитованные ВАДА. Для анализа в ФГУП АДЦ использовали методику количественного определения эндогенных стероидов, описанную в настоящей работе. Данные, полученные из различных лабораторий, сравнивали между собой статистически, и было показано, что результаты, полученные в ФГУП АДЦ, согласуются с данными из других европейских лабораторий. Таким образом, данная методика полностью соответствует критериям ВАДА и может быть использована для анализа стероидного профиля мочи.

Статистический анализ полученных данных Разработанную методику в течение более трех лет использовали в работе по Государственным контрактам № 08ЮД-109 от 19.09.2008, № 09ЮД-10 от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время в рамках исполнения контрактов проанализированы 5796 проб российских спортсменов. Полученные в ходе анализа значения концентраций и соотношений эндогенных стероидов статистически обработаны в программах 81а113Йса 6 и МаНаЬ 7.1. При обработке использовали значения концентраций, скорректированные на плотность по следующей формуле:

Сзокор = С X (1.02 - 1.0)/(8Собразца - 1 -0), где Сб&юр - концентрация, скорректированная на плотность мочи, С - концентрация соединения в моче без учета плотности, 8Со5разца - плотность исследуемого образца мочи.

Статистический анализ концентраций эндогенных стероидов. На основании данных по концентрациям эндогенных стероидов, полученных за несколько лет

в ФГУП АДЦ, определены популяцнонные нормы для всех анализируемых соединений. Показано, что динамика и количество выводимых с мочой стероидных гормонов сильно различается в зависимости от пола, и по этой причине полученные данные отдельно обработаны для мужчин и женщин. Для каждого соединения определены среднее, медиана, а также верхний референсный предел, соответствующий 95% значений. Для всех определяемых эндогенных стероидов получены гистограммы распределения, после анализа которых установлено, что популяцнонные распределения большинства из исследуемых соединений имеют логнормальный вид. Исключение составляют несколько стероидов, например, тестостерон.

Таблица 4. Концентрации основных эндогенных стероидов. Описательная статистика для мужской (п=2831) и женской популяций (п=2351)

Вещество Мужчины, нг/мл Женщины, нг/мл

Среднее Медиана 95% предел Среднее Медиана 95% предел

За,5-цикло-5а-андростан-бр-ол-17-он 13.2 6.2 65.7 10.4 4.2 54.6

андростерон 3985 3264 11429 3389 2598 11430

этиохоланолон 3091 2505 8509 3581 3008 10322

5а-андростан-За, 17р-диол 60 53 154 26 21 77

5(3-андр0стан-3а, 17р-диол 160 127 492 100 69 366

дегидроэпиандростерон 26.4 20.9 80.7 31.7 24.0 100.6

эпитестостерон 37 30 102 15 11 54

дигидротестостерон 19.7 14.8 63.4 19.0 14.2 66.7

тестостерон 52 45 141 16 11 66

11р-ОН-андростерон 830 712 2080 733 583 2361

11 Р-ОН-этиохоланолон 279 246 684 325 316 763

На рис. 1 приведены графики популяционного распределения концентрации тестостерона. Как видно, это распределение сильно зависит от пола: для мужчин оно имеет вид бимодального логнормального распределения, в то время как для женской популяции у данного распределения имеется только один максимум. Вид полученной зависимости концентрации тестостерона полностью согласуется с литературными данными, однако значения референсных пределов концентраций заметно отличаются от указанных в литературе, что полностью подтверждает необходимость устанавливать референсный предел для каждой конкретной популяции, в нашем случае для российских спортсменов.

Из представленных данных видно, что использование популяционных границ без учета пола может привести к возникновению как ложноотрицательных, так и в некоторых случаях ложноположительных результатов. Особенно необходимо отметить, что популяцнонные пределы, установленные для европейской, азиатской или других популяций, не являются взаимозаменяемыми. В свою очередь, использование усредненных значений может привести к понижению диагностической чувствительности анализа стероидного профиля в связи с тем, что прием большинства эндогенных стероидов все еще остается не детектируемым.

Рис. 1. Распределение плотности вероятности для концентрации тестостерона мужской (М) и женской (Ж) популяций. Пунктирной линией обозначены референс-ные пределы для 95% популяции.

По итогам выполненной работы впервые получены референсные пределы для популяции российских спортсменов, причем вид полученных данных согласуется с литературными данными, а значения концентраций, установленные для мужской и женской популяции российских спортсменов, заметно отличаются от референсных пределов, установленных ВАДА. Проведенное исследование показывает необходимость тщательного изучения стероидного профиля спортсменов, а также выявление более чувствительных к приему эндогенных препаратов референсных пределов.

Статистический анализ данных соотношений эндогенных стероидов. Соотношения, традиционно используемые в стероидном профиле, проанализированы для мужской и женской популяций. Первоначально методами описательной статистки получены основные показатели для исследуемых соотношений. Для каждого соотношения установлены среднее, медиана и референсный предел. Полученные данные приведены в табл. 5.

Таблица 5. Соотношения эндогенных стероидов. Описательная статистика для мужской (п=2831) и женской популяций (п=2351)

Соотношение Мужчины Женщины

Среднее Медиана 95% предел Среднее Медиана 95% предел

Т/Е 1.7 1.4 6.3 1.1 0.9 2.7

АУЭтио 1.4 1.2 3.0 1.0 0.9 2.0

5оиЗа17р/5рЗ«17р 0.6 0.4 1.8 0.5 0.3 1.8

5аЗа17р/Е 2.6 1.8 8.8 3.5 2.2 15.7

А/Т 171 84 838 454 275 2154

ДГТ/Е 0.9 0.5 4.1 1.8 1.3 6.7

11 рОНА/11РОНЕ 3.9 2.8 13.6 2.9 2.1 10.5

5аэпи3а17р/5рэпи-3а17р 0.4 0.3 1.4 0.4 0.3 1.3

(А/Этио)/( 11 рОНА/ ПрОНЕ) 0.5 0.4 1.6 0.5 0.4 1.5

Для всех исследуемых соотношений получены гистограммы распределения и статистически установлено, что распределения всех исследуемых соотношений

имеют логнормальный вид, причем соотношение Т/Е имеет бимодальное логнор-мальное распределение как для мужской, так и для женской популяции, однако первый максимум для женской популяции не так явно выражен (см. рис. 2).

Рис. 2. Распределение плотности вероятности для соотношения Т/Е для мужской (М) и женской (Ж) популяций. Пунктирной линией обозначены референсные пределы для 95% популяции.

Из рис. 2 видно, что понижение верхней границы допустимого значения соотношения Т/Е для женской популяции с 4 до 2.7 может увеличить диагностическую чувствительность разработанной методики к приему тестостерона. В свою очередь, для мужской популяции целесообразнее увеличить верхнюю границу допустимого значения Т/Е до 6.3, что значительно уменьшит количество ложноположительных проб.

Переход от популяционных границ к индивидуальным. В антидопинговом контроле предложено использовать теорему Байеса, которая позволяет объединять популяционные и индивидуальные пределы. Основная идея данной теоремы заключается в том, что если имеется только одна проба спортсмена, то доверительный интервал для любого параметра стероидного профиля, например, соотношения Т/Е, полученного для этой пробы, будет рассчитываться исходя из популяционных данных, однако при добавлении в анализ последующих проб в качестве референсных пределов будут рассматриваться пределы, полученные на предыдущем этапе. Таким образом, при увеличении числа измерений полученные границы будут все более достоверно отображать индивидуальный референсный интервал. Для проведения статистического анализа получаемых данных реализован проект «Биологический паспорт спортсмена», в котором анализируют пробы, полученные от одного и того же человека в разное время, после чего устанавливают индивидуальные пределы для исследуемых параметров. Частью этого проекта является разработанная методика определения стероидного профиля спортсмена. Данный подход обеспечивает высокую чувствительность индивидуальных границ к изменениям параметров стероидного профиля, вызванных приемом запрещенных препаратов.

В рамках данного проекта нами совместно с факультетом вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М.В.

О.й

я;

Ломоносова разработан программный модуль Вауе81ап Вютагкеге, позволяющий не только формировать популяции с учетом пола, возраста, вида спорта и других интересующих параметров, но и определять индивидуальные референсные интервалы для интересующих концентраций и соотношений.

Определение приема запрещенных препаратов. Определение индивидуальных и популяционных референсных пределов может свести к минимуму количество ложноположительных тестов и уменьшить таким образом время и финансовые затраты на проведение полного анализа на допинг. Чувствительность таких пределов по отношению к реальным образцам, полученным после приема запрещенных препаратов, является основным параметром при выборе действительно значимых референсных пределов. Для проверки чувствительности установленных пределов проанализировали ряд проб, полученных после приема эндогенных стероидов. Первоначально у каждого добровольца собрали пробы до приема препаратов тестостерона и ДГЭА. Пробы анализировали по разработанной методике определения стероидного профиля. В эксперименте участвовали доброволец с европейским типом метаболизма (доброволец 1), с повышенным значением Т/Е (доброволец 2) и с азиатским типом метаболизма (доброволец 3), собственное значение Т/Е у которого составляет 0.1, см. рис. 3.

о8_______ _ _____ __ Рис- 3. Популяционное распреде-

ление соотношения Т/Е для муж-

0.7

1 чин, с указанием номеров добро-

о.б Ч 1 у 6.3 М

° 1 ^ 1 вольцев.

0 1 2 3 4 5 6 7

Т/Е

Для исследования выбраны индивидуумы с принципиальными различиями в типе метаболизма, чтобы иметь наиболее полную картину характерных метаболитов, выводящихся из организма с мочой после приема различных эндогенных стероидов. Для всех соотношений и концентраций эндогенных стероидов нами вычислены нормы для каждого из добровольцев. Вычисления проводили для 5 заведомо отрицательных проб мочи. Все пробы, собранные после приема тестостерона, проанализировали с помощью разработанной программы Вауез1ап Вютагкеге. Данная программа позволяет получить сначала нормальный диапазон собственных значений для каждого параметра, а затем вычисляет вероятность попадания каждой последующей точки в данный диапазон.

3 1 2 6.3 м 1 Г 1 1

\ \ !' Г-. " ■• к Мк 1 } ! { 1 I I 3

Анализ проб после приема тестостерона. Пробы, собранные после приема тестостерона, проанализировали по разработанной методике определения стероидного профиля мочи. Все полученные данные по концентрациям и соотношениям стероидов первоначально сравнивали с пределами, установленными ВАДА, затем с рефе-ренсными пределами, установленными в данной работе и затем с индивидуальными пределами, вычисленными в программе Вауеэ^ап Вютагкеге.

При использовании критериев, установленных ВАДА, время определения приема тестостерона (10.5 ч) у первого добровольца оказывается меньше, чем при использовании популяционных пределов (17 ч), установленных в данной работе, а индивидуальные границы, полученные в программе Вауез1ап Вютагкеге позволяют определить прием тестостерона 1-ым добровольцем до 17-ти часов по шести различным параметрам. В качестве примера на рис. 4 приведена зависимость для соотношения ТУЕ.

Т/Е 18 1б 14 12 10 \ _и 71 '1

\ —ш-я-—-—§ ,

-110 -60 -10 40 90 140 —»—нижняя граница -»-значение / и —*—верхняя граница -критерий Е\ДА

Рис. 4. Зависимость значения соотношения Т/Е от времени после приема тестостерона первым добровольцем с указанием индивидуальных норм и критерия ВА-ДА.

Для второго добровольца, собственное значение соотношения Т/Е для которого в среднем 3.7, значительная часть проб даже до приема тестостерона оказывается положительной по критерию ВАДА. Однако, если использовать референсные пределы, установленные в данной работе, то собственное повышенное значение соотношения Т/Е уже не считается положительным, и появляется возможность детектирования приема тестостерона в течение 12 часов. С использованием индивидуальных границ, время определения приема тестостерона увеличивается до 22.5 ч.

В случае с третьим добровольцем критерии ВАДА не позволяют в принципе определить прием тестостерона. Это связано с тем, что у людей с азиатским типом метаболизма тестостерон выводится в мочу в настолько низких концентрациях, что

даже прием заметных его количеств не вызывает значимого увеличения концентрации тестостерона, определяемой по моче. При этом метаболизм в данном случае протекает не по стандартной схеме, и в результате приема тестостерона могут образовываться метаболиты, которые не определяются в традиционном стероидном профиле. В связи с этим проведено определение приема тестостерона с использованием популяционных и индивидуальных пределов, для соотношений и концентраций, для которых не существует критериев ВАДА. Наше исследование показало, что наиболее значимыми являются соотношения андростерон/этиохоланолон и 5а-андростан-За,17(3-диол/эпитестостерон, которые позволяют определять прием тестостерона течение 11.5 ч.

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование критериев, установленных ВАДА, в большинстве случаев не позволяет определять прием тестостерона уже после 12 часов, а в некоторых случаях, для людей с азиатским типом метаболизма, прием тестостерона остается полностью не детектируемым. Для второго добровольца (с собственным повышенным значением Т/Е), напротив, значительная часть проб до приема препарата тестостерона превысила установленные ВАДА критерии. При действующем в настоящее время протоколе такие пробы необходимо анализировать методом ГХ/С/ИМС, чтобы установить происхождение тестостерона.

Использование популяционных пределов, установленных в данной работе, позволяет не только определить факт приема тестостерона третьим добровольцем в течение 10 ч, но и заметно уменьшить число проб второго добровольца, требующих последующего анализа методом ГХ/С/ИМС. При этом заметного выигрыша во времени определения приема тестостерона первым добровольцем получено не было.

Использование же разработанного программного модуля позволило увеличить время определения приема тестостерона первым добровольцем до 17 ч, для второго добровольца, с собственным повышенным уровнем Т/Е, до 22 ч, и для третьего, имеющего азиатский тип метаболизма - до 11.5 ч. Таким образом, данный подход позволяет значительно увеличить время детектирования после приема тестостерона и достоверно определить факт приема запрещенного препарата. При этом данная программа учитывает индивидуальные особенности метаболизма человека, что позволяет сделать анализ стероидного профиля более надежным.

Анализ проб после приема дегндроэпиандростерона. Пробы, собранные после приема ДГЭА, проанализировали по разработанной методике определения стероидного профиля мочи. Все полученные данные по концентрациям и соотношениям стероидов первоначально сравнивали с пределами, установленными ВАДА, затем с пределами, установленными в данной работе, а затем с индивидуальными пределами, вычисленными в программе Bayesian Biomerkers.

Для первого добровольца значимыми оказались превышения только индивидуальных границ, вычисленных в программе Bayesian Biomarkers, в то время как ни один из определяемых параметров стероидного профиля не превысил ни критерии

ВАДА, ни популяционные границы. Индивидуальные нормы позволили в течение 147 ч определять факт приема ДГЭА.

У второго добровольца наиболее значимым оказалось превышение границ для соотношения А/Т, при этом наблюдался проигрыш во времени детектирования индивидуальных границ популяционным. Данная особенность легко объясняется тем, что у людей с высоким соотношением Т/Е концентрации основных стероидов повышены, поэтому небольшое влияние на эти концентрации извне может привести к значительному увеличению исходных значений и значительному превышению по-пуляционных границ, вычисленных на основании средних данных. Низкая чувствительность индивидуальных границ объясняется высокой флуктуацией собственных значений концентраций и соотношений стероидов в заведомо отрицательных пробах, вследствие чего индивидуальные границы оказываются не столь чувствительны, как популяционные.

У третьего добровольца одинаково значимым для всех трех критериев является концентрация самого ДГЭА, выходящая за допустимые пределы только в течение первых 4-х часов, при этом ни один другой параметр стероидного профиля не выходит не только за популяционные, но и за индивидуальные границы. Определение приема ДГЭА третьим добровольцем представляет наиболее проблемный случай.

Определение приема ДГЭА в настоящее время является довольно сложной задачей для антидопингового контроля, поскольку критерии, установленные ВАДА, недостаточно чувствительны и позволяют выявить факт употребления ДГЭА не более 36 часов после приема. При этом как выбор самих маркеров (соотношений и концентраций), так и референсных пределов играет важную роль при антидопинговом контроле. Необходимо учитывать, что пределы, установленные по популяциям, нечувствительны к собственным изменениям параметров стероидного профиля, что, в свою очередь, может привести к многочисленным ложноотрицательным результатам.

Переход от популяционных к индивидуальным доверительным интервалам гораздо более значим для выявления приема запрещенных эндогенных стероидов. Однако существующий на сегодняшний день традиционный стероидный профиль охватывает небольшое количество эндогенных стероидов и их соотношений, при этом лишь некоторые из них значимо изменяются после приема запрещенных препаратов. Эти изменения сильно зависят от индивидуальных особенностей метаболизма, так что для некоторых людей данные соотношения являются наиболее значимыми, а для других - абсолютно не изменяются после приема запрещенных препаратов. В итоге составление индивидуального стероидного профиля и мониторинг данных во времени позволяет заметно повысить чувствительность определения приема эндогенных стероидов по сравнению с традиционными популяционными границами и критериями, установленными ВАДА.

Поиск новых значимых соотношений эндогенных стероидов.

Для расширения возможностей анализа мочи методом стероидного профиля и увеличения чувствительности определения приема прогормонов эндогенных стероидов было принято решение провести поиск новых соотношений с помощью модуля «Добыча данных» программы $1а1151юа. Данный модуль является классическим инструментом, использующимся в хемометрике для проведения углубленного анализа данных. Для этого предварительно получили все возможные соотношения из исследуемых концентраций, причем только для тех концентраций, значения которых превышали 5 нг/мл во всех исследуемых пробах (как до, так и после приема изучаемых прогормонов). В связи с особенностями индивидуального метаболизма некоторые стероиды могли присутствовать или отсутствовать у разных добровольцев, поэтому окончательное количество исследуемых соотношений было разным для каждого добровольца.

Для поиска новых, наиболее значимых соотношений эндогенных стероидов использовали «деревья классификации» - метод, позволяющий предсказывать и искать зависимость между наблюдениями и результатом анализа. Таким образом, имея набор соотношений, данный метод может показать, насколько значимо результат анализа (положительная или отрицательная проба) зависит от каждого соотношения.

Анализ проб после приема тестостерона. Для первого добровольца наиболее показательными оказались соотношения Т/ДГЭА, Этио/ДГЭА, 5а-андростан-3(Х,17|3-диол/ДГЭА, 5Р-андростан-За,17р-диол/ДГЭА, 5Р-андростан-За,17р-

диол/прегнандиол и 5р-андростан-За,17р-диол/11рОНЕ, которые заметно повышаются сразу после приема тестостерона. Для второго добровольца наиболее значимым оказалось соотношение 5р-андростан-3а,17р-диол/прегнандиол. Для третьего добровольца значимым оказалось только одно соотношение - 5а-андростан-За,17р-диол/ДГЭА. Для проверки чувствительности полученных соотношений к определению приема тестостерона рассчитаны индивидуальные интервалы с помощью программы Вауе51ап Вютагкеге и построены графики зависимостей выбранных соотношений от времени после приема тестостерона всеми тремя добровольцами с указанием индивидуальных норм. Полученные графики представлены на рис. 5-7.

Найденные новые соотношения позволяют определять прием тестостерона первым добровольцем в течение 42.5 часов вместо 17 часов при определении традиционных параметров стероидного профиля с использованием программы Вауезтп отагкеге. Для второго добровольца, имеющего собственный повышенный уровень тестостерона, время определения приема тестостерона увеличилось с 22 до 55 часов.

Для третьего добровольца, имеющего азиатский тип метаболизма — 59 часов, вместо 11.5 часов при определении традиционных параметров стероидного профиля с использованием программы Вауе$1ап Вютагкеге.

В целом, используя данный подход, удалось увеличить время обнаружения приема тестостерона в 3 и более раза, причем наибольшего времени определения

удалось добиться для добровольца, имеющего азиатский тип метаболизма и представлявшего наиболее проблемный случай.

5рЗа17р ПРОНЕ

-40 10 -нижняя граница -верхняя граница

5/ЗЗаПр/ ПД 60

-90 -40 10 60 110

—•—нижняя граница -^"-значение

А верхняя граница

160

и ч

5аЗа17/3/ ДГЭЛ

-40 10 -нижняя граница -верхняя граница

60 110 —значение

Рис. 5. Зависимость значения соотношения 5р-андростан-За,17(3 диол/11р-ОН-этиохоланолон от времени после приема тестостерона первым добровольцем.

Рис. 6. Зависимость значения соотношения 5(3-андростан-За,17р-диол/ пре-гнандиол от времени после приема тестостерона вторым добровольцем.

Рис. 7. Зависимость значения соотношения 5а-андростан-За,17(3-диол/ ДГЭА от времени после приема тестостерона третьим добровольцем.

Показана значимость найденных новых соотношений на ретроспективном анализе данных, полученных в течение 2010 года после определения стероидного профиля мочи спортсменов. Установлено, что виды спорта, такие как тяжелая и легкая атлетика, имеющие наибольшую вероятность использования тестостерона, показали повышенный процент проб, превышающих популяционные пределы, как для мужской, так и для женской популяций.

Также стоит отметить, что для первого добровольца значимыми являются все установленные соотношения, однако для второго и третьего добровольцев устано-

вить факт приема тестостерона можно только по повышениям нескольких из установленных соотношений.

ЭтиоПТ 7'5 т

6 I

,-.—

-90

-40 10 - нижняя граница -верхняя граница

60 ПО —в—значение

160

г, Ч

-90 -70 -50 -30 -10 10 30 50 70 —*— нижняя граница —В—значение * верхняя граница £ ц

-40 10 60 110 - нижняя граница значение

-верхняя граница

и ч

Рис. 8. Зависимость значения соотношения этиохоланолон/прегнан-триол от времени после приема ДГЭА первым добровольцем.

Рис. 9. Зависимость значения соотношения этиохоланолон/эпитес-тостерон от времени после приема ДГЭА вторым добровольцем.

Рис. 10. Зависимость значения соотношения 5(3-андростан-За,17(3-диол/ДГТ от времени после приема ДГЭА третьим добровольцем.

Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона. Для первого добровольца наиболее значимыми оказались соотношения Этио/Е, ДГЭА (М)/Е, Этио/прегнандиол и Этио/прегнантриол, причем, если первые три соотношения уже ) через 50 часов превышают установленные индивидуальные пределы несущественно, 1 то последнее соотношение - Этио/прегнантриол - превышает индивидуальные границы более чем в 2 раза даже через 148 часов (рис. 8). Для второго добровольца ! наиболее значимыми оказались изменения соотношений этиохоланолон/Е (рис. 9) и I этиохоланолон/прегнандиол, однако максимальное время определения приема

ДГЭА для второго добровольца составляет только 50 часов. Для третьего добровольца наиболее значимым оказалось соотношение 5(3-андростан-За,17|3-диол/ДГТ (рис. 10), при этом максимальное время определения приема ДГЭА добровольцем с азиатским типом метаболизма составило 60-65 часов.

Таким образом, найденные новые соотношения стероидов позволяют определять прием ДГЭА в течение 159 часов вместо 28 часов для первого добровольца (для соотношения этиохоланолон/прегнантриол), причем изменение данного соотношения происходит в два и более раз. Для второго добровольца время определения приема ДГЭА увеличилось с 24 до 50 часов, а для третьего составило 60 часов, при том, что традиционные соотношения и концентрации стероидного профиля не позволяли определять прием ДГЭА третьим добровольцем уже черед 4 часа. Впервые предложен способ поиска новых значимых для допинг-контроля соотношений, основанный на использовании модуля «добыча данных» программы Би^вйса. Полученные с помощью данного способа соотношения позволили увеличить время определения приема запрещенных эндогенных стероидов как минимум в три раза, по сравнению с традиционными критериями, установленными В АДА. При этом предложенные в качестве маркеров соотношения в некоторых случаях, в частности при анализе проб добровольца с азиатским типом метаболизма, оказываются единственно достоверно изменяющимися параметрами.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика определения 43 эндогенных стероидов в моче человека методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Получены масс-спектры электронной ионизации для ТМС-производных всех исследуемых соединений, установлены времена удерживания и выбраны характеристичные ионы для дальнейшего определения эндогенных стероидов в режиме регистрации селективных ионов.

2. Проведено сравнение градуировочных коэффициентов для 6-ти исследованных матриц. Показано, что наиболее пригодной матрицей для построения градуировочных зависимостей является моча, с предварительно удаленными неконъгированными стероидами.

3. Предложенная методика определения эндогенных стероидов после проведения метрологической аттестации добавлена в область аккредитации ФГУП АДЦ. Подана заявка №2011109874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

4. В течение более трех лет разработанная методология анализа стероидного профиля мочи использовалась во ФГУП АДЦ в работе по Государственным контрактам № ОБ/ОД-Ю9 от 19.09.2008, № 09ЮД-10 от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время проанализировано 5796

проб, принадлежащих российским спортсменам, и на основе этого установлены популяционные нормы для концентраций и соотношений большинства эндогенных стероидов в популяции российских спортсменов.

5. Разработан программный модуль Bayesian Biomarkers, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать индивидуальные нормы концентрации и соотношений каждого исследованного стероида с учетом пола, возраста, вида спорта и других параметров. Использование разработанного программного модуля Bayesian Biomarkers позволило увеличить время определения приема запрещенных препаратов в среднем в 2 раза (на примере тестостерона и ДГЭА) при анализе проб, полученных от трех добровольцев.

6. Проведена апробация разработанной методики определения стероидного профиля для анализа проб мочи добровольцев, участвующих в проектах «Марс 105» и «Марс 500». Выявлены параметры стероидного профиля мочи, испытывающие влияние условий жизнедеятельности в гермообъекте у здорового человека. Определены параметры индивидуальной вариабельности показателей стероидного профиля и их зависимость от определенных условий эксперимента, таких как смена периодов различного солепотребления, автономность жизнедеятельности.

7. После поиска новых значимых маркеров приема запрещенных препаратов с помощью одного из подходов хемометрики, реализованного в программе Sta-tistica, выбраны новые соотношения, для которых построены индивидуальные границы в разработанном модуле Bayesian Biomarkers. Данный подход позволил увеличить время определения приема эндогенных стероидов в среднем в 3 раза по сравнению с использованием индивидуальных границ для традиционных маркеров. При этом время определения приема эндогенных стероидов увеличилось в среднем более чем в 6 раз и составило 50 — 150 часов после приема. Для всех новых маркеров установлены популяционные пределы в зависимости от пола.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Е.А. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Хромато-масс-спектрометрический анализ стероидного профиля спортсмена. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. 8. 76. Р. 20-25.

2. И.М. Ларина, Е.А. Кочнова, JLX. Пастушкова, Г.М. Родченков, A.M. Носовский, E.H. Николаев. Профиль половых стероидов мочи здорового человека в условиях жизнедеятельности в гермообъекте. // Физиология человека. 2011. 37. 4. Р.79-89.

3. Е. Kochnova, I. Shevtsova, Т. Sobolevsky, G. Rodchenkov. Software for analysis of urinary and blood parameters using Bayesian approach. // In Recent Advances in

Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 2010. P. 250-258.

4. E.A. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Хромато-масс-спектрометричские исследования параметров стероидного профиля российских спортсменов. // Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». Россия, Краснодар, 26 сентября - 01 октября 2010 г. Р. 168.

5. Е.А. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Анализ стероидного профиля методом ГХ-МС. // Московский семинар по аналитической химии, Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН. Москва, Россия, 28 октября, 2009 г.

6. Е.А. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Разработка методики определения стероидного профиля методом ГХ/МС. // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием. Краснодар, 27 сентября - 3 октября 2009 г. Р. 79.

7. Е.А. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Сравнение различных способов дериватизации стероидов в моче человека. // Четвертый съезд ВМСО. III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». Россия, Москва, 18-22 мая 2009 г. Р. 37.

8. Е.А. Кочнова, Т.Г. Соболевский, В.Ф. Сизой, Г.М. Родченков. Исследование стероидного профиля методом ГХ-МС. // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (к 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселева). Россия, Москва, Клязьма, 14-18 апреля 2008 г. Р. 57.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. O.A. Шпигуну и проф. Т.Н. Шеховцовой за неоценимую помощь и внимание; к.х.н. Т.Г. Соболевскому за плодотворное обсуждение результатов и внимательное отношение на всех этапах работы; коллективу Федерального государственного унитарного предприятия «Антидопинговый центр» за предоставленную возможность и понимание, проявленные во время выполнения работы.

Подписано в печать 21.01.2012г.

Заказ № 07555 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «Чертеж.ру» ИНН 7701723201 107023, г.Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Кочнова, Елизавета Александровна, Москва

61 12-2/253

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

Кафедра аналитической химии

На правах рукописи

Кочнова Елизавета Александровна

Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии

02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н., Родченков Г.М.

Москва - 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................8

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................15

1.1 Номенклатура стероидов..............................................................................15

1.2 Биосинтез и метаболизм стероидов............................................................16

1.3 Определение стероидов в моче....................................................................19

1.3.1 Гидролиз коньюгатов стероидов..........................................................19

1.3.2 Методы определения эндогенных стероидов......................................20

1.3.3 Проблема количественного анализа эндогенных стероидов.............22

1.4 Стероидный профиль....................................................................................23

1.4.1 Исследование стероидного профиля....................................................23

1.4.2 Стероидный профиль и основные метаболиты...................................26

1.4.3 Стероидный профиль и минорные метаболиты..................................27

1.4.4 Стероидный профиль и генетика..........................................................29

1.4.5 Стероидный профиль и разбавление мочи..........................................30

1.4.6 Популяционные нормы концентраций и соотношений эндогенных стероидов в моче............................................................................31

1.4.7 Переход от популяционных границ к индивидуальным....................34

2 ОБОРУДОВАНИЕ, ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА....................................................................................................39

2.1 Оборудование................................................................................................39

2.2 Исходные вещества и материалы................................................................39

2.3 Приготовление растворов и буферов..........................................................47

2.3.1 Приготовление раствора внутреннего стандарта метилтестостерона..............................................................................................47

2.3.1.1 Приготовление рабочего раствора метилтестостерона............47

2.3.2 Приготовление буферной смеси...........................................................48

2.3.3 Приготовление фосфатного буфера.....................................................48

2.3.4 Приготовление карбонатного буфера..................................................48

2.3.5 Приготовление концентрированного раствора для дериватизации.....................................................................................................49

2.3.6 Приготовление модельных растворов для оптимизации условий хроматографического разделения......................................................49

2.3.7 Приготовление градуировочных растворов........................................49

2.3.7.1 Приготовление растворов 1 группы...........................................50

2.3.7.2 Приготовление растворов 2 группы...........................................51

2.3.7.3 Приготовление растворов 3 группы...........................................52

2.3.7.4 Приготовление растворов 4 группы...........................................52

2.3.7.5 Приготовление растворов 5 группы...........................................53

2.3.8 Подготовка матриц для проведения градуировки..............................53

2.3.8.1 Подготовка матрицы мочи без стероидов, содержащихся в свободной фракции - «свободная моча»....................................................53

2.3.8.2 Подготовка матрицы мочи, прошедшей через патрон для твердофазной экстракции - «ТФЭ моча»...................................................54

2.4 Подготовка пробы мочи для анализа и проведения градуировки...........54

2.4.1 Подготовка пробы мочи........................................................................54

2.4.2 Подготовка пробы для проведения градуировки................................55

2.4.3 Препараты эндогенных стероидов, использованные в работе..........55

2.5 Прием препаратов эндогенных стероидов.................................................55

2.6 Статистические программы и математические модули, используемые в работе......................................................................................................................56

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................57

3.1 Разработка способа определения эндогенных стероидов в моче.............57

3.1.1 Выбор температурной программы и хроматографической колонки.................................................................................................................57

3.1.2 Определение времен удерживания и характеристичных ионов.......57

3.1.3 Масс-спектры исследуемых соединений.............................................60

3.1.4 Построение градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов...................................75

3.1.4.1 Выбор матрицы для построения градуировочных кривых......75

3.1.4.2 Сравнение коэффициентов чувствительности..........................76

3.1.4.3 Сравнение отношений эндогенных стероидов..........................81

3.1.5 Эффективность гидролиза и степень извлечения...............................85

3.1.6 Метрологическая аттестация разработанного способа анализа........86

3.1.7 Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных В АДА. Межлабораторная сходимость результатов.........93

3.2 Статистический анализ полученных данных.............................................99

3.2.1 Статистический анализ концентраций эндогенных стероидов.........99

3.2.2 Статистический анализ данных соотношений эндогенных стероидов...........................................................................................................105

3.2.3 Использование установленных популяционных пределов для определения приема запрещенных препаратов.............................................107

3.2.3.1 Анализ проб после приема тестостерона.................................109

3.2.3.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона............113

3.3 Переход от популяционных границ к индивидуальным.........................115

3.3.1 Использование разработанной программы для определения приема запрещенных препаратов....................................................................116

3.3.1.1 Анализ проб после приема тестостерона.................................119

3.3.1.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона............126

3.4 Поиск новых значимых соотношений эндогенных стероидов..............130

3.4.1 Анализ проб после приема тестостерона...........................................132

3.4.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона......................139

3.4.3 Установление популяционных границ для новых соотношений.... 143

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................145

ВЫВОДЫ.................................................................................................................147

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................149

Приложение 1. Вауеягак Вюмаюсекз...............................................................163

Работа с программой............................................................................................163

Модули программы Вауез1ап Вютагкеге..........................................................168

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

' 11а«каппе соединении Сокращение

Метилтестостерон ВС

Тестостерон т

Эпитестостерон Е

5 а-андростан-3 а, 17(3-диол 5<хЗа17р

5 (З-андростан-З а, 17Р-диол 5рЗа17р

5а-андростан-За,11 р-диол-17-он 11РОНА

5р-андростан-За, 11 Р-диол-17-он 11РОНЕ

Дегидроэпиандростерон ДГЭА

Дигидротестостерон дгт

Андростерон А

Этиохоланолон Этио

5 р-прегнан-3 а,20а-диол (прегнандиол) ПД

5 Р-прегнан-3 а, 17а,20а-триол (прегнантриол) пт

5-холестен-З Р-ол хол

5а-андростан-3,17-дион 5адион

5Р-андростан-3,17-дион 5Рдион

Андростендион Адион

11-оксо-этиохоланолон ПоксоЕ

4-андростен-бр, 17Р-диол-3-он бронт

Эпиандростерон ЭпиА

Эстрадиол ЭД

Эстриол эл

Эстрон эн

За,5-цикло-5а-андростан-бр-ол-17-он ДГЭА (М)

5а-андрост-16-ен-За-ол 5а16енЗаол

Тетрагидрокортизол ТГЛ

Тетрагидрокортизон ТГН

5-андростен-Зр,17Р-диол 5енЗр17р

5-андростен-ЗаД7р-диол 5енЗа17р

4-андростен-6а-ол-3,17-дион Форместан

5 а-андростан-3 р, 17р-диол 5<хЗр17р

5 Р-андростан-За, 17а-диол 5рЗа17а

5р-андростан-3(3,17а-диол 5рзр17а

4-андростен-З а, 17а-диол 4енЗа17а

5а-андростан-3 а, 17а-диол 5аЗа17а

5-андростен-З р, 17а-диол 5енЗр17а

5а-андростан-Зр,17а-диол 5аЗр17а

1 ба-гидроксиандростерон 1баОНА

1бр-гидроксидегидроэпиандростерон 16рОНДГЭА

4р-гидроксидегидроэпиандростерон 4РОНДГЭА

7а-гидроксидегидроэпиандростерон 7аОНДГЭА

7-оксодегидроэпиандростерон 7оксоДГЭА

7р-гидроксидегидроэпиандростерон 7рОНДГЭА

бр-гидроксиандростерон 6РОНА

6 Р-гидроксиэтиохоланолон брОНЕ

Никотинамидадениндинуклеотид НАД

Всемирное антидопинговое агентство ВАДА

Газовая хроматография/масс-спектрометрия ГХ-МС

Helix pomatia Н. pomatia

Escherichia coli Е. coli

N-метил-М-трифторацетамид МТФА

триметилсилилимидазол ТМСИм

триметилсилил ТМС

К-метил-К-(триметилсилил)трифторацетамид МСТФА

триметилсилилиодид ТМСИ

газовая хроматография-сжигание-изотопная масс-спектрометрия ГХ/С/ИМС

твердофазная экстракция ТФЭ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Употребление анаболических стероидов распространено в спорте, и по этой причине они внесены в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Тестостерон относится к наиболее часто выявляемым эндогенным анаболическим стероидам, но при установлении случаев его употребления возникает ряд проблем. Тестостерон вырабатывается в организме человека в больших количествах, а любые принятые эндогенные стероиды активно метаболизируют с образованием многочисленных продуктов. С точки зрения антидопингового контроля такие препараты являются сложно определяемыми, и большинство современных методов не способно достоверно выявить факт их употребления уже через 36 часов после приема. Исключение составляет метод газовой хроматографии-сжигания-изотопной масс-спектрометрии (ГХ/С/ИМС), но этот анализ не распространен из-за дороговизны и сложности пробоподготовки. Для выявления приема синтетических эндогенных стероидов предложено использовать определение стероидного профиля, то есть количественное определение совокупности концентраций и соотношений стероидов. Впервые использовать стероидный профиль для выявления применения тестостерона было предложено еще около 30 лет назад, однако проблема выявления приема запрещенных эндогенных стероидов не решена и в настоящее время. Для обнаружения применения различных эндогенных стероидов существует несколько критериев, установленных ВАДА, однако наибольшее диагностическое значение имеет только один - соотношение концентраций тестостерона/эпитестостерона (Т/Е). Однако одного данного соотношения недостаточно, поскольку применение запрещенных в спорте прогор-монов может оказывать значительное влияние на спортивную форму, оставаясь при этом «незаметным» для лабораторий допинг-контроля. Данная ситуация показывает, что используемая методика определения приема стероидов тесто-стеронового ряда может быть улучшена за счет мониторинга ряда других перспективных соотношений.

В настоящее время существуют следующие критерии ВАДА: соотношение Т/Е >4, концентрации тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е) > 200 нг/мл, концентрации андростерона (А) и этиохоланолона (Этио) > 10000 нг/мл и концентрация дегидроэпиандростерона (ДГЭА) >100 нг/мл. Проба, в которой наблюдается превышение одного или нескольких данных параметров считается атипической и подвергается дальнейшему анализу методом ГХ/С/ИМС.

матриц, а чаще всего даже не указывая их. При определении популяционных норм для концентраций эндогенных стероидов не всегда используется нормировка на плотность мочи, что приводит к повышенной вариативности полученных данных. В последнее время в литературе появились данные, что традиционно изучаемый стероидный профиль, состоящий из восьми стероидов и их соотношений, не чувствителен к приему новых прогормонов, поэтому необходимо определять дополнительные эндогенные стероиды, которые впоследствии могут стать новыми маркерами приема запрещенных препаратов.

Цели работы заключались в:

3. определении популяционных и индивидуальных границ для соотношений и концентраций эндогенных стероидов;

4. поиске новых наиболее значимых маркеров приема эндогенных стероидов.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• провести метрологическую аттестацию разработанного способа определения эндогенных стероидов;

• провести анализ образцов, получаемых от В АДА в рамках межлабораторного сравнения результатов, и статистически сравнить полученные данные с другими лабораториями, аккредитованными ВАДА;

• провести анализ статистически значимого количества проб мочи российских спортсменов и получить значения концентраций и соотношений исследуемых стероидов для данной специфической популяции, а затем установить популяционные пределы для основных концентраций и соотношений эндогенных стероидов российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• провести апробацию разработанной методики и программного модуля на реальных образцах мочи;

• найти новые значимые маркеры приема эндогенных стероидов с помощью программного пакета 81айзйса;

ных графиков с использованием различных матриц мочи. Показано, что основным преимуществом использования в качестве матрицы мочи, из которой предварительно удалены неконъюгированные стероиды, является повышение точности определения стероидного профиля.

На основе определения стероидного профиля более 5000 проб мочи спортсменов и описательной статистики установлен вид распределения концентраций и соотношений всех исследуемых стероидов. Показано, что вид популя-ционного распределения соотношения Т/Е сильно отличается в зависимости от пола.

На основании проведенных систематических исследований установлены популяционные пределы для определяемых параметров стероидного профиля. Показано, что популяционные пределы для российских спортсменов заметно различаются в зависимости от пола, вследствие чего данный фактор предложено использовать при анализе. В