Хроматографическое и электрофоретическое определение стероидов и биогенных аминов в биологических объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

БЕССОНОВА ЕЛЕНА АНДРЕЕВНА

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ И БИОГЕННЫХ АМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Специальность 02.00.02. - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в НИО лабораторной диагностики Медицинской Академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Беленький Борис Григорьевич

доктор химических наук, профессор Калинкин Игорь Петрович

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится

2004 г. в_

_ч.на заседании

диссертационного совета Д 212.232.37 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 1990034 Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

jU>

апреля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

/А.Г. Папсуева/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Стероидные гормоны коры надпочечников играют основную роль в обеспечении жизненных процессов. Изменение концентраций катехоламинов в крови определяет различные заболевания мозга и нервной системы. Низкие концентрации обсуждаемых аналитов в биологических жидкостях требуют использования высокочувствительных и селективных методов их определения. К тому же биологически активной является лишь свободная фракция стероидов, содержание которой в сыворотке не превышает 15%. Для корректной диагностики многих патологий, например, эндокринных нарушений, необходимо определение в сыворотке крови и моче как стероидов, так и катехоламинов.

Традиционно используемые в отечественной практике иммуноферментные методы имеют существенные ограничения и обеспечивают определение лишь одного конкретного соединения. Опубликованные работы в области ВЭЖХ стероидов и катехоламинов посвящены ограниченному набору аналитов либо решению конкретной задачи (установлению количественного соотношения кортизол : кортизон). Определенные перспективы, открываются в выяснении возможности использования различных вариантов капиллярного электрофореза с УФ- и МС-детектированием.

Актуальность проблемы подтверждается поддержкой исследований в этом направлении со стороны конкурсного центра фундаментального естествознания (гранты АСП-30513 и АСП - 301053) и Министерства образования РФ ( грант АОЗ-2.11-394).

Цель работы Усовершенствование методов хроматографического и электрофоретического разделения стероидов (кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S), 11-дегидрокортикостерона(А), прогестерона(Рг), 17а-гидроксипрогестеро-на (17СС-ОНРг), тестостерона (Т)) и биогенных аминов (адреналина (Е), норадреналина (NE), дофамина (DA)) в биологических жидкостях.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

-Установить на модельных смесях факторы, влияющие на хроматографическое и электрофоретическое разделение стероидных гормонов и катехоламинов.

— Отработать режимы пробоподготовки для указанных классов аналитов.

— Выяснить пути снижения их предела обнаружения в биологических жидкостях.

— Получить сравнительные оценочные характеристики используемых методов для

определения этих аналитов. i

рос национальная |

библиотека |

-Разработагь методики определения стероидов и катехоламинов в сыворотке крови и моче больных с различными эндокринными нарушениями.

Научная новизна

Установлены закономерности элсктрофоретического и хроматографического разделения стероидов и катехоламинов, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий разделения сложных смесей нейтральных соединений с близкими свойствами.

Выявлена доминирующая роль p-циклодекстрина при разделении природных стероидных юрмонов в изокрагическом режиме ОФ ВЭЖХ.

Обнаружен эффект влияния мочевины на разделение кортикостероидов в режиме МЭКХ.

Практическая значимоегь работы

Разработан метод хромат ографического (ОФ ВЭЖХ с УФ-детектором) и электрофоретического (МЭКХ с УФ-детектором) определения стероидных гормонов в сыворотке и моче.

Впервые выполнен анализ смесей стероидных гормонов (F, Е, А, В, 17-OHPr, DOC, S) в реальных объектах (моча, сыворотка крови) методом МЭКХ с использованием on-line концентрирования.

Проведен комплексный анализ закономерностей хроматографических стероидных профилей, позволяющих обнаруживать нарушения стероидогенеза на ранних этапах заболеваний и осуществить дифференциальную диагностику различных патологий коры надпочечников.

Определение кортикостероидов в биологических объектах нашло практическое применение в области клинической медицины. Получено свидетельство на рационализаторское предчожение №1354 от 18.06.2001. Ворохобина Л.В., Великанова Л.И., Королева Е.М., Бессонова Е.А., Шафигулина З.Р., Милютина О.Л. Комплексное исследование уровня кортикостероидов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ для ранней диагностики патологий коры надпочечников.

Положения, выносимые на защиту 1.Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного электролита, природы и концентрации мицеллообразователя и органических модификаторов, добавки циклодекстрина в качестве компонента подвижной фазы, разделит сльного буфера и магрицьь образца, определяющие закономерности хроматографического и электрофоретического разделения кортикостероидов.

: л » •><.

-»¡г-«-».^.. ■ 4 : •--< \ч V;

2. Количественная оценка (константы комплексообразования) процессов комплексообразованця с участием стероидов и 0-цикло декстрина.

3. Оптимизированный регламент пробопоаготовки биологических жидкостей (сыворотки крови и мочи) при определении стероидных гормонов методами ОФ-ВЭЖХ и МЭКХ.

4. Способы предварительного концентрирования (стэкинга и евнпинга) для увеличения концентрационной чувствительности определения кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматофафии.

5. Обоснование преимуществ для определения кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии по отношению к обращенно-фазовой

вэжх.

6. Сравнительные характеристики ОФ ВЭЖХ и КЭ-МС определения катехоламинов.

7. Методики анализа реальных объекте с использованием выявленных закономерностей:

- определение кортикостероидов методом ОФ-ВЭЖХ,

- определение кортикостероидов методом МЭКХ.

Апробация работы Результаты исследований докладывались на Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов». 16-21 апреля. 2000 г. Москва; IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии. 24-28 апреля. Клязьма. 1999 г. Москва; научно-практической конференции молодых ученых СПбМАПО "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". 2001. СПб; симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины». 9-11 октября. 2001г. СПб; 4-м Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии». 2001. СПб; X Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбиии и адсорбционной хромато1рафии. 2428 апреля. 2001г. Москва; VIII Всероссийском симпозиуме :ю жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. 15-19 октября. 2001г. Москва; Всероссийском симпозиуме по «Современным проблемам хроматографии» 18-22 марта. 2002 г. Москва; I International conference «High medical technologies in XXI century» November 2-9. 2002. Benidorm. Spain; Illrd International symposium on separations in BioSienceJ "100 years of Chromatography". 1318 may. 2003. Moscow; XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии. 21-26 сентября. 2003. Казань; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы». 15-19 марта. 2004 г. Москва.

Публикация результатов. Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 15 тезисах докладов.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, приложения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (162 наименований). Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, содержит 5 схем, 39 таблиц и 35 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования. Отмечена перспективность использования капиллярного электрофореза при определении стероидов и катехоламинов и необходимость одновременного их определения в моче и сыворотке крови при многих заболеваниях, в частности, при эндокринных нарушениях.

1-я глава (Обзор литературных данных) состоит из 8 разделов, в которых обсуждаются общие сведения о стероидных гормонах; биологические формы и их функции; физико-химические методы исследования кортикостероидов (иммунологические, хроматографические и электрофоретические); основные этапы пробоподготовки; краткое описание биосинтеза и функций катехоламинов в организме; физико-химические методы определения катехоламинов.

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов - и методов исследования.

В 3-й главе предметом обсуждения является исследование хроматографического и электрофоретического поведение кортикостероидов методами ОФ ВЭЖХ и МЭКХ.

Изучение закономерностей хроматографического поведения стероидов проводили на модельной смеси стероидных гормонов. Варьирование рН и состава элюента не обеспечило полного их разделения в одном хроматографическом цикле в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ из-за сильно различающейся гидрофобности. Введение Р-циклодекстрина (Р-ЦЦ) (от 0,3 до 3 мМ) в состав элюента (ацетонитрил : вода) привело к увеличению эффективности разделения, улучшению разрешения аналитов с близкими параметрами удерживания (кортизол и кортизон), сокращению факторов удерживания для более гидрофобных аналитов (рис. 1, 2,3).

Рис. 1. Зависимость разрешения Rs (а) и эффективности разделения (^ (б) для кортизола и кортизона от концентрации |1-циклодекстрина (элюент: ацетонитрил : вода, 45 : 55; по объему).

Такое влияние ЦД обусловлено его способностью образовывать комплексы включения со стероидами с участием гидрофобной полости макроцикла. Рассчитаны константы

комплексообразования в системе

стероидный гормон - р-ЦЦ (табл.1). Стабильность комплексов для более гидрофобных стероидов увеличивается при уменьшении содержания органического компонента в составе элюента, что связано с их меньшей сольватацией в более гидрофильной среде (табл.1).

В оптимизированных условиях (ацетонитрил : вода (45:55, по объему) с добавкой 2,5 мМ р-ЦД) осуществлен анализ реальных объектов с предварительным проведением пробоподготовки, которая предполагала выделение лишь свободной биологически активной фракции

стероидных гормонов.

Таблица 1. Значения констант устойчивости комплексов

разделяемых стероидов с р-циклодекстрином, введенным в состав

Рис 2 Зависимость относительных факторов удерживания стероидов от концентрации элюент:

ацетонитрил : вода (30 : 70; по объему).

Стероиды Константа устойчивости

I серия (45:55) II серия (30:70)

Кортизол 158±6 128±б

Кортизон 121±5 101±7

11 -дегидро-кортикостерон 106±5 91 ±1

Кортикостерон 130±5 218±5

Тестостерон 140±5 363±7

11-дезокси-кортикостерон 138±3 280±6

П-дезокси-кортизол 63±0,2 -

Для твердофазной экстракции

использовались концентрационные

патроны с силикагелем и С18. Проведена сравнительная количественная оценка (по значениям степеней извлечения) двух вариантов экстракции кортикостероидов -твердофазной и жидкостно-жидкостной -в сыворотке крови и моче с использованием различных сорбентов и элюирующих систем. Установлено, что в случае сыворотки предпочтительна твердофазная экстракция на

концентрационных патронах С]з (табл.2, 3). В процессе жидкостной экстракции сыворотки образуется эмульсия, что свидетельствует о частичном разрушении комплексов стероидов, связанных с белками. Для определения стероидов в моче пригодны оба варианта пробоподготовки. Предел

обнаружения кортикостероидов в моче и сыворотке крови ~ 2 мкг/л.

Стероидные гормоны, являясь нейгральными и близкими по строению аналитами, были определены нами независимо методом мицеллярной

электрокинетической хроматографии (МЭКХ), который по эффективности превосходит ВЭЖХ. Разработка такого варианта для указанных аналитов имеет самостоятельный интерес. Кроме того, при решении данной задачи он выполнил и роль арбитражного метода.

Изучены факторы, определяющие закономерности электрофоретического поведения стероидных гормонов в МЭКХ: состав, концентрация и рН рабочего электролита

РисЗ. Хроматогралша модельной смеси стероидов с добавлением 2,5 мМ Р-ЦД в составе элюента. Колонка Sepaгon SGX С-18 100x2 мм, 5 мкм (Чехия); элюент СН}СМ:НгО (45.55, по объему), скорость элюента: 3 мл/мин.

Таблица 2. Результаты жидкостной экстракции кортикостероидов из сыворотки крови и мочи (П=5,Р=0,95).

Стероидные гормоны Степень извлечения (в %)

Сыворотка крови Моча

СНС1з СН2С12 сись

Кортизол 80±4 82,3 ±2,5 83±4

Кортизон 78±3 80,6±1,8 89,6±2,5

11-дегидро кор гикостерон 56,4±1,3 76,4±1,9 87,8±2,3

Кортикостерон 54,0±1,5 72,6±2,5 70±3

11-дезокси кортикостерон 50,0±2,3 65,8±1,5 71±3

11-дезохси кортизол 47±4 64,4±1,9 65,5±1,9

Таблица 3. Результаты твердофазной экстракции корткостероидов из сыворотки крови и мочи на силикагеле и обращенно-фазовом сорбенте.

Стероидный гормон Степень извлечения (%)

Силикагель | См С„

Сыворотка Моча

Кортизол 77.0±2,3 92,0±2,3 91±3

Кортизон 78.0*2,3 93±4 90±4

Кортикостсрон 11 -дегидрокортикостерон 82,0±2,5 89,5±2,8 81,0±2,7

11 -дезоксикортикостерон 64,0±1,9 87,3*1,5 79,0±2,3

11 -дезоксикортизол 67,0±2,0 85±3 75,5±1,8

Рис.4. Электрофореграммы смеси кортикостерондов: F, Е, А, В, 17-ОНРг, DOC, S, Рг в режиме МЭКХ. Гидродинамический ввод пробы 300 мбар; условия КЭ: 22 кВ (а); -25кВ (б,в). Буферный электролит: 5мМ тетраборат натрия, 50мМ ДДСН, 20% метанола (а) 25мМ фосфорная кислота, 10мМ ДДСН, 15% метанола (б); 25мМ фосфорная кислота, 10мМ ДДСН, 4М мочевина (в). Раствор пробы: буферный электролит.

(аммиачно-атдетатный и боратный буферы, фосфорная кислота, 20 -100 мМ); природа и концентрация мицеллообразователя: додецилсульфата (ДДСН) и холата натрия; роль органических растворителей (метанола и ацетонитрила 10 - 20 %, объемн.) в составе рабочего электролита; влияние добавок -

циклодекстрина и мочевины. Использование ДДСН (10 мМ) в качестве мицеллообразователя (в отличие от холата натрия) оказалось возможным при разделении стероидных гормонов в кислой и щелочной среде (рис.4). Порядок выхода стероидов в щелочной среде соответствует увеличению их гидрофобности (как в случае ОФ ВЭЖХ), в кислой - он обращается: более гидрофобные аналиты элюируются первыми, что приводит и к заметному увеличению эффективности

разделения. Так, для прогестерона эффективность при рН = 9,2 составила - 48 000 т.т./м, а при рН 2,5 - 270 000 т.т./м. Этот результат важен, поскольку более гидрофобные стероидные гормоны находятся в сыворотке в значительно меньших концентрациях, чем кортизол и кортизон.

Вследствие большого сродства гидрофобных стероидов к мицеллам полного разделения достигнуть не удалось. Введение в состав рабочего электролита метанола (1020%, объемн.) привело к улучшению разрешения пиков на электрофореграмме, но общее время возросло с 5 (0% метанола) до 28 мин. (20% метанола), что к тому же сопровождалось и снижением эффективности.

Оптимальный результат получен при введении в состав рабочего электролита (25мМ ортофосфорной кислоты; 10 мМ ДДСН) мочевины, способной образовывать водородные связи с ДДСН и тем самым ослаблять взаимодействия с аналитами: достигнуто с высокой эффективностью (рис.4в.) полное разделение стероидов. Зависимости параметров удерживания стероидов от концентрации мочевины представлены на Рис.5.

Рис. 5 Влияние концентрации мочевины на времена миграции кортикостероидов (а) и эффективность разделения (б).

В табл.4, представлены сравнительные характеристики электрофоретического разделения стероидов в различных условиях. Полученные пределы обнаружения для стероидных гормонов (5 - 2,5 мкг/мл), показали, что чувствительности УФ-детектирования недостаточно для их определения в сыворотке и моче. Поэтому необходимо было выработать стратегию on-line концентрирования в потоке. Изучены возможности различных вариантов стэкинга и свипинга: проба перед вводом разбавляется буфером или водой; аналиты движутся с высокой локальной скоростью, концентрируясь на границе, отделяющей зону высокой проводимости рабочего электролита и низкой -образца (стэкинг). При свипинге аналиты концентрируются псевдостационарной фазой

Таблица 4. Условия и некоторые характеристики разделения стероидов методом МЭКХ при различных рН

Фосфорная кислота (рН=2,5) с добавкой мочевины Борашый буфер рН-9,2 Фосфорная кислота (рН = 24) с метанолом

Полярность Отрицательная Нормальная Отрицательная

Скорость ЭОП (см2/В с) -»0 3,6x10^ — 0

Эффективность, т.т./м Рг-350 ООО И-250 000 Рг-45 000 F-180 000 Рг-250 000 И — 210 000

Общее время анализа, мин 12,5 27,0 22,0

Разрешение соседних пиков >1,34 >1,25

Состав ведущего электролита 25мМ фосфорная к-та ЮмМ ДЦСН 4,5М мочевина 5мМ тетраборат натрия 50мМ ДДСН 20% метанола 25мМ фосфорная к-та ЮмМ ДДСН 15% метанола

Условия ввода пробы, величина рабочего напряжения, параметры капилляра Кварц: L^/Lo6ui=30/80cm; 75мкм, Ввод: 60 мбар с,.

и:—25 кВ 1:= - 28 мкА U:=+22 кВ 1—+28 мкА U--25 кВ 1:= - 33,5 мкА

Примечание Полное разделение всех стероидов Можно разделить все компоненты смеси, кроме 17-ОНРг и РОС.

(мицеллами), которая проникает в раствор образца без мицелл. В отличие от стэкинга проводимость раствора образца близка проводимости рабочего электролита. На модельной смеси стероидов проведен сравнительный анализ методов концентрирования: стэкинга с обращено-мигрирующими мицеллами, стэкинга с высокопроводящей матрицей (с использованием добавки ЫаС1), стэкинга с усилением поля, с обращенно-мигрирующими мицеллами и свипинга.

Процедура стэкинга позволила сни$ить предел обнаружения при МЭКХ определении стероидов в 15-30 раз, а свипинга - в 100 раз (Рис 6.). В табл. 5 приведены сравнительные характеристики методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ при определении стероидов в биологических жидкостях. В табл. 6 сопоставлены результаты МЭКХ и ОФ ВЭЖХ определения кортикостероидов в сыворотке крови больных с эндокринными нарушениями.

Рис. 6. Оптимизация свипинга на модельной смеси кортикостероидов (2,5 мкг/мл). Матрица образца: р-р Н3РО4, равной проводимости буферного электролита, с добавкой 5мМ р-ра р-ЦД. Ввод: 60 мбар с (а), 3000 мбарс (б). Буферный электролит: 25мМ ортофосфорная кислота (рН=2,5), 10 мМ ДДСН, 4,5М мочевина; напряжение: -25 кВ, ток: -28 мкА. Компоненты пробы: 1- прогестерон, 2 - 11-дезоксикортизол, 3-17-гидроксипрогестерон, 4 - 11-дезоксикортикостерон, 5 - кортикостерон, 6 - 11-дегидрокортикостерон, 7 - кортизон, 8 - кортизол.

Таблица. 5. Сопоставление методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ, используемых при определении кортикостероидов

Контролируемый параметр МЭКХ ОФ ВЭЖХ (Изократическое элюирование)

Эффективность, тт/м 250 000 - 350 000 10 000- 15 000

Линейный диапазон определяемых концентраций 0,05-500 мг/л 0,02 -1000 мг/л

Предел обнаружения (мкг/л) 50 мкг/л (без конц.), 3 мкг/л (с конц.). 30 мкг/л (без конц.), 2 мкг/л (с конц.)

Объем пробы 20 нл 20 мкл

Скорость потока 0,3 мкл/мин 250 мл/мин

Разрешение Я (п, п+1) >1,25 > 1,25

Время анализа (мин) 15 мин 34 мин

Вспомогательные процедуры: - кондиционирование капилляра (колонки) - проведение пробоподготовки 10-15 мин 20 мин 15-20 мин 20 мин

Порядок элюирования В порядке уменьшения гидрофобности В порядке ув. гидрофобности.

Таблица 6. Данные ВЭЖХ и МЭКХ определения коргикостероидоа в сыворотке крови и моче больных с гипертензией.__

Сыворотка | Моча

Е К/Е В оос Б 17-ОНРг I Г Е Е/К

ВЭЖХ 35,0 ±2,5 10,9 ±0,4 3,2 3,8 ±1,2 3,9 ±1,1 2,0 ±0,5 <1,0 12,0 ±2,1 29,6 ±2,0 2,5

38,5 ±2,1 14,8 ±1,1 2,6 3,0 ±0,7 2,8 ±0,7 3,0 ±0,3 <1,0 10,6 ±1,8 28 ±3 2,6

МЭКХ 33 ±4 11,2 ±1,5 2,9 3,9 ±1,8 4,5 ±1,0 3,0 ±1,9 <3,0 13,5 ±0,6 27 ±3 2,0

39,1 ±2,0 14,0 ±2,2 2,8 3,0 ±1,5 3,2 ±0,8 3,7 ±0,4 <3,0 11,7 ±2,3 30,2 ±1,1 2,6

Глава 4 посвящена определению катехоламинов методом КЭ с УФ и МС-детектированием. Для корректной диагностики эндокринных нарушений необходимо определение катехоламинов: адреналина (Е), норадреналина (NA), дофамина (DA) в биологических жидкостях. Наличие легко окисляемых фенольных гидроксилов обеспечивает режим их определения методом ОФ ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Одним из ограничений данного метода является невозможность добиться одновременного разделения биогенных аминов и их основных, кислотных и нейтральных метаболитов. Использование зонного капиллярного электрофореза (КЗЭ) с УФ-детектированием для определения катехоламинов в сыворотке крови и моче невозможно из-за недостаточной чувствительности. В связи с этим, наряду с методом КЭ-УФ, изучены возможности электрофоретического разделения катехоламинов методом. КЗЭ с масс-спектрометрическим детектором. Установлен такой режим работы масс-спектрометра, при котором детектирование катехоламинов осуществляется по соответствующим сигналах молекулярных ионов практически без фрагментации.

Катехоламины в режиме КЗЭ могут быть определены в катионной и анионной формах. Исследованы оба варианта. При оптимизации условий варьировали состав вводимой пробы, состав буферного электролита, концентрацию и рН, наличие солевых добавок и органических модификаторов. Оптимальный состав рабочего электролита: 50 мМ ацетатно-аммонийный буфер с добавкой 5 мМ диэтиламин гидрохлорида (рН = 4,5). Был оптимизирован режим работы электроспрейя: скорость газа-осушителя 5 л/мин, температура 200°С, давление 14 кПа; состав обволакивающей жидкости: изопропиловый спирт/вода (1:1), 0,5 % уксусной кислоты; скорость обволакивающей жидкости 4мкл/мин. Отработана процедура пробоподготовки с использованием варианта твердофазной экстракции (ТФЭ) на оксиде алюминия, промытом кислотой. Сопоставление данных, полученных методом КЭ-МС и ОФ ВЭЖХ-ЭХ, показало, что капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием уступает по пределу обнаружения методу

ВЭЖХ с амперометрическим детектированием при сопоставимом времени анализа (табл.7).

Таблица 7. Пределы обнаружения катехоламинов, определенные методами КЭ-МС, КЭ-УФ и ВЭЖХ-АД

Соединение т/г [М-»1| Норма катехоламинов в моче, имоль/л Предел обнаружения, нмоль/л

КЭ-МС КЭ-УФ ВЭЖХ-АД

Дофамин 154,1 649 - 4930 110±3 650 ±2 1,87±0,04

Адреналин 184,1 81,5-200 90 ±2 540 ±1 0,15±0,03

Норадреналин 170,1 58,8 - 230 100 ±1 590 ±3 0,27±0,03

Глава 5. Практическое приложение. Обнаруженные на модельных смесях закономерности позволили разработав методику определения стероидов методом ОФ-ВЭЖХ и МЭКХ в сыворотке крови и моче больных с эндокринными нарушениями. Обследованы сыворотка крови и моча здоровых доноров (21 человек) и 4 групп пациентов с диагнозами: 1. врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) (19 человек,); 2. алъдостерома (10 человек); 3. рак коры надпочечников (12 человек); 4. синдром Иценко-Кушинга (15 человек) Определен диапазон нормы содержания стероидов у здоровых доноров и при различных заболеваниях коры надпочечников (табл. 8, 9). Установлены соотношения диагностически важных стероидов. Так, при врожденной гиперплазии коры надпочечников (стертая форма) (Рис.7а) — отмечено снижение уровня кортизола в крови и свободною кортизола в моче, что, в свою очередь, приводит к уменьшению соотношения кортизол/кортизон как в крови, так и в моче; а также увеличение

О ю 20 30 Время (мин) 0 20 -Ю Время (мин)

Рис.7. Хроматограмма сыворотки крови (а) и мочи (5) пациента с диагнозом врожденная гиперплазия коры надпочечников. Условия анализа на рис.6.

выработки предшественников стероидогенеза 11-дезоксикортизол и 11-дезоксикортикостерона. Погучгнные стероидные профили являются характеристичными для данных заболеваний.

Таблица 8. Данные хроматографического определения кортикостероидов в сыворотке кропи при различных эндокринных нарушениях.

N Группа обследуемых Количество наблю-дамых Сыворотка рови (нг/мл)

? Е В ООС Б

1 Норма 21 64±3 19,9+1,1 3,8+0,3 4,0±0,4 2,4+0,2 3,3+0,2

2 вгкг (стертая • форма) 19 34+4 22,2+2,9 5,9±0,9 21 ±6 13,4+1,8 1,8±0,1

3 Альдостерома 10 85,2+5 26+3 16,0+2,5 31+8 12,3+1,9 4.0+0,2

4 Рак коры надпочечников 12 100+15 28+5 30+6 26,9 ±2,9 44+7 4,8+1,1

5 Синдром Иценко-Кушинга 15 193+21 30+4 15,0±2,1 12+4 10+3 8,7+0,9

Таблица.9. Данные хроматографического определения кортикостероидов в моче

N Группа Количество Моча (м кг/24 ч

обследуемых наблюдаемых Г Ь Р/Е

1 Норма 21 13,310,6 3512,1 0,40+0,02

2 ВКГН (стертая форма) • 19 5,8+0,6 24,4+2,8 0,26±0,02

3 Альдостерома 10 6,0+1.2 25*, 0,26+0,04

4 Синдром Иценко-Кушинга 15 241¿12 266+16 0,91:0,1

Разработанная методика метрологически аттестована и используется для определения кортикостероидов в клинической лаборатории.

ВЫВОДЫ.

1. Выявлены факторы, определяющие закономерности хрсматографического и электрофоретичсского разделения стероидных гормонов: состав элюента (ацетонитрил -вода) и рабочего электролита (25 мМ ортофосфорная кислота; рН=2,5), концентрация мицеллообразователя (10 мМ ДДС11), природа и концентрация органических модификаторов (20% метанола и 4,5М раствора мочевины) в составе буферного электролита и подвижной фазы.

2. Обнаружен эффект доминирующего влияния Р-циклодекстрина, введенного в состав элюента, в изократичсском режиме ОФ ВЭЖХ на разделение стероидов, и проведена количественная оценка имеющего место комплексообразовання. Показано, что наиболее

прочные комплексы с ЦД образуют более гидрофобные стероиды - тестостерон и 11-дезоксикортикостерон.

3. Оптимизирован регламент пробоподготовки биологических жидкостей при определении стероидных гормонов и показано, что для анализа сыворотки крови предпочтительно использование твердо-фазной экстракции (сорбционные патроны элюент - этанол).

4. Установлено, что использование динамического концентрирования (стэкинга и свипинга) при определении стероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии позволяет снизить предел обнаружения при стэкинге — в 20 раз, при свипинге в 100 раз.

5. Установлено влияние рН, состава и концентрации буферного электролита (50 мМ ацетатно-аммиачный буфер с добавкой 5 мМ диэтиламин гидрохлорида; рH=4,5), режима работы электроспрейя (напряжение + 4 кВ; скорость газа-осушителя — 5 л/мин; скорость потока обволакивающей жидкости - 4 мкл/мин; состав обволакивающей жидкости: изопропиловый спирт/ вода (50:50 %, по объему), 0,5% уксусная кислота) на разделение катехоламинов в капиллярном зонном электрофорезе с масс-спектрометрическим детектированием.

6. Получены сравнительные количественные характеристики методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ с УФ детектированием при определении стероидных гормонов. По эффективности и времени анализа МЭКХ предпочтительна по сравнению с ОФ ВЭЖХ, незначительно уступая по пределу обнаружения.

7. На основании установленных закономерностей разработаны методики определения стероидных гормонов в сыворотке крови и моче методами изократической ОФ ВЭЖХ и МЭКХ и получены характеристические стероидные профили, используемые для диагностики эндокринных патологий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Великанова ЛИ , Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Шафигулина З.Р., Серебрякова И.П., Милютина О.Л. Диагностическое значение ВЭЖХ кортикостероидов при различных патологиях системы гипофиз - кора надпочечников. Клиническая лабораторная диагностика. 2001. №10. С. 34 -35.

2. Ворохобина Л.В., Великанова Л.А., Бессонова Е.А., Серебрякова И.П. Некоторые особенности стероидогенеза у больных с различными формами врожденной гиперплазии коры надпочечников. Тезисы научно-практической конференции молодых ученых

СПбМАПО "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". 2001. С. 40-42.

3. Великанова Л.И., Карцова Л.А, Бессонова ЕА., Шафигулина З.Р. Диагностическое значение ВЭЖХ кортикостероидов в биологических жидкостях при различных патологиях системы коры надпочечников Тезисы симпозиума «Национальные дни лабораторной медицины» России. 9-11 октября СПб. 2001. С.72.

4. Великанова Л.И., Карцова Л.А, Бессонова Е.А., Арефьева Е.В., Егорова IIJI. Диагностическое значение ВЭЖХ для анализа кортикостероидов в биологических жидкостях у больных с патологией надпочечников. Материалы 4-го Всероссийского конгресса эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии». СПб. 2001. С. 56.

5. Ворохобина, Л.В.. Великанова, Л.И. Кораблина И.П., Бессонова Е.А., Крихели И.О., Арефьева Е.В. Некоторые особенности стероидогенезау больных со стертой формой врожденной гиперплазии коры надпочечников. Материалы 4-го Всероссийского конгресса эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии». 2001. СПб. С.78.

6. Карцова Л.А., Полякова Е.А., Великанова Л.И., Королева Е.М. Определение кортикостероидов в сыворотке крови методом жидкостной хроматографии. Тезисы IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии. 24-28 апреля. 2001г. Москва, с. 177.

7. Карцова Л.А., Великанова Л.И., Бессонова Е.А. Оптимизация процедуры пробоподготовки при ВЭЖХ-анализе стероидных гормонов в биологических матрицах. Тезисы VIII Всероссийского симпозиума по жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. 15-19 октября . Москва. 2001.С.96

8. Карцова ЯЛ, Великанова Л.И., Бессонова ЕА., Павлова Е.Г.. Интерпретация хроматографических профилей кортикостероидов в биологических жидкостей полученных методов. ОФ-ВЭЖХ для диагностики патологии коры надпочечников. Тезисы Всероссийского симпозиума «Современным проблемам хроматографии» 18-22 марта 2002 г. Москва. С. 99.

9. Великанова Л.И., Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Павлова Е.Г., Крихели И.О., Шафигуллина З.Р., Серебрякова И.П. ВЭЖХ кортикостероидов биологических жидкостей в ранней диагностике патологий коры надпочечников. Тезисы 1 International conference «High medical technologies in XXI century» November 2-9 2002, Spain Benidorm. P. 62.

10. Карцова Л.А., Бессонова Е.А. Изучение влияния Р-циклодекстрина на разделение смеси стероидных гормонов коры надпочечников методом ОФ ВЭЖХ. Тезисы

Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии» 18-22 марта. 2002 г. Москва. Клязьма. С. 104.

11. Карцова Л.А., Великанова Л.И., Павлова Е.Г., Бессонова ЕЛ. Интерпретация хроматографических профилей кортикостероидов биологических жидкостей, полученных методом ВЭЖХ, для диагностики патологии коры надпочечников. Тезисы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии». 24-31 марта 2002 . Москва. С.99.

12. Kartsova LA., Velikanova L.I., Pavlova E.G., Bessonova E.A. The investigation of steroidogenic characters and corticosteroids metabolism by RP-11PLC. Illrd International symposium on separations in BioSiences "100 years of Chromatography". 13-18 may 2003 Moscow. P. 118.

13. Velikanova L.I., Kartzova L.A., Serebryakova I.P., Gloukhov N.V., Bessonova EA., Pavlova E.G. "High I'erformance Liquid Chromatography of corticosteroids in the Diagnosis of Adrenal Steroidogenesis Abnormalities in different forms of Hyperandrogenism" // 11 Международный конгресс «Современные медицинские технологии XXI века» Бенидорм, Испания, 1-7 ноября 2003 Р.92.

14. Великанива Л.И., Ворохобина Н.В, Серебрякова И.П., Павлова Е.Г., Бессонова Е.А. Диагностическое значение хрома гографических профилей кортикостероидов при различных формах надпочечниковой гиперандрогении // Конференция «Врачи мира пациентам». Санкт-Петербург. Сентябрь 2003. С. 15-16.

15. Карцова Л.А, Великанова Л.И, Бессонова Е.А., Сидорова А.А, Казаков В.А., Тверьянович И.А Определение адреналина, норадреналина и дофамина, методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием. Журн. Аналит. химии. 2004. Т. 59. С. 815-823.

16. Карцовэ Л.А., Сидорова А.А., Казаков В.А., Бессонова Е.А., Яшин А.Я. «Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и ОФ'ВЭЖХ» // Всероссийский симпозиум «Хрома гографья и хроматографические приборы». 15-19 марта 2004г. Москва. С. 199.

17. Карцова А.А., Бессонова Е.А., Великанова Л.И. «Определение кортикостероидов в сыворотке крови методом мицеллярной электрокинетической хроматографии». // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы». 15-19 марта 2004. Москва. С.239.

ЛР № 040815 от 22.05.97.

Подписано к печати 12.04.2004 г. Формат бумаги 60X84 1/16 Бумага офсетная. Печать ризографическая. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 3225. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ с оригинал-макета заказчика. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26.

» - « л з г

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Общие сведения о стероидных гормонах и их классификация.

1.2. Биосинтез и метаболизм кортнкостероидов. Биологические формы и действие кортнкостероидов в организме.

1.3. Физико-химические методы исследования стероидных гормонов.

1.3.1. Иммунологические методы.

1.3.2. Хроматографические методы анализа стероидных гормонов.

1.3.2.1. Определение стероидов методом тонкослойной хроматографии.

1.3.2.2. Газовая хроматография (ГХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) при определении стероидов.

1.3.2.3. Определение стероидных гормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

1.3.2.3.1. Использование циклодекстринов (ЦД) в хроматографии стероидов.

1.3.2.3.2.Методы детектирования стероидных гормонов.

1.3.2.4. Мицеллярная жидкостная хроматография.

1.3.3. Определение кортнкостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).

1.3.3.1. Поверхностно-активные вещества, используемые в МЭКХ для разделения стероидных гормонов.

1.3.3.2. Буферные системы, используемые в МЭКХ стероидов

1.3.3.3. Влияние модификаторов в составе ведущего электролита на разделение кортикостероидов методом МЭКХ.

1.4. Подготовка биологических объектов к анализу.

1.4.1. Гидролиз коньюгатов стероидов.

1.4.2. Методы экстракции стероидных гормонов.

1.5. Биосинтез и метаболизм катехоламинов.

1.6. Физико-химические методы исследования катехоламинов.

1.6.1. Иммунологические методы определения катехоламинов.

1.6.2. Газовая хроматография для определения катехоламинов.

1.6.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) катехоламинов.

1.6.4. Использование метода капиллярного электрофореза (КЭ) для определения катехоламинов (КА).

1.6.5. Детектирование катехоламинов в ВЭЖХ и КЭ.

1.6.6. Сравнительный анализ физико-химических методов определения катехоламинов.

1.6.7. Пробоподготовка реальных объектов к анализу катехоламинов.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Реактивы и материалы.

2.2.1. Подготовка рабочих растворов.

2.2.2. Отбор пробы.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении стероидов и катехоламинов.

2.3.2. Капиллярный электрофорез.

2.4. Подготовка биологических объектов к анализу.

2.4.1. Подготовка биологических объектов к анализу смесей стероидных гормонов.

2.4.1.1. Жидкостная экстракция.

2.4.1.2. Твердофазная экстракция.

2.4.1.3. Определение стероидных гормонов методом ТСХ

2.4.2. Оптимизация пробоподготовки при определении катехоламинов.

2.4.2.1. Подготовка сорбента для экстракции катехоламинов.

2.4.2.2. Твердофазная экстракция катехоламинов.

ГЛАВА 3. УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ {ОФ ВЭЖХ) И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ (МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ) РАЗДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ.

3.1 Факторы, влияющие на разделение стероидов в режиме ОФ

ВЭЖХ.

3.2. Влияние добавки Р-циклодекстрина на разделение стероидных гормонов в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ.

3.3 Расчет констант устойчивости, образующихся комплексов между |3~циклодекстрином и стероидами.

3.4. Сравнительная оценка жидкостной и твердофазной экстракции при определении кортикостероидов в сыворотке крови и в моче.

3.5. Факторы, влияющие на разделение кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.

3.6. Методы on-line концентрирования в МЭКХ при определении стероидных гормонов в биологических жидкостях.

3.7. Определение стероидов в биологических объектах методом

МЭКХ.

3.8. Сопоставление полученных результатов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с методом ОФ ВЭЖХ.

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ МЕТОДАМИ КЭ-УФ И КЭ-МС.

4.1. Факторы, влияющие на разделение катехоламинов в капиллярном зонном электрофорезе.

4.2. Факторы, влияющие на стабильность электрораспыления и чувствительность ESI-MS-детектирования.

4.3. Определение катехоламинов в реальных объектах методом КЭ-МС.

4.4. Сопоставление методов КЭ-МС и ОФ ВЭЖХ при определении катехоламинов.

ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ.

5.1. Закономерности изменения стероидных профилей при различных дисфункциях коры надпочечников.

5.1.1. Подготовка пробы к анализу.

5.1.2. Характеристические стероидные профили при различных дисфункциях коры надпочечников методом ОФ-ВЭЖХ.

Разработка метода определения стероидов и биогенных аминов (адреналина, норадреналина, дофамина) в плазме и сыворотке крови, тканях мозга и других биологических объектах является чрезвычайно важной задачей при диагностике различных заболеваний. Колебание их концентраций отражает целый ряд патологических состояний в организме человека.

Низкие концентрации стероидных гормонов (на уровне нг/мл) и катехоламинов в биологических объектах (на уровне нг и пкг), требуют высокочувствительного и селективного метода их определения.

Несмотря на активный интерес, проявляемый в мире к анализу биологических объектов на содержание стероидов, имеющиеся публикации в основном касаются либо определения ограниченного спектра кортикостероидов, либо соотношения важнейших из них - кортизола к кортизону.

В отечественной литературе опубликованы лишь единичные работы [24] в этой области. Традиционные методы определения стероидов -радиоиммунный и иммуноферментный анализы - имеют серьезные ограничения.

Наибольшее число публикаций по определению стероидов экзо- и эндогенного происхождения посвящено использованию ОФ ВЭЖХ в градиентном режиме. При этом для биологических объектов возникает проблема воспроизводимости факторов удерживания. Изократический режим вследствие резко различающейся гидрофобности стероидов приводит к значительному увеличению времени анализа с одновременным снижением эффективности разделения.

Определенные перспективы в улучшении селективности и эффективности разделения открываются при использовании в составе элюента различных комплексообразующих добавок.

Традиционный вариант решения этой проблемы в случае катехоламинов - ОФ ВЭЖХ с электрохимическим или флуориметрическим детектором. В последнем случае требуется предварительное получение производных. При этом варьирование рН и изменение содержания органического модификатора в подвижной фазе ВЭЖХ не решает задачи разделения исходных биогенных аминов с основными свойствами, их нейтральных и кислых метаболитов, а также аминокислот в одном хроматографическом цикле.

По химической природе эти классы соединений заметно различаются: одни (стероидные гормоны) представляют собой нейтральные соединения, различающиеся по гидрофобности; другие -биогенные амины - могут быть проанализированы в виде катионов или анионов.

Многообразие методов электрофоретического разделения позволяет проводить разделение ионных аналитов (катехоламины) - методом капиллярного зонного электрофореза и нейтральных (кортикостероидов) -методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).

Сопряжение режима зонного капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием представляется весьма перспективным при аналитическом решении задач определения катехоламинов в биологических жидкостях, что обусловлено сочетанием высокой эффективности разделения, малым объемом пробы нл), универсальным детектированием.

В данной работе проведено комплексное исследование, посвященное установлению закономерностей и выявлению доминирующих факторов при электрофоретическом и хроматографическом разделении стероидов и катехоламинов.

Полученные в работе результаты востребованы медицинской практикой.

Выводы.

1. Выявлены факторы, определяющие закономерности хроматографического и электрофоретического разделения стероидных гормонов: состав элюента (ацетонитрил - вода) и рабочего электролита (25 мМ ортофосфорная кислота; рН=2,5), концентрация мицеллообразователя (10 мМ ДДСН), природа и концентрация органических модификаторов (20% метанола и 4,5М раствора мочевины) в составе буферного электролита и подвижной фазы.

2. Обнаружен эффект доминирующего влияния Р -цикло декстрина, введенного в состав элюента, в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ на разделение стероидов, и проведена количественная оценка имеющего место комплексообразования. Показано, что наиболее прочные комплексы с ДД образуют более гидрофобные стероиды - тестостерон и 11-дезоксикортикостерон.

3. Оптимизирован регламент пробоподготовки биологических жидкостей при определении стероидных гормонов и показано, что для анализа сыворотки крови предпочтительно использование твердо-фазной экстракции (сорбционные патроны Cjg; элюент - этанол).

4. Установлено, что использование динамического концентрирования (стэкинга и свипинга) при определении стероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии позволяет снизить предел обнаружения при стэкинге ~ в 20 раз, при свипинге ~ в 100 раз.

5. Установлено влияние рН, состава и концентрации буферного электролита (50 мМ ацетатно-аммиачный буфер с добавкой 5 мМ диэтиламина; рН=4,5), режима работы электроспрейя (напряжение + 4 кВ; скорость газа-осушителя - 5 л/мин; скорость потока обволакивающей жидкости - 4 мкл/мин; состав обволакивающей жидкости: изопропиловый спирт/ вода (50:50 %, по объему), 0,5% уксусная кислота) на разделение катехоламинов в капиллярном зонном электрофорезе с масс-спектрометрическим детектированием.

6. Получены сравнительные количественные характеристики методов ОФ ВЭЖХ и МЭКХ с УФ детектированием при определении стероидных гормонов. По эффективности и времени анализа МЭКХ предпочтительна по сравнению с ОФ ВЭЖХ, незначительно уступая по пределу обнаружения.

7. На основании установленных закономерностей разработаны методики определения стероидных гормонов в сыворотке крови и моче методами изократической ОФ ВЭЖХ и МЭКХ и получены характеристические стероидные профили, используемые для диагностики эндокринных патологий.

1. РозенВ.Б. Основы эндокринологии. М.: Мир, 1972.С. 384.

2. Под ред. М.С. Бирюковой. Эндокринные заболевания и синдромы. Вирилизм. "Знание-М" М., "Знание" Запорожье, 1999. С.310.

3. Герег Ш. Количественный анализ стероидов. М.: Мир, 1985.

4. Pirkko Volin. High-performance liquid chromatographic analysis of corticosteroids.//J. Chromatogr. B. 1995. V. 671. P. 319-340.

5. Nozaki O. Steroid analysis for medical diagnosis. Review. // J. Chromatogr. A. 2001. V: 935. P. 267-278.

6. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под редакцией Тица Н.У.// Изд. «Лабинформ» М. 1997.С. 350.

7. Hartmann S., Steinhart Н. Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meat by GC-MS.// J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1997. V. 704 (1+2). P. 105-117.

8. Honour J.W. Steroid profiling.// Ann. Clin. Biochem. 1997. V. 34. N. 1. P. 3244.

9. Орлов E.H., Антипов E.M., Николаев H.H. Некоторые аспекты получения стероидных профилей мочи. // Вопросы медицинской химии. 1993. № 5. С. 79.

10. Wudy S. A., Harmatin М., Homoki J. Hormonal diagnosis of 21-hydrolxylase deficiency in plasma and urine of neonates using benchtop gas chromatography -mass spestrometry. //Journ. ofEndocrin. 2000. V. 165. P. 679-683.

11. Jap В. K., Johnston G.A.R., Kazlauskas R. Routine screening and quantitation of urinary corticosteroids using bench-top gas chromatography mass-selective detection.//J. Chromatogr. B. 1992. V. 573. P. 183-190.

12. Shibasaki H., Arai I., Furuta T. and Kasuya Y. Simultaneous determination of serum Cortisol and cortisone in humane plasma by stable-isotope dilution mass-spectrometry.// J. Chromatogr. B. 1992. V. 576. N. 1. P. 47-52.

13. Fallon A., Booth R.F.G., Bell L.D. Applications of HPLC in biochemistry. Elsevier Science Publishers B.V. 1987. P. 410.

14. Pirkko Volin. Simultaneous determination of serum Cortisol and cortisone by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection.// J. Chromatogr. B. 1992. V. 584. P. 147-155.

15. Amin M., Harrington K., Wandruszka von R. Determination of steroids in urine by micellar HPLC with detection by sensitized terbium fluorescence.// Anal. Chem. 1993. V. 65. P. 2346-2351.

16. Carpene G., Vettoretti A., Pedini F., Rocco S., Mantero F., Opocher G. Hypertensiv congenital adrenal enzymatic defects detected by high-performance liquid-chromatography of corticosteroids.// J. Chromatogr. B. 1991. V. 553. P. 201-204.

17. C. Lejeune-Lenain, S. Kina, D. Bosson. Preparative HPLC for analysis of mineralocorticoids in human plasma/// Chromatographia. 1987. V. 24. P. 333336.

18. Hariharan M., Naga S., VanNoord Т., Kindt E.K. Simultaneous assay of corticosterone and Cortisol in plasma by reversed-phase liquid chromatography.// Clin. Chem. 1992. V. 38. N. 3. P. 346-352.

19. Turnell D.C., Cooper J.D.H., Green В., Hughes G., Wright D.J. Tottally automated liquid-chromato graphic assay for Cortisol and associated glucocorticoids in serum, with use of ASTEM sample preparation. // Clin. Chem. 1988. V. 34. N. 9. P. 1816-1820.

20. Hariharan M., Naga S., VanNoord Т., Kindt E.K. Assey of human plasma cortison by LC, normal plasma concentrations (between sand 10 a.m.) of cortisone and corticosterone.// J. Chromatogr. 1993. V. 613. P. 195-201.

21. T. Yoshitake, S. Нага, M. Yamaguch, Y. Ohkura, S. Gorog. Measurement of 21-hydroxy corticosteroids in human and rat sera by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection.// J. Chromatogr. 1989 V. 489. N. 2. P.364-369.

22. Королева E.M., Гампер H.JI., Великанова Л.И. Определение кортикостероидов плазмы крови методом микроколоночной жидкостной хроматографией.//Журнал аналитической химии. 1996. Т. 29. С. 16-24.

23. Mc Whinney B.C., Ward G., Hickman P.E. Improved HPLC method for simultaneous analysis of Cortisol, 11-deoxycortisol, prednisolone, methylprednisolone, dexamethasone in serum and urine.// Clin. Chem. 1996. V. 42. N. 6. P. 979-981.

24. Kuronen P., Volin P., Laitalainen T. Reversed-phase HPLC screening method for serum steroid using retention index and diod-array detection. // J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 1998. V. 718. N. 2. P. 211-224.

25. А. Хеншен, К.-П. Хуле, Ф. Лотшпайх, В. Вельтер. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М. Мир. 1988. С. 580.

26. L.R.Snyder, J.L. Glajch, J.J.Kirkland. Practical HPLC method development. US 1988. P. 320.

27. Shoneshofer M., Weber В., Dulche H.J. Estimation of free urinary aldosteroneand 18-hydrocorticisterone by a combination of automatic high-performance liquid chromatography and radioimmunoassay.// J. Chromatogr. 1982. V. 227. P. 492496.

28. Nozaki O., Ohata Т., Ohaba J., Moriyama H., Kato J. Determination of serum Cortisol by reversed-phase liquid chromatography using precolumn sulphuric acid-ethanol fluorescence derivation and column switching.// J. Chromatogr. 1991. V. 570. P. 1-7.

29. Ji~qing W., Xian-teng Z., Ji-lu W. Simultaneous measurement of eight corticosteroids by liquid chromatography and application of the procedure to diagnosis of congenital adrenal hyperplasia. // Clin. Chem. 1987. V. 33. N. 8. P. 1354-1359.

30. Stoner E., Loche S., Mirth A.M., New M.I. Clinical utility of adrenal steroid measurement by high-performance liquid chromatography in pediatric endocrinology. //J. Chromatogr. 1986. V. 374. P. 358-362.

31. Stolker A.A.M., Schwillens P.L.W.J., van Ginkel L.A., Brinkman U.A.Th. Comparison of different liquid chromatography methods for the determination of corticosteroids in biological matrices. // J. Chromatogr. A. 2000 V. 893. P. 55-67.

32. Морозова М.Г., Гампер Н.Л., Дубинина Ю.Л., Нуллер Ю.Л., Лебедев А.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией. // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. №4. С. 14-16.

33. Steffen Steffenrud and George Maylin. Termospray liquid chromatography -mass spectrometry of corticosteroids.// J. Chromatogr. B. 1992. V. 577. P. 221227.

34. Ohno M., Yamaguchi I., Saiki M., Yamamoto I., Azuma J. Specific determination of urinary 6(3-liydroxycortisol and Cortisol LC-MS. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 746. P. 95-101.

35. Miksik I., Vylitova M., Pach J., Deyl Z. Separation and identification of corticosterone metabolites by liquid chromatography electrospray mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 726. P. 59-69.

36. Marwah A., Marwah P., Lardy H. Liguid chromatography electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat plasma using selected ion monitoring. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 757. P. 333-342.

37. Csehati Т., Forgacs T. Effect of {3-cyclodextrin derivatives on the retention of steroidal drugs.//J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 1996. V. 681. N. 1 P. 205211.

38. NurekD., Kleyle R.M., Mc Cain C.L., Risley D.S., Ruterbories K.J. Statistical method for quantifying mobile phase selectivity in one- and two- dimensional over pressured layer chromatography.// Anal. Chem. 1997. V. 69. N. 7. P. 1398 -1405.

39. Feuske M., Schonheiter H. Thin-lair chromatography on silica coated aluminum sheet as an adjunct to radioimmunoassay of steroid.// J. Chromatogr. 1991. V. 563. N. 1. P.178-183.

40. Резников А.Г. Методы определения гормонов. // Киев. 1980. С. 266-267.

41. Сергеев П.В. Стероидные гормоны. //М. Наука. 1984. 239 С.

42. Shibasaki Н., Furuta Т., Kasuya J. Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography termospray mass spectrometry using stable isotope dilution.// J. Chromatogr. B. 1997. V. 692. N. 1. P. 7-14.

43. Masatoki Katayata. Determination of corticosteroids in plasma by HPLC after pre-column derivatization with 2-(4-carboxyphenyl)-5,6-dimethylbenzimidazole.// J. Chromatogr. B. 1993. V. 612. P. 33-39.

44. Taylor M.R., Teale P., Westwood S.A., Perrett D. Analysis of corticosteroids in biofluids by capillary electrochromatography with gradient elution.// Anal. Chem. 1997. V. 69. N.13. P. 2554-2558.

45. Oka K., Noghi M., Kitamura Т., Shima S. Liquid chromatography and radioimmunoassay compared for determination of Cortisol and corticosterone in plasma after a dexamethasone suppression test. // Clin. Chem. 1987. V. 33. N. 9. P. 1639-1642.

46. Stoner E., Loche S., Mirth A.M., New M.I. Clinical utility of adrenal steroid measurement by high-performance liquid chromatography in pediatric endocrinology.// J. Chromatogr. 1986. V. 374. P. 358-362.

47. Flood K.G., Reynolds E.R., Snow N.H. Characterization of inclusion complexes of dexamethasone related steroids with cyclodextrins using high-performance liquid chromatography. //J. Chromatogr. A. 2000. V. 903. P. 49-65.

48. Hughes G., Green В. Urinary excretion rates of 15 free steroids, potential utility in defferential diagnosis of Cushing's syndrome.// Clin Chem 1986. V. 32. N.l.P. 93-96.

49. Карцова JI.А. Макроциклы как компоненты хроматографических фаз. // Докторская диссертация. 2002. СПб. СПбГУ. 320 С.

50. Forgacs Т., Csehati Т. Interaction of some steroid drugs with p-cyclodextrin polymer. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 845. P. 447-453.

51. Shneiderman E., Stalcup A.M. Review. Cyclodextrins: a versatile tool in separation science. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 745. P.83-102.

52. Connors K.A. The stability of cyclodextrin complexes in solution.// Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 1325-1357.

53. Gunasingham H., Tay B.T., Ang K.P. Determination of estriol in pregnancy urine by normal-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection.//J. Chromatogr. 1985. V. 341. P. 271-276.

54. Appelblad P., Irgum K. Review. Separation and detection of neuroactive steroids from biological matrices.// J. Chromatogr. A. 2002. V. 955. P. 151-182.

55. Столяров В.В., Савинов И.М., Виттенберг А.Г., Карцова Л.А.и др. Практическая газовая и жидкостная хроматография. Изд. СПбГУ. 1998. 610 С.

56. Стыскин ЕЛ, Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая ВЭЖХ. М. "Химия". 1986. 256 С.

57. Rao L.V., Petersen J.R., Bissell G., Okorodudu A.O., Mohammad A.A. Development of a urinary free Cortisol assay using solid-phase extraction -capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 730. P. 123-128.

58. Palmer J., Munro N.J., Landers J.P. A universal concept for stacking neutral analytes in micellar capillary electrophoresis. // Anal. Chem. 1999. V.71. 16791687.

59. Liu Y., Pietzyk J. Capillary-electrochromatographic separations with copolymeric reversed-stationary phase and ion-exchanger-packed columns. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 920. P. 367-375.

60. Bumgarner J.G., Khaledi M.G. Mixed micelles of short chain alkyl surfactants and bile salts in electrokinetic chromatography: enhanced separation of corticosteroids. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 738. P. 275-283.

61. Nishi H., Fukuyama Т., Matsuo M., Terabe S. Separation and determination of lipophilic corticosteroids and benzothiazepin analogues by micellar electrokinetic chromatography using bile salts. // J. Chromatogr. A. 1990. V. 513. P. 279-295.

62. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. 5. Field-enhanced sample injection with reverse migrating micelles. // Anal. Chem. 1998.V. 70. P. 1893-1901.

63. Vomastova L., Miksik I., Deyl Z. Microemulsion and micellar electrokinetic chromatography of steroids. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 681. P. 107-113.

64. Mohammand A.A., Peterson J.R., Bissell M.G. Micellar electrokinetic capillary chromatographic separation of steroids in urine by trioctylphosphine oxide and cationic surfactant. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 674. P. 31-38.

65. Palmer J., Burgi D.S., Landers J.P. Electrokinetic stacking of neutral analytes under continuous conductivity conditions. // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 632638.

66. Mohammand A.A., Bissell M.G., Peterson J.R. Micellar electrokinetic capillary chromatography to separate steroids that are increased in congenital adrenal hyperplasia. // Clinical chemistry 1995. V. 41. N. 9. P. 1369-1370.

67. Jumppanen J.H., Wiedmer S.K., Siren H., Rekkola M.-L., Haario H. Optimized separation of seven corticosteroids by micellar electrokinetic chromatography. //Electrophoresis. 1994. V. 15. P. 1267-1272.

68. Wu C.-H., Chen M.-C., Su A.-K., Shu P.-J., Chou S.-H., Lin C.-H. Determination of corticosterone in mouse plasma by a sweeping technique using micellar electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. B. 2003. V. 785. P. 317-325.

69. Kim J.-B., Otsuka K., Terabe S. On-line sample concentration in micellar electrokinetic chromatography with cationic micelles in a coated capillary. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 912. P. 343-352.

70. Palmer J., Burgi D. S., Munro N.J., Landers J.P. Electrokinetic injection for stacking neutral analytes in capillary and microchip electrophoresis. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 725-731.

71. Steard D.A., Reid R.G., Taylor R.B. Capillary electrochromatography of steroids. Increased sensitivity by on-line concentration and comparison with high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. V.798. P. 259-267.

72. Terabe S., Otsuka K., Ichikawa K., Tsuchiya A., Ando T. Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries. // Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 111-113.

73. Lin C.-E., Huang H.-C., Chen H.-W. A capillary electrophoresis study on the influence of p-cyclodextrin on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulfate. // J. Chromatogr. A. 2001.V 917. P. 297-310.

74. Ahuja E.S., Preston B.P., Foley J.P. Anionic-zwitterionic mixed micelles in micellar electrokinetic chromatography: sodium dodecyl sulfate N-dodecyl-N,N-dimethylammonium-3-propane-1-sulfonic acid. // J. Chromatogr. B. 1994. V.657. P. 271-284.

75. Palmer J., Atkinson S., Yoshida W.Y., Stalcup A.M., Landers J.P. Charged chelate capillary electrophoresis of endogenous corticosteroids. // Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 3045-3051.

76. Katzuta S., Saitoh K.J.Control of separation selectivity in micellar electrokinetic chromatography by modification of the micellar phase with solubilized organic compounds (Review). // J. Chromatogr. A. 1997. V. 780. P. 165-178.

77. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of analytes for micellar electrokinetic chromatography. I. Normal stacking mode. // J. Chromatogr. A. 1997: V. 781. P. 119-128.

78. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. II. Reversed electrode polarity stacking mode. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 791. P. 255-267.

79. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatograph. 3. Stacking with reverse migrating micelles. // Anal. Chem. 1998. V.70. P. 149-157.

80. Quirino J.P., Terabe S. Sweeping of analyte zones in electrokinetic chromatography.// Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 1638-1644.

81. Quirino J.P., Terabe S. Electrokinetic chromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 856. P. 465-482.

82. Kim J.B., Otsuka K, Terabe S. Anion selective exhaustive injection sweep -micellar electrokinetic chromatography.// J. Chromatogr. A. 2001. V. 932. P. 129-137.

83. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. // М. 1990. 410 С.

84. В.Т. Hofreiter, А.С. Mizera, J.P. Allen, A.M. Masi, W.C. Hicok. Solid-state extraction of Cortisol from plasma or serum for liquid chromatography.// Clin Chem. 1983 V. 29. N. 10. P. 1808-1809.

85. Kagedal В., Goldstein D. Catecholamines and their metabolites. Review. // J.

86. Chromatogr. B. 1988. V. 429. P. 177-233.

87. Paquette D.M., Sing R., Banks P.R., Waldron K.C. Capillary electrophoresis withlaser-induced native fluorescence detection for profiling body fluids. // J.

88. Chromatogr. B. 1998. V. 714. P. 47-57.

89. Rosano T.G., Swift T.A, Hayes L.W. Advances in catecholamine and metabolitemeasurements for diagnosis of pheochromocytoma. // Clin. Chem. 1991. V. 37. N.10. P. 1854-1867.

90. Westermami J., Hubl W., Kaiser N., Salewski L. Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by noncompetitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. // Clin. Lab. 2002. V. 48. N. 1-2. P. 61-71.

91. Lovelady H.G., Foster L.L. Quantitative determination of epinephrine and norepinephrine in the picogram range by flame ionization gas-liquid chromatography. //J. Chromatogr. 1975. V. 108. N. 1. P. 43-52.

92. Wang M.-T., Imai K., Yoshioka M., Tamura Z. Gas-liquid chromatographic and mass-fragmentographic determination of catecholamines in human plasma. // Clin. Chim. Acta. 1975. V. 63. P. 13-9.

93. Ehrhart J.-D., Schwartz J. A gas chromatography mass spectrometry assay of human plasma catercolamines. // Clin. Chim. Acta. 1978. V. 88. P. 71-9.

94. Jacob K., Vogt W., Knedel M. Schwerfeger G. Quantitation of adrenaline and noradrenaline from human plasma by combined gas chromatography high-resolution mass fragmentography. // J. Chromatogr. 1978. V. 146. P. 221-6.

95. Karoum F., Cattabeni, Costa E., Rutherven C.R.J., Sandler M. Gas chromatographic assay of picomole concentrations of biogenic amines. // Anal. Biochem. 1972. V. 47. P. 550-61.

96. Volin P. Determination of free urinary catecholamines by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 655. P. 121-126.

97. Ohkura Y., Kai M., Nohta H. Fluorigenic reactions for biomedical chromatography. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 85-107.

98. Chan E.C.Y., Wee P.Y, Ho O.Y. HPLC assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-column 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl chloride derivatization // J. Chromatogr. B. 2000. V. 749. P. 179-189.

99. Riggin R. M., Kissinger P. T. Determination of catecholamines in urine by reverse-phase liquid chromatography with electrochemical detection. // Anal. Chem. 1977. V.49.N. 13. P. 2109-2111.

100. Honda S., Takahashi M., Araki Y., Kakehi K. Postcolumn derivatization of catecholamines with 2-cyanoacetamide for fluorimetric monitoring in high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1983. V. 274. P. 45-52.

101. Mitsui A., Mohta H., Ohkura Y. High- performance liquid chromatography of plasma catecholamines using 1,2-diphenylethylenediamine as precolumn fluorescence derivatization reagent. // J. Chromatogr. B. 1985. V. 344. P. 61-70.

102. Todoriki H., Hayashi Т., Naruse H., Hirakawa A. Y. Sensitive high-performance liquid chromatographic determination of catecholamines in rat brain using a laser fluorimetric detection system. // J. Chromatogr. B. 1983. V. 276. P. 45-54.

103. Yamaguchi M., Ishida J., Yoshimura M. Simultaneous determination of urinary catecholamines and 5-hydroxyindoleamines by high-performance liquidchromatography with fluorescence detection. // Analyst. 1998. V. 123. N. 2. P. 307-11.

104. Higashidate S., Imai K. Determination of femtomole concentrations of catecholamines by high-performance liquid chromatography with peroxyoxalate chemiluminescence detection. // Analyst. 1992. V. 117. N. 12. P. 1863-68.

105. Mitsui A., Nohta H., Ohkura Y. High-performance liquid chromatography of plasma catecholamines using 1,2-diphenylethylenediamine as precolumn fluorescence derivatizationreagent. // J. Chromatogr. 1985. V. 344. P. 61-70.

106. Gerlo E.A., Sevens C. Urinary and plasma catecholamines and urinary catecholamine metabolites in pheochromocytoma: diagnostic value in 19 cases. // Clin. Chem. 1994. У. 40. N. 2. P. 250-6.

107. Soga Т., Inoue Y. Determination of catecholamines in urine and plasma by online sample pretreatment using an internal surface boronic acid gel. // J. Chromatogr. 1993. V. 620. N. 2. P. 175-81.

108. Weicker H., Feraudi M., Hagele H., Pluto R. Electrochemical detection of catecholamines in urine and plasma after separation with HPLC. // Clin. Chim. Acta. 1984. V. 141. N. l.P. 17-25.

109. Moleman P, van Dijk J. Determination of urinary norepinephrine and epinephrine by liquid chromatography with fluorescence detection and pre-column derivatization. // Clin. Chem. 1990. V. 36. N. 5. P. 732-726.192

110. Wu A.H., Gornet T.G. Preparation of urine samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines: bonded-phase phenylboronic acid, cation-exchange resin, and alumina adsorbents compared. // Clin. Chem. 1985. V. 31. N. 2. P. 298-302

111. Tsuchiya H., Hayashi T. High-performance liquid chromatographic analysis of catecholamines in biological samples by liquid/liquid extraction prepurification. // Journ. of Pharmacol. Methods. 1990. V. 23. N. 1. P. 21-30.

112. Ganhao M.F., Hattingh J., Hurwitz M.L., Pitts N.I. Evaluation of a simple plasma catecholamine extraction procedure prior to high-performance liquid chromatography and electrochemical detection. // J. Chromatogr. 1991. V. 564. N. 1. P. 55-66.

113. Rentel C., Gfrorer P., Bayer E. Coupling of capillary electrochromatography to coordination ion spray mass spectrometry, a novel detection method. // Electrophoresis 1999. Y. 20. N. 12. P. 2329.

114. Chen D.-C., Zhan D.-Z., Cheng C.-W., Liu A.-C., Chen C.-h. Determination of urine catecholamines by capillary electrophoresis with dual-electrode amperometric detection. // J. Chromatogr. B. 2001. Y. 750. P. 33-39.

115. Durgbanshi A., Kok W.Th. Capillary electrophoresis and electrochemical detection with a conventional detector cell.// J. Chromatogr. A. 1998. V. 798. P. 289-296.

116. Wallingford R.A. and Ewing A.G. Amperometric detection of catechols in capillary zone electrophoresis with normal and micellar solutions. // Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 258-263.

117. Vuorensola K., Kokkonen J., Siren H., Ketola R.A. Optimization of capillary-electrophoretic-electrospray ionization-mass spectrometric analysis of catecholamines. //Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 4347-4354.

118. Choudhary G., Apffel A., Yin H., Hancock W. Use of on-line mass spestometric detection in capillary electrochromatography. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 887. P. 85-101.

119. Britz-McKibbin P., Chen D.D.Y. Selective focusing of catecholamines and weakly acidic compounds by capillary electrophoresis using a dynamic pH junction. // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1242-1252.193

120. Kirby D. P., Thorne J. M., Gotzinger W. K., Karger B. L. A CE/ESI-MS interface for stable, low-flow operation // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 44514457.

121. Zhu R., Kok W.Th. Determination of catecholamines and related compounds by capillary electrophoresis with post column terbium complexation and sensitized luminescence detection // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4010-4016.

122. Swanek F.D., Chen G., Ewing A.G. Identification of multiple components of dopamine in a single cell by CE with scanning electrochemical detection. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 3912-3916.

123. Britz-McKibbin P., Wong J., Chen D.D.Y. Analysis of noradrenaline from 15 different dental anestetic formulations by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 853. P. 535-540.

124. Chang H.-T., Jeung E. S. Determination of catecholamines in single adrenal medullary cells by capillary electrophoresis and laser-induced native fluorescence. // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 1079-1083.

125. Siren H., Karjalainen U. Study of catecholamines in patient urine samples by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V.853. P. 527-533

126. Zhu R., Kok W.Th. Determination of catecholamines and related compounds by CE with postcolumn terbium complexation and sensitized luminescence detection. // Anal. Chem. 1997. V. 67. P. 4010 4016.

127. Imai K., Wang M.-T., Yoshiue S., Tamura Z. Determination of catecholamines in the plasma of patients with essential hypertension and of normal persons. // Clin. Chim. Acta 1973. V. 43. P. 145-9.

128. Pestoris A., Cerutti L., Sacco R., Vecchi L. De, Sbaffi A. Automated analysis of urinary catecholamines by high-performance liquid chromatography and on-line sample pretreatment. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 664. P. 287-293.

129. Raggi M.A., Sabbioni C., Casamenti G., Gerra G., Calonghi M., Masotti L. Determination of catecholamines in human plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 730. P. 201-211.

130. Москвин JI.H., Царицын Л.Г. Методы разделения и концентрирования в аналитической химии. // Л. Химия. 1991. 256 С.

131. Bovingdon М.Е., Webster R.A. Derivatization reactions for neurotransmitters and their automation. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 157-183.

132. Vuorensola K., Siren H. Determination of urinary catecholamines with capillary electrophoresis after solid-phase extraction // J. Chromatogr. A. 2000. V. 895. P. 317-327.

133. Bardelmeijer H.A., Waterval J.C.M., Lingeman H., van't Hof R., Bult A., Underberg W.J.M. Pre-, on- and post-column derivatization in capillary electrophoresis. //Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 2214-2227.

134. Kushnir M.M., Urry P.M., Frank E.L., Roberts W.L., Shushan B. Analysis of catecholamines in urine by positive-ion electrospray tendem mass spectrometry.// Clinical Chem. 2002. V. 48. N. 2. P. 323-331.

135. Kushnir M.M., Urry F.M., Frank E.L., Roberts W.L., Shushan B. Analysis of catecholamines in urine by positive-ion electrospray tandem mass spectrometry. // Clin. Chem. 2002. V. 48. N. 2. P. 323-31.

136. Nomura S., Fujitaka M., Sakuka N., Ueda K. Circadian rhythms in plasma cortisone and Cortisol and the cortisone/cortisol ratio.// Clinica Chemica Acta. 1997. V. 266. P. 83-91.1. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

137. Сокращение Полное название Английский эквивалент

138. КЭ капиллярный электрофорез СЕ, НРСЕ (Capillary Electrophoresis, High Performance Capillary Electrophoresis)кзэ капиллярный зонный электрофорез CZE (Capillary Electrophresis)

139. МЭКХ мицеллярная электрокинетическая хроматография MEKC (Micellar Electrokinetic Chromato graphy)

140. НМ-МЭКХ вариант МЭКХ с нормальной миграцией NM-MEKC (Normal Migration Electrokinetic Chromatography)

141. МС масс-спектрометрия MS (Mass-Spectrometry)

142. ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография HPLC (High Performance Liquid Chr omato graphy)

143. ОФ-ВЭЖХ обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография RF HPLC (Reversed Phase High Performance Liquid Chromato graphy)

144. ГХ газовая хроматография GC (Gas Chromato graphy)эоп электроосмотический поток EOF (Electroosmotic Flow)

145. ПАВ поверхностно-активное вещество Surfactant

146. ДДСН додецилсульфат натрия SDS (Sodium Dodecylsulfate)осн октилсульфонат натрия SOS (sodium octylsulfonate)

147. ДТАБ додецилтриметил аммоний бромид DTABбиологически-активные ПАВ: Bile salts:

148. XII холат натрия SC (Sodium Cholate)тхн таурохолат натрия STC (Sodium Taurocholate)

149. ДХН дезоксихолат натрия SDC (Sodium Desoxycholate)

150. ДГХН дегидрохолат натрия SDHC (Sodium Dehydrocholate)

151. Ы-додецил-ЬТД- диметил-3 -амино-1 -пропансульфонат SB3-12од Циклодекстрин CD (Cyclodextrin)ср-ВД сульфированный р-циклодекстрин sp-CD (cP- Cyclodextrin)ккм критическая концентрация мицеллообразования CMC (Critical Micelle Concentration)

152. ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота EDTA (Ethylene Diaminotetraacetic Acid)

153. МЭС 2-(К-морфолино)-этансульфоновая кислота, MES (2-(N-Morpholinoethanesulfonic Acid)

154. ЦАПС 3 -(циклогексиламино) пропансульфоновая кислота CAPS (3-(Cyclo-hexylamino) Propanesulfonic Acid)

155. ТОФО триоксифосфоний оксид TOPO

156. ТФЭ твердофазная экстракция SFE (Solid Phase Extraction)жжэ жидкостно-жидкостная экстракция LLE (Liquid-Liquid Extraction)1. F кортизол F (Cortisol)1. Е кортизон E (Cortison)

157. А 11-дегидрокортикостерон A (11-Dehydrocorticosterone)

158. В кортикостерон В (Corticosterone)

159. DOC 11-дезоксикортикостерон DOC (11-Dezoxycorticosteron)

160. Т тестостерон T (Testosterone)

161. ОНРг 17-гидроксипрогестерон 17-OHPr (17-Hydroxyprogesterone)

162. And андростендион And (Androstendion)

163. S 11-дезоксикортизол S (11-DeoxyCortisol)

164. Рг прогестерон Pr (Progesterone)

165. КА катехоламины CA (Catecholamine)

166. А (Е) адреналин (эпинефрин) A (E) (Adrenaline (Epinephrine))

167. NA (NE) норадреналин (норэпинефрин) NA or NE (Noradrenaline or Norepinephrine)1. ДА дофамин DA (Dopamine)

168. Сер серотонин Ser (Serotonine)

169. ДОРА дигидроксифенилаланин ДОФА1. Dihydroxyphenylalanine)тн тирозин гидроксилаза ТН (Tyro sinehydroxylase)

170. DC декарбоксилаза DC (Dehydroxylase)

171. DBH дофамин р гидроксилаза DBH (Dopamine (3-Hydroxylase)

172. PNMT фенилэтаноламин N -метилтрансфераз PNMT

173. ПТФЭ политетрафторэтилен PTFE (Polytetrafluorethylene)

174. ОФА opmo-фталевый альдегид OPA (o-Phthalialdehyde)

175. MXK монохлоруксусная кислота MCA (Monochloracetic Acid)