Оптимальные многоступенчатые системы спектрофотометрических и хроматографических методов в клинической лабораторной диагностике эндокринных заболеваний: принцип построения и применение в анализе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Колоскова Светлана Владимировна

ОПТИМАЛЬНЫЕ МНОГОСТУПЕНЧАТЫЕ СИСТЕМЫ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЭНДОКРИННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ: ПРИНЦИП ПОСТРОЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В АНАЛИЗЕ

02.00.02. - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Саратов 2006

Работа выполнена в Самарском государственном университете на кафедре аналитической и экспертной химии

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Лобачев Анатолий Леонидович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Сумина Елена Германовна

кандидат химических наук, доцент Ястребова Надежда Ивановна

Ведущая организация: Институт физической химии и

электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН

Защита состоится 27 апреля 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 при Саратовском государственном университете им. Н.Г.Чернышевского по адресу:

410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, СГУ, корп.1, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.

Автореферат разослан 17 марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Ж

доктор химических наук, профессор Ли Штыков С.Н.

5723 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Клиническая лабораторная диагностика является одной из важнейших областей современной медицины, успехи которой зависят как от уровня развития аналитической химии, так и от степени внедрения наиболее перспективных методов анализа в практику. В настоящее время возможности абсолютного большинства клинико-диагностических лабораторий нашей страны ограничены применением фотометрических методов анализа. Это не всегда дает возможность быстро и правильно провести определение диагностически значимых параметров.

Многочисленные эпидемиологические исследования установили связь гиперхолестеринемии с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. В связи с этим определение холестерина в крови является одной из самых актуальных задач современной клинической лабораторной диагностики. Анализ литературных данных показывает, что исследования в этой области ведутся, в основном, с применением химических и ферментных фотометрических методик. Отсутствуют также данные о возможности оптимизации применения комплекса аналитических методов, что дало бы возможность повысить эффективность решения задачи определении холестерина (ХС) в биологических жидкостях.

Не менее важной проблемой современной клинической биохимии является определение содержания высших жирных кислот (ВЖК) и катехоламинов (КА) в плазме крови для ранней диагностики ряда тяжких расстройств здоровья. Одним из направлений в решении этой задачи является внедрение в практику медицинских лабораторий хроматографических методов анализа. Методом ГХ можно быстро выявлять малейшие изменения в содержании и соотношении ВЖК различного строения, что позволяет диагностировать ряд серьезных заболеваний эндокринной системы. Внедрение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения содержания катехоламинов в плазме крови позволяет с высокой точностью проводить диагностику гормонально активных опухолей хромафинной ткани на ранних стадиях заболевания.

Делью работы явилась разработка системного подхода к определению основных показателей липидного, кальций-фосфорного обмена и катехоламинов в биологических жидкостях человека спектрофотометрическими и хрома-тографическими методами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи;

• систематизировать и оценить аналитические и метрологические характеристики методов, применяемых в клинико-диагностических лабораториях для определения параметров липидного и кальций-фосфорного обмена;

• оптимизировать условия спектрофотометрического определения некоторых показателей липидного и кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях;

• выбрать оптимальные условия и разработать методики хроматографиче-ского определения катехоламинов, высш^Гд^щ^иелот и холестерина

в плазме крови; I Библиотека '

• выявить возможности использования совокупности основных параметров биологических жидкостей для решения классификационных задач в целях ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга лечебного процесса.

Научная новизна работы

• изучена возможность использования системы методов жидкостной хроматографии, включающей планарные варианты (бумажную и тонкослойную) и ВЭЖХ, для определения холестерина в сыворотке крови с целью оптимизации процесса диагностики нарушений липидного обмена;

• разработана рациональная многоступенчатая схема определения холестерина и высших жирных кислот, включающая спектрофотометрические и хроматографические методы анализа;

• разработана и внедрена методика ВЭЖХ - определения катехоламинов и холестерина при их совместном присутствии в пробе с использованием мультидетекторной схемы;

• показана принципиальная возможность применения элементов метода распознавания образов для обработки совокупности результатов определения содержания ключевых веществ в биологических жидкостях человека с целью решения классификационных задач;

• оптимизированы условия аналитического определения основных биохимических показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека.

Практическая значимость работы

• на основе результатов проведенных исследований предложены и внедрены в практику работы диагностической лаборатории тест-методики определения ХС и ВЖК;

• разработана и внедрена в практику работы лабораторий СамГМУ методика газохроматографического определения высших жирных кислот в плазме крови;

• разработана и внедрена методика определения ХС в плазме крови методом ВЭЖХ;

• предложена и внедрена многоуровневая схема определения ХС и ВЖК с использованием комплекса аналитических методик;

• разработан и внедрен в практику клинико-диагностической лаборатории ООО «Центр «Диабет» ВЭЖХ - методика количественного определения катехоламинов в плазме крови;

• разработана и внедрена в практику система классификации образцов биологических жидкостей в целях ранней диагностики расстройств здоровья, основанная на графическом представлении совокупности ключевых параметров крови и мочи.

Положения, выносимые на защиту

• многоступенчатая система определения параметров липидного обмена, включающая спектрофотометрические, колоночные и плоскостные хроматографические методы;

• оптимальные условия спектрофотометрического определения биохимических показателей обменных процессов;

• оптимизация хроматографического определения параметров липидного обмена, катехоламинов в плазме крови;

• разработанные методики определения основных показателей обменных процессов и система использования совокупности ключевых параметров биологических жидкостей для ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга процесса лечения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999г); I Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 1999); Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000); IV Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 2001); VII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (к 100 - летаю со дня рождения К.В.Чмутова) (Москва, 2002); XII Всероссийской конференция по газовой хроматографии (Самара, 2002); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), V Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы: 3 статьи в центральной печати, 1 статья в сборнике научных трудов, 18 тезисов докладов. Струюгура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы (203 наименования) и приложений. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 33 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая значимость работы, перечислены положения, выносимые на защиту.

Обзор литературы (глубиной в 20 лет) состоит из 3 разделов, в которых обсуждены методы определения ХС, ВЖК и КА в биологических жидкостях человека. Проведен анализ возможностей химических, ферментных и хромато-графических методов определения ХС, описанных в литературе, обсуждены преимущества и недостатки каждой группы методов. Рассмотрены физико-химические методы определения ВЖК в плазме крови, особенности пробопод-готовки. Обсуждены методики подготовки пробы, условия хроматографического разделения и особенности детектирования катехоламинов.

Во 2-й главе представлены методы исследования, которые применялись для решения поставленных в работе задач: спектрофотомерия, газовая, бумажная, тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография. Описаны реагенты и аппаратура, используемые в работе, рассмотрены общие характеристики объектов исследования.

Глава 3. Многоуровневая система определения холестерина в плазме крови человека

Определение содержания холестерина методом планарной хроматографии

Определение порогового содержания ХС, являющейся нормой для здорового человека (1600-2600 мг/л) проводили с помощью разработанной нами методики (бумажная хроматография). Подвижной фазой служила система: Н20-СНзСООН (0,25% кислоты в воде). Для проявления применяли пары йода. Для ХС нами было рассчитано значение Rf, которое составило 0,87± 0,03. Невысокая ошибка определения Rf, а также легкость и высокая чувствительность проявления зоны холестерина на хроматограмме позволяет рекомендовать данный метод для использования в практике клинических лабораторий для качественного (идентификация) и полуколичественного определения ХС в сыворотке крови.

Определение холестерина фотометрическими методами

В случае отклонения содержания ХС в крови от нормы определение данного биологически активного вещества проводилось альтернативными методами. Нами были изучены различные варианты фотометрического метода определения ХС. Анализ литературных данных показал, что ХС сыворотки крови и его эфиры дают цветное окрашивание при взаимодействии с серной кислотой и солями железа (III), а также при обработке смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной кислот (1:5:1).

Экспериментальные исследования показали, что прямые методики определения ХС обладают низкой специфичностью. Для устранения мешающего действия интерферирующих веществ нами была предпринята попытка модифицировать методику путем предварительной экстракции ХС изопропанолом. Далее анализировали надосадочную жидкость, используя реакцию ХС с хлорным железом.

Метрологические характеристики исследуемых методик оценивались на примере определения ХС в аттестованном контрольном материале (с известной нормальной (2000 мг/л) и патологической (3200 мг/л) концентрацией ХС).

Рассчитанное значение критерия Стьюдента сравнивали с табличным при числе степеней свободы fNi-l и доверительной вероятности Р равной 0,95. t та6 (0,95;19)=2,09. Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что при нормальной концентрации ХС в контрольном материале все три методики удовлетворяют условиям правильности. Прямое определение ХС в патологической сыворотке по реакциям с хлорным железом и уксусным ангидридом характеризуется наличием весьма существенной систематической погрешности, что не позволяет

рекомендовать данный метод для использования в практике клинико-диагностических лабораторий.

Таблица 1.

Методика определения ХС (Х± Д1)*1(Г3 Бг 1

Контрольная сыворотка с содержанием ХС 2000 мг/л

По реакции ХС с уксусным ангидридом 2,10±0,12 0,11 5,0 2,03

По реакции ХС с хлорным железом 2,10±0,11 0,11 5,0 2,05

По реакции ХС с хлорным железом с предварительным экстрагированием и-пропанолом. 2,02±0,03 0,04 1,0 1,36

Контрольная сыворотка с содержанием ХС 3200 мг/л

По реакции ХС с уксусным ангидридом 3,51±0,09 0,06 9,7 7,11

По реакции ХС с хлорным железом 3,62±0,10 0,07 12 6,98

По реакции ХС с хлорным железом с предварительным экстрагированием и-пропанолом. 3,25±0,06 0,04 1,4 1,70

Изучена возможность применения ферментной методики определения ХС, включающего в себя стадии ферментного гидролиза эфиров ХС при действии холестеринэстеразы, окисления ХС в присутствии холестериноксидазы и определения образовавшийся Н2О2 по реакции с 4-аминоантипирином в присутствии пероксидазы. Результаты определения ХС в контрольных сыворотках ферментным методом приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты определения ХС в контрольных сыворотках ферментным методом

схс*ю' п (Х± Д]р)*10'3 о,% г

2,00 мг/л 20 2,01±0,02 0,02 0,5 0,38

3,20 мг/л 20 3,22±0,04 0,03 0,6 1,86

Как видно из таблицы 2, рассчитанное значение ^критерия, меньше 1габ(0,95;19)=2,09, что свидетельствует об отсутствии значимой систематической погрешности и позволяет судить о правильности результатов определения ХС по данной методике. Относительная погрешность определения ХС в патологической (с завышенным содержанием таких интерферирующих веществ, как билирубин и глюкоза) и нормальной сыворотках статистически не различается.

Это позволяет сделать вывод, что данная методика определения ХС обладает достаточно высокой селективностью.

Нами были оценены реальные нижние пределы обнаружения ХС с помощью изученных нами методик. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Величины нижних пределов обнаружения различных методик определения ХС

Методика определения ХС С тш *10"2, мг/л

По реакции ХС с уксусным ангидридом 1,3

По реакции ХС с хлорным железом 1,3

По реакции ХС с хлорным железом с предварительным экстрагированием и-пропанолом. 1,1

Ферментная методика 0,6

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что из изученных нами фотометрических методик определения ХС, ферментная обладает наилучшими метрологическими характеристиками, высокой экспрессно-стью и простотой выполнения. Поэтому именно она может быть рекомендована к использованию в клинико-диагностических лабораториях для рутинных исследований. Однако ферментная методика не позволяет зарегистрировать малые (меньше 10 мг/л) изменения концентрации ХС, что необходимо для ранней диагностики, а также при проведении мониторинга лечения. В этом случае, как нами установлено, наиболее эффективным является метод ВЭЖХ.

Определение холестерина методом ВЭЖХ

Анализ холестерина методом ВЭЖХ осуществлялся на хроматографиче-ской колонке из нержавеющей стали 150 х 3 мм, заполненной Диасорбом С]6Т с зернением 6 мкм. Анализ проводили при 25°С и давлении 50 атм. Объем вводимой пробы - 50 мкл. ПФ служил фосфатно- цитратный буфер (рН 4,0) с 7% ацетонитрила.

Нами изучалась возможность использования стандартного УФ-детектора с фиксированной длиной волны Х=254 нм. Обнаружена линейная зависимость между концентрацией ХС и величиной получаемого сигнала. Установлена минимально определяемая концентрация ХС, которая составила 33,3 мг/л.

Таким образом, предложенная нами многоступенчатая схема определения ХС состоит из следующих последовательных этапов: полу количественное определение ХС методом бумажной хроматографии; при превышении норматива содержания ХС в сыворотке крови применение ферментной методики; в случае необходимости ранней диагностики либо при контроле процесса лечения -

применение метода ВЭЖХ. Использование предложенной нами многоступенчатой схемы, включающей в себя методы планарной, высокоэффективной жидкостной хроматографии и фотометрического анализа, позволяет эффективно решить задачу определения ХС в сыворотке крови человека в широких концентрационных пределах.

Глава 4. Определение высших жирных кислот в плазме крови человека

Нами была изучена возможность использования системы хроматографи-ческих методов, включающей ТСХ и ГХ для определения содержания ВЖК.

Для определения ВЖК методом ТСХ использовали вариант обращено-фазовой хроматографии на пластинах «БогЬШ». В качестве модификатора использовали 15%-ный раствор ундекана в гексане. Для проявления зон ВЖК использовали реакцию комплексообразования их медных солей с рубеанводород-ной кислотой. В качестве элюента использовали смеси:

ледяная уксусная кислота - ацетонитрил (1:1), насыщенная ундеканом; ледяная уксусная кислота - ацетонитрил (3:1), насыщенная ундеканом; ледяная уксусная кислота - ацетонитрил (1:3), насыщенная ундеканом; ледяная уксусная кислота - ацетон (1:1), насыщенная ундеканом. В таблице 4. приведены результаты определения ^ ВЖК.

Таблица 4

Результаты хроматографирования индивидуальных ВЖК на обработанной ундеканом пластине «БогЬШ»

Элюент Rr

С 140 Cl5 0 Ci6-o Cl80 Сго-о

СНзСООН - АН (1:1) 0,38 0,33 0,30 0,21 0,19 0,29

СНзСООН - АН (3:1) 0,37 0,38 0,34 0,22 0,25 0,36

СНзСООН-АН (1:3) 0,77 0,75 0,73 0,64 0,65 0,74

СНзСООН - ацетон (1:1) 0,56 0,55 0,50 0,39 0,37 0,48

Наилучшего разделения смеси ВЖК удалось достичь при использовании подвижной фазы: уксусная кислота - ацетонитрил (1:1). При хроматографиро-вании смеси из шести ВЖК произошло разделение на 3 труппы кислот: 1) ара-хидоновая, стеариновая (Rf=0,26); 2) олеиновая, пентадекановая, пальмитиновая (Rf=0,33); 3) миристиновая кислота (Rf=0,38).

При превышении порогового содержания суммы ВЖК в плазме крови мы проводили их ГХ- определение. Методика основана на определении ВЖК в плазме крови путем перевода их в сложные эфиры с последующим хромато-графированием. Использовали хроматограф «Хром - 5» с ПИД, с колонкой из нержавеющей стали (3000 х 3 мм) с твердым носителем Хроматон W-AW и не-

подвижной фазой ПМС - 1000. Разделение эфиров проводили в режиме программирования температуры (от 150°С до 250°С).

При анализе плазмы крови идентификация кислот проводилась по временам удерживания с использованием стандартов. Нами в крови идентифицированы миристиновая, пентадекановая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая и арахидоновая кислоты. Количественный расчет проводили методом внутренней нормализации.

Нами было проведено клиническое исследование содержания ВЖК в плазме крови 56 пожилых больных инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД). Контролем служили данные, полученные при обследовании 17 практически здоровых людей того же возраста. Результаты исследования приведены в таблице 5, хроматограмма на рисунке 1.

Рис. 1. Хроматограмма метиловых эфиров высших жирных кислот в плазме крови человека. Кл. с Хроматон W-AW и неподвижной фазой ПМС - 1 ООО (15%).

Т кл.150 - 250°С. ПФ-Не. Компоненты пробы: 1- С 140, 2- С

15 0,

3 - С 161, 4 - С 1б.о, 5 - С 18-2, 6 -С 18 1, 7 — С 18-о, 8 — С 20 4-

Таблица 5 .

Границы изменения содержания высших жирных кислот в плазме крови человека, %.

Наименование ВЖК Здоровая группа п = 17 ИНСД (> 60 лет) п = 56

Миристиновая (С14.0) 1,4 ±0,1 0,9 ± 0,1

Пентадекановая (С 150) 0,9 ±0,1 0,9 ±0,1

Пальмитиновая (С 0) 17,3 ±0,7 15 ± 1

Пальмитолеиновая (С]61) 12,8 ±0,3 12 ± 1

Стеариновая (С18 0) 7,9 ± 0,4 10,7 ± 0,7

Олеиновая (Ci81) 15,3 ±0,4 18,1 ±0,2

Линолевая (С ig 2) 20 ± 1 23 ±1

Арахидоновая (С 2о 4) 0,4 ±0,1 1,2 ±0,2

Как видно из таблицы 5, метод ГХ позволяет выявлять малейшие изменения в содержании и соотношении концентраций ВЖК различного строения, что позволяет на ранних стадиях диагностировать ряд серьезных заболеваний эндокринной системы.

Таким образом, предложенная нами схема, включающая методы ТСХ и ГХ позволяет эффективно, с наименьшими материальными затратами решить проблему определения ВЖК в плазме крови человека.

Глава 5. Определение катехоламинов и важнейших биохимических маркеров в биологических жидкостях человека

Определение катехоламинов методом ВЭЖХ

Содержание катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина) в биологических жидкостях человека является наиболее информативным показателем состояния эндокринной и симпатической нервной системы. Низкие концентрации данных биологически активных веществ в крови требуют высокочувствительных методов их определения. Наличие в молекулах КА легко окисляемых фенольных гидроксильных групп позволило предположить принципиальную возможность их определения методом ВЭЖХ с электрохимическим способом детектирования.

Нами разработана ВЭЖХ - методика определения биогенных аминов в плазме крови. Определение катехоламинов осуществляли на хроматографиче-ской колонке из нержавеющей стали 4 х 150 мм, заполненной Диасорбом С^Т с зернением 6 мкм. В качестве детектора использовали электрохимический детектор «ДЭ-106М» с 3-электродной ячейкой, рабочий потенциал которого устанавливали равным +0,65 В. Скорость потока ПФ через колонку составляла 0,5 мл/мин. Объем вводимой пробы - 50 мкл (25 мкл пробы + 25 мкл ПФ). Чувствительность - 1 нА/В. ПФ служил фосфатно- цитратный буфер (рН 4,0) с 7% ацетонитрила.

Методика пробоподготовки включала в себя обратимую сорбцию на активированном А1203 с последующим элюированием НСЮ4 и микрофильтрацией с мембраной 0,2 мкм.

Рис.2. Хроматограмма катехоламинов плазмы крови

Кл (4 х 150 мм) с Диасорб Ci6T.

ПФ - фосфатно- цитратный буфер (рН 4,0) с

7% ацетонитрила.

Компоненты пробы: 1 - НА, 2 - А,

3- ДГБА, 4 - ДА.

Идентификацию веществ осуществляли по временам удерживания с использованием соответствующих стандартов. Были идентифицированы адреналин (А), норадреналин (НА), дофамин (ДА). Количественные расчеты проводили методом внутреннего стандарта, в качестве которого использовали 3,4-дигидроксибензиламин. Хроматограмма приведена на рисунке 2.

Определение КА осуществляли у 45 больных сахарным диабетом II типа пожилого возраста, из них у 30 - в сочетании с артериальной гипертензией (СД + АГ) и у 15 - без нее (СД- АГ). Все больные имели тяжелую степень сахарного диабета с множественными поздними осложнениями.

Результаты исследований сопоставлены с 2 контрольными группами: 1) 30 практически здоровых людей молодого возраста и 2) 15 больных пожилого возраста с артериальной гипертензией, но без сахарного диабета (АГ - СД).

Таблица 6

Содержание катехоламинов в плазме крови

Группа Содержание КА Здоровая группа(п=30) СД + АГ (п=30) СД-АГ (п=15) АГ-СД (п=15)

Норадреналин, нг/мл 57,8 ± 4,6 75,3 ± 2,9 70,7 ±2,7 62,3 ± 5,7

Адреналин, нг/мл 14,7 ±2,9 29,5 ±1,9 24,1 ± 1,5 18,6 ±4,5

Дофамин, нг/мл 7,6 ± 1,1 9,1 ± 1,4 8,1 ±1,3 8,4 ±1,3

Разработанная нами методика определения КА позволила зафиксировать повышение А, НА у всех больных сахарным диабетом не зависимо от уровня артериального давления по сравнению со здоровыми. Содержание дофамина достоверно увеличивалось только у больных сахарным диабетом в сочетании с артериальной гипертензией. Таким образом, разработанная нами ВЭЖХ- методика определения КА может использоваться в медицинской практике для решения диагностических задач, выбора схемы и контроля процесса лечения эндокринных заболеваний.

Определение холестерина и катехоламинов методом ВЭЖХ при совместном присутствии

Анализ литературных данных, а также изучение опыта работы 6 клинических лабораторий г. Самары позволило сделать вывод о том, что наибольший вклад в погрешность определения ключевых для диагностирования веществ вносит использование разных методов и, главное, определение ведется не из одной пробы.

С целью выяснения возможности определения КА и ХС из одной пробы нами было изучено электрохимическое поведение холестерина в диапазоне потенциалов от +0,50 до +1,00 В с дискретом потенциала 0,05 В. При оптималь-

ном потенциале, используемом для обнаружения (+0,65 В), нами был определен предел обнаружения, который составил 333 мг/л, в то время как Cmm (ХС) тем же методом с УФ - детектированием составляет 33,3 мг/л. В связи с этим для эффективного решения задачи определения КА и ХС в одной пробе, нами разработана ВЭЖХ - методика определения ХС и КА с использованием мультиде-текторной схемы, включающей последовательно соединенные спектрофото-метрический детектор LCD 2563 (1=254 нм) и электрохимический детектор ДЭ-106 М (потенциал +0,65В). При этом УФ- детектором определяется только ХС, в то время как электрохимическим детектором - все компоненты пробы. Таким образом, мы имеем возможность определения концентрации ХС (двумя методами) и КА в одной пробе, что существенно повышает надежность определения и правильность результата анализа.

Определение показателей кальций-фосфорного обмена в биологических

жидкостях человека

К показателям кальций-фосфорного обмена, определяемым с целью диагностики ряда серьезных заболеваний, относят содержание кальция и фосфора в крови и моче, активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в крови. Информативным также является определение экскреции кальция и фосфора по отношению к креатинину в утренней порции мочи.

В литературе описаны различные варианты определения показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях, однако метрологические характеристики методик не приводятся.

Нами была изучена возможность применения двух комплексообразовате-лей: о-крезолфталеина и Арсеназо III для определения кальция в сыворотке крови фотометрическим методом.

В кислой среде ионы кальция взаимодействуют с Арсеназо-III с образованием комплекса малинового цвета, оптическая плотность раствора которого пропорциональна содержанию кальция, измерение проводится при Х= 650 (640670) нм. Крезолфталеинкомплексон образует с ионами кальция в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета. Фотометрирование проводится при Х,=578 нм. Нами было проведено определение концентрации кальция в аттестованном контрольном материале (контрольной сыворотке фирмы BioRad, с концентрацией кальция 2,50 ммоль/л) по описанным методикам. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Результаты определения кальция в контрольном материале

Реагент п (Х±АХ) sr D,% t

Арсеназо III 15 2,53 ±0,42 0,02 1,2 2,02

О-крезолфталеин 15 2,52±0,29 0,01 0,8 1,80

Как видно из таблицы, рассчитанное значение t-критерия для результатов, полученных при использовании обеих методик меньше, чем 11аб (0,95,14)=2,15 , что свидетельствует об отсутствии значимой систематической погрешности. Как видно из приведенных выше данных, относительная погрешность определения концентрации кальция в контрольной сыворотке при использовании в качестве реагента о-крезолфталеина меньше, чем в случае Арсеназо III. А меньшие значения Sr свидетельствуют о лучшей воспроизводимости результатов по данной методике.

Нами были изучены метрологические характеристики методики определения ЩФ по реакции с п-нитрофенилфосфатом. Метрологические характеристики методики оценивали путем определения активности ЩФ в аттестованных контрольных сыворотках с нормальным (2,7 мкмоль/(с*л)) и патологической (8,0 мкмоль/(с*л)) активностью фермента. Результаты статистических расчетов приведены в таблице 8.

Таблица 8.

Результаты определения активности щелочной фосфатазы

Активность ЩФ в контрольной сыворотке п (Х±Ах) sr D,% t

2,7 мкмоль/(с*л) 15 2,6 ± 1,1 0,05 3,7 1,79

8,0 мкмоль/(с*л) 15 8,2 ± 1,6 0,02 2,5 2,12

Данные таблицы 8 позволяют сделать вывод о правильности результатов, полученных с использованием данной методики. Относительная погрешность определения активности ЩФ в патологической сыворотке, которая содержит мешающие вещества, также не превышает 10%, что свидетельствует о достаточной избирательности данной методики определения активности ЩФ.

Нами были оценены метрологические характеристики методики определения фосфора по реакции с молибдатом аммония путем определения концентрация фосфора в контрольном материале с нормальным и повышенным содержанием данного аналита. Результаты приведены в таблице 9.

Таблица 9.

Результаты определения содержания фосфора в контрольных материалах

Содержание фосфора в контрольной сыворотке п (Х±Ах) sr D, % t

1,1 ммоль/л 15 1,2±0,7 0,08 4,5 1,97

3,6 ммоль/л 15 3,7±1,1 0,04 2,7 1,92

Определен линейный диапазон определения фосфора по данной методике, который составил 0,2 - 5,0 ммоль/л. Необходимо отметить, что верхний предел нормы для здорового человека составляет 1,3 ммоль/л.

Таким образом, изученные нами методики с применением различных реагентов позволяют быстро и достаточно точно провести определение кальция, фосфора и щелочной фосфатазы. Данные методики могут широко применяться в практике клинико-диагностических лабораторий, что обусловлено их простотой, доступностью реактивов и оборудования, а следовательно, относительно малыми материальными затратами на проведение исследований.

Глава 6. Использование совокупности параметров для решения классификационных задач в клинической диагностике.

Главный недостаток современной клинической диагностики - отсутствие системного подхода. Нами разработана и апробирована система обработки результатов хроматографического и спектрофотометрического определения ряда ключевых веществ в биологических жидкостях человека, позволяющая без проведения длительных и дорогостоящих функциональных обследований отнести объект исследования (пациента) к одной из категорий групп риска. Для этого была предпринята попытка рассмотрения результатов определения таких веществ в сыворотке, плазме крови и моче пациентов в виде совокупности аналитических сигналов и сравнения их с аналогичным массивом данных для «здорового» человека.

Нами было проведено исследование крови и мочи 714 больных с различной степенью снижения минеральной плотности костной ткани. В качестве «реперных» точек нами были выбраны следующие параметры: содержание кальция, неорганического фосфата, креатинина в крови и моче, активности щелочной фосфатазы в крови, а также экскреция кальция и фосфора по отношению к экскреции креатинина в утренней порции мочи. Контроль степени тяжести заболевания костной системы осуществляли с помощью ультразвукового денситометра Achilles+ (Lunar, USA). Также было проведено исследование содержания биогенных аминов в плазме крови здоровых людей, пациентов с артериальной гипертензией и больных, имеющих подтвержденные методами магнитно-ядерного резонанса и компьютерной томографии опухоли надпочечника.

Определение кальция в сыворотке крови и моче проводилось по реакции с орто-крезолфталеином, так как нами установлено, что именно эта методика характеризуется наилучшими метрологическими характеристиками. Определение неорганического фосфата проводили по методике, основанной на взаимодействии с молибдатом аммония. Активность щелочной фосфатазы определяли кинетическим методом по реакции с пара-нитрофенилфосфатом. Концентрацию креатинина в сыворотке крови и моче определяли фотометрическим методом с использованием в качестве реагента пикриновой кислоты. Для оценки состояния гепатобилиарной системы мы проводили определение активности ала-нинаминотрансферазы (AJIAT) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ). Опреде-

ление содержания катехоламинов в плазме крови проводилось методом ВЭЖХ. В таблице 10 приведена информация по проведенным нами тестам в биологических жидкостях пациентов.

Таблица 10.

Исследования, проведенные в биологических жидкостях

Объект Аналитический параметр Кровь Моча Количество объектов анализа

Сыворотка Плазма

Кальций + - + 1361

Неорганический фосфат + - + 1179

Креатинин + - + 1107

Щелочная фосфатаза + - + 670

Аланинаминотрансфераза + - - 417

Аспартатаминотрансфераза + - - 417

Адреналин - + - 337

Норадреналин - + - 337

Дофамин - + - 337

Всего нами было проведено 6162 исследований биологических жидкостей от 1099 пациентов. Исследованные нами объекты на основании данных ультразвуковой денситометрии пяточной кости пациентов были разделены на 3 группы: лица с нормальной плотностью костной ткани, пациенты с остеопенией (доклиническая стадия заболевания) и пациенты с остеопорозом (тяжелая патология костной ткани). Также были исследованы показатели кальций-фосфорного обмена, определены концентрации креатинина, адреналина, норадреналина, дофамина, активности АЛАТ и АСАТ в биологических жидкостях лиц «контрольной группы», в качестве которой выступали 48 молодых людей в возрасте 20-25 лет с нормальной плотностью костной ткани. Таким образом, нами было получено 4 массива данных: 1) совокупность выбранных «реперных» точек лиц «контрольной группы», 2) «портрет» биологических жидкостей «здорового» человека, 3) картина биологических жидкостей пациентов с начальной стадией заболевания, 4) биохимические маркеры больного с тяжелой патологией.

Сакр Ркр щ.ф дддт дсдтм

О Контрольная фуппа □ "Здоровый" человек В Средняя тяжесть В Тяжелая форма

сам Р„ Кр м Са/Кр ржр N

I Контрольная фуппа I Средняя тяжесть

□ "Здоровый" человек И Тяжелая форма |

Рис.3. Результаты определения Рис.4. Результаты определения

характеристик кальций -фосфорного характеристик кальций-фосфорного обмена в сыворотке крови обмена в моче

N - параметр, А - нормализованное численное значение параметра.

Результаты исследования сыворотки крови, характеризующие состояние кальций-фосфорного обмена в группах с различной минеральной плотностью костной ткани, приведены в таблице 11 и на рисунке 3.

Анализ полученных данных показал, что у пациентов с начальной стадией заболевания наблюдается достоверное уменьшение концентрации кальция в сыворотке крови, повышение содержания фосфора и активности щелочной фосфатазы по сравнению с группой лиц с нормальной минеральной плотностью костной ткани. Это свидетельствует о том, что изменение картины крови, установленное рекомендованными нами методами, происходит раньше, чем заболевание начинает проявляться болевым синдромом, что имеет большое значение при проведении скрининга.

Таблица 11.

Результаты определения параметров кальций-фосфорного обмена в сыворотке крови у пациентов с различной степенью снижения минеральной плотности костной ткани (п - число исследованных проб) _

Определяемый «Контроль- Нормальная Остеопения Остеопороз

параметр ная» группа МПКТ

Содержание каль- 2,15 ±0,12 2,13 ±0,11 1,91 ±0,11 1,83 ±0,12

ция крови, ммоль/л п=48 п=358 п=184 п=172

Содержание фосфора крови, ммоль/л* 102 86 ±2 85 ± 1 116 ± 8 138 ±5

п=48 п=306 п=184 п=172

Активность щелочной фосфатазы, мкмоль/(с*л) *102 91 ±3 п=48 83 ±3 п=266 105 ±7 п=184 158 ± 12 п=172

Профиль критериев для мочи, отражающих состояние костной системы, приведен на рисунке 4.

На рисунке 5 представлены результаты исследования плазмы крови групп людей с различной степенью поражения симпато-адреналовой системы (по данным врачей-диагностов) на содержание в ней биогенных аминов, полученные по разработанной нами ВЭЖХ-методике.

Рис 5. Результаты определения содержания катехоламинов а плазме крови, N - параметр, А — нормализованное численное значение параметра.

Анализ полученных данных показал, что содержание катехоламинов в плазме крови лиц «контрольной группы» и людей с нормальным артериальным давлением статистически не различается. Наблюдается статистически значимое увеличение концентрации этих веществ в плазме крови у пациентов со стойкой артериальной гипертензией.

У больных с подтвержденной феохромоцитомой - гормонально активной опухолью мозгового слоя надпочечников наблюдается статистически достоверное повышение концентрации адреналина, норадреналина и дофамина. В связи с этим отнесение "портрета" крови пациента к одному из полученных массивов позволяет диагностировать данную патологию на ранней стадии заболевания, до появления клинических признаков, прогнозировать состояние его здоровья без использования дорогостоящих и малодоступных для лечебных учреждений методов функциональной диагностики.

Таким образом, рассмотренные нами фрагменты дают возможность проанализировать изменения различных параметров кальций-фосфорного обмена и содержания нейромедиаторов в отдельных биологических объектах (сыворотка крови, плазма крови, моча) в зависимости от тяжести заболевания. Для однозначного отнесения пациента к одной из групп риска необходимо рассмотрение полной совокупности характеристик по всем предложенным нами критериям.

Общая картина состава биологических жидкостей для рассмотренных нами групп объектов приведена на рисунке 6. Как видно из рисунка, состав биологических жидкостей группы «здоровых» людей и контрольной группы существенных различий не имеют. Пациенты со средней тяжестью заболевания имеют значительное уменьшение содержания кальция, увеличение концентра-

■ Контрольная группа □ "Здоровый" человек

■ Средняя тяжесть £3 Тяжелая форма

ции фосфора, активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови, увеличение экскреции кальция с мочой, усиление выброса нейромедиаторов в плазме крови. Картина биологических жидкостей лиц, страдающих тяжелым расстройством здоровья, характеризуется этими же, но значительно более выраженными изменениями.

А

Ш Контрольная группа □ "Здоровый" человек Ш Средняя тяжесть И Тяжелая форма

Рис.6. Интегральная характеристика состояния биологических жидкостей человека для четырех исследованных групп пациентов.

Таким образом, предложенный нами метод анализа совокупности результатов определения содержания ключевых веществ в биологических жидкостях человека с использованием графического представления нормализованных параметров позволяет проводить раннюю диагностику целого ряда эндокринных расстройств, а также осуществлять мониторинг лечения без дополнительного применения методов функциональной диагностики. Полученные результаты полностью согласуются с заключениями лечащих врачей.

ВЫВОДЫ

1. Разработана многоступенчатая система аналитического контроля параметров липидного обмена, основанная на комплексном использовании спектро-фотометрических и хроматографических методов, и отличающаяся большей экспрессностью и эффективностью по сравнению с традиционными биохимическими методами.

2. Найдены оптимальные условия и выявлены особенности применения спек-трофотометрического метода, газовой, высокоэффективной жидкостной и планарной хроматографии для определения основных биохимических показателей липидного и кальций-фосфорного обмена, катехоламинов, позволяющие существенно повысить эффективность ранней диагностики эндокринных заболеваний и проводить непрерывный контроль за процессом лечения.

3. Предложен способ графического представления совокупности результатов определения биохимических показателей, позволяющий отнести объект исследования к одной из категорий групп риска для ранней диагностики ряда заболеваний и мониторинга лечения без привлечения методов функциональной диагностики.

4. Разработана ВЭЖХ-методика определения ХС, характеризующаяся наибольшей чувствительностью, точностью и надежностью определения данного аналита в сыворотке крови в интервале 33,3-3200 мг/л.

5. Показано, что в случае реализации метода обращено-фазовой ТСХ оптимальным является использование в качестве подвижной фазы системы ледяная уксусная кислота - ацетонитрил (1:1), насыщенная ундеканом. Рассчитаны Rf для индивидуальных высших жирных кислот Си - Сад. Разработана методика пробоподготовки для определения высших жирных кислот методом ГХ, оптимизированы условия газохроматографического определения содержания их в плазме крови.

6. Разработана методика определения катехоламинов и холестерина при совместном присутствии методом ВЭЖХ с использованием мультидетекторной схемы, включающей электрохимический и спектрофотометрический детекторы.

7. В практику работы клинико-диагностических лабораторий ООО «Центр «Диабет» и Самарского государственного медицинского университета внедрены методики определения холестерина, катехоламинов, высших жирных кислот, а также показателей костного метаболизма в биологических жидкостях человека с применением предложенного комплекса методов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Особенности использования органических реагентов в клинической лабораторной практике// VII Всерос. конф. «Органические реагенты в аналитической химии». Тез. докл., Саратов, 1999. С. 165.

2. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Методы определения активности щелочной фосфатазы// VII Всерос. конф. «Органические реагенты в аналитической химии». Тез. докл., Саратов, 1999. С. 166.

3. Вербовая Н.И., Макарова Т.В., Скрипник М.А., Колоскова C.B. Состояние симпато- адреналовой системы у пожилых больных сахарным диабетом.// I Российский съезд геронтологов и гериатров. Тез. докл., Самара, 1999. С.56-57.

4. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В., Ревинская Е.В. Хроматографи-ческие методы определения содержания высших жирных кислот и катехоламинов в биологических жидкостях организма// Всерос. конф. «Химический анализ веществ и материалов». Тез. докл., Москва, 2000. С.200.

5. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В., Ревинская Е.В. Хроматографи-ческие методы определения содержания высших жирных кислот и катехоламинов в биологических жидкостях человека// Известия ВУЗов. Химия и химическая технология, 2000. Т. 43. Вып.6. С.119-123.

6. Колоскова C.B., Лобачев A.JI., Лобачева И.В., Ревинская Е.В. Определение высших жирных кислот в плазме крови человека//Клиническая лабораторная диагностика, 2001. №7. С.13-15.

7. Вербовая Н.И., Макарова Т.В., Лоткова Е.А., Скрипник М.А., Колоскова C.B. Функциональная активность симпато - адреналовой системы у пожилых больных сахарным диабетом 2 типа// IV Рос. съезд геронтологов и гериатров. Тез. докл., Самара, 2001. С.32-33.

8. Вербовая Н.И., Макарова Т.В., Лоткова Е.А., Колоскова C.B. Роль катехола-минов в генезе артериальной гипертензии у пожилых// IV Российский съезд геронтологов и гериатров. Тез. докл., Самара, 2001 г. С.30-31.

9. Колоскова C.B., Лобачев А.Л. Определение холестерина, высших жирных кислот и катехоламинов методами жидкостной хроматографии// VII Всерос. симп. по молекулярной жидкостной хроматографии и электрофорезу. Тез. докл., Москва, 2001. С. 83.

10. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Многоуровневая схема определения содержания холестерина в крови// Всерос. конф. «Актуальные проблемы аналитической химии». Тез. докл., Москва, 2002 . С. 108-109.

11. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Синицин М.В., Лобачева И.В., Ревинская Е.В. Хроматографическая информация в системе идентификации материалов// Всерос. симп. «Современные проблемы хроматографии» (к 100 - летию со дня рождения К.В.Чмутова). Тез. докл., Москва, 2002. С.70.

12. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Ревинская Е.В. Определение холестерина методами газовой, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии// XII Всерос. конф. по газовой хроматографии. Тез. докл., Самара, 2002. С.68.

13. Колоскова C.B., Лобачев А.Л. Газохроматографическое определение высших жирных кислот в плазме крови// XII Всерос. конф. по газовой хроматографии. Тез. докл., Самара, 2002 . С.67.

14. Колоскова C.B., Лобачев А.Л. Комплексное исследование химического состава биологических жидкостей человека для ранней диагностики функциональных расстройств// IV Всерос. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». Тез. докл., Саратов, 2003. С. 165.

15. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Использование комплекса аналитических методов для ранней диагностики нарушений липидного обмена// IV Всерос. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». Тез. докл., Саратов, 2003. С. 166.

16. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Ревинская Е.В. Многоуровневая хроматографическая схема определения высших жирных кислот в плазме крови человека// IV Всерос. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». Тез. докл., Саратов, 2003. С. 167.

17. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Методы определения холестерина (обзор литературы)// Клиническая лабораторная диагностика, 2004. №1-с.3-9.

18. Лобачев А.Л., Колоскова C.B. Аналитическая составляющая современных методов клинической лабораторной диагностики// Всеросс.конф. «Аналитика России». Тез. докл., Москва, 2002. С.209.

19. Колоскова C.B., Лобачев А.Л., Лобачева И.В. Спектрофотометрические методы определения холестерина в сыворотке крови человека// Межвузовский сборник научных трудов V Всерос. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». Саратов, 2005. С.155-157.

20. Колоскова C.B., Лобачев А.Л. Влияние природы комплексообразователя на аналитические характеристики методики определения кальция в сыворотке крови// V Всерос. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии». Тез. докл., Саратов, 2005. С. 60.

21. Лобачев А.Л., Колоскова C.B. Хроматографическое определение веществ -индикаторов эндокринных расстройств// Всерос. конф. «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Тез. докл., Самара, 2005. С. 199.

22. Лобачев А.Л., Колоскова C.B. Использование хроматографической информации в клинической диагностике// Всерос. конф «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Тез. докл., Самара, 2005. С.206.

Подписано в печать 17 марта 2006 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 4//А-443011 г. Самара, ул. Академика Павлова, 1

Отпечатано ООО «Универс-групп»

»-5720

v Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Методы определения холестерина в сыворотке крови человека.

1.1.1. Химические методы определения холестерина.

1.1.2. Ферментные методы определения холестерина.

1.1.3. Определение холестерина методами жидкостной хроматографии.

1.1.4. Определение холестерина методом газожидкостной хроматогра-^ фии.

1.2. Определение высших жирных кислот в плазме крови человека.

1.3. Определение катехоламинов в плазме крови человека.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Реагенты и аппаратура.

2.2. Методы исследования.

Глава 3. Многоуровневая система определения холестерина в плазме крови человека

3.1. Определение содержания холестерина методом планарной хромато-- графии.

3.2. Определение холестерина фотометрическими методами.

3.3. Определение холестерина методом ВЭЖХ.

Глава 4. Методы определения высших жирных кислот в плазме крови.

Глава 5. Определение катехоламинов и важнейших биохимических маркеров в биологических жидкостях человека.

5.1. Определение катехоламинов методом ВЭЖХ.

5.2. Определение показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека.

Глава 6. Использование совокупности параметров для решения классификационных задач в клинической диагностике.

Выводы.

Актуальность работы. Клиническая лабораторная диагностика является одной из важнейших областей современной медицины, успехи которой зависят как от уровня развития аналитической химии, так и степени внедрения наиболее перспективных методов анализа в практику. В настоящее время возможности абсолютного большинства клинико-диагностических лабораторий нашей страны ограничены применением фотометрических методов анализа. Это не всегда дает возможность быстро и правильно провести определение диагностически значимых параметров.

Многочисленные эпидемиологические исследования установили связь гиперхолестеринемии с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. В связи с этим определение холестерина в крови является одной из самых актуальных задач современной клинической лабораторной диагностики. Анализ литературных данных показывает, что исследования в этой области ведутся, в основном, с применением химических и ферментных фотометрических методик. Отсутствуют также данные о возможности оптимизации применения комплекса аналитических методов, что дало бы возможность повысить эффективность решения задачи определении холестерина (ХС) в биологических жидкостях.

Не менее важной проблемой современной клинической биохимии является определение содержания высших жирных кислот (ВЖК) и катехоламинов (КА) в плазме крови для ранней диагностики ряда тяжких расстройств здоровья. Одним из направлений в решении этой задачи является внедрение в практику медицинских лабораторий хроматографических методов анализа. Методом ГХ можно быстро выявлять малейшие изменения в содержании и соотношении ВЖК различного строения, что позволяет диагностировать ряд серьезных заболеваний эндокринной системы. Внедрение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения содержания катехоламинов в плазме крови позволяет с высокой точностью проводить диагностику гормонально активных опухолей хромафинной ткани на ранних стадиях заболевания.

Целью работы явилась разработка системного подхода к определению основных показателей липидного и кальций-фосфорного обмена, катехолами-нов в биологических жидкостях человека спектрофотометрическими и хрома-тографическими методами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• систематизировать и оценить аналитические и метрологические характеристики методов, применяемых в клинико-диагностических лабораториях для определения параметров липидного и кальций-фосфорного обмена;

• оптимизировать условия спектрофотометрического определения некоторых показателей липидного и кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях;

• выбрать оптимальные условия и разработать методики хроматографиче-ского определения катехоламинов, высших жирных кислот и холестерина в плазме крови;

• выявить возможности использования совокупности основных параметров биологических жидкостей для решения классификационных задач в целях ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга лечебного процесса.

Научная новизна работы

• Изучена возможность использования системы методов жидкостной хроматографии, включающей планарные варианты (бумажную и тонкослойную) и ВЭЖХ для определения холестерина в сыворотке крови с целью оптимизации процесса диагностики нарушений липидного обмена.

Разработана рациональная многоступенчатая схема определения холестерина и высших жирных кислот, включающая спектрофотометрические и хроматографические методы анализа.

Разработана и внедрена методика ВЭЖХ - определения катехоламинов и холестерина при их совместном присутствии в пробе с использованием мультидетекторной схемы;

Показана принципиальная возможность применения элементов метода распознавания образов для обработки совокупности результатов определения содержания ключевых веществ в биологических жидкостях человека с целью решения классификационных задач;

Оптимизированы условия аналитического определения основных биохимических показателей кальций-фосфорного обмена в биологических жидкостях человека. Практическая значимость работы на основе результатов проведенных исследований предложены и внедрены в практику работы диагностической лаборатории тест-методики определения ХС и ВЖК; разработана и внедрена в практику работы лабораторий СамГМУ методика газохроматографического определения высших жирных кислот в плазме крови; разработана и внедрена методика определения ХС в плазме крови методом ВЭЖХ; предложена и внедрена многоуровневая схема определения ХС и ВЖК с использованием комплекса аналитических методик; разработан и внедрен в практику клинико-диагностической лаборатории ООО «Центр «Диабет» ВЭЖХ - методика количественного определения катехоламинов в плазме крови;

• разработана и внедрена в практику система классификации образцов биологических жидкостей в целях ранней диагностики расстройств здоровья, основанная на графическом представлении совокупности ключевых параметров крови и мочи.

Положения, выносимые на защиту

• многоступенчатая система определения параметров липидного обмена, включающая спектрофотометрические, колоночные и плоскостные хро-матографические методы;

• оптимальные условия спектрофотометрического определения биохимических показателей обменных процессов;

• оптимизация хроматографического определения параметров липидного обмена, катехоламинов в плазме крови;

• разработанные методики определения основных показателей обменных процессов и система использования совокупности ключевых параметров биологических жидкостей для ранней диагностики эндокринных заболеваний и мониторинга процесса лечения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999г); I Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 1999); Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000); IV Российском съезде геронтологов и гериатров (Самара, 2001); VII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и электрофорезу (Москва, 2001); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (к 100 - летию со дня рождения К.В.Чмутова) (Москва, 2002); XII Всероссийской конференция по газовой хроматографии (Самара, 2002); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), V Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2005), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, 2005).

ВЫВОДЫ

1. Разработана многоступенчатая система аналитического контроля параметров липидного обмена, основанная на комплексном использовании спектрофотометрических и хроматографических методов, и отличающаяся большей экспрессностью и эффективностью по сравнению с традиционными биохимическими методами.

2. Найдены оптимальные условия и выявлены особенности применения спектрофотометрического метода, газовой, высокоэффективной жидкостной и планарной хроматографии для определения основных биохимических показателей липидного и кальций-фосфорного обмена, катехоламинов, позволяющие существенно повысить эффективность ранней диагностики эндокринных заболеваний и проводить непрерывный контроль за процессом лечения.

3. Предложен способ графического представления совокупности результатов определения биохимических показателей, позволяющий отнести объект исследования к одной из категорий групп риска для ранней диагностики ряда заболеваний и мониторинга лечения без привлечения методов функциональной диагностики.

4. Разработана ВЭЖХ-методика определения ХС, характеризующаяся наибольшей чувствительностью, точностью и надежностью определения данного аналита в сыворотке крови в интервале 33,3-3200 мг/л.

5. Показано, что в случае реализации метода обращено-фазовой ТСХ оптимальным является использование в качестве подвижной фазы системы ледяная уксусная кислота - ацетонитрил (1:1), насыщенная ундеканом. Рассчитаны Rf для индивидуальных высших жирных кислот Си -Сго- Разработана методика пробоподготовки для определения высших жирных кислот методом ГХ, оптимизированы условия газохромато-графического определения содержания их в плазме крови.

Разработана методика определения катехоламинов и холестерина при совместном присутствии методом ВЭЖХ с использованием мультиде-текторной схемы, включающей электрохимический и спектрофотомет-рический детекторы.

В практику работы клинико-диагностических лабораторий ООО «Центр «Диабет» и Самарского государственного медицинского университета внедрены методики определения холестерина, катехоламинов, высших жирных кислот, а также показателей костного метаболизма в биологических жидкостях человека с применением предложенного комплекса методов.

1. Denti L., Cecchetti A., Annoni V., Merli M, Ablondi F, Valenti G. The role of lipid profile in determining the risk of ischemic stroke in the elderly: a case-control study// Arch. Gerontology and Geriatrics, 2003.- V. 37.- I. 1.- P. 51-62.

2. Aguilo A., Tauler P., Guix M.P., Villa G., Cordova A.,. Tur J.A., Pons A. Effect of exercise intensity and training on antioxidants and cholesterol profile in cyclists//J. Nutritional Biochem., 2003.- V. 14. I. 6.- P. 319-325.

3. Hirsch G.A., Blumenthal R.S. Usefulness of non-high-density lipoprotein cholesterol determinations in the diagnosis and treatment of dyslipidemia// Amer. J. Cardiology, 2003 V. 91.- I. 7.- P. 827-830.

4. Денисова O.B. Диагностика нарушений липидного обмена//Клин. лаб. диагностика, 1997. №6.- с. 28.

5. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Ч.З. Клиническая биохимия/ Под ред. Базарновой М.А., Морозовой В.Т. -Киев: Головное издательство издательского объединения «Вища школа», 1996. -с.95-112.

6. Rylander L., Nilsson-Ehle P., Hagmar L. A simplified precise method for adjusting serum levels of persistent organohalogen pollutants to total serum lipids// Atherosclerosis, 2005. V. 180.-1. 2. - P. 233-244.

7. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник/ Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1997. 241 с.

8. Захария Е.А., Децик Ю.И., Яворский О.Г. Лабораторная диагностика ишемической болезни сердца.- Киев: Здоровье, 1989. с. 16-170.

9. Waddington Е. I., Boadu Е., Francis G.A. Cholesterol and phospholipid efflux from cultured cells// Methods, 2005. V. 36.- I. 2. - P. 196-206.

10. Waddington E. I., Boadu E, Francis G. A. Cholesterol and phospholipid efflux from cultured cells// Methods, 2005.-V. 36.-I. 2.-P. 196-206.

11. Storch M., Konig D., Bultermann D., Blum A., Vogt S., Baumstark M., Berg A., Schmid A. Lipid profile in spinal cord-injured women with different injury levels//Preventive Medicine, 2005.- V.40.- I.3.- P.321-325.

12. Гуревич B.C., Шаталина Л.В., Ковалева И.Г., Бершадский Б.Г. Липидный состав крови пациентов с ишемической болезнью сердца// Биохимия, 1992.- Т.57.- №2.- с.267-274.

13. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липопротеиды, дислипопротеидемии и атеросклероз. М.: Медицина, 1991.- с. 12-38.

14. Allison М. A., Wright М., Tiefenbrun J. The predictive power of low-density lipoprotein cholesterol for coronary calcification//Int. J. Cardiology, 2003.- V. 90.-I. 2-3.-P. 281-289.

15. Marin M. G., Zitter J. N. Expenditures associated with preventive healthcare//Preventive Medicine, 2004. V. 39.- I. 5.- P. 856-862.

16. Poli A., Bruschi F., Cesana В., Rossi M., Paoletti R., Crosignani P. G. Plasma low-density lipoprotein cholesterol and bone mass densitometry in postmenopausal women//Obstetrics & Gynecology, 2003.- V. 102.- I. 5.-P. 922-926.

17. Kishimoto Т., Matsuoka Т., Imamura S., Mizuno K. A novel colorimetric assay for the determination of cholesterol in plasma// Clin. Chem. Acta, 2003. V. 333.-I. 1.- P. 59-67.

18. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии/ Под редакцией проф. А.И.Карпищенко. Санкт-Петербург: Интермедика, 1999. - 656 с.

19. Kourounakis А. P., Victoratos P., Peroulis N., Stefanou N., Yiangou M., Hadjipetrou L., Kourounakis P. N. Experimental Hyperlipidemia and the Effect of NSAIDs//Experimental and Molecular Pathology, 2002.-V. 73.- I. 2.-P. 135-138.

20. Contarini G., Povolo M., Bonfitto E., Berardi S. Quantitative analysis of sterols in dairy products: experiences and remarks// Int. Dairy J., 2002.-V. 12.-1. 7.- P. 573-578.

21. Хайдукова И.Л., Шахов Ю.А., Еремеева M.E., Малахов В.Н. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови человека// Вопросы медицинской химии, 1989.- №5. -с. 133-138.

22. Superko R., Harvey S. Hecht Metabolic disorders contribute to subclinical coronary atherosclerosis in patients with coronary calcification// The Am. J. of Cardiology, 2001.- V. 88.-1. 3.- P. 260-264.

23. Valerio L., Fontas E., Pradier C., Lavrut Т., Garraffo R., Dunais В., Cua E., Dellamonica P. Lopinavir/ritonavir combination and total/HDL cholesterol ratio// J. of Infection, 2005.-V. 50.-1. 3.-P. 229-235.

24. Suman C., Pundir S. Co-immobilization of cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase onto alkylamine glass beads for measurement of total cholesterol in serum//Current Applied Physics, 2003.-V. 3.- I. 2-3.-P. 129-133.

25. Hamed S. A., Hamed E. A., Kandil M. R., El-Shereef H.K., M. M. Abdellah and Omar H. Serum thyroid hormone balance and lipid profile in patients with epilepsy//Epilepsy Research, 2005.-V. 66.-1. 1-3. P. 173-183.

26. Yazawa N., Ono J., Yoshimura H., Kimura S. Influence of nonspecific reaction on determination of H2O2 using Trinder reagents// Clin. Chem. Acta, 2005. V. 360. -I. 1-2.- P. 52-59.

27. Gay C. A., Stocker R. Simultaneous Determination of Coenzyme Q10, Cholesterol, and Major Cholesterylesters in Human Blood Plasma// Methods in Enzymology, 2004.-V. 378.-P. 162-169.

28. Герег Ш. Количественный анализ стероидов. М.: Мир, 1985. 281 с.

29. Nogueira G. С., Bragagnolo N. Assessment of methodology for the enzymatic assay of cholesterol in egg noodles//Food Chemistry, 2002.- V. 79.- I. 2,- P. 267270.

30. Vidal J. C., Garcia E. and Castillo J. R. In situ preparation of overoxidized PPy/oPPD bilayer biosensors for the determination of glucose and cholesterol in serum//Sensors and Actuators B: Chemical, 1999.-V. 57.- I. 1-3.- P. 219-226.

31. Ефимов A.C., Черепанов Д.С. Возможности нового портативного анализатора для определения холестерина в сыворотке крови// Вопросы медицинской химии, 1989.- №5.- С.124-128.

32. Каринова И.Н., Дворкин В.И., Золотов H.H. Определение содержания холестерина и его эфиров методом ВЭЖХ в сыворотке крови // Журн. аналит. химии, 1989.- Т.40,- №11. С.2104-2107.

33. Rordic A. Determination of cholesterol in egg yolk by high performance liquid chromatography using an automated F.A.//J. Liq. Chromatogr. and Relat. Technol, 1999. V. 22. -1.8.- P. 1235-1246.

34. Горячковский A.M. Справочное пособие по клинической биохимии. -Одесса: ОНФА, 1994.- 415 с.

35. Hirowatari Y., Yoshida H., Kurosawa H., Doumitsu K., Tada N. A new convenient HPLC method for determination of the cholesterol levels in HDL, LDL, IDL, VLDL, and chylomicron//Atherosclerosis Supplements, 2003. V. 4. -I. 2. - P. 220.

36. Masukawa Y., Tsujimura H., Imokawa G. A systematic method for the sensitive and specific determination of hair lipids in combination with chromatography//.!. Chromatogr. B, 2005.- V. 823.-1. 2.- P. 131-142.

37. Boswart J., Kostiuk P., Thomas J. High-performance liquid chromatographic determination of cholesteryl esters in the blood of obese children//J. Chromatogr.: Biomedical Applications, 1991.- V. 571.-1. 1-2.- P. 19-28.

38. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Под ред. А. Хеншена, К.-П. Хуне, Ф. Лотшнайк, В. Вёльтера. М.: Мир, 1988.- С. 383428.

39. Boselli Е., Velazco V., Caboni М. F., Lercker G. Pressurized liquid extraction of lipids for the determination of oxysterols in egg-containing food//J. Chromatogr. A, 2001.- V. 917.- I. 1-2.- P. 239-244.

40. Новиков Д.К., Мятиева С.Д., Мухамедова H.A., Чарыев Х.Э. Определение липидов крови методом ВЭЖХ с УФ-детектированием// Клин, лаб. диагностика, 1993.- №2.-с. 24-27.

41. Хайдукова ИЛ., Шахов Ю.А., Еремеева М.Е., Малахов В.Н. Хроматографическое определение холестерина сыворотки крови// Вопросы медицинской химии, 1989.-№5.-с. 133-138.

42. Tvrzicka Е., Mares P., Pi'saFikova A., Novakovic J., Hrabak P. Simplified gas chromatographic method for the simultaneous determination of phytosterols and cholesterol// J. Chromatogr.: Biomedical Applications, 1991.- V. 563.- I. 1.- P. 188-192.

43. Момыналиев K.T., Осипова C.B., Садовская В.Л., Говорун В.М., Сергиенко В.И. ВЭЖХ- определение холестерина в биологических объектах// Биохимия, 1997.- Т.62,- №2. -С. 187-194.

44. Park Е. J., Lee D., Shin Y. G., Lantvit D. D., Breemen R., Kinghorn A. D., Pezzuto J. M. Determination of cholesterol using liquid chromatography// J. Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications, 2001.- V. 754.- I. 2.-P. 327-332.

45. Boswart J., Kostiuk P., Thomas J. High-performance liquid chromatographic determination of cholesteryl esters in the blood of obese children// J. Chromatogr.: Biomedical Applications, 1991.-V. 571.- I. 1-2.-P. 19-28.

46. Jeannot R., Sabik H., Sauvard E., Dagnac Т., Dohrendorf К. Determination of endocrine-disrupting compounds in environmental samples using gas and liquid chromatography with mass spectrometry// J. Chromatogr. A, 2002.- V. 854.- I. 12.- P. 521-534.

47. Choudhari К. В., Jayanthi S., Murty R. В., Matharu R. P. A high-performance liquid chromatographic method for the analysis of lipids from lyophilized formulations// J. Chromatogr. A, 1996.- V. 724,- I. 1-2.- P. 343-347.

48. SetaHaruo K., Okuyama N.T. Determination of a-tocopherol, free cholesterol, esterified cholesterols and triacylglycerols in human lipoproteins by high-performance liquid chromatography// J. Chromatogr. A, 1990.-V. 515.-P. 585-595.

49. Красиков В. Д. Современная планарная хроматография// Журн. аналит. химии, 2003.- Т. 58.- №8.- с.792-808.

50. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика . — М.: Мир, 1991.-с.142-158.

51. Kim Н. S., Choi С. К., Park Y. Н. Determination of cholesterol and its fermentation products by liquid chromatography// J. Chromatogr. A, 1987.- V. 398.-P. 372-374.

52. Singh R., Ajagbe M., Bhamidipati S., Ahmad Z., Ahmad I. A rapid liquid chromatography method for determination of cholesterol in liposome-based drug formulations // J. Chromatogr. A, 2005,- V. 1073.- I. 1-2.- P. 347-353.

53. Hradec J. A chromatographic method for the quantitative determination of cholesterol in biological materials// J. Chromatogr., 1988.-V. 32.- P. 511-518.

54. Horvath C. Quantitative determination of cholesterol in auto-oxidation mixtures by thin-layer chromatography// J. Chromatogr. A, 1986.- V. 22.-P. 52-59.

55. Крыжановская H. А., Басалгина Т. А. Хроматографические методы исследования в практике клинико-диагностической лаборатории// Клин. лаб. диагностика, 2004. №9. - С.63.

56. Shan Н., Pang J., Li S., Chiang Т. В., Wilson W. К., Schroepfer G. J. Chromatographic behavior of oxygenated derivatives of cholesterol// Steroids, 2003.- V. 68.-1. 3.- P. 221-233.

57. Hwang B.S., Wang J.T., Y.M. Choong. A simplified method for the quantification of total cholesterol in lipids using gas chromatography// J. of Food Composition and Analysis, 2003.- V. 16.- I. 2.- P. 169-178.

58. Garcia Regueiro J. A., Maraschiello C. Procedure for the determination of eight cholesterol oxides in poultry meat using on-column and solvent venting capillary gas chromatography// J. Chromatogr. A, 1997.-V. 764.- I. 2,- P. 279-293.

59. Bragagnolo N., Rodriguez-Amaya D. B. Simultaneous determination of total lipid, cholesterol and fatty acids in meat and backfat of suckling and adult pigs// Food Chemistry, 2002.- V. 79.-1. 2.- P. 255-260.

60. Garcia Regueiro J. A., Gibert J., Diaz I. Determination of neutral lipids from subcutaneous fat of cured ham by capillary gas chromatography and liquidchromatography// J. Chromatogr. A, 1994.- V. 667.- I. 1-2.- P. 225-233.

61. Toivo J., Phillips K., Lampi A., Piironen V. Determination of Sterols in Foods: Recovery of Free, Esterified, and Glycosidic Sterols// J. of Food1.

62. Composition and Analysis, 2001.- V. 14,-1. 6,- P. 631 -643.

63. Batta A. K., Salen G. Gas chromatography of lipids// J. Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications, 1999.- V. 723.- I. 1-2.- P. 1-16.

64. Хейфец Г.М. Газохроматографическое определение холестерина в плазме крови //Журн. аналитической химии, 1990.- Т.45,- №4.- С.802-808.9 81. Bailey Е., F. Brooks A. G, Purchase М, Meakings М., Davies М., Walters D.

65. G. Improved method for the determination of the major neutral steroids andunconjugated bile acids in human faeces using capillary gas chromatography// J. Chromatogr.: Biomedical Applications, 1987.-V. 421.- P. 21-31.

66. Paterson E., Amado R. Simplified Method for the Simultaneous Gas Chromatographic Determination of Fatty Acid Composition and Cholesterol in Food// Anal. Chem. Acta, 1997.- V. 330.- I. 2.-P. 202-209.

67. Seppanen-Laakso Т., Laakso I., Hiltunen R. Analysis of lipids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition// Anal. Chem. Acta, 2002.- V. 465.- I. 1-2.- P. 39-62.

68. Xu X., Li R., Chen J., Chen P., Ling X., Rao P. Quantification of cholesterol in foods using gas chromatography// J. Chromatogr. B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2002.- V. 768.- I. 2.- P. 369-373.

69. Лапин Б.Н. Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности.- Геленджик: Наука, 1990.-е. 48-49.

70. Машнов А.П. Клинические исследования.- М.: Медицина, 1990 56 с.

71. Руководство по современной тонкослойной хроматографии. По материалам школы-семинара по тонкослойной хроматографии/ Под ред. О.Г.Ларионова.- М., 1994.-312 с.

72. Li Y., Lander R., Manger W., Lee A. Determination of lipid profile in meningococcal polysaccharide using reversed-phase liquid chromatography// J. Chromatogr. B, 2004.- V. 804.- I. 2.- P. 353-358.

73. Mjos S. A. Identification of fatty acids in gas chromatography by application of different temperature and pressure programs on a single capillary column// J. Chromatogr. A, 2003.- V. 1015.- I. 1-2.- P. 151-161.

74. Титов В. Н., Лисицын Д. М. Этерификация жирных кислот спиртами и функциональная роль полярных и неполярных липидов в кровотоке. Двойные связи жирных кислот липидов в липопротеинах// Клин. лаб. диагностика, 2003. №1. - С 4-10.

75. Seppanen-Laakso Т., Laakso I., Hiltunen R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition// Anal. Chem. Acta, 2002.- V. 465.-1. 1-2.- P. 39-62.

76. Пилипчак E. M., Гирина О. H., Брюзгина Т. С. Сезонные особенности соотношений жирных кислот липидов сыворотки крови у больных с постинфарктным кардиосклерозом// Клин. лаб. диагностика, 2004. №6.-С.17-19.

77. Ардатская М. Д., Иконников Н. С., Минушкин О. Н. Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (фракции С2—С6 с изомерами) в различных биологических субстратах методом газожидкостной хроматографии// Клин. лаб. диагностика, 2004.- №9. С.64.

78. Zghibeh С. М., Gopal V. R., Poff С. D., Falck J. R., Balazy M. Determination of trans-arachidonic acid isomers in human blood plasma// Anal. Biochem., 2004.-V.332.-I. l.-P. 137-144.

79. Осочук С. С., Коневалова Н. Ю. Изменения жирнокислотного спектра липопротеинов высокой плотности у мужчин и женщин при остром аппендиците// Клин. лаб. диагностика, 2005.- №1.- С.8-12.

80. Яценко О. В., Брюзгина Т. С., Рева С. Н. Жирно-кислотный состав липидов в биологических объектах при возрастной катаракте// Клин. лаб. диагностика, 2000.- №2. -С 11-13.

81. Брюзгина Т. С., Амосова Е. Н., Лыховский О. И., Вретик Г. М., Голод А. Г., Рева С. Н. Жирно-кислотный состав липидов в липопротеинах сыворотки крови при хронических заболеваниях печени// Клин. лаб. диагностика, 1999. -№7. -С.5.

82. Giacometti J., Miloevi A., Milin С. Gas chromatographic determination of fatty acids contained in different lipid classes after their separation by solid-phase extraction//J. Chromatogr. A, 2002.- V. 976.- I. 1-2,- P. 47-54.

83. Moldovan Z., Jover E., Bayona J. M. Gas chromatographic and mass spectrometric methods for the characterisation of long-chain fatty acids: Application to wool wax extracts// Anal. Chem. Acta, 2002.- V. 465.- I. 1-2.-P. 359-378.

84. Yang Y. J., Choi M. H, Paik M., Yoon H.R., Chung В. C. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of plasma saturated fatty acids// J. Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications, 2000.- V. 742.- I. 1.-P. 37-46.

85. Garcia С. C., Hernandez J. L., Lozano J. S. Gas chromatographic determination of the fatty-acid content of heat-treated green beans// J. Chromatogr. A, 2000.- V. 891.-1. 2.- P. 367-370.

86. Bragagnolo N., Rodriguez-Amaya D. B. Simultaneous determination of total lipid, cholesterol and fatty acids in meat and backfat of suckling and adult pigs// Food Chemistry, 2002.- V. 79.- I. 2.- P. 255-260.

87. Hu£ek P., Simek P., Tvrzicka E. Simple and rapid procedure for the determination of individual free fatty acids in serum// Anal. Chem. Acta, 2002.- V. 465.-1. 1-2.-P. 433-439.

88. Кузнецова Э.Э., Долгушина Г.С. Определение спектра жирных кислот в плазме крови пациентов с ишемической болезнью сердца// Клин. лаб. диагностика, 1993.- №6.- С.4-6.

89. Orellana-Coca С., Adlercreutz D., Andersson М. М., Mattiasson В., Hatti-Kaul R. Analysis of fatty acid by gas- chromatography// Chemistry and Physics of Lipids,2005.- V. 135.- I. 2.- P. 189-199.

90. Heravi M. J., Vosough M. Characterization and determination of fatty acids in fish oil using gas chromatography// J. Chromatogr. A, 2004.-V. 1024.- I. 1-2.- P. 165-176.

91. Destaillats F., Sebedio J., Berdeaux O., Juaneda P., Angers P. Gas chromatography determination of fatty acid// J. Chromatogr. B, 2005,- V. 820.- I. 1-P. 15-22.

92. Diniz Y. S., Cicogna A. C., Padovani C. R., Santana L. S., Faine L. A., Novel E. L. Diets rich in saturated and polyunsaturated fatty acids: metabolic shifting and cardiac health// Nutrition, 2004.- V. 20.- I. 2.- P. 230-234.

93. Розен В.Б. Основы эндокринологии.- M.: Изд-во МГУ, 1994. 128 с.

94. Бохонски А. Современные воззрения в биохимии.- М.: Мир, 1990.- 364 с.

95. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1990.- 652 с.

96. Ленинджер А. Основа биохимии. -М.: Мир, 1985 620 с.

97. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. Л.: Медицина, Ленинградское объединение, 1989.-с.191-196.

98. Бессонова Е.А. Хроматографическое и электрофоретическое определение стероидов и биогенных аминов в биологических объектах: Автореф. дисс.канд. хим. наук. СПб., 2004.- 22 с.

99. Королева Е. М., Адамсон В. Г., Лапшина А. С., Похелайнен Е. JL, Никитина Т. Г. Использование высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии в медицинских исследованиях// Клин. лаб. диагностика, 2004.- №9. с.66

100. Каримова M.X., Кудрин B.C., Гайнетдинов P.P. Оценка содержания катехоламинов в крови у практически здоровых людей// Клин. лаб. диагностика, 1993.-№2.-c.33-35.

101. Corcuff J. -В., Monsaingeon М., Gatta В., Simonnet G. Diagnostic biochimique des pheochromocytomes: Biochemical diagnosis of pheochromocytoma// Immunoanalyse & Biologie Specialisee, 2002.-V. 17.- I. 5.-P. 293-296.

102. Zhang X.-H., Wang S.-F. Determination of ethamsylate in the presence of catecholamines using 4-amino-2-mercaptopyrimidine self-assembled monolayer gold electrode//Sensors and Actuators B: Chemical, 2005.- V. 104.- I. 1.- P. 29-34.

103. Gouarne C., Foury A., Duclos M. Critical study of common conditions of storage of glucocorticoids and catecholamines in 24-h urine collected during resting and exercising conditions// Clin. Chem. Acta, 2004.-V. 348.- I. 1-2.- P. 207-214.

104. Карцова Л. А., Сидорова А. А., Казаков В. А.,Бессонова E. А., Яшин A. Я. Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии// Журн. аналит. химии, 2004.- Т. 59. -№8.- с.812-818.

105. Simeon D., Guralnik О., Knutelska М., Yehuda R., Schmeidler J. Basal norepinephrine in depersonalization disorder// Psychiatry Research, 2003.-V. 121.-I. l.-P. 93-97.

106. McKenzie J. M., Watson C. J., Rostand R. D., German I., Witowski S. R., Kennedy R. T. Automated capillary liquid chromatography for simultaneous determination of neuroactive amines and amino acids// J. Chromatogr. A, 2002,-V. 962.-I. 1-2.- P. 105-115.

107. Nonutoshi K., Tatsuo M. Determination of catecholamines by high-performance liquid chromatography with catalytic photometric detection// J. Chromatogr. B, 1985.- V. 329.- I. 1.- P. 147-152.

108. CanditoAnte M. M., Sbirazzuoli K.V., Chambon P. Proposal for the standardization of the calibration method for the assay of plasma catecholamines //

109. J. Chromatogr. В: Biomedical Sciences and Applications, 1990.- V. 526.- P. 194202.

110. Tzontcheva A., Denikova N. Analytical interference of drugs on the fluorimetric determination of urinary catecholamines// Clin. Chem. Acta, 2000.- V. 297.-1. 1-2.- P. 217-223.

111. Яшин Я. И., Яшин А. Я Аналитические возможности амперометрического детектирования в ВЭЖХ// Журн. аналит. химии, 2003.Т. 58.- №7.- с.728-729.

112. Красиков В. Д. Современная планарная хроматография// Журн. аналит. химии, 2003.-Т. 58.- №8.- с.792-808.

113. Сумина Е. Г., Штыков С. Н., Тюрина Н. В. Тонкослойная хроматография. Теоретические основы и практическое применение. Учебно-методическое пособие. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2002.- 108 с.

114. Титов В. Н. Атеросклероз — патология полиеновых жирных кислот (обзор литературы)// Клин. лаб. диагностика, 2001.- №1. С 3-10.

115. Storch M.-J., Konig D., Biiltermann D., Blum A., Vogt S., Baumstark M., Berg A., Schmid A. Lipid profile in spinal cord-injured women with different injury levels// Preventive Medicine, 2005.- V. 40,- I. 3.- P. 321-325.

116. С. Гланц. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика, 1998.-459 с.

117. Лифшиц В.М., В.И.Сидельникова. Медицинские лабораторные анализы. 2-е изд., исправ. и доп.- М.: Триада-Х, 2003.- 312 с.

118. Mo Y., Dobberpuhl D., Dash А.К. A simple HPLC method for the analysis of creatine //J. Pharm. and Biomed. Anal, 2003. Vol. 32. - N 1. - 125-132.

119. Zuojun S., Zimin S., Lin W., Kui W., Siqin S., Zunbo H. Rapid method for the determination of creatine in serum by capillary electrophoresis// J. Chromatogr. A, 2002. Vol. 979. - N 1-2. - 227-232.

120. Ефимов А.С., Черепанов Д.С. Ферментные электроды для анализа метаболитов// Вопр. мед. химии, 1992.- №5.- с.16-18.

121. Khalil A., El-Sayed K., Belal F., Khalil N.Y., Hamann M. Spectrophotometric determination of phosphorus in spiked human urine and plasma// Pharmazie, 2003. -Vol. 58.-N6. -385-388.

122. Jong Y.J., Hsu H.O., Wu H.L., Kou H.S., Wu S.M. Analysis of phosphorus and calcium in human plasma by spectrophotometry// Anal. chem. Acta, 2003. -Vol. 488. N 2. - 223-230

123. Misztal G., Skibinski R., Olajossy M., Paw B. Spectrophotometric determination of phosphorus in plasma // J. Pharm. and Biomed. Anal., 2002. -Vol. 30.-N4.- 1277-1285.

124. Гурьев И.А., Калугин А.А., Абражеев Р.В., Нипрук О.В., Егорова О.А. Фотометрическое определение малых количеств урана, фосфора, мышьяка в насыщенных водных растворах малорастворимых соединений// Журн. аналит. химии, 2000.-Т.55.- №10.- с.1060-1064.

125. Yamada Hiroyuki, Yoshizawa Katsuyoshi, Hayase Tetsuo. Sensitive determination method of alkaline phosphatase in plasma// J. Pharm. and Biomed. Anal., 2002. Vol. 775. - N 2. - 209-213.

126. Левченко Л.В. Фотометрическое определение щелочной фосфатазы в сыворотке крови// Клин. лаб. диагностика, 1993.- №8.- с.26-28.

127. Атякшева Л.Ф., Чухрай Е.С., Полторак О.М., Козленков А.А., Вознесенская В.В., Вайсоки Ч.Д. Влияние андростенона на щелочную фосфатазу, иммобилизованную на природных носителях// Журн. физ. химии , 1999. Т. 73. - N 5. - с. 915-917.

128. Атякшева Л.Ф., Чухрай Е.С., Полторак О.М. Ассоциация щелочной фосфатазы из Е. coli в растворе// Журн. физ. химии, 1998. Т. 72. - N 8. -1490-1492.

129. Чухрай Е.С., Атякшева Л.Ф., Полторак О.М., Козленков А. А., Вознесенская В.В., Вайсоки Ч.Д. Адсорбционные и каталитические свойства щелочной фосфатазы на обонятельном эпителии// Журн. физ. химии, 1999. -Т. 73.-N4.- с.739-742.

130. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Торшин И.Ю., Наккар С., Веселова М.Н. Стабилизация щелочной фосфатазы ионами магния// Вестник МГУ, 1998. Т. 39. - N 4. - с.233-235.

131. Wolfert Robert L., Hill Craig S. Assay for bone alkaline phosphatase// Anal, chem. Acta, 2002. Vol. 388. - N 2. - 124-128.

132. Lendl В., Krieg P., Kellner R. Determination of alkaline phosphatase activity in human sera by mid-FTIR spectroscopy // J. Anal. Chem., 1998. Vol. 360. - N 6.-P. 717-720.

133. De Silva Renuka, Akhavan-Tafti H., Eickholt R.A., Lauwers K., Chrovian C., Handley R.S., Schaap A.P. Novel red chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase// Luminescence, 2000. Vol. 15. - N 4. - 205-206.

134. Атякшева Л.Ф., Чухрай E.C., Полторак О.М. Стабильность щелочной фосфатазы из Е. coli // Журн. физ. химии, 2001. Т. 75. - N 2. - 369-371.

135. Fenoll J., Jourquin G., Kauffmann J. M. Fluorimetric determination of alkaline phosphatase in solid and fluid dairy products// Talanta, 2002. Vol. 56. -N6.- 1021-1026.

136. Wibawa J.I.D., Fowkes D., Shaw P.N., Barrett D.A. Measurement of alkaline phosphatase in plasma and gastric samples using high-performance liquidchromatography with fluorimetric detection// J Chromatgr. B, 2002. Vol. 774. - N 2.-141-148.

137. Перелыгин В.М., Подгорнова Н.М., Сорокина Ю.Н. К вопросу об определении кальция // Мат. 41 Отчетной науч. конф. за 2002 год, Воронеж, 2002 Воронеж: ВГТА, 2003. - Ч. 1 - с. 24-26

138. Синяев В.А., Григгс Дж., Левченко Л.В., Шустикова Е.С. Фосфаты кальция для медицины// Тез. Докл. 17 Менделеевский съезда по общей и прикладной химии, Казань, 21-26 сент., 2003. Казань: Центр операт. печ., 2003.-с. 298.

139. Suzuki Kazuo Т., Mandal Badal К., Ogra Yasumitsu. Speciation of calcium in body fluids// Talanta, 2002. Vol. 58. - N 1. - 111-119.

140. Слепченко Г.Б., Дубова Н.М. Применение метода амперометрического титрования для определения кальция в пищевых продуктах и биологических материалах // Завод, лаб.: Диагност, матер., 2003. Т. 69. - N 7. - с. 18-20.

141. Л Xueping, Ren Jujie. Determination of calcium and zinc in serum by a new method// Analyst, 2002. Vol. 127. - N 3. - 416-419.

142. Сапельникова C.B., Кручкова E.C., Кудашева Ф.Х., Бердникова И.В., Боголюк Г.Б., Пухова В.М., Нафикова С.Х. Фотометрическое определениекальция в сыворотке крови реагентами арсеназо-I и арсеназо-П .- Уфа: Гилем, 2003.-с. 61-62.

143. Dash Alekha К., Sawhney Angeli. A simple method for the analysis of creatine, calcium and creatinine // J. Pharm. and Biomed. Anal., 2002. Vol. 29. -N5.-p. 939-945.

144. Motellier S., Petit S., Decambox P. Quantitative capillary electrophoretic analysis for calcium and magnesium in sodium-matrix waters // Anal. chem. Acta, 2000,-Vol. 410.-N 1-2.-p. 11-23.

145. Mo Y., Dobberpuhl D., Dash Alekha K. A simple method for the analysis of calcium and creatine// J. Pharm. and Biomed. Anal., 2003. Vol. 32. - N 1. - p. 125-132.

146. Kargosha K., Sarrafi Amir H.M Simultaneous spectrophotometric determination of calcium and magnesium in dialysis fluids using multivariate calibration methods//Anal. Lett, 2001. Vol. 34. - N 10.-p. 1781-1793.

147. Ekinci N., Sahin Y. Determination of calcium and iodine in gall bladder stone using energy dispersive X-ray fluorescence spectrometry// Spectrochim. acta. B, 2002.-Vol. 57. -N l.-p. 167-171.

148. Werner Т., Kurner J. M., Krause C., Wolfbeis O. S. New longwave absorbing chromogenic for calcium determination in aqueous environment// Anal. chem. acta 2000. - Vol. 421. - N 2. - p. 199-205.

149. Brodkin С.A., Moon J.-D., Camp J., Echeveriia D., Redlich C.A., Willson R.A., Checkoway H. Serum biochemical activity in two populations of workers exposed to styrene//Anal. chem. acta, 2001. Vol. 458. - N 2. - p. 95-102.

150. Martin S.P., Lamb D.J., Lynch J.M., Reddy S.M. Enzyme-based determination of cholesterol using the quartz crystal acoustic wave sensor // Anal, chem. acta 2003. - Vol. 487. - N 1. - p. 91-100.

151. Тогузов Р.Т., Яшин Я.И., Яшин А.Я., Лапин Б.П., Гугля Е.Б., Тихонов Ю.В. Биомаркеры заболеваний человека как проблема аналитической химии// Тез. Докл. Всерос. симп. "Хроматография и хроматографические приборы», 2004: Сборник тезисов М., 2004. - с. 72.

152. Лапшина А.С., Королева Е.М. Определение катехоламинов и винилилминдальной кислоты в моче методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором// Тез. Докл. Всерос. симп. "Хроматография и хроматографические приборы», 2004: Сборник тезисов М., 2004. - с. 253.

153. Gyurcsanyi R. Е., Bereczki A., Nagy G., Neuman М. R., Lindner Е. Amperometric microcells for alkaline phosphatase assay// Analyst 2002. - Vol. 127.-N2.-235-240.

154. ГОСТ 8.315-97 «Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов».- М.: ИПК Издательство стандартов, 1997.

155. Дворкин В.И. Метрология и обеспечение качества количественного химического анализа. М.: Химия, 2001,- 263 с.

156. Шаевич А.Б. Стандартные образцы для аналитических целей.- М.: Химия, 1987.- 184 с.

157. Гаранина Е.Н. Качество лабораторного анализа.- М.: Лабинформ, 1997.192 с.

158. Липперт Г. Международная система единиц в медицине.- М.: Медицина, 1980.- 208 с.

159. Управление качеством клинических лабораторных исследований/ Под ред. В.В. Меньшикова.- М.: Лабпресс, 2000.- 152 с.

160. МИ 2552-99 Рекомендация. Государственная система обеспечения единства измерений. Применение Руководства по выражению неопределенности измерений.- М., 1999.

161. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. Пер с нем.- М: Мир, 1994.-268 с.

162. МИ 2336-95 «Характеристика погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания». Екатеринбург, 1995.

163. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. JL: Химия, 1984.- с.ЗЗ.

164. Мердок Дж. Контрольные карты. М.: Финансы и статистика, 1986.- 150 с.

165. ЖХ жидкостная хроматография

166. ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

167. ТСХ тонкослойная хроматография1. МЭ метиловые эфиры1. Кл колонка1. НФ неподвижная фаза1. ПФ подвижная фаза

168. ПИД пламенно-инизационный детектор1. ВС внутренний стандарт

169. Т кл ~ температура колонки

170. Т исп температура испарителя

171. Т дет температура детектора1. А адреналин1. НА норадреналин1. ДА дофамин

172. ДГБА дигидроксибензиламин ЭДТА - этилендиаминтетраацетат СЖК - свободные жирные кислоты бенз. - бензолац. ацетонлед. уксус, к-та ледяная уксусная кислота эф. — эфирх.р. хорошо растворимум.р. умеренно растворимн.р. нерастворимоб./мин — обороты в минуту

173. ИБС ишемическая болезнь сердца1. AJIAT аланинтрасфераза1. АСАТ аспартаттрансфераза1. УТВЕЖДАЮ

174. Проректор по НИР Самарского государственного университета1. Ю.Н. Горелов200£г.твенного рситета1. В.В.Косарев/// 2005г.1. М.П.1. АКТо внедрении методики "Определение катехоламинов в плазме крови методом ВЭЖХ"

175. Настоящий акт составлен о том, что на кафедре эндокринологии Самарского государственного медицинского университета с 01.03.2005 г. проведено внедрение методики № 17/05 "Определения катехоламинов в плазме крови методом ВЭЖХ".

176. Данная методика разработана профессором СамГУ Лобачевым А.Л. и спе- . циалистом клинической лабораторной диагностики/аспирантом Колосковой С.В.

177. Авторы: Заведующий кафедройэндокринологии СамГМУ д.м.н., профессор

178. Лобачев А.Л. /X^tW ■ Вербовая Н.И.1. УТВЕЖДАЮ

179. Проректор по НИР Самарского государственного1. Ю.Н. Горелов200&Г.1. Мр. В.Косареварственного |верситета2005г.1. М.П.1. АКТо внедрении методики "Определение высших жирных кислот методом газовой хроматографии"

180. Настоящий акт составлен о том, что на кафедре эндокринологии Самарского государственного медицинского университета с 12.01.2005 г. проведено внедрение методики № 14/05 «Определение высших жирных кислот методом газовой хроматографии».

181. Данная методика разработана профессором СамГУ Лобачевым А.Л. и специалистом клинической лабораторной диагностики/аспирантом Колосковой С.В.

182. Авторы: Заведующий кафедройэндокринологии СамГМУ д.м.н., профессор1. Лобачев А.Л.1. Вербовая Н.И.с/1. УТВЕЖДАЮ

183. Проректор по НИР Самарского государственного университете1. Ю.Н. Горелов 2006г.1. ООО «Центр «Диабет»1. Н.И. Вербовая 2005г.1. АКТо внедрении методики "Определение холестерина в плазме крови методом ВЭЖХ"

184. Настоящий акт составлен о том, что в ООО «Центр «Диабет» с 12.05.2004 г. проведено внедрение методики № МИ-003-04 "Определения холестерина в плазме крови методом ВЭЖХ".

185. Данная методика разработана профессором СамГУ Лобачевым А.Л. и специалистом клинической лабораторной диагностики/аспирантом Колосковой С.В.

186. Авторы: у. Медицинский директор

187. Лобачев А.Л. //W^- Антонова М.В.

188. Колоскова С.В. /Ul-ttiZe&j1. УТВЕЖДАЮ

189. Проректор по НИР Самарского государственного университета1. Ю.Н. Горелов2006г.1. ООО «Центр «Диабет»1. И. Вербовая 2005г.1. АКТо внедрении методики "Определение катехоламинов в плазме крови методом ВЭЖХ"

190. Настоящий акт составлен о том, что в ООО «Центр «Диабет» с 06.02.2004 г. проведено внедрение методики №. МИ-001-04 "Определения катехоламинов в плазме крови методом ВЭЖХ".

191. Данная методика разработана профессором СамГУ Лобачевым А.Л. и специалистом клинической лабораторной диагностики/аспирантом Колосковой С.В.

192. Авторы: Медицинский директор

193. Лобачев А.Л. l/W\) v Антонова М.В.1. УТВЕЖДАЮ

194. Проректор по НИР Самарского государственного университетаШ1. Ю.Н. Горелов1. ООО «Центр «Диабет»1. И. Вербоваяi>/ \1. Ж/л. Аг/2005г.I1. АКТо внедрении методики "Использование совокупности аналитических параметров для решения диагностических задач"

195. Настоящий акт составлен о том, что в ООО «Центр «Диабет» с 01.02.2005 г. проведено внедрение методики № МИ-001-05 "Использование совокупности аналитических параметров для решения диагностических задач".

196. Данная методика разработана профессором СамГУ Лобачевым А.Л. и специалистом клинической лабораторной диагностики/аспирантом Колосковой С.В.

197. Авторы: jT/1 Медицинский директор

198. Лобачев А.Л. l/^Hj Антонова М.В.1. УТВЕЖДАЮ

199. Проректор по НИР Самарского государственного университета1. Ю.Н. Горелов2005 г.