Остаточное диполь - дипольное взаимодействие в ЯМР исследованиях пространственного строения олигопептидов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им В.И. Ульянова-Ленина

На правах рукописи

КЛОЧКОВ АНТОН ВЛАДИМИРОВИЧ

ОСТАТОЧНОЕ ДИПОЛЬ - ДИПОЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В ЯМР ИССЛЕДОВАНИЯХ ПРОСТРАНСТВЕННОГО СТРОЕНИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ

01.04 07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 О иг\п ТГПН

Казань - 2008

003452390

Диссертационная работа выполнена в научно-исследовательской группе ЯМР лаборатории Изучения Структуры Органических Соединений и на кафедре молекулярной физики Казанского государственного университета

Научный руководитель' доктор физико - математических наук,

профессор СКИРДА В Д

Научный консультант' доктор химических наук,

профессор АГАНОВА В

Официальные оппоненты: академик АН Республики Татарстан,

доктор физико - математических наук, профессор ИЛЬЯСОВ А. В.

доктор физико - математических наук, ведущий научный сотрудник КРУШЕЛЬНИЦКИЙ А. Г.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

Физической и органической химии Южного Федерального университета, г. Ростов

Защита состоится " 27 " ноября 2008 года в "1430" на заседании Диссертационного совета Д 212 081.15 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И Лобачевского Казанского государственного университета.

Афтореферат разослан " 24 " октября 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук, профессор

М В Еремин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Одной из важнейших задач химической и биологической физики является установление пространственного строения органических и биоорганических соединений. Хорошо известно, что биологическая активность протеинов связана с их пространственным строением. Изучение конформаций олигопептидов также важно, так как они являются структурными блоками полипептидов, и знание их пространственного строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей протеинов Кроме того, многие из олигопептидов обладают фармакологическими свойствами, а некоторые короткие пептидные последовательности, синтезируемые клеткой, являются частью иммунной системы живого организма.

Традиционно исследования пространственного строения органических соединений в растворах основаны как на данных одномерной ЯМР спектроскопии, включая динамический ЯМР, так и на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера и обмена), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 Л. К сожалению, применение двумерной NOESY ЯМР спектроскопии к исследованию низкомолекулярных органических соединений, подпадающих под условие быстрого движения (00 о * « 1, где Тс - время корреляции

молекулярного движения, СОо - угловая скорость прецессии магнитных ядер) не всегда эффективно В этом случае наблюдаются слабые по интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение количественной информации о межпротонных расстояниях в таких системах

Среди направлений в приложениях ЯМР спектроскопии особое место занимает подход к определению конформаций молекул, растворенных в магнитно-ориентированных лиотропных жидкокристаллических системах (Tjandra N, Вах A, Science, 1997) В его основе лежит анализ остаточного диполь-дипольного взаимодействия (residual dipolar couplings, RDC) между магнитными ядрами С недавних пор этот подход активно используется при исследованиях методом ЯМР биохимических объектов, таких как полипептиды и позволяет независимым образом определять структуру этих соединений в растворах. Актуальным является приложение этого подхода к определению конформаций молекул, подпадающих под условие быстрого движения, к которым относятся и олигопептиды

Задача частичного ориентирования исследуемых органических молекул в магнитном поле требует поиска и подбора подходящих лиотропных жидкокристаллических сред, включающих ламеллярную (La) - фазу В литературе есть описание некоторых лиотропных сред, однако в этих работах не приводятся фазовые диаграммы ламеллярного состояния для них, определенные методом ЯМР спектроскопии, что осложняет использование смесей при определении остаточного диполь-дипольного взаимодействия. Поскольку, большинство органических соединений растворимы лишь в органических растворителях, то выявление лиотропных смесей на их основе также являлось важной задачей

Цель работы определение пространственного строения олигопептидов, содержащих в цепи от двух до четырех аминокислотных остатков, с использованием подхода, основанного на анализе величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, проявляющегося при растворении пептидов в лиотропных жидкокристаллических средах В

качестве пар магнитных ядер выбраны ядра ,3С и 'Н, разделенные одной химической связью, как единственно возможные при исследованиях олигопептидов с естественным содержанием изотопов.

Необходимость апробации подхода к определению конформаций олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения, определила дополнительную задачу: исследование стереоизомеров тиакаликс[4]арена, подпадающих под это условие при комнатной температуре и низкой концентрации их в растворе.

Физико-химические свойства исследованных соединений определили необходимость поиска лиотропных магнитно-ориентированных сред, обладающих ламеллярными свойствами в широком диапазоне температур и концентраций, включая среды на основе органических растворителей Решение этой задачи и определение границ существования ламеллярной фазы для этих сред методом ЯМР спектроскопии являлось условием достижения выше обозначенной цели.

В качестве объектов исследования выбраны дипептид 01и-Тгр, являющийся основной составляющей лекарственных средств; трипептиды 01у-01у-й1у, 01у-01у-ЬНз, С1у-С1у-Туг, Ии-Сув-Яу, которые используются в качестве лигандов в комплексах с Си (II) и применяются в качестве моделей активных центров ферментов; тетрапепггид пАс-8сг-РЬе-Уа1-С1у-ОМе - актуальная модель исследования межмолекулярных взаимодействий пептидов с растворителями

Научная новизна работы определяется следующим:

Показана принципиальная возможность использования подхода, основанного на определении и анализе остаточных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами |3С и 'Н, разделенными одной химической связью ('Осн) для описания пространственного строения соединений, подпадающих под условие быстрого движения. С помощью этого подхода впервые удалось различить конформации конус и 1,3-альтернат для изомеров тетратиакаликс[4]арена Результат подтвержден двумерными ЯМР МОЕвУ ('Н-'Н) экспериментами, проведенными для этих соединений в изотропном растворителе СИСЬ.

На основании анализа величин ' Сен впервые определено пространственное строение ряда олигопептидов, имеющих важное практическое приложение: дипептида Яи-Тгр, трипептидов 01у-01у-С1у, Оу-Яу-Шв, Яу-Яу-Туг; С1и-Суз-01у и тетрапептида пАс-8ег-РЬе-УаЮ1у-ОМе.

Впервые метод 2Н ЯМР предложен для определения границ существования магнитно-ориентированной ламеллярной Ьп - фазы в координатах температура - концентрация мицеллообразующих соединений, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления ЯМР сигналов 2Н дейтерированной воды

Впервые: предложена и изучена лиотропная жидкокристаллическая система п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5, где С„ означает число атомов углерода в углеводородной цепи, а Ет число гликольных фрагментов), диметилсульфоксид и вода, которая может быть использована для частичного ориентирования нерастворимых (или плохо растворимых) в воде органических или биоорганических молекул; методом 2Н ЯМР определены фазовые диаграммы ламеллярного состояния для предложенной системы.

Методом 2Н ЯМР впервые определены границы ламеллярной Ьа -фазы в координатах температура - концентрация п-алкил-поли(этилен)гликоля в воде для лиотропных жидкокристаллических систем на основе С„Е„, - октанол и вода Показано, что

предложенная нами система С12Е5 - октанол и вода проявляет искомые ламеллярные свойства в более широком диапазоне температур и концентраций, чем известная система CgE3 - октанол и вода.

Научная и практическая ценность

1 Координаты атомов (в pdb формате), входящих в состав изученных олигопептидов (дипептид Glu-Trp, трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu-Cys-GIy и тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe), определенные путем анализа экспериментальных значений 'Dch, могут быть использованы при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае фрагментов цепей полипептидов).

2 Предложенные лиотропные жидкокристаллические системы могут быть использованы для частичного ориентирования как воднорастворимых соединений [система п-алкил-поли(этилен)гликоль (C^Ej) - октанол - вода], так и соединений, растворимых лишь в органических растворителях [система диметилсульфоксид - п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5) - вода]

3 Способ определения границ существования ламеллярной магнитно-ориентированной La - фазы, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления ЯМР сигнала 2Н дейтерированной воды, может быть применен при исследованиях фазовых состояний различных лиотропных сред.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается:

а) использованием подхода, основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия в исследованиях строения полипептидов и белков; б) согласием с аналогичными исследованиями, проводимыми с помощью других подходов в ЯМР спектроскопии (например, с данными двумерной ЯМР NOESY спектроскопии, в тех случаях, где это было возможно); в) использованием современного ЯМР оборудования и программного обеспечения

Результаты исследований обсуждались в рамках научных конференций, а также в известных научных изданиях, где анализировались на предмет достоверности.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на VII - ой Молодежной научной школе «Новые аспекты применения магнитного резонанаса» (г. Казань, 2003); на XVII - м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г Казань,

2003); на II - ой Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (г. Ростов-на-Дону, 2003), на IV - й Научной конференции Молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (г. Казань,

2004); на VII - м Международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология) (г Ростов-на-Дону, 2004), на IV - м Всероссийском семинаре "Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях" (г Казань, 2005); на X, XI, XII и XIII - й Всероссийских конференциях "Структура и динамика молекулярных систем" (г. Йошкар-Ола, 2003 - 2006) и на Итоговой конференции Казанского государственного университета (Казань, 2007).

Работа, на отдельных этапах, выполнялась в соответствии с Техническими заданиями Грантов РФФИ (03-03-33112а, 06-03-32101а), программы "Развитие научного потенциала Высшей школы" и гранта Казанского государственного университета (НИР КГУ № 1.3.03, ЕЗН - тема "СДМС")

По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах и 11 работ в сборниках статей и тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 62 рисунка и 14 таблиц. Список цитированной литературы содержит 99 наименований.

В первой главе представлены общие вопросы одно- и двумерной ЯМР спектроскопии, а также принципы подхода к определению конформаций органических молекул растворенных в лиотропных магнитно-ориентированных жидкокристаллических системах, основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами. Во второй главе рассмотрена спектроскопия ЯМР ориентированных молекул как метод структурного анализа, описаны типы жидкокристаллических сред, используемых в спектроскопии ЯМР для слабого ориентирования молекул В данной части работы представлены и оригинальные исследования методом ЯМР спектроскопии лиотропных жидкокристаллических систем, их свойств, в частности, представлены фазовые диаграммы ламелляркого состояния (в координатах концентрация компонентов -температура раствора) для некоторых известных лиотропных средах и средах предложенных нами. В третьей главе рассмотрена возможность использования подхода, основанного на анализе остаточных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами |3С и 'Н, разделеных одной химической связью ('Рсн), для органических соединений, подпадающих под условие быстрого движения Показана принципиальная возможность применения этого подхода для установления пространственного строения изомеров тиакаликс[4]арена. Подход использован при установлении пространственного строения ряда олигопептидов: дипептида С1и-Тгр; трипептидов 01у-С1у-01у, 01у-С1у-Н1з, Иу-Иу-Туг; Яи-Сув-СИу; тетрапептида пАс-Бег-РИе-УаЬЯу-ОМе. В четвертой главе описана техника и методика проведения эксперимента и измерений, условия приготовления образцов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Остаточное днполь-днпольное взаимодействие в определении пространственного строения органических соединений

В данной работе рассматривается подход к определению конформаций органических молекул, частично ориентированных в лиотропных жидкокристаллических системах, основанный на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами 13С и 'Н, разделеных одной химической связью ('оСц) (здесь и далее цифровой индекс означает число связей, разделяющих соответствующие атомы). Как известно, в растворах диполь-дипольное взаимодействие между магнитными ядрами внутри молекулы полностью усредняется вследствие хаотичного движения молекул. Если молекулярная система растворена в лиотропной жидкокристаллической системе, то поступательное и вращательное движения молекул перестают бьггь изотропными, как результат взаимодействия с магнитно-ориентированными молекулярными образованиями Эта анизотропия в движении молекул приводит к тому, что диполь-дипольного взаимодействие не усредняется полностью (остаточное диполь-дипольное взаимодействие), что проявляется в ЯМР спектрах, в виде расщепления Уширение сигналов ЯМР при этом не существенно. Известно, что величина диполь-дипольного взаимодействия (0,9) между двумя магнитными ядрами I и .1 может быть выражена следующим образом:

О« (8,ф) = и" {(Зсоз2 9 - 1) + 3/2 Я вш2 8 а« 2ф}, (1)

где = - (цоЬ/16тс3) 8 ус/1 {гу/3} Аа Здесь А, = А„ - (А« + Ау,) / 2 - аксиальная компонента молекулярного тензора А, характеризующего преимущественное пространственное расположение молекулы относительно направления внешнего магнитного поля; Я = (Ахч - Ауу) / А„ ромбическая компонента, А хх , Ауу и Ад - проекции молекулярного тензора А на х, у и т. направления ортогональной системы координат, связанной с молекулой; 9 и ср - полярные координаты межядерного вектора (I и .1 ядра); 8 -параметр порядка, отражающий внутреннюю динамическую подвижность меж ядерного вектора; у/ и -р - гиромагнитные отношения ядер I и Л; г,.г расстояние между магнитными ядрами

Поскольку исследуемые молекулы и ориентированные ламеллярные частицы не связаны между собой ковалентно, в образце реализуется быстрый обмен между молекулами, находящимися в анизотропной и изотропной частях образца. Отсюда следует, что наблюдаемая величина 'Эсн представляет собой усредненную между константой диполь-дипольного взаимодействия в молекуле, находящейся в анизотропной части образца ('Осн ати) и нулевым значением константы для молекулы, находящейся в изотропной части образца (отсюда термин частичного ориентирования молекул). В этом случае обмен приводит к тому, что величина наблюдаемой константы будет равна: 'Бен ~ Р„,„„ 'Осна»ы + (1- Р„,„„)*0 = Р„„ш 'Осн™^, где Р„„„ определяется относительным временем жизни молекулы вблизи магнитно-ориентированных ламеллярных частиц. В реальных условиях, с учетом того, что значение константы 'Осншш лежит в пределах до (+/-) ~ 2 5 кГц, ожидаемое максимальное значение наблюдаемых констант может лежать в пределах 25 - 125 Гц

Для пары магнитных ядер |3С и 'н в наблюдаемую константу спин-спинового взаимодействия одновременно могут давать вклады, как косвенное, так и диполь-дипольное

взаимодействие ('Jch + 'Dch) Эти прямые константы спин-спинового взаимодействия для пар магнитных ядер молекул, растворенных в лиотропной жидкокристаллической среде ('Jch + 'Dch) и изотропном растворителе ('Jch), можно определить методом ЯМР 13С спектроскопии в отсутствии радиочастотной развязки от протонов, а величины 'Dch определяляются из разницы этих наблюдаемых КССВ

Анализ определенных величин 'Dch проводится по известным программам PALES или MODULE, в основе которых лежит соотношение (1). Программы позволяют связывать значения наблюдаемых величин 'Dch и пространственное расположение межьядерных векторов (химическая связь С-Н) относительно внешнего магнитного поля в рамках предполагаемой (рассчитанной) конформации исследуемой молекулы. Критерием соответствия исходной и реальной структур является линейная корреляция между наблюдаемыми и рассчитанными величинами 'Dch

Изучение ламеллярных свойств лиотропных жидкокристаллических сред методом ЯМР

Физико-химические свойства исследованных олигопептцдов определили необходимость исследования методом ЯМР спектроскопии ламеллярных жидкокристаллических состояний лиотропных систем на основе п-алкил-поли(этилен)гликолей, хлорид или бромид цетилпиридиния и нормальных спиртов в диметилсульфоксиде и воде.

При определенных условиях перечисленные системы формируют ламеллярные жидкокристаллические фазы, обозначаемые как Lee, в которых плоскости молекулярных образований ориентируются в магнитном поле вдоль его направления. Существование упорядоченной фазы подтверждалось наблюдением квадрупольного расщепления 2Н ЯМР сигнала дейтерированной воды (D2O), входящей в состав жидкокристаллических систем, как следствие, различной ориентации квадрупольных ядер дейтерия молекулы воды вблизи частиц, образующих ламеллярную фазу. Наблюдаемое расщепление представляет собой усредненное расщепление между различными сигналами дейтерия воды, находящейся в анизотропной части (Av„,„u), и «синглетным» сигналом дейтерия воды в изотропной части образца На рисунке 1 представлено квадрупольное расщепление сигнала 2Н ЯМР дейтерированной воды в двух лиотропных системах на основе п-алкил-поли(этилен)гликолей, и нормальных спиртов (октанол и гексанол)

Жидкокристаллические лиотропные системы на основе п-алкил-поли(этилен)гликолей (CsEs и CuEs) и нормальных спиртов

Исследуемые жидкокристаллические лиотропные системы представляют собой смеси п-алкил-поли(этилен)гликолей (CgEs или С12Е5), нормальных спиртов (гексанол или октанол) и воды. В литературе описаны смеси CgEs - октанол и вода, а также С12Е5 -гексанол и вода, однако там не приводятся фазовые диаграммы жидкокристаллического состояния для этих систем. Смесь С12Е5 - октанол и вода предложена и описана нами впервые

м I I

нг 0 50~

Рисунок 1 - 2Н ЯМР спектр дейтерированной воды в двух лиспропных системах на основе п-алкил-поли(этилен)гликолей (СвЕв и СцЕ5) и нормальных спиртов.

Рисунок 2 - Зависимости квадрупольного расщепления (Ду, Гц) сигнала 2Н ЯМР дейтерированной воды для системы п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5), октанол от концентрации С12Е5 в воде (массовые) [Т = 288 К, мольное соотношение С12Е5/октанол (г) = 0 536] (слева) и от температуры [концентрация С12Е5 в воде 3 01 % (массовая), г(С|2Е5/октанол) = 1.06 (верхняя зависимость) и 0.92 (нижняя)] (справа).

Было установлено влияние концентраций п-алкил-поли(этилен)гликолей (СвЕв и СиЕО в воде и температуры на наблюдаемое квадрупольное расщепление спектра 2Н ЯМР дейтерированной воды (Ду, Гц), когда системы находились в жидкокристаллических ламеллярных фазах. На рисунке 2 представлены, в качестве примера, подобные зависимости для среды п-алкил-поли(этилен)гликоль, октанол и вода Пунктирные прямые, приведенные на рисунке 2, ограничивают зависимости наблюдения квадрупольного

расщепления спектра 2Н ЯМР дейтерированной воды для приведенных параметров, характеризующих данную среду.

Наблюдение квадрупольного расщепления спектра 2Н ЯМР дейтерированной воды (Ду, Гц) при изменении концентрации мицеллообразующих веществ и температуры для систем п-алкил-поли(этилен)гликолей (С*Е5 или С12Е5) - октанол и вода методом 2Н ЯМР позволило выявить границы существования магнитно-ориентированных ламеялярных Ьа -фаз этих сред в координатах температура - концентрация (С8Е5 или С12Е5) в воде.

концентрация, %

Рисунок 3 - Фазовая диаграмма ламеллярного состояния среды п-алкил-поли(этилен)гликоль (СвЕз), октанол и вода; г(С8Е5/октанол) = 1.06 (слева) и п-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), октанол и вода; г(С12Е5/октанол) = 1 22 (справа). Внутри обозначенных контуров системы находятся в ламеллярной Ьц -фазе

На рисунке 3 представлены фазовые диаграммы ламеллярного состояния для исследованных систем. Отметим, что обозначенные диаграммы имеют определенную экспериментальную погрешность, которая может быть охарактеризована как в 2.5 К по температурной шкале и в 0.2 % (массовые) по шкале концентрации. Сравнивая две эти фазовые диаграммы, необходимо отметить, что ламеллярная Ьц -фаза предложенной нами системы п-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5) - октанол существует в более широком диапазоне температур (вдвое больший) и концентраций (почти в полтора раза), чем известная в литературе системы п-алкил-поли(этилен)гликоля (С8Е5)-октанол

Изучение системы С12Е5 - октанол и вода методом 2Н ЯМР позволило выявить границы существования ламеллярных фаз в координатах температура - мольное соотношение С12Е5 к октанолу (г) Анализ этих фазовых диаграмм позволяет утверждать, что предложенная нами система п-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5) - октанол и вода сохраняет свои жидкокристаллические свойства в довольно широком диапазоне мольного соотношения С12Е5 к октанолу (г).

Жидкокристаллическая лиотропная система на основе п-алкш-поли(этилен)гликоля (С12Е5) и диметилсульфоксида ((СО 1)280)

Нами предложена жидкокристаллическая лиотропная среда на основе л-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), диметилсульфоксида ((СОз)2Ю) и воды, которая может быть использована для создания частичного ориентирования нерастворимых (или плохо растворимых) в воде органических или биоорганических молекул.

Данная молекулярная смесь характеризуется определенным содержанием п-алкил-поли(этилен)гликоля в растворе ((С0з)250 + БгО) (массовым) и мольным соотношением диметилсульфоксида ((СО^ЭО) и воды (020). Были исследованы образцы с весовыми соотношениями 1/1 и 1/2 [смеси (А) и (Б), соответственно], а концентрация и-алкил-поли(этилен)гликоля менялась от 3 до 13 % (массовые).

Существование ламеллярной Ьа-фазы также подтверждалось наблюдением квадрупольного расщепления 2Н ЯМР сигнала дейтерированной воды (020), входящей в состав смеси.

Установлено влияние концентраций л-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5) в (ОгОНСОз^БО) и температуры раствора на наблюдаемое квадрупольное расщепление спектра 2Н ЯМР дейтерированной воды (Ду в Гц), когда среды существовали в ламеллярной Ьа-фазе. Это позволило определить границы магнитно-ориентированных ламеллярных -фаз предложенных сред в координатах температура - концентрация С12Е5 в растворе (ОгОНСОз^О) (рисунок 4)

концентраций, %

Рисунок 4 - Фазовая диаграмма магнитно-ориентированного ламеллярного состояния среды и-алкил-поли(этилен) гликоль CuEs, диметилсульфоксид и вода; соотношение (CD3)2SO / D2O =1:1. Внутри обозначенного контура система находится в ламеллярной Lа -фазе

Рассмотрено приложение смеси (А) для определения величин *Dch между магнитными ядрами |3С и 'Н в аминокислоте - метионин (1) в этой среде CH3-s-CH2-CH2-ch(nh2)-c(0)-0h (1) Наблюдаемые величины диполь-дипольного взаимодействия ('Dch) определенные из разницы наблюдаемой КССВ ('Jch + 'Dch) для магнитных ядер |3С и 'н молекул, растворенных в предложенной лиотропной среде и изотропном растворителе, оказались следующими в -СН< группе 'dch = - 3 9 (- 8 8) Гц, в s- СН2- группе 'dch = - 14 6 (- 18.2)

Гц, в - СН2 - группе 'DCH = - 15.0 (-18 4) Гц и в - СН3 группе 'Dch = +2 1 (+6 7) Гц (в скобках приведены 'Dch, полученные в известной смеси С12Е5 - и-гексанол) Анализ полученных величин 'Dch в двух средах показывает синхронность в изменении этих величин, что подтверждает применимость предложенной лиотропной среды на основе п-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), диметилсульфоксида ((CD3)2SO) и воды для частичного ориентирования молекул.

Жидкокристаллические лиотропные системы на основе хлорид (или бромид) цетилпиридиния, нормального спирта (гексанол) и воды

В литературе описаны и используются лиотропные системы на основе хлорид- или бромид- цетилпиридиния, однако в этих работах не приводятся фазовые диаграммы жидкокристаллического состояния этих систем, определенные методом ЯМР. Эти системы представляют собой смеси хлорид (или бромид) цетилпиридиния (СРС1 или СРВг), нормального спирта (гексанол), воды и соответствующей соли NaCl (или NaBr) Нами проведены исследования влияния концентрации хлорид (или бромид) цетилпиридиния в воде и температуры на наблюдаемое расщепление спектра 2Н ЯМР дейтерированной воды (Av, Гц), когда среды существовали в ламеллярной фазе Отметим, что в пределах этих двух систем существенных различий во влиянии концентрации и температуры на квадрупольное расщепление в спектре 2Н ЯМР дейтерированной воды не наблюдалось. В результате исследований были определены фазовые диаграммы ламеллярного жидкокристаллического состояния этих систем.

Пространственное строение модельных низкомолекулярных соединений, определенное на основании анализа остаточного диполь-дипольного взаимодействия

Как уже отмечалось выше, на сегодняшний день активно используется подход к определению конформаций протеинов, частично ориентированных в лиотропных жидкокристаллических системах, основанный на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия. Применение данного подхода к определению конформаций низкомолекулярных органических соединений, подпадающих под условие быстрого движения, в литературе лишь начали появляться. И хотя физические основы этого подхода не предполагают принципиального подразделения исследуемых объектов на "малые" и "большие" молекулы, высокая подвижность низкомолекулярных соединений не давала уверенности в возможности наблюдения остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами в известных лиотропных системах.

Остаточное диполь-дипольные взаимодействие в бензойной кислоте

В качестве модели, позволяющей выявить возможность определения остаточного диполь-дипольного взаимодействия для небольших молекул, подпадающих под условие быстрого движения, была выбрана бензойная кислота (рисунок 5) Были рассмотрены взаимодействия между ядрами ,3С и 'Н, разделенными одной химической связью, в бензойной кислоте, растворенной в лиотропной среде и изотропном растворителе (D2O) Оказалось возможным определить величины 'Dch, значения которых получены из разницы наблюдаемой КССВ ('Jch + 'Dch) для магнитных ядер молекул, растворенных в лиотропной жидкокристаллической среде и изотропном растворителе (рисунок 5): 'Dc(2,6)h = -07 Гц, 'Dc(3,5)h = - 06 Гц; 'Dc<4)h = П-З Гц. Исходя из выражения (1), следует ожидать

максимально положительного значения константы 'Оодн в случае совпадения направления вектора, соединяющего магнитные ядра 13С и 'Н, и направления внешнего магнитного поля. С учетом того, что направления связей Орд -Ни Ср.щ - Н связей отличаются от С<4) - Н направления на 60° и 120°, соответственно, ожидаемые значения 'Осрда и 'Ос(з.5)н должны быть, в соответствии с (1), тождественно равными. Выше приведенные экспериментальные значения величин 'Оцадн и 1 Пс<з.5>н подтверждают подобное описание диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами в бензойной кислоте.

Рисунок 5 - Сигнал ЯМР 1ЗС (75.43 МГц) атома углерода С(4) бензойной кислоты в отсутствии радиочастотной развязки от протонов в дейтерированной воде (слева) и лиотропной системе (справа).

Пространственное строение изомеров тиакаликс[4]арена

Модельными соединениями, позволяющими выявить возможности установления пространственного строения тиакаликс[4]аренов путем определения и анализа величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, были выбраны два стереоизомера: (2а) (конформация конус) и (2ь) (конформация 1,3-альтернат).

Величины 'DCh, определенные из разницы наблюдаемых КССВ (Jch + 'Dch) для магнитных ядер молекул, растворенных в ориентирующей среде (поли-у-бензил-L-глютамат в cdc13) и изотропном растворителе (CDCI3), оказались следующими: стереоизомер (2а) 'dch = +10.5 Гц, 'оснвд = + 20.0 Гц; 'dcm® = + 23.0 Гц, 'DCH3 = - 31.9 Гц, 'Dc(ch3)3 = - 8.2 Гц; стереоизомер (2b) 'DCH = + 57.4 Гц, 'DCh2«<) = + 110.8 Гц; 'эснгда = + 109.8 Гц, 'оСНз = - 38.0 Гц, 'Dc(ch3)3 — - 12.9 Гц. Анализ полученных величин 'Dch проводили по программе PALES. В качестве исходных данных для программы PALES были использованы координаты атомов конформеров (2а) и (2Ь), определённые по

программе МОРАС (метод РМЗ). Сопоставление значений 'Осн показало полное согласие между наблюдаемыми и рассчитанными значениями констант для случая, когда стереоизомеру (2а) приписывается конформация конус, а стереоизомеру (2Ь) -1,3 -альтернат (рисунок 6).

10 эксп / Гц

50 100

'О эксп / Гц

Рисунок 6 - Зависимости между наблюдаемыми величинами 'Осн для стереоизомеров (2а) (слева) и (2Ь) (справа) и рассчитанными значениями 'Осн для стереоизомера (2а) в конформации конус, а для стереоизомера (2Ь) в конформации 1,3-альтернат

-РЬ-

-С«!-

-СН! I 1 -МЗи

-1-Ви -ОН}

-СЛЬ--РЬ-

Рисунок 7 - 2М ЯМР ЫОЕЭУ (300 МГц) спектр стереоизомера (2Ь) тиакаликс[4]арена в растворе СОС13 (1т = 0.8 с)

Применимость подхода; основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия, к определению конформации тиакаликс[4]аренов подтверждается экспериментами 2М ЯМР NOESY ('Н-'Н), проведенными для стереоизомеров (2а) и (2Ь). В спектрах 2М ЯМР ИОЕБУ стереоизомера (2а) наблюдались кросс-пики в результате переноса поляризации дипольно взаимодействующих -С(СН3)3 и СН протонов аренового

кольца, а также кросс-пики между протонами метиленовой и метальной (-СН2-С(0)-С113) групп, находящихся на нижнем ободе макроцикла. В спектрах 2М ЯМР 1МОЕ8У стереоизомера (2Ь) (рисунок 8), кроме обозначенных кросс-пиков, наблюдаются кросс-пики между сигналом протона аренового кольца и сигналами протонов метиленовой и метальной (-СНг-С(О)-СНз) групп, а также кросс-пики между сигналами протонов группы -С(СНз)з и протонов метальной (-С(О)-СНз) группы. Подобная спектральная картина объяснима с позиций такого пространственного расположения этих групп лишь в конформации 1,3 - альтернат.

Остаточное диполь-дипольное взаимодействие и пространственное строение олигопептидов

В данном разделе на основании анализа величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами 13С и 'Н представлены результаты исследований пространственного строения олигопептидов: дипептида 01и-Тгр; трипептидов С1у-01у-01у, Иу-Оу-Шэ, 01у-С1у-Туг, О1и-Суз-О1у и тетрапептида пАс-Эег-РИе-Уа1-01у-0Ме. Эти соединения могут рассматриваться как модельные, поскольку определенные координаты всех атомов в рс1Ь формате, входящих в их состав, могут быть непосредственно использованы в сравнении с координатами атомов, входящих в состав полипептидов или белков. С другой стороны, как уже отмечалось, данные олигопептиды представляют самостоятельный интерес.

н,с ti

Рисунок 8 - Структурная формула тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe

Общий алгоритм определения пространственного строения олигопептидов выглядит следующим образом. Начальная стадия исследований заключалась в регистрации и полном описании *Н и J3C ЯМР спектров олигопептидов в водном растворе, а также |3С ЯМР спектров в лиотропной жидкокристаллической среде, находящейся в ламеллярной фазе (рисунки 8, 9 и 10, в качестве примера).

Известно, что пространственное строение основной цепи олигопептидов определяется расположением атомов и фрагментов молекулы относительно пептидной -С(О) - NH-связи, а также относительно -aCHR-C(O)- и - NH-aCHR- связей.

Н R

И 9 Н-

П Ф ÍÍ о> г

Д.^ N

У

"с"

II

о

N С' " С/ Н 11 / '• OHR

ЯМР спектроскопия позволяет описать пространственное строение олигопептидов в терминах расположения аминокислотных фрагментов относительно пептидных связей. Это

связано с тем, что вращение вокруг.-C(0)-NH- (о) связей заторможено (энергия активация 75-80 кДж/моль), что может приводить к одновременному существованию коформеров транс и цис (относительная ориентация С(О) и NH связей) в растворе при комнатной температуре. В олигопептидах вращение вокруг -aCHR-C(O)- (у) и - NH-aCHR- (ф) связей определяется низким барьером (до 20 кДж/моль), а число устойчивых конформеров вращения для каждого из этих фрагментов может достигать трех. Как результат, нельзя заранее исключить тот факт, что наблюдаемые ЯМР спектры могут представлять собой усредненные спектры, за счет быстрого вращения фрагментов молекулы вокруг этих связей.

ссСН Ser

0CHU Ser aCH Val

Mj

aCH2 Gly

CH, Gly

4.0 3.9 3.8 ppm

eCH и £CH Phe

NH Phe NH Val

^ I

aCH Phe

SCH Phe

/ж.

рсн, Phe PCH Val

CH, Ser V CH, Val

9.5 9.0 8.5 8.0 "7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 3.5 4.0 3.5 3.0 2.5 ^.0 1.5 1.0 0.5 pprc.

Рисунок 9 - ЯМР 'н (700 МГц, AVANCE-700, "Bruker", Университет г. Лейпциг, Германия) спектр тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в растворе D2O (значком (*) отмечены сигналы примесей). Т= 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 'Н ТМС.

СН3 Ser

CH,Gly

у СНз Val

jjjw«...........lj. .......jilüillL»

■r-j-r-60

55

51)

4Í

25

Рисунок 10 - Часть ЯМР |3С (176 МГц) спектра тетрапептида пАс-5ег-Р11е-Уа1-С1у-ОМе в условиях отсутствия радиочастотной развязки от протонов в растворе ЭгО (внизу) (значком (*) отмечены сигналы примеси) и в среде С12Е5, гексанол и вода (ламеллярная фаза) (вверху). Т= 298 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР |3С ТМС.

Поскольку для всех исследуемых соединений наблюдались лишь индивидуальные ЯМР 'Н и 13С спектры в используемых средах, сделан вывод, что олигопептиды при комнатной температуре существуют в растворе в виде индивидуальных конформеров относительно частично двойных пептидных С(О) - NH связей.

Для определения межпротонных расстояний, напрямую характеризующих пространственную геометрию олигопептидов в растворе D2O, записывались спектры 2D NOESY с вариацией времени смешивания. Наблюдать кросс-пики между протонами, относящимися к различным аминокислотным фрагментам, в спектрах 2D NOESY исследуемых соединений не удалось. Это объяснимо, прежде всего, удаленностью друг от друга аСН или аСН2 протонов, принадлежащих различным аминокислотным остаткам, а также тем обстоятельством, что метод двумерной NOESY ЯМР спектроскопии не всегда эффективен при исследованиях строения молекул, подпадающих под условие быстрого движения.

Далее, с целью определения координат атомов молекул олигопептидов, проводились полуэмперические расчеты теплот образования молекул по программе МОРАС (метод РМЗ). Эти же расчеты позволили определить некий конформер, как наиболее выгодный для каждого из олигопептидов. Полученные структуры рассматривались в качестве исходных при дальнейшем анализе величин 'Dch-

Величины диполь-дипольного взаимодействия ('Dch), определялись из разницы наблюдаемых КССВ ('Jch + 'Dch) для магнитных ядер молекул, растворенных в лиотропных жидкокристаллических средах и изотропном растворителе.

Рисунок 11 - Соотношения между наблюдаемыми величинами 'Оси для тетрапептида пАс-8ег-РЬе-Уа1-С1у-ОМе, растворенного в лиотропной жидкокристаллической среде, и значениями величин 'Оси в конформации, полученной в результате расчета по программе МОРАС (слева) и в оптимизированной конформации (справа).

Использование в качестве исходных данных для программы MODULE координат атомов олигопептидов определенных с помощью программного обеспечения МОРАС (метод РМ 3), и экспериментальных величин 'Dch во всех случаях приводило к отсутствию корреляции между наблюдаемыми и рассчитанными значениями 'Dch (рисунок 11, как пример).

GluTrp (глютомат-триптофян) GlyGlyGly (триглицин)

GlyGlyHis (глицин-глицин-гистидин)

GlyGlyTyr (глицнн-глицнн-тирозин)

С1иСузС1у (глутатион) п-Ас-8егРЬеУа1С1у-ОМе

(ацетилсерин-фенилаланин-валин-окснметилглицин)

Рисунок 12 - Установленные конформации олигопептидов 01иТгр, 01уС1у01у, С1уС1уН|5, 01у01уТуг, ИиСуэау и п-Ас-8егРНеУаЮ1у-ОМе, для которых наблюдалось лучшее соответствие между наблюдаемыми и рассчитанными значениями величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия.

Оптимизация исходных конформаций, путем поворота фрагментов молекулы вокруг отдельных связей (см. рисунок 8), что позволяло выбирать единственные структуры (рисунок 12), для которых наблюдались линейные корреляции между наблюдаемыми и рассчитанными величинами 'Dch (рисунок 11, справа).

В таблицах Приложения диссертации приведены координаты атомов исследованных олигопептидов, отвечающих оптимальному соответствию между наблюдаемыми и рассчитанными константами.

Для установления факта конформационной однородности (или конформационной неоднородности, за счет реализации нескольких конформеров вращения вокруг -aCHR-С(О)- и - NH-aCHR- связей) основной цепи олигопептидов в растворе были сняты и проанализированы CP/MAS ЯМР |3С спектры этих соединений в порошкообразном состоянии. На рисунке 13, в качестве примера приведен CP/MAS ЯМР |3С спектр теграпептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe.

Для четырёх из пяти исследованных олигопептидов (Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr, nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe) смена фазового состояния не привела к существенным изменениям величин химических сдвигов |3С аСН или аСНг углеродных атомов (исключением является дипептид Glu-Trp). Такой результат говорит о конформационной однородности и неизменности конформаций основных цепей этих олигопептидов при переходе от раствора к твердой фазе, поскольку качественное и количественное отличие в конформацшх привело бы, как известно, к существенным различиям в химических сдвигах (от 3 до 7 м.д.).

CHjGIy

с=о

Ser, Phe, Val, Gly

Э,5СН,2,6СН,4СН Phe

i i | . i i Г I I i TT7' i 'i-i i |

aCH2 Gly PCH2 Phe aCH Val PCH Val

CHj Ser CH3 Val

PCH, Ser

Рисунок 13 - CP/MAS ЯМР l3C (75.43 МГц) спектр теграпептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe. Скорость вращения образца - 4,5 кГц.

Исследованные в диссертации сгереоизомеры тетратиакаликс[4]аренов предоставлены профессором, чл -корр РАН Антипиным И С; трипептиды 01у-01у-01у, 01у-С1у-Н15, С1у-01у-Туг; Ии-Сув-Яу - зав. лаб., к.х.н. Штырлиным В.Г. (Казанский государственный университет); дипептид 01и-Тгр - профессором Байкиевым Р.Ф.

(Казанский медицинский университет) и тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe-профессором Бергером С. (университет г. Лейпциг, Германия)

Регистрация ЯМР >Н (300 МГц), ,3С (75.43 МГц) и 2Н (46.05 МГц) спектров лиотропных сред, аминокислоты - метионин (1), бензойной кислоты, изомеров тиакаликс[4] аренов (2а) и (2Ь), трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr и Glu-Cys-Gly в изотропной и лиотропной средах проводилась на ЯМР спектрометре "Unity-300" фирмы "Varian".

Запись ЯМР 'Н (700 МГц) и 13С (176 МГц) спектров дипептида Glu-Trp и тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в различных средах проводилась на ЯМР спектрометре AVANCE-700 фирмы "Bruker" (ЯМР лаборатория Университета Лейпцига, Германия). Концентрации исследованных соединений в растворах не превышали 0.5% (массовые). Спектры ЯМР 13С CP/MAS ЯМР (75.43 МГц) олигопептидов в порошке сняты на ЯМР спектрометре "Unity-300" с использованием датчика фирмы "Doty Scientific.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

На основании экспериментальных исследований свойств лиотропных жидкокристаллических сред и пространственного строения низкомолекулярных органических соединений методом ЯМР (JН, '^С, 2ц) спектроскопии, а также теоретического моделирования молекулярных структур с использованием программ МОРАС 7.0 (РМ 3), PALES и MODULE получены следующие основные результаты.

1 Показана возможность определения величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами 13С и 'Н, для органических соединений, подпадающих под определение быстрого движения. С помощью анализа величин 'Dch удалось различить стереоизомеры конус и 1,3-альтернат для тиакаликс[4]арена в ориентирующей среде (поли-у-бензил-Ь-глютамат в CDCb). Полученный результат подтвержден двумерными ЯМР NOESY ('Н-'Н) экспериментами, проведенными для этих соединений в растворителе CDCI3.

2. Путем анализа остаточных диполь-дипольных взаимодействий для всех пар ядер ,3С и 'Н, определено пространственное строение ряда олигопептидов, таких как: дипептид Glu-Trp; трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr, Glu-Cys-Gly; тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe, растворенных в магнитно-ориентированных жидкокристаллических средах. Для всего ряда этих молекулярных систем приведены координаты атомов в общепринятом pdb формате.

3. На основании сравнения величин химических сдвигов |3С аСН или аСНг углеродных атомов олигопептидов в растворе и порошке (CP/MAS ЯМР 13С спектроскопия) показана неизменность конформаций основных цепей трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr, Glu-Cys-Gly и тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe при переходе от раствора к твердой фазе Для дипептида Glu-Trp наблюдалось существенное изменение величин химических сдвигов, что не позволяет говорить об идентичности конформации его при изменении фазового состояния.

4 Предложена лиотропная жидкокристаллическая система на основе п-алкил-поли(этилен)гликоля (CnEj), диметилсульфоксида (органический растворитель) и воды. Возможность использования предложенной среды для частичного ориентирования олигопептидов продемонстрирована на примере аминокислоты - метионин

5. Впервые подход, основанный на наблюдении квадрупольного расщепления сигнала ЯМР 2Н дейтерированной воды, был использован для определения границ области существования магнитно-ориентированной ламеллярной La - фазы (фазовые диаграммы) в координатах температура - концентрация мицеллообразующих соединений в лиотропных жидкокристаллических системах а) п-алкил-поли(этилен)гликоль С12Е5 диметилсульфоксид и вода; б) хлорид (или бромид) цетилпиридиния, гексанол, вода и соответствующая соль NaCl (или NaBr); в) п-алкил-поли(этилен)гликоль (CgEs или С12Е5) -октанол и вода Показано, что для предложенной нами системы п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5) - октанол и вода ламеллярная L« -фаза существует в двое большем диапазоне температур и в полтора раза большем диапазоне концентраций, чем для известной системы п-алкил-поли(этилен)гликоль (CgEs) - октанол.

Публикации по теме диссертации

1. Klochkov, V V Spatial structure of triglycine determined by the residual dipolar couplings analysis [Text] / V.V. Klochkov, B.I Khairutdinov, A V. Klochkov, V.G Shtyrlm, R.A Shaykhutdmov //Appl. Magn. Resonance. - 2003. - v. 25. -p 113-119

2 Клочков, В В. Использование лиотропной жидкокристаллической среды и констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия для определения пространственного строения тиакаликс[4]аренов в растворах [Текст] / ВВ. Клочков, Б И. Хайрутдинов, А В Клочков, М.С Тагиров, К М. Тейл, С Бергер, И.С Вершинина, И.И Стойкое, И С Антипин, А.И. Коновалов // Изв РАН, сер. хим. - 2004. - вып. 7.-е 14111415

3. Klochkov, A.V. Determination of the spatial structure of glutathione by residual dipolar coupling analysis [Text] / AV Klochkov, B.l Khairutdinov, MS Tagirov, V.V. Klochkov // Magn. Resonance in Chemistry. - 2005. - v. 43. - p. 948-951

4 Klochkov, V.V. A novel liquid crystalline system for partial alignment of polar organic molecules [Text] / V.V. Klochkov, A.V. Klochkov, С M. Thiele, S. Berger // Journal of Magnetic Resonance - 2006 - v. 179, No 1. - p. 58-63

5. Клочков, B.B. Пространственное строение тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe определенное путем анализа констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия [Текст] / В.В Клочков, В Д Скирда, А В. Клочков, С. Бергер // Ученые Записки Казанского Государственного Университета - 2007. - т 149, Серия Естественные науки, книга 1.-е 21-30

6. Шамсутдинов, М.Н. Пространственное строение тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe по данным двумерной 'Н-'Н NOESY ЯМР спектроскопии [Текст] / М.Н. Шамсутдинов, А.Р Юльметов, А В. Клочков, С. Бергер, А.В. Аганов, В В. Клочков // Ученые Записки Казанского Государственного Университета. - 2008. - т. 150, Серия Естественные науки, книга 1. с 76-86

7 Klochkov, VV Spatial structure of peptides determined by residual dipolar couplings analysis [Text] / V V. Klochkov, R F. Baikeev, V.D. Skirda, A.V. Klochkov, F.R Muhamadiev, I Baskyr, S. Berger // Magn. Resonance m Chemistry. - 2008 - v. 46 - accept for publication (MRC-08-0038 R2)

8. Клочков, А.В. Пространственное строение триглицина определенное анализом наблюдаемых констант диполь-дипольного взаимодействия [Текст] / А В. Клочков, Б.И. Хайрутдинов, М.С. Тагиров, ВВ. Клочков // Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений Труды VIl-ой Молодежной научной школы «Новые аспекты применения магнитного резонанаса». Изд-во Полиграф комплекс физического факультета - Казань, КГУ. - 2003. - с. 111-115

9. Клочков, В.В. ЯМР спектроскопия в исследованиях структуры органических и биоорганических соединений в лиотропных жидкокристаллических системах [Текст] / В.В. Клочков, Б И. Хайрутдинов, А.В. Клочков, Р А. Шайхутдинов, Е Тищенко, Р. Боеленс, Р. Каптейн // Труды Х-ой Всеросс. конференции "Структура и динамика молекулярных систем", И-Ола, Казань, Уфа, июль 2003 года. Изд-во: Издательско-полиграфический центр КГУ. - Казань, КГУ. - 2003 - ч 2. - с. 5-13

10. Хайрутдинов, Б.И. ЯМР спектроскопия в исследованиях структуры относительно малых органических соединений в лиотропных жидкокристаллических системах [Текст] /Б И. Хайрутдинов, А.В. Клочков, Р.А Шайхутдинов, В В. Клочков // Тезисы докладов II -ой международной конференции по новым технологиям и

приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды. - Ростов-на-Дону, 15-21 сентября 2003 г. - с. 47

11. Клочков, В В. ДЯМР и 2D NOESY ЯМР спектроскопия в исследованиях структуры органических соединений в растворах и лиотропных жидкокристаллических системах [Текст] /В В Клочков, Б.И.Хайрутдинов, Т.А.Гадиев, A.B.Клочков, Р.А.Шайхутдинов, А В.Аганов// Тезисы докладов XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Казань, 21-26 сентября 2003 г. - С. 406

12. Клочков, В В. Диаграммы ламеллярной жидкокристаллической фазы в системах на основе п-алкил-поли(этилен)гликолей (CeEj и С12Е5) и n-октанола [Текст] / В.В. Клочков, Б И Хайрутдинов, А В Клочков, Е. Тищенко, Р. Боеленс, Р. Каптейн // Новости ЯМР в письмах. Изд-во. Полиграфический комплекс физического факультета - Казань, КГУ -2004.-No 1-2 - с 1568-1577

13. Клочков, A.B. Константы остаточного диполь-дипольного взаимодействия в определении пространственного строения тиакаликс[4]аренов в растворах [Текст] / A.B. Клочков, Б.И. Хайрутдинов, М С Тагиров, И.С. Вершинина, И.И. Стойков, И.С. Антипин, В.В Клочков // XI Всеросс. Конф. "Структура и динамика молекулярных систем"' Сб. статей. - Казань. - 2004. - ч. 1. - с. 452-456

14. Клочков, В В Двумерная NOESY ЯМР спектроскопия и лиотропные жидкокристаллические среды в исследованиях структуры небольших органических соединений [Текст] /В.В. Клочков, ТА. Гадиев, М.Н. Шамсутдинов, A.B. Клочков, Б.И. Хайрутдинов// XII Всеросс. конф. "Структура и динамика молекулярных систем": Сб. статей - Й-Ола, Казань, Москва, 2005. - ч. 1. - с. 360-369

15. Клочков В В Жидкокристаллическая лиотропная среда на основе л-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5) и диметилсульфоксида ((CDj^SO) для частичного ориентирования органических молекул [Текст] / В.В. Клочков, А В. Клочков, K.M. Тейл, С Бергер // Новости ЯМР в письмах. Изд-во: Полиграфический комплекс физического факультета Казань, КГУ. - 2005 -N 1-4. С 1666-1676

16 Клочков, В.В. Двумерная NOESY спектроскопия и лиотропные жидкокристаллические среды в исследованиях структуры относительно небольших органических соединений [Текст] / В.В. Клочков, Б.И Хайрутдинов, A.B. Клочков, Т.А Гадиев // Тезисы докл. IV Всероссийской конференции "Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях". Изд-во. Полиграфический комплекс физического факультета. Казань, КГУ. - Апрель, 4-7. - 2005. - с. 17

17 Клочков, A.B. Пространственное строение некоторых трипептидов в лиотропных средах, растворах и твердой фазе по данным ЯМР спектроскопии [Текст] / А.В Клочков, М Н Шамсутдинов, Б.К. Валеев, А.Р. Юльметов, Ю.И Зявкина, В.Г. Штырлин, Ал.В. Клочков, В.Д. Скирда, В.В. Клочков // XIII Всеросс. Конф. "Структура и динамика молекулярных систем". Сб. статей. - Й-Ола, Казань, Уфа, Москва, РФ. - 2006. - ч. 1.-е. 406410

18. Клочков, А.В Константы остаточного диполь-дипольного взаимодействия в определении пространственного строения некоторых олигопептидов [Текст] / А В Клочков, В В. Клочков // Новости ЯМР в письмах. Изд-во: Полиграфический комплекс физического факультета - Казань, КГУ. - 2007. - № 1-4 - с 1892-1908

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского государственного университета Тираж 120 экз. Заказ 89/10

420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: 231-53-59, 292-65-60

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СТРУКТУРЫ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

1.1 Введение.

1.2 Физические основы ЯМР спектроскопии.

1.3 Принципы двумерной спектроскопии ЯМР.

1.4 Остаточное диполь-дипольное взаимодействие в определении пространственного строения органических соединений.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ЛИОТРОПНЫХ ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ СРЕД МЕТОДОМ ЯМР.

2.1 Введение.

2.1 Спектроскопии ЯМР ориентированных молекул как метод структурного анализа.

2.3 Типы жидкокристаллических сред, используемых в спектроскопии ЯМР для слабого ориентирования молекул.

2.4 Квадрупольное расщепление 2Н ЯМР сигнала дейтерированной воды (D20) как тест существования Lot -фазы.

2.5 Жидкокристаллические лиотропные системы на основе n-алкил-поли(этилен)гликолей (С8Е5 и С12Е5) и нормальных спиртов.

2.6 Жидкокристаллическая лиотропная система на основе n-алкилполи(этилен)гликоля (С12Е5) и диметилсульфоксида ((CD3)2SO).

2.7 жидкокристаллические лиотропные системы на основе хлорид (или бромид) цетилпиридиния и нормального спирта (гексанол).

ГЛАВА 3. ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ И ГЕОМЕТРИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ НЕКОТОРЫХ МОДЕЛЬНЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И ОЛИГОПЕПТИДОВ.

3.1 Введение.

3.2 Остаточное диполь-дипольное взаимодействие между ядрами 13С и'нв бензойной кислоте.

3.3 пространственное строение изомеров тиакаликс[4]арена.

3.4 Остаточное диполь-дипольное взаимодействие и пространственное строение олигопептидов.

3.4.1 Дипептид Glu-Trp.

3.4.2 Триглицин Gly-Gly-Gly.

3.4.3 Трипептид глицин-глицин-гистидин (Gly-Gly-His).

3.4.4 Трипептид глицин-глицин-тирозин (Gly-Gly-Tyr).

3.4.5 Трипептид Glu-Cys-Gly (глутатион).

3.4.6 Тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Актуальность темы исследования. Одной из важнейших задач химической и биологической физики является установление пространственного строения органических и биоорганических соединений. Хорошо известно, что биологическая активность протеинов связана с их пространственным строением. Изучение конформаций олигопептидов также важно, так как они являются структурными блоками полипептидов, и знание их пространственного строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей протеинов. Кроме того, многие из олигопептидов обладают фармакологическими свойствами, а некоторые короткие пептидные последовательности, синтезируемые клеткой, являются частью иммунной системы живого организма.

Традиционно исследования пространственного строения органических соединений в растворах основаны как на данных одномерной ЯМР спектроскопии, включая динамический ЯМР, так и на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера и обмена), которая позволяет определять расстояния между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А. К сожалению, применение двумерной NOESY ЯМР спектроскопии к исследованию низкомолекулярных органических соединений, подпадающих под условие быстрого движения (СО 0 * ^с « где тс - время корреляции молекулярного движения, СОо - угловая скорость прецессии магнитных ядер) не всегда эффективно. В этом случае наблюдаются слабые по интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение количественной информации о межпротонных расстояниях.

Среди направлений в приложениях ЯМР спектроскопии особое место занимает подход к определению конформаций молекул, растворенных в магнитно-ориентированных лиотропных жидкокристаллических системах [1]. В его основе лежит анализ остаточного диполь-дипольного взаимодействия (residual dipolar couplings, RDC) между магнитными ядрами. С недавних пор этот подход активно используется при исследованиях методом ЯМР биохимических объектов, таких как полипептиды и позволяет независимым образом определять структуру этих соединений в растворах. Актуальным является приложение этого подхода к определению конформаций молекул, подпадающих под условие быстрого движения, к которым относятся и олигопептиды.

Задача частичного ориентирования исследуемых органических молекул в магнитном поле требует поиска и подбора подходящих лиотропных жидкокристаллических сред, включающих ламеллярную (La) - фазу. В литературе есть описание некоторых лиотропных сред, однако в этих работах не приводятся фазовые диаграммы ламеллярного состояния для них, определенные методом ЯМР спектроскопии, что осложняет использование смесей при определении остаточного диполь-дипольного взаимодействия. Поскольку, большинство органических соединений растворимы лишь в органических растворителях, то выявление лиотропных смесей на их основе также являлось важной задачей.

Цель работы: определение пространственного строения олигопептидов, содержащих в цепи от двух до четырех аминокислотных остатков, с использованием подхода, основанного на анализе величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, проявляющегося при растворении пептидов в лиотропных жидкокристаллических средах. В качестве пар магнитных ядер выбраны ядра 13С и ]Н, разделенные одной химической связью, как единственно возможные при исследованиях олигопептидов с естественным содержанием изотопов.

Необходимость апробации подхода к определению конформаций олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения, определила дополнительную задачу: исследование стереоизомеров тиакаликс[4]арена, подпадающих под это условие при комнатной температуре и низкой концентрации их в растворе.

Физико-химические свойства исследованных соединений определили необходимость поиска лиотропных магнитно-ориентированных сред, обладающих ламеллярными свойствами в широком диапазоне температур и концентраций, включая среды на основе органических растворителей. Решение этой задачи и определение границ существования ламеллярной фазы для этих сред методом ЯМР спектроскопии являлось условием достижения выше обозначенной цели.

В качестве объектов исследования выбраны: дипептид Glu-Trp, являющийся основной составляющей лекарственных средств; трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr, Glu-Cys-Gly, которые используются в качестве лигандов в комплексах с Си (II) и применяются в качестве моделей активных центров ферментов; тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe - актуальная модель исследования межмолекулярных взаимодействий пептидов с растворителями.

Научная новизна работы определяется следующим:

Показана принципиальная возможность использования подхода, основанного на определении и анализе остаточных диполь-дипольных взаимодействий между магнитными ядрами 13С и *Н, разделенными одной химической связью ('Dch) для описания пространственного строения соединений, подпадающих под условие быстрого движения. С помощью этого подхода впервые удалось различить конформации конус и 1,3-альтернат для изомеров тетратиакаликс[4]арена. Результат подтвержден двумерными ЯМР NOESY ('Н-'Н) экспериментами, проведенными для этих соединений в изотропном растворителе CDC13.

На основании анализа величин 'Dqh впервые определено пространственное строение ряда олигопептидов, имеющих важное практическое приложение: дипептида Glu-Trp, трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu-Cys-Gly и тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe.

Впервые метод Н ЯМР предложен для определения границ существования магнитно-ориентированной ламеллярной La - фазы в координатах температура - концентрация мицеллообразующих соединений, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления ЯМР сигналов "Н дейтерированной воды.

Впервые: предложена и изучена лиотропная жидкокристаллическая система п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5, где Сп означает число атомов углерода в углеводородной цепи, а Ет число гликольных фрагментов), диметилсульфоксид и вода, которая может быть использована для частичного ориентирования нерастворимых (или плохо растворимых) в воде органических или биоорганических молекул; л методом Н ЯМР определены фазовые диаграммы ламеллярного состояния для предложенной системы. О

Методом Н ЯМР впервые определены границы ламеллярной Lx -фазы в координатах температура - концентрация п-алкил-поли(этилен)гликоля в воде для лиотропных жидкокристаллических систем на основе CnEm - октанол и вода. Показано, что предложенная нами система С12Е5 - октанол и вода проявляет искомые ламеллярные свойства в более широком диапазоне температур и концентраций, чем известная система С8Е5 - октанол и вода.

Научная и практическая ценность.

1. Координаты атомов (в pdb формате), входящих в состав изученных олигопептидов (дипептид Glu-Trp, трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu-Cys-Gly и тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe), определенные путем анализа экспериментальных значений 'Dch, могут быть использованы при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае фрагментов цепей полипептидов).

2. Предложенные лиотропные жидкокристаллические системы могут быть использованы для частичного ориентирования как воднорастворимых соединений [система п-алкил-поли(этилен)гликоль (С12Е5) - октанол - вода], так и соединений, растворимых лишь в органических растворителях [система диметилсульфоксид - п-алкил-поли(этилен)гликоль (Ci2E5) - вода].

3. Способ определения границ существования ламеллярной магнитно-ориентированной LK - фазы, основанный на рассмотрении квадрупольного расщепления ЯМР сигнала 2Н дейтерированной воды, может быть применен при исследованиях фазовых состояний различных лиотропных сред.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается: а) использованием подхода, основанного на анализе остаточного диполь-дипольного взаимодействия в исследованиях строения полипептидов и белков; б) согласием с аналогичными исследованиями, проводимыми с помощью других подходов в ЯМР спектроскопии (например, с данными двумерной ЯМР NOESY спектроскопии, в тех случаях, где это было возможно); в) использованием современного ЯМР оборудования и программного обеспечения.

Результаты исследований обсуждались в рамках научных конференций, а также в известных научных изданиях, где анализировались на предмет достоверности.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на VII - ой Молодежной научной школе «Новые аспекты применения магнитного резонанаса» (г. Казань, 2003); на XVII - м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Казань, 2003); на II - ой Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (г. Ростов-на-Дону, 2003); на IV - й Научной конференции Молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (г. Казань, 2004); на VII - м Международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология) (г. Ростов-на-Дону, 2004); на IV -м Всероссийском семинаре "Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях" (г. Казань, 2005); на X, XI, XII и XIII - й Всероссийских конференциях "Структура и динамика молекулярных систем" (г. Йошкар-Ола, 2003 - 2006) и на Итоговой конференции Казанского государственного университета (Казань, 2007).

Работа, на отдельных этапах, выполнялась в соответствии с Техническими заданиями Грантов РФФИ (03-03-33112а, 06-03-32101а), программы "Развитие научного потенциала Высшей школы" и гранта Казанского государственного университета (НИР КГУ № 1.3.03, ЕЗН -тема "СДМС").

По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах и 11 работ в сборниках статей и тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 60 рисунков и 14 таблиц. Список цитированной

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

На основании экспериментальных исследований свойств лиотропных жидкокристаллических сред и пространственного строения низкомолекулярных органических соединений методом ЯМР (^Н, ^С, 2н) спектроскопии, а также теоретического моделирования молекулярных структур с использованием программ МОРАС 7.0 (РМ 3), PALES и MODULE получены следующие основные результаты.

1. Показана возможность определения величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами 13С и *Н, для органических соединений, подпадающих под определение быстрого движения. С помощью анализа величин 'DCH удалось различить стереоизомеры конус и 1,3-алътернат для тиакаликс[4]арена в ориентирующей среде (поли-у-бензил-Е-глютамат в CDCI3). Полученный результат подтвержден двумерными ЯМР NOESY ('Н-'Н) экспериментами, проведенными для этих соединений в растворителе CDCI3.

2. Путем анализа остаточных диполь-дипольных взаимодействий

13 1 для всех пар ядер С и Н, определено пространственное строение ряда олигопептидов, таких как: дипептид Glu-Trp; трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu-Cys-Gly; тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe, растворенных в магнитно-ориентированных жидкокристаллических средах. Для всего ряда этих молекулярных систем приведены координаты атомов в общепринятом pdb формате.

13

3. На основании сравнения величин химических сдвигов С аСН или аСН2 углеродных атомов олигопептидов в растворе и порошке

1 Ч

CP/MAS ЯМР С спектроскопия) показана неизменность конформаций основных цепей трипептидов Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr; Glu

Cys-Gly и тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe при переходе от раствора к твердой фазе. Для дипептида Glu-Trp наблюдалось существенное изменение величин химических сдвигов, что не позволяет говорить об идентичности конформации его при изменении фазового состояния.

4. Предложена лиотропная жидкокристаллическая система на основе п-алкил-поли(этилен)гликоля (С12Е5), диметилсульфоксида (органический растворитель) и воды. Возможность использования предложенной среды для частичного ориентирования олигопептидов продемонстрирована на примере аминокислоты - метионин.

5. Впервые подход, основанный на наблюдении квадрупольного расщепления сигнала ЯМР Н дейтерированной воды, был использован для определения границ области существования магнитно-ориентированной ламеллярной Lx - фазы (фазовые диаграммы) в координатах температура - концентрация мицеллообразующих соединений в лиотропных жидкокристаллических системах: а) п-алкил-поли(этилен)гликоль С12Е5 - диметилсульфоксид и вода; б) хлорид (или бромид) цетилпиридиния, гексанол, вода и соответствующая соль NaCl (или NaBr); в) п-алкил-поли(этилен)гликоль (CgE5 или С12Е5) - октанол и вода. Показано, что для предложенной нами системы п-алкил-поли(этилен)гликоль (Ci2E5) - октанол и вода ламеллярная La -фаза существует в двое большем диапазоне температур и в полтора раза большем диапазоне концентраций, чем для известной системы п-алкил-поли(этилен)гликоль (С8Е5) - октанол.

1. Tjandra, N. Direct measurement of distances and angles in biomolecules by NMR in a dilute liquid crystalline medium Text. / N. Tjandra, A. Bax // Science. - 1997. - v. 278. - p. 1111-1114

2. Klochkov, V.V. Spatial structure of triglycine determined by the residual dipolar couplings analysis Text. / V.V. Klochkov, B.I. Khairutdinov, A.V. Klochkov, V.G. Shtyrlin, R.A. Shaykhutdinov // Applied Magnetic Resonance. 2003. - 25. - p. 113-119

3. Ионин, Б.И. ЯМР-спектроскопия в органической химии Текст. / Б.И. Ионин, Б.А. Ершов, А.И. Кольцов // Л.: Химия, Л/О. - 1983.-е. 269

4. Сергеев, Н.М. Спектроскопия ЯМР Текст. / Н.М. Сергеев // М.: Изд-во МГУ. - 1981.-е. 279

5. Эмсли, Дж. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения Текст. / Дж. Эмсли, Дж. Финей, А. Сатклиф // М.: Мир. - 1968. - т. 1. - с. 630

6. Гюнтер, X. Введение в курс спектроскопии ЯМР Текст. / X. Гюнтер // М.: Мир. - 1984. - с. 478

7. Самитов, Ю.Ю. Анализ спектров ЯМР пространственных изомеров. Текст. / Ю.Ю. Самитов // Казань. Изд-во КГУ. - 1978 (1983). - т. 1(2).

8. Sandstrom, J. Dynamic NMR spectroscopy Text. / J. Sandstrom // L.: Acad. Press. 1982. - p. 256

9. Friebolin, H. Basic one- and two dimensional NMR spectroscopy Text. / H. Friebolin // Weinheim; Basel; New York: Wiley-VCH. 1991. - p. 344

10. Breitmaier, E. 13c NMR spectroscopy. Methods and application in organic chemistry Text. / E. Breitmaier, W. Woelter // Weinheim, N.-Y.: Verlag Chemie. 1978.-p. 322

11. Каратаева, Ф.Х. Спектроскопия ЯМР и 13c в органической химии. Текст. / Ф.Х. Каратаева, В.В. Клочков // Казань: Издательство Казанского государственного университета. 2007. - с. 154

12. Ernst, R.R. Principles of nuclear magnetic resonance in one and two dimensions Text. / R.R. Ernst, B. Bodenhausen, A. Wokaun // Oxford: Oxford University Press. 1987. - p. 610

13. Van der Ven. Multidimensional NMR in liquids: basic principles and experimental methods Text. / Van der Ven, J.M. Frank // N-Y; Toronto: Wiley-VCH.- 1995.-p. 399

14. Aue, W.P. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance Text. / W.P. Aue, E. Barttoldi, R.R. Ernst // J. Chem. Phys. -1976. v. 64, No5 > - p. 2229 - 2246

15. Jeener, J. Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscopy Text. / J. Jeener, B.H. Meier, P. Bachman, R.R. Ernst // J. Chem. Phys. 1979. - v. 71, No 11. - p. 4546 - 4553

16. Hoffman, R.H. High resolution nuclear magnetic double and multiple resonance Text. / R.H. Hoffman, S. Forsen // In.: Progress in NMR spectroscopy. Eds. J.M Emsley, L.H. Sutcliff. - Oxford: Pergamon Press. -1966. -v.l.- p. 175 -205

17. Willem, R. 2D NMR applied to dynamic stereochemical problem Text. / R. Willem // Progress in NMR spectroscopy. 1988. - v. 20. - p. 1 - 94

18. Jackman, L.M. Dynamic nuclear magnetic resonance spectroscopy Text. / L.M. Jackman, F.A. Cotton // N.Y.; San Francisco. L.: Acad. Press. - 1975. -p. 660.

19. Oki, M. Application of dynamic NMR spectroscopy to organic chemistry Text. / M. Oki // N.Y.: VCH Publishers, Inc. 1985. - p. 423

20. Alba, E. NMR dipolar couplings for the structure determination of biopolymers in solution Text. / E. Alba, N. Tjandra // Progress in NMR Spectroscopy. 2002. - v. 40. - p. 175-197

21. Шахатуни, А.А. Определение трёхмерной структуры слабо ориентированных биомолекул методом спектроскопии ЯМР Текст. / А.А. Шахатуни, А.Г. Шахатуни // Успехи химии. 2002. - т. 71. - с 1132-1172

22. Saupe, A. High resolution NMR spectra of oriented molecules Text. / A. Saupe, G. Englert // Phys.Rev.Lett. 1963. - 11. - p. 462-464

23. Diehl, P. NMR Basic principles and progress Text. / P. Diehl, E. Fluck, R. Kosfeld, C.L. Khetrapal // Springer-Verlag. Berlin. - 1969. - v. 1. - p. 1-10

24. Emsley, J.W. NMR spectroscopy using liquid crystal solvents Text. / J.W. Emsley, J.C. Lindon // Pergamon Press. Oxford. - 1975. - p. 367

25. Emsley, J.W. Nuclear magnetic resonance of liquid crystals Text. / ed. J.W. Emsley // NATO Advanced Study Institute. ser. C. - v. 141. - Reidel

26. Publishing Company, Dordrecht, Holland. 1985

27. Burnel, E.E. NMR of ordered liquids Text. / E.E. Burnel, С.А. de Lange // Kluwer Academic Publishers: Norwell, MA. 2003

28. Шахатуни, А.А. Точность и однозначность структурных параметров молекул в спектроскопии ЯМР в ориентирующих средах Текст. / А.А. Шахатуни // Национальная Академия Наук Республики Армения, Институт Химической Физики, Ереван, диссертация. -2005. с. 7-15

29. Wuthrich, К. NMR of proteins and nucleic acids Text. / K. Wuthrich // NY: Wiley-VCH. 1986. - p. 1-292, 396

30. Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice Text. / J. Cavanagh, W.J. Fairbrother, A.G. Palmer, N.J. Skelton // Academic Press. -1996. -p. 1-587

31. Hus, J.C. Determination of protein backbone structure using only residual dipolar couplings Text. / J.C. Hus, D. Marion, M. Blackledge // J.Am.Chem.Soc. 2001. - 123, 7. - p. 1541-1542

32. Kung, Н.С. Magnetic alignment of duplex and quadruplex DNAs Text. / Н.С. Kung, K.Y. Wang, I. Goljer, P.H. Botton // J.Magn.Reson. 1995. -Ы09. - p. 323-325

33. Tolman, J.R. Nuclear magnetic dipole interactions in field-oriented proteins: Information for structure determination in solution Text. / J.R. Tolman, J.M. Flanagan, M.A. Kennedy, J.H. Prestegard // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1995.-92.-p. 9279-9283

34. Prestegard, J.H. New techniques in structural NMR anisotropic interactions Text. / J.H. Prestegard // Nature Struct.Biol., NMR Suppl. -1998.-p. 517-522

35. Bax, A. Dipolar couplings in macromolecular structure determination Text. / A. Bax, G. Kontaxis, N. Tjandra // Methods Enzymol. 2001. - 339. - p. 127-175

36. Prestegard, J.H. Partial alignment of biomolecules: an aid to NMRчcharacterization Text. / J.H. Prestegard, A.I. Kishore // Curr.Opin.Chem.Biol. 2001. - 5. - p. 584-590

37. Bax, A. Liquid crystalline samples: application to macromolecular structure determination Text. / A. Bax, J.J. Chou, B.E. Ramirez // Suppl. to encyclopedia of the NMR (eds. D.M.Grant and R.K.Harris). Wiley. - 2002. -p. 401-412

38. Prestegard, J.H. Risidual dipolar couplings in structure determination of biomolecules Text. / J.H. Prestegard, C.M. Bougault, A.I. Kishore // Chem.Rev. 2004. - 104. - p. 3519-3540

39. Barrientos, L.G. Characterization of surfactant liquid crystal phases suitable for molecular alignment and measurement of dipolar couplings Text. / L.G. Barrientos, C. Dolan, A.M. Gronenborn // J. Biomol. NMR. 2000. - v. 16. -p. 329-337

40. Prosser, R.S. Use of a novel aqueous liquid crystalline medium for high-resolution NMR of macromolecules in solution Text. / R.S. Prosser, J.A. Losonczi, I.V. Shiyanovskaya // J. Am. Chem. Soc. 1998. - v. 120. - p. 11010-11011

41. Ruckert, M. Alignment of biological macromolecules in novel nonionic liquid crystalline media for NMR experiments Text. / M. Ruckert, G. Otting // J. Am. Chem. Soc. 2000. - v. 122. - p. 7793-7797

42. Prestegard, J.H. NMR structures of biomolecules using field oriented media and residual dipolar couplings Text. / J.H. Prestegard, H.M. Al-Hashimi, J.R. Tolman // Q. Rev. Biophys. 2000. - v. 33. - p. 371-424

43. Klochkov, V.V. A novel liquid crystalline system for partial alignment of polar organic molecules Text. / V.V. Klochkov, A.V. Klochkov, C.M. Thiele, S. Berger // Journal of Magnetic Resonance. 2006. - v. 179, No 1. -p. 58-63

44. Klochkov, A.V. Determination of the spatial structure of glutathione by residual dipolar coupling analysis Text. / A.V. Klochkov, B.I. Khairutdinov, M.S. Tagirov, V.V. Klochkov // Magn. Reson. in Chemistry.- 2005. v. 43.-p. 948-951

45. Thiele, C.M. Probing the diastereotopicity of methylene protons in strychnine using residual dipolar couplings Text. / C.M. Thiele, S. Berger // Organic Letters. 2003. - v. 5. - p. 705-708

46. Ohnishi, S. Observation of residual dipolar couplings in short peptides Text. / S. Ohnishi, D. Shortle // Proteins. 2003. - v. 50. - p. 546-551

47. Bernado, P. Anisotropic small amplitude peptide plane dynamics in proteins from residual dipolar couplings Text. / P. Bernado, M. Blackledge // J. Am. Chem. Soc. 2004. - v. 126. - p. 4907-4920

48. Fyles, Т.М. Ion channel models Text. / T.M. Fyles, W.F. Van Straaten-Nijenhuis // Comprehensive Supramol. Chem. Oxford: Pergamon Press. -1996. - v. 10. - p. 53-77

49. Sugawara, M. Design and application of ion-channel sensors based on biological and artificial receptors Text. / M. Sugawara, A. Hirano, P. Buhlmann, Y. Umezawa // Bull. Chem. Soc. Jpn. 2002. - v. 75. - p. 187

50. Kumagai, H. Facile synthesis of /?-fer/-butylthiacalix4.arene [Text] / H.Kumagai, M. Hasegawa, S. Miyanari, Y. Sugawa, Y. Sato, T. Hori, S. Ueda, H. Kamiyama, S. Miyano // Tetrahedron Lett. 1997. - v. 38. p. 3971

51. Weber, D. Phosphorylation of p-tert-butylthiacalix4.arene: reaction with phosphorous triamides [Text] / D. Weber, M. Gruner, I.I. Stoikov, I.S. Antipin, W.D. Habicher. // J.Chem.Soc., Perkin Trans.2. 2000. - No 8. - p. 1741-1744

52. Krishna, N.R. Modem techniques in protein NMR Text. / N.R. Krishna, L.J. Berliner // Biological Magnetic Resonance. N. Y.: Kluwer. - 2002. - v. 16. - p. 540

53. Zweckstetter, M. Prediction of sterically induced alignment in a dilute liquid crystalline phase: aid to protein structure determination by NMR Text. / M. Zweckstetter, A. Bax // J. Am. Chem. Soc. 2000. - v. 122. - p. 3791-3792

54. Gutsche, C.D. Calixarenes 9 conformational isomers of the ethers and esters of calix4.arene [Text] / C.D. Gutsche, B. Dhawan, J.A. Levine, H.H. No, L.J. Bauer // Tetrahedron. 1983. - v. 39. - p. 406-426

55. Gutsche, C.D. Calixarenes Text. / C.D. Gutsche, J. F. Stoddart // Monographs in supramolecular chemistry; The Royal Society of Chemistry: Cambridge.-1989.-p. 225

56. Vicens, J. Calixarenes: a versatile class of macrocyclic compounds Text. / J. Vicens, V. Bomer // Kluwer Academic Publishers, Dorbrecht. 1990. - p. 261

57. Ottiger, М. Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra Text. / M. Ottiger, F. Delaglio, A. Bax // Journalof Magnetic Resonance. 1998. - v. 131. - p. 373-378

58. Krishna, N.R. Structure computation and dynamics in protein NMR / N.R. Krishna, L.J. Berliner Text. // Biological Magnetic Resonance. N. Y.: Kluwer. - 2003. - v. 17. - p. 590

59. Boman, H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity Text. / H.G. Boman // Annu. Rev. Immunol. 1995. - v. 13. - p. 61-92

60. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms Text. / M. Zasloff// Nature. 2002. - v. 415. - p. 389-395

61. Wang, Z. APD: the antimicrobial peptide database Text. / Z. Wang, G. Wang // Nucleic Acids Res. 2004. - v.32. - p. 590-592

62. Epand, R.M. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action Text. / R.M. Epand, H.J. Vogel // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -v. 1462.-p. 11-28

63. Boland, M.P. Membrane interactions of antimicrobial peptides from Australian tree frogs Text. / M.P. Boland, F. Separovic // Biochim. Biophys. Acta. 2006. - v. 1758. - p. 1178-1183

64. Wang, G. Structural biology of antimicrobial peptides by NMR spectroscopy Text. / G. Wang // Curr. Org. Chem. 2006. - v. 10. - p. 569581

65. Wang, G. The helix-hinge-helix structural motif in human apolipoprotein

66. A-I determined by NMR spectroscopy Text. / G. Wang, J.T. Sparrow, R.J. Cushley // Biochemistry. 1997. - v. 36. - p. 13657-13666

67. Wang, G. Tool developments for structure-function studies of host defense peptides Text. / G. Wang // Prot. Peptide Letters. 2007. - v. 14. - p. 57-69

68. Li, X. NMR studies of aurein 1.2 analogs Text. / X. Li, Y. Li, A. Peterkofsky, G. Wang // Biochim. Biophys. Acta. 2006. - v. 1758. - p. 1203-1214

69. Wang, G. Correlation of three-dimensional structures with the antibacterial activity of a group of peptides designed based on a nontoxic bacterial membrane anchor Text. / G. Wang, Y. Li, X. Li // J. Biol. Chem. 2005. -v. 280.-p. 5803-5811

70. Wang, G. Solution structure of the N-terminal amphitropic domain of Escherichia coli glucose-specific enzyme IIA in membrane-mimetic micelles Text. / G. Wang, P.A. Keifer, A. Peterkofsky // Protein Sci. -2003.-v. 12.-p. 1087-1096

71. Wang, G. Short-chain diacyl phosphatidylglycerols: which one to choose for the NMR structural determination of a membrane-associated peptide from Escherichia coli Text. / G. Wang, P.A. Keifer, A. Peterkofsky // Spectroscopy. 2004. - v. 18 - p. 257-264

72. Keifer, P.A. Effects of detergent alkyl chain length and chemical structure on the properties of a micelle-bound bacterial membrane targeting peptide Text. / P.A. Keifer, A. Peterkofsky, G. Wang // Anal. Biochem. 2004. - v. 331 - p. 33-39

73. Li, X. Solution structures of human LL-37 fragments and NMR-basedidentification of a minimal membrane-targeting antimicrobial and anticancer region Text. / X. Li, Y. Li, H. Han, D.W. Miller, G. Wang // J. Am. Chem. Soc. 2006. - v. 128 - p. 5776-5785

74. Delaglio, F. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes Text. / F. Delaglio, S. Grzesiek, G.W. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer, A. Bax // J. Biomol. 1995. - NMR 6. - p. 277-293

75. Schwieters, C.D. The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package Text. / C.D. Schwieters, J. Kuszewski, N. Tjandra, G.M. Clore // J. Magn. Reson. 2003. - v. 160. - p. 65-73

76. Cornilescu, G. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology Text. / G. Cornilescu, F. Delaglio, A. Bax // J. Biomol. 1999. - NMR 13. - p. 289-302

77. Laskowski, R.A. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR Text. / R.A. Laskowski, J.A. Rullmannn, M.W. MacArthur, R. Kaptein, J.M. Thornton // J. Biomol. -1996.-NMR 8.-p. 477-486

78. Bechinger, B. Structure and dynamics of the antibiotic peptide PGLa in membranes by solution and solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy Text. / B. Bechinger, M. Zasloff, S.J. Opella // Biophys. J. -1998.-v. 74.-p. 981-987

79. Dosset, P. A novel interactive tool for rigid-body modeling of multi-domain macromolecules using residual dipolar couplings Text. / P. Dosset, J.C. Hus, D. Marion, M. Blackledge // J. Biomol. 2001. - NMR 20. - p. 223-233

80. Kim, M.K. Proton nuclear magnetic resonance study of metal-glycine peptide complexes Text. / M.K. Kim, A.E. Martell // J. Am. Chem. Soc.1969. -v. 91. -p. 872

81. Diaz, M.D. Preferential solvation of a tetrapeptide by trifluorethanol as studied by intermolecular NOE Text. / M.D. Diaz, S. Berger // Magn. Reson. in Chemistry. 2001. - v. 39. - p. 369-373