Пространственное строение олигопептидов в растворе и в комплексе с моделью поверхности биологической мембраны по данным методов спектроскопии ЯМР тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

Федеральное государственное автономное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

на правах рукописи

Блохин Дмитрий Сергеевич

ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ ОЛИГОПЕПТИДОВ В РАСТВОРЕ И В КОМПЛЕКСЕ С МОДЕЛЬЮ ПОВЕРХНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ПО ДАННЫМ МЕТОДОВ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

01.04.07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

г I НОЯ 2014

Казань-2014

005556032

Работа выполнена на кафедре общей физики и в лаборатории ЯМР Института физики Казанского (Приволжского) Федерального Университета

Научный руководитель:

Клочков Владимир Васильевич

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Волков Виталий Иванович

доктор физико-математических наук, профессор, заведующий лаборатории ядерного магнитного резонанса Института проблем химической физики РАН

Зуев Юрий Федорович

кандидат физико-математических наук, доктор химических наук, заведующий лабораторией биофизической химии наносистем Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН

Московский Университет г. Москва.

имени

Государственный М.В. Ломоносова,

Защита состоится «25» декабря 2014 года в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 212.081.15 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте Казанского (Приволжского) федерального университета http://www.kpfu.ru

Автореферат разослан «¿Р» 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук, профессор

М.В. Еремин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Важнейшей задачей химической и биологической физики является установление пространственного строения органических и биоорганических соединений. Известно, что биологическая активность протеинов связана с их пространственным строением. При исследовании особенностей пространственной структуры и функций протеинов в ряде случаев оказывается полезным использовать их короткие фрагменты - олигопептиды (~ до 1,5 kDa). Изучение конформаций олигопептидов также важно, так как они являются структурными блоками полипептидов, и знание их строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей протеинов. Поскольку большая часть биохимических процессов протекает на поверхности мембраны клетки, то данные о пространственном строении комплекса олигопептид -поверхность мембраны, весьма важны для понимания механизмов этих процессов.

Традиционно, исследования пространственного строения биоорганических соединений в растворах основаны как на использовании данных одномерной ЯМР ('Н,13С) спектроскопии, включая анализ величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, так и на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная гомоядерная (COSY, TOCSY и др.) и гетероядерная корреляционная ('Н-13С HSQC, 'H-15N HSQC, 'Н-13С НМВС и др.) спектроскопия, позволяющие регистрировать ЯМР параметры. Двумерная ЯМР NOESY спектроскопия (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера), которая позволяет определять межпротонные расстояния между магнитными ядрами, отстоящими друг от друга на расстоянии до 5 А, ограниченно применима к молекулам, удовлетворяющим условию быстрого движения (coo"tc <<: 1 > где ^о - частота ларморовой прецессии, тс - время корреляции молекулярного движения) (например, олигопептиды) и удобна при изучении молекул и молекулярных образований, подпадающих под условие медленного движения (соо-тс >> 1)-

При связывании молекул малой молекулярной массы с мицеллами на основе поверхностно-активного вещества образуется комплекс, молекулярная масса которого значительно превосходит массу несвязанной молекулы и исследуемое низкомолекулярное соединение переходит из разряда малых молекул (условие быстрого движения) в разряд молекул, подпадающих под условие медленного движения.

Объекты исследования.

В качестве объектов исследования были выбраны олигопептиды: тетрапептид SFVG (содержит ароматическую, алифатические и полярные группы), декапептид VIKKSTALLG (относится к классу водорастворимых олигопептидов, обладающих фармакологическим действием), а также фрагменты ВИЧ усиливающего пептида РАР248-286: начальный фрагмент -PAP248-261(GIHKQKEKSRLQGG); два центральных участка - РАР266-

272(Е1ЬЫНМК) и РАР262-270(УЬУЫЕ1ЬЫН); концевой фрагмент - РАР274-284(АТ01Р8УККиМУ) (рисунок 1).

В работе были исследованы мицеллы на основе додецилсульфата натрия, которые использовались как модель заряженной поверхности биологической мембраны.

[-<- РАР248-286 ->~|

GIHK.QKEKSR.LQG О.У Ь V N Е I Ь N Н М К Я АТ Q I РБУККЫМУ'

-РАР248-261->4*РАР262-270«-| |-<РАР274-284>-|

ГРАР266-2721

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность пептида РАР248-286 и его фрагментов в общепринятых буквенных кодах, соответствующих номенклатуре ШРАСЯиВМВ (сверху). Структурная формула гептапептида РАР266-272

(ЕИЛНМК) (внизу).

О о

СН2(2) СН2(4) СН2(6) СН2(8) СН2(10) СНг(12)

СН3(1) СН2(3) СН2(5) СН2(7) СН2(9) СН2(11)

Рисунок 2. Структурная формула додецилсульфата натрия.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось установление пространственного строения олигопептидов в растворе и комплексе с моделью поверхности биологической мембраны. Для достижения этой цели было необходимо решение следующих задач:

- разработка подхода для мониторинга формирования мицеллярных систем на основе додецилсульфата натрия (ДСН) в растворе;

- повышение эффективности метода двумерной спектроскопии ЯМР NOESY к исследованию пространственного строения молекул, подпадающих под условие быстрого движения;

- определение геометрических параметров исследуемых олигопептидов (координат атомов) в растворе и в комплексе «пептид-модель поверхности мембраны»;

Методы исследования и использованная аппаратура.

При решении поставленных задач были использованы методы ЯМР спектроскопии высокого разрешения: одно- и двумерные гомо- и гетероядерные корреляционные ЯМР эксперименты (TOCSY, NOESY, HSQC и др.). Регистрацию 1М и 2М ('Н-'Н, 'Н-|3С) спектров ЯМР проводили на ЯМР спектрометре AVANCE II-500 (Bruker) (500 МГц ('H), 125,76 МГц (13С)) при температуре 293 К. Расчет пространственных молекулярных структур производился методом молекулярной динамики с помощью современных развивающихся программ DYNAMO [1] и XPLOR-NIH [2].

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах. Научная новизна:

1. Разработан подход для контроля состояния (мономерная или мицеллярная форма) поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия (ДСН) - в растворе с помощью двумерной 'Н-'Н NOESY ЯМР спектроскопии.

2. Предложен метод описания пространственной структуры олигопептидов на основе определения межъядерных расстояний (метод двумерной 'Н-'Н NOESY ЯМР спектроскопии) путем перевода исследуемого низкомолекулярного соединения из разряда малых молекул (условие быстрого движения) в разряд молекул, подпадающих под условие медленного движения за счёт образования комплекса олигопептидов с мицеллами поверхностно-активного вещества (ДСН).

3. Впервые определено пространственное строение тетрапептида SFVG (только в комплексе), декапептида VIKKSTALLG и фрагментов пептида РАР248-286 в растворе и в комплексе с моделью заряженной поверхности биологической мембраны: РАР248-261, РАР266-272,

РАР262-270 (только в комплексе), РАР274-284. Получены координаты атомов в формате рс!Ь файла.

4. Впервые установлено наличие вторичной структуры в олигопептидах РАР262-270 и РАР274-284 в комплексе с мицеллами ДСН.

5. На основании данных двумерной 'Н-'Н ИОЕБУ ЯМР спектроскопии предложены и описаны модели комплексов «исследуемые пептиды-поверхность биологической мембраны».

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается: отсутствием противоречий с результатами других исследований, проводимых в этом направлении с помощью других подходов в спектроскопии ЯМР (как пример, подход, основанный на использовании парамагнитных агентов в экспериментах ЯМР); использованием современного ЯМР оборудования, программного обеспечения и методик, адекватных задачам исследования.

Научная и практическая ценность:

1. Предложенный подход для контроля состояния (мономерная или мицеллярная форма) додецилсульфата натрия (ДСН) в растворе с помощью двумерной 'Н-'Н ЫОЕБУ ЯМР спектроскопии может быть использован при исследовании процессов мицеллообразования на основе подобных поверхностно-активных веществ.

2. Разработанный и экспериментально обоснованный подход к описанию пространственной структуры олигопептидов на основе определения межъядерных расстояний ('Н-'Н МЭЕЭУ ЯМР спектроскопия) путем перевода исследуемого низкомолекулярного соединения из разряда малых молекул (условие быстрого движения) в разряд молекул, подпадающих под условие медленного движения, может быть применен при исследовании подобных биоорганических соединений.

3. Установленные спектральные параметры ЯМР (!Н,13С) и измеренные межпротонные расстояния в изученных соединениях могут быть использованы в качестве справочного материала. Координаты атомов (в рс1Ь формате), входящих в состав изученных пептидов могут использоваться при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей (в частном случае фрагментов цепей полипептидов).

4. Предложены модели образования комплекса фрагментов пептида РАР248-286 - модель поверхности биологической мембраны. Данная информация крайне полезна в поиске лекарственных препаратов снижающих вероятность заражения ВИЧ, за счет препятствования комплексообразования вируса ВИЧ и пептида РАР248-286.

Личный вклад автора.

Участие в постановке целей и задач исследования. Проведение ЯМР экспериментов и написание статей по теме исследования. Автору принадлежат результаты интерпретации спектров ЯМР (информация о геометрии исследованных соединений) и результаты компьютерного моделирования молекулярных структур.

Апробация работы.

Основные результаты докладывались и обсуждались на следующих конференциях: III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА" (г. Москва, 2010); Магнитный резонанс в химической и биологической физике (г. Новосибирск, 2010); Итоговая конференция Казанского (Приволжского) Федерального Университета (г. Казань, 2010); V Всероссийская конференция "Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях" (г. Казань, 2011); Международная молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (г. Казань, 2012); II международный симпозиум КФУ - РИКЕН, посвященный междисциплинарным исследованиям (г. Казань, 2012); Международный симпозиум «Биохимия - основа наук о жизни» (г. Казань, 2013); конкурс на соискание именных стипендий мэра г. Казани (г. Казань, 2013); XX Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых ученых (г. Ижевск, 2014).

Диссертационная работа выполнена в лаборатории ЯМР Института физики Казанского (Приволжского) Федерального университета. Работа на отдельных этапах поддерживалась грантами РФФИ (09-03-00077а), Министерства образования и науки РТ (13-03-97041), гос.задания Министерства образования и науки РФ (К(П)ФУ, 2.2792.2011), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (02.740.11.0702).

Изученные в работе соединения синтезированы в лаборатории пептидного синтеза отделения химии поверхностных явлений технического университета Лулео под руководством доктора физико-математических наук Филиппова A.B. (Luleä University of Technology, Luleä, SE-91187, Sweden).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 9 статей в рецензируемых изданиях, 8 - тезисы докладов.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 149 (включая 2 страницы приложения) страницах машинописного текста и содержит 68 рисунков, 24 таблицы; включает введение, пять глав, основные результаты и выводы, публикации автора по теме диссертации, список литературы из 130 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы, сформулирована цель, описаны методы и объекты исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, представлены выносимые на защиту научные положения.

В первой главе даны физические основы ЯМР спектроскопии, представлены импульсные последовательности (HSQC, НМВС, TOCSY, NOESY), которые были использованы при выполнении работы.

В этой главе дан анализ зависимости интенсивностей кросс-пиков laß и диагональных пиков 1„„ от времени смешивания rOTopt (рисунок 3) в NOESY экспериментах. При оптимальном времени смешивания, когда амплитуда кросс-пиков наибольшая, отношение интенсивностей кросс-пиков к диагональным равно [3]

Igß (Г«¥)_+ RC Iaa(Jm°P') ~2Rl+Rc здесь Rc - константа скорости кросс-релаксации; Rl - константа скорости потери суммарной намагниченности.

Приводится теоретическое обоснование тому, что для малых молекул, подпадающих под условие быстрого движения (тс « Шо '), значения кросс-пиков в 2М NOESY спектрах отрицательны и имеют малую интенсивность; для молекул, подпадающих под условие медленного движения (тс » а>о~'), кросс-пики имеют положительный знак. Далее в работе этот факт будет использован для мониторинга образования мицелл и комплексов олигопептидов с мицеллами.

Описаны подходы для определения величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия и межъядерных расстояний на основе 2М ЯМР спектроскопии. Представлены основы метода молекулярной динамики при расчете пространственных структур молекул.

Вторая глава содержит описание исследуемых в работе объектов (олигопептиды: тетрапептид SFVG (nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe) и декапептид VIKKSTALLG (Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly); фрагменты пептида РАР248-286 (рисунок 1): РАР248-261 (GIHKQKEKSRLQGG), РАР266-272 (EILNHMK), РАР262-270 (VLVNEILNH), РАР274-284 (ATQIPSYKKLIMY); додецилсульфат натрия) и экспериментальных параметров проведенных ЯМР экспериментов.

Тетрапептид SFVG был выбран в качестве примера малых олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения (тс « Юо"1)- Ранее в работе [4] было определено пространственное строение этого тетрапептида в растворе.

Декапептид относится к классу водорастворимых олигопептидов, обладающих фармакологическим (противовоспалительным) действием.

Пептид РАР248-286, состоящий из 39 аминокислотных остатков (рисунок 1), продуцируется простатой и содержится в семенной жидкости. Показано, что этот пептид формирует амилоидо-подобные фибриллы, образующие волокна вблизи клеточной мембраны и играющие определенную роль в оплодотворении [5]. Но присутствие волокон PAP может многократно увеличить риск инфекций, в том числе и ВИЧ, способствуя прикреплению вируса к живой клетке. Предполагается, что эти амилоидные волокна, известные как SEVI (англ. semen-derived enhancer of viral infection, полученный из семенной жидкости, усиливающий вирусную инфекцию), служат поликатионными мостами, нейтрализующими отрицательный заряд отталкивания между капсидом вируса и мембраной клетки - цели [6].

Рисунок 3. Зависимости интенсивности диагональных и кросс-пиков от времени смешивания двухспиновой системы для трёх характерных времен корреляции: сооТс= 11,2 -длинное время корреляции; сооТс= 0,112 -короткое; ш0тс= 1,12 — критические значения времени корреляции (интенсивности кросс-пиков равны нулю при любых временах смешивания тт) [3].

Наличие этого белка резко увеличивает инфекционную активность ВИЧ. Точный механизм неизвестен, но полагают, что повышение адгезии вируса со специфическим рецептором связывания обуславливается сокращением электростатического отталкивания между мембранами вируса и клетки-мишени [6].

Для установления механизма усиления инфекционной активности ВИЧ с помощью белка РАР248-286 важно знать сайты-связывания белка с мембраной и установить активные центры белка. Понимание этого механизма поможет в решении задачи о снижении вероятности заражения ВИЧ-инфекцией.

В работе РАР248-286 был разделен на четыре отдельных олигопептида (РАР248-261, РАР266-272, РАР262-270, РАР274-284) для детального изучения каждого фрагмента.

Додецилсульфат натрия - это натриевая соль лаурилсульфокислоты, анионоактивное, амфифильное поверхностно-активное вещество. Структурная формула ДСН представлена на рисунке 2.

Мицеллы являются удобной моделью мембранной поверхности для структурных исследований методом ЯМР спектроскопии [7, 8] и могут быть использованы для моделирования поведения протеинов на биологических мембранах для небольших гидрофобных протеинов [9]. В работе они используются как модель заряженной поверхности биологической мембраны.

В третьей главе описывается исследование мицелл на основе додецилсульфата натрия: образование мицелл и контроль мицеллообразования с помощью 1М и 2М ЯМР спектроскопии. Также рассматривается возможность использования мицелл ДСН в качестве модели заряженной поверхности биологической мембраны.

Мониторинг мицеллообразования ДСН с помощью 1М ЯМР спектроскопии основан на изменении разности химических сдвигов протонов метиленовой группы СН2 (12) (рисунок 2) и метальной группы СН3 (1) в спектрах ЯМР 'Н от концентрации ДСН в водном растворе. Были проведены температурные эксперименты мицеллярного раствора додецилсульфата натрия (Т = 5-35°С). При изменении температуры различий в химических сдвигах ДСН не наблюдалось, что может говорить о том, что мицеллы достаточно устойчивые образования.

Для контроля мицеллообразования ДСН с помощью 2М ЯМР спектроскопии были использованы 2М 'Н-'Н МЭЕБУ ЯМР спектры. Как уже говорилось выше, интенсивности и знаки кросс-пиков в МЭЕБУ спектрах для больших и малых молекул различаются. Додецилсульфат натрия в мономерной форме относится к разряду малых молекул, подпадающих под условие быстрого движения, и кросс-пики в Ж)Е8У спектрах отрицательные (рисунок 4 а). Когда же ДСН образует мицеллы, то они подпадают под условие медленного движения и наблюдаются положительные кросс-пики в МОЕБУ спектре (рисунок 4 б). Используя этот эффект, можно в процессе проведения 'Н-'Н ЫОЕБУ экспериментов контролировать существование ДСН в мономерной или мицеллярной форме.

Четвертая глава посвящена определению пространственного строения тетрапептида SFVG в комплексе с мицеллами додецилсульфата натрия, пространственной структуры декапептида VIKKSTALLG в растворе на основе анализа величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия и в комплексе с мицеллами додецилсульфата натрия. Как пример, на рисунке 5 приведен соотнесенный 1М 'Н ЯМР спектр декапептида в водном растворе.

На примере тетрапептида показано, что при образовании комплекса с мицеллами додецилсульфата натрия значительно увеличивается информативность 2М NOESY ЯМР спектров (рисунок 6).

Расчеты пространственных структур тетрапептида и декапептида в комплексе с мицеллами ДСН (рисунок 7) проводились на основе подходов молекулярной динамики с использованием программ DYNAMO [1] и XPLOR-NIH [2]. Входными параметрами были межъядерные расстояния, определенные из анализа 2М NOESY спектров с различным временем смешивания. Работа по установлению образования комплекса декапептид-мицелла проводилась совместно с Ефимовым C.B. ([1-3] список публикаций автора), на защиту выносится структура данного олигопептида.

Рисунок 4. Проекции двумерных ЯМР ИОЕБУ спектров додецилсульфата натрия вдоль частоты, соответствующей 5 = 3,93 м.д. (химический сдвиг метиленовых протонов СН2 (12)) в водном растворе: а) концентрация ДСН в водном растворе равна 2,2 г/л; б) концентрация ДСН в водном растворе равна

7,5 г/л.

а СН о

см СН

1 Г

сн ; 1/1

1еи

сн\ \ 1 /Д И / СН

\ !г

СМ2 11»

уяГ

Р , ста сн3

А» ТЙГ

У2 гг

&2СИ3СН3 Сн31!е ->а| СНз

СНг

СН2 V и» СН

Щ I

I У»,

иу б СНз

Рисунок 5. 'Н ЯМР спектр (500 МГц) декапептидаУ1КК8ТА1ХО в водном растворе (Н20+020/ 90%+10%). Т 288 К.

Рисунок 6. Двумерные ЯМР МОЕБУ^Н 500 МГц) спектры тетрапептида пАс-Бег-РЬе-УаГИу-ОМе растворенного а) в воде и б) в смеси Н20+ Б20 с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии. Время смешивания тт= 0,25 с.

При расчете пространственного строения декапептида VIKKSTALLG в водном растворе (H20+D20 / 90%+10%) (рисунок 8) в программе DYNAMO входными данными были величины остаточного диполь-дипольного взаимодействия ('DCh)-

Рисунок 7. Пространственные структуры тетрапептида 8РУС (слева) и декапептида У1КК8ТАЬЬО (справа) в комплексе с мицеллами додецилсульфата натрия, рассчитанная в программе XPL0R.-N.1H с использованием экспериментально определенных межъядерных расстояний.

VIKKSTALLG

Рисунок 8. Конформация декапептида У1КК8ТАЬЬС в водном растворе (Н20+Б20 / 90%+10%).

Пятая глава посвящена изучению конформации фрагментов пептида РАР248-286. Глава состоит из четырех частей, в которых рассмотрено пространственное строение в растворе и комплексе «пептид-модель заряженной поверхности биологической мембраны» для каждого фрагмента (РАР248-261, РАР266-272, РАР262-270, РАР274-284).

В качестве примера, разберем процесс установления пространственного строения начального фрагмента РАР248-261 (СГНКдКЕКБЯЬдОО)

(рисунок 9) в водном растворе и в комплексе с моделью заряженной поверхности биологической мембраны.

На первом этапе были соотнесены сигналы ЯМР спектров с химической структурой молекулы. Отнесение 'Н сигналов РАР248-261 (рисунок 10) было сделано с учетом данных двумерных 'Н-'Н ТОСЗУ (рисунок 11) спектров, сведений из литературы о химических сдвигах протонов в аминокислотных фрагментах, а также интегральных интенсивностей сигналов в спектрах ЯМР. Соотнесение сигналов 13С с химической структурой пептида проводилось на основе анализа полученных химических сдвигов !Н и двумерном гетероядерном 'Н-13С НБС)С ЯМР эксперименте, спектр которого содержит сигналы, отвечающие за взаимодействие между ядрами водорода и углерода разделенными одной химической связью.

Пептид РАР248-261 является малой молекулой, и использование подхода, на основе ядерного эффекта Оверхаузера не эффективно для определения пространственной структуры. В связи с этим ограничением был использован подход, основанный на анализе величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия.

Рисунок 9. Структурная формула пептида РАР248-261.

Рисунок 10. 'Н ЯМР спектр (500 МГц) пептида РАР248-261 (СШКдКЕК8КЬСЮО) в водном растворе (Н20+В20/ 90%+10%). Т 288 К.

Я257НМе-НЬ1 ъ

К251,3,5НМ2-НЫ

|249НМ-НЕ> K251.3HN-JHb2.Hd £ Е254НМ-НЫ \ К251,ЗНЫ-НЫ

Е254НГ<-Нд 0252НЫ-Нд/Ш

£254НМ-НьХ

■ К251,ЗНЫ-Нд

6261НЫ-На С260НЫ-На

Н250НМ-НЫ Н250НЫ-НЬ2

и

К255НЫ-НЬ^257НЫ-Нд

0259Н1Ч-НМ/ / \ \Л Н257НМ НЙ!(.,„НЫ н„ 0252НМ-НЬ1 / \ \\ К255НМ.Нд

0259НМ-НЬ2 \ у255Н"'НЬ2'™

" 2 - Н (м.д 1

Рисунок 11. Часть двумерного 'Н-'НТОСБУ ЯМР спектра (500 МГц) пептида РАР248-261 (СННКдКЕКЗЯЬдСО) в водном растворе (Н2ОФ20/ 90%+10%).

Т 288 К.

Величины остаточного диполь-дипольного взаимодействия были получены из гетероядерных ЯМР спектров 'Н-13С ШдС-НЕСАОЕ. Определены прямые константы спин-спинового взаимодействия между ядрами 'Н и 13С (^сн) в воде (рисунок 12 а) и в жидкокристаллической лиотропной системе ('1сн + 'Осн) (рисунок 12 б).

Величины 'Бен были получены вычитанием величин констант спин-спинового взаимодействия (^сн) для водных растворов из значений величин спин-спинового взаимодействия, определенных в лиотропной жидкокристаллической среде ('1Сн + '0Сц).

Так же для расчетов были использованы вицинальные константы спин-спинового взаимодействия (3.1мн-на) между ядрами водорода N11 и На групп, которые зависят от торсионных углов основной цепи пептида [10].

Построение пространственной структуры пептида РАР248-261 осуществлялось в программе ХРЬОН-МН [2], использующей методы молекулярной динамики. Входными параметрами были величины остаточного диполь-дипольного взаимодействия 'БСн и вицинальные константы 31ын-на-

В результате было выбрано 10 структур с минимальной энергией (рисунок 13). Среднее квадратичное отклонение (СКО) основной цепи центрального участка (Н1з250 - 1^255) для выбранных 10 структур составило 1,37 ± 0,32 А. Большое значение СКО обусловлено небольшими размерами пептида, что приводит к высокой подвижности, и отсутствием жесткой вторичной структуры.

Из расчетов получаем, что пространственная структура пептида РАР248-261 в растворе реализуется в виде случайного клубка (рисунок 13). Поскольку внутримолекулярная подвижность отдельных фрагментов пептида высокая, то полученная структура в растворе, рассматривалась нами как оценочная.

1.0 0.9 0.8 0.7

8 а) !249Св 120.9Ги >| 8

10 10

4 5 о'2 %Н 12 12

? 1249Са 125.8 Гц > 1

14 14 14-

16 ■16 16-

0.9

0.8

\«2-1Н (м.д.)

1тт 13Г

б)

1240С¡1 136.2 Гц

'Ъг'Осн

|24<)Сё 129,1 Гц

№2-1Н (мл.)

Рисунок 12. Области 'Н-'С ШдС-НЕСЛОЕ ЯМР спектров пептида РАР248-261 в воде (а) и смеси С12Е5, гексанола и воды (б).

Рисунок 13. Пространственная структура пептида РАР248-261 в растворе (слева), справа - ансамбль из 10 структур (основная цепь без радикалов).

При изучении структуры РАР248-261 в комплексе «протеин-модель заряженной поверхности биологической мембраны» была использована методика, основанная на ядерном эффекте Оверхаузера (ЯЭО) (определение межъядерных расстояний). Как указывалось ранее, в качестве модели заряженной поверхности биологической мембраны были выбраны мицеллы на основе додецилсульфата натрия. ЯЭО стало возможно использовать за счет того, что при образовании комплекса пептида с мицеллой ДСН они переходят под условие медленного движения, и повышается информативность ЫОЕБУ спектров.

Пептид РАР248-261 был растворен в воде с мицеллами на основе додецилсульфата натрия. Отнесение 'Н ЯМР сигналов сделано, опираясь на данные исследования в растворе и двумерного эксперимента ЯМР 'Н-'Н ТОС8У.

Образование комплекса в данной системе подтверждается двумя фактами. Во-первых, изменением химических сдвигов олигопептида при смене среды, что свидетельствует об изменении химического окружения ядер исследуемой молекулы. Во-вторых, наблюдающиеся положительные кросс-пики в двумерном ЯМР 'Н-'Н NOESY спектре означают, что скорость движения молекулы уменьшилась.

Для определения межъядерных расстояний внутри молекулы пептида были проведены NOESY ЯМР эксперименты: записаны и проанализированы 'Н-'Н NOESY ЯМР спектры (как пример, рисунок 14). Было определено всего 93 межъядерных расстояния: из них 7 расстояний между ядрами водорода 'Н NH групп различных аминокислотных остатков, 12 - между водородами а-группы и NH, 23 - между различными аминокислотными остатками, 51 — внутри одного аминокислотного остатка. Значения этих расстояний использовались в качестве входных данных при расчете пространственной структуры РАР248-261 в миццелярном растворе в программе XPLOR-NIH [2].

Полученные 10 структур с минимальной энергией представлены на рисунке 15 слева, справа на рисунке представлена модель комплекса пептида с мицеллой ДСН. Среднее квадратичное отклонение (СКО) основной цепи участка Lys251 - Arg257 для выбранных 10 структур составило 0,61 ± 0,21 А. Пространственная структура РАР248-261 в комплексе, также как и в растворе, имеет вид «случайного клубка».

8.4

8.0

S256H62-HN

\ 5256: G248H3-HN \ г G261Ha-HN»^ ' \ /^

S256Hb1-HN

G248Ha-l24SHN

G260H3-HN V < .ifjh 1249H3-HN

' — K251 Ha-HM

/ x4f I ,^K253Ha-E254HN

l249Ha-H260HN ч^л l249Ha.G248HN>5^j/4j'5 K251 Ha-K255HN - —•»■ K255Ha-HNi K253Ha-Q252HN Q252Ha-HN Q259Ha-G260HN^"§|j L26SH3-R257HN

E254Ha-HN

S256Ha-R257HI

H250Ha-!249HN H250Ha-2H H250Ha-HN \ .

1И ч?

ч

H20-H2602H

L258Ha-HN

^ггана-нм

iHa-E254HN R257H3-HN ^ ' H250Ha-K251HN

_ ¿P ™

Ü H250Ha-K263H№

8.2

8.0

7.8

W2~1H (М.Д.)

le249

His250

,ys251

Рисунок 14. Слева: часть двумерного 'Н-'Н NOESY ЯМР спектра (500 МГц) пептида РАР248-261 (GIHKQKEKSRLQGG) в мицеллярном растворе на основе додецилсульфата натрия (50мМ). Время смешивания тт=350 мс. Т=288 К. Справа: участок основной цепи пептида РАР248-261 с межъядерными

расстояниями.

Рисунок 15. Пространственная структура пептида РАР248-261 в мицеллярном растворе на основе додецилсульфата натрия (50мМ), ансамбль из 10 структур -слева; модель комплекса пептида с мицеллой ДСН - справа.

Аналогичным образом были определены пространственные структуры всех исследуемых в работе фрагментов РАР248-286 в водном растворе (рисунок 16) и в комплексе с моделью заряженной поверхности биологической мембраны (рисунок 17). Пространственную структуру фрагмента РАР262-270 в водном растворе получить не удалось из-за плохой растворимости образца.

Рисунок 16. Пространственные структуры фрагментов РАР248-286 в водном растворе (H20+D20/90%+10%): РАР248-261, РАР266-272, PAP 274-284.

РЛР248-261

случайный клуоок

РАР266-272

I

' случайный клуоок

РАР262-270

'.-спираль

РА Р2 74-284

3]гспчраль

Рисунок 17. Пространственные структуры фрагментов пептида РАР248-286 в комплексе «пептид-модель поверхности биологической мембраны»: РАР248-261, РАР266-272, РАР262-270, РАР 274-284.

Из структурных исследований фрагментов пептида РАР248-286 в комплексе с моделью заряженной поверхности биологической мембраны было установлено, что на участках РАР265-268 и РАР281-283 имеется вторичная структура в виде а-спирали и Зю-спирали, соответственно (рисунок 18). Предполагается, что этими участками пептид связывается с поверхностью мембраны.

Ранее коллегами был исследован изотопно обогащенный пептид РАР248-286 в комплексе с мицеллами ДСН [3, 6]. В их работе эти центры так же отмечались, как центры комплексообразования. Наши данные для этих центров в отдельных фрагментах подтверждает их активность, так как она не пропадает даже при делении белка, сохраняется вторичная структура, участвующая в комплексообразовании «пептид — модель поверхности биологической мембраны».

-<- РАР248-286 -►

GiHKQKEKSRLQGGVLVNEIijNHMKR.ATQIPSYKK.LIMY

РАР265-268 РАР281-283

а-спираль Зц) спираль

Рисунок 18. Участки пептида РАР248-286, обладающие вторичной структурой в комплексе «пептид - модель заряженной поверхности биологической

мембраны».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

На основании данных одномерной ЯМР ('Н,13С) спектроскопии, включая анализ величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия, и на использовании современных подходов в ЯМР, таких как двумерная гомоядерная (COSY, TOCSY и др.), гетероядерная корреляционная ('Н-13С HSQC, H-'5N HSQC, 'Н-13С НМВС и др.) и двумерная ЯМР NOESY (!Н-'Н) спектроскопия и теоретического моделирования молекулярной структуры (с использованием программы XPLOR-NIH):

1. Разработан подход для контроля состояния (мономерная или мицеллярная форма) поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия (ДСН) - в растворе с помощью двумерной 'н-'н NOESY ЯМР спектроскопии.

2. Предложен метод описания пространственной структуры олигопептидов на основе определения межъядерных расстояний (метод двумерной 'Н-'Н NOESY ЯМР спектроскопии) путем перевода исследуемого низкомолекулярного соединения из разряда малых молекул (условие быстрого движения) в разряд молекул, подпадающих под условие медленного движения за счёт образования комплекса олигопептидов с мицеллами поверхностно-активного вещества (ДСН).

3. Впервые определено пространственное строение олигопептидов -тетрапептида SFVG (в комплексе), декапептида VIKKSTALLG и фрагментов пептида РАР248-286 (РАР248-261, РАР266-272, РАР262-270 (в комплексе), РАР274-284) в растворе (оценочный характер) и комплексе с моделью заряженной поверхности биологической мембраны. Получены координаты атомов, входящих в состав исследованных соединений в формате pdb файла.

4. Впервые установлено наличие вторичной структуры в олигопептидах РАР262-270 и РАР274-284 в виде a-спирали и 310-спирали, соответственно, в комплексе с мицеллами ДСН.

5. На основании данных двумерной 'Н-'Н NOESY ЯМР спектроскопии предложены и описаны модели комплексов «исследуемые пептиды-поверхность биологической мембраны».

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Delaglio F., Grzesiek S., Vuister G. W„ Zhu G„ Pfeifer J., Bax A. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes // J Biomol NMR. - 1995. - Т. 6, № 3. - С. 277-93.

2. Schwieters С. D., Kuszewski J. J., Tjandra N., Clore G. M. The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package H J Magn Reson. - 2003. - Т. 160, № 1. -C. 65-73.

3. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. / Ernst R. R., Bodenhausen В., Wokaun A. - Oxford: Oxford University Press, 1987.

4. Klochkov V. V., Baikeev R. F., Skirda V. D., Klochkov A. V., Muhamadiev F. R., Baskyr I., Berger S. Spatial structure of peptides determined by residual dipolar couplings analysis // Magnetic Resonance in Chemistry. - 2009. - T. 47, № 1. - C. 57-62.

5. Hassan M. I., Aijaz A., Ahmad F. Structural and functional analysis of human prostatic acid phosphatase // Expert Review of Anticancer Therapy. - 2010. - T. 10, № 7. - C. 1055-1068.

6. Roan N. R., Munch J., Arhel N., Mothes W., Neidleman J., Kobayashi A., Smith-McCune K., Kirchhoff F., Greene W. C. The Cationic Properties of SEVI Underlie Its Ability To Enhance Human Immunodeficiency Virus Infection // Journal of Virology. - 2009. - T. 83, № 1. - C. 73-80.

7. Braun W., Wider G., Lee К. H., Wuthrich K. Conformation of glucagon in a lipid-water interphase by 1H nuclear magnetic resonance // J Mol Biol. — 1983. - T. 169, № 4. - C. 921-48.

8. Motta A., Pastore A., Goud N. A., Morelli M. A. C. Solution Conformation of Sainton-Calcitonin in Sodium Dodecyl-Sulfate Micelles as Determined by 2-Dimensional Nmr and Distance Geometry Calculations // Biochemistry. - 1991. - T. 30, №43.-C. 10444-10450.

9. Wang G. S., Keifer P. A., Peterkofsky A. Solution structure of the N-terminal amphitropic domain of Escherichia coli glucose-specific enzyme IIA in membrane-mimetic micelles // Protein Science. - 2003. - T. 12, № 5. - C. 1087-1096.

10. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy. / Rule G.S. H. Т. K.: Springer, 2006.-531 c.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly, определенное анализом величин остаточного диполь дипольного взаимодействия. [Текст] / Д.С. Блохин, С.В. Ефимов, А.В. Клочков, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, В.В. Клочков // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. Науки. - 2010. - Т. 152, кн. 3 - С. 36-47.

2. Блохин Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в комплексе протеин - мицеллы додецилсульфата натрия [Текст]/ Д.С. Блохин, С.В. Ефимов, А.В. Клочков, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, В.В. Клочков, А.В. Аганов// Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. Науки. - 2011. - Т. 153, кн. 1 — С. 59-70.

3. Blokhin D.S. Spatial structure of the decapeptide Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly in water and in a complex with sodium dodecyl sulfate micelles [Text]/ D.S. Blokhin, S.V. Efimov, A.V. Klochkov, A.R. Yulmetov, A.V. Filippov, O.N.Antzutkin, A.V. Aganov, V.V. Klochkov // Applied Magnetic Resonance - 2011 - Vol. 41,1. 2, P. 267-282.

4. Blochin,D.S. Spatial structure of heptapeptide Gly-Ile-Leu-Asn-His-Met-Lys, a fragment of HIV enhancer prostatic acid phosphatase, in aqueous and in SDS

micelle solutions [text] /D.S. Blochin, O.V. Aganova, A.R. Yulmetov, A.V. Filippov, O.N. Antzutkin, B.I. Gizatullin, S. Afonin and V.V. Klochkov//J. Molecular Structure. 2013. V.1033.P.59-66.

5. Блохи», Д.С. Способы контроля образования мицеллярных систем на основе додецилсульфата натрия в растворе и пространственное строение тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в комплексе протеин - мицеллы по данным спектроскопии ЯМР [текст] / Д.С.Блохин, М.А.Кулькова, В.В.Клочков // Ученые Записки Казанского Университета. - 2012. - Т. 154, Серия Естественные науки, книга 4, с.80-91.

6. Рахматуллин, И.З. Пространственное строение усиливающего вич гептапептида Glu-Ile-Leu-Asn-His-Met-Lys в растворе и комплексе: гептапептид - модель биологической мембраны [текст] / И.З. Рахматуллин, Д.С. Блохин, О.В. Аганова, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, А.В. Аганов, В.В. Клочков // Ученые Записки Казанского Университета. - 2012. - Т. 154, Серия Физико-математические науки, книга 1. С. 63-73.

7. Blokhin, D.S. Spatial structure of tetrapeptide N-AC-Ser-Phe-Val-Gly-OMe in "protein-micelle of sodium dodecyl sulfate" complex and in solid state by NMR spectroscopy [Text] / D.S. Blokhin, S. Berger, V.V. Klochkov // Magnetic Resonance in Solids (Electronic Journal). - 2013. - Vol. 15, No.2. -13202 (7 pp).

8. Blokhin, D.S. Spatial structure of oligopeptide PAP(248-261), the N-terminal fragment of the HIV enhancer prostatic acid phosphatase peptide PAP(248-286), in aqueous and SDS micelle solutions [Text] / D.S. Blokhin, A.V. Filippov, O.N. Antzutkin, F.K. Karataeva, V.V. Klochkov // // J. Molecular Structure. 2014. V.1070. P.38-42.

9. Blokhin D.S. NOE effect of sodium dodecyl sulfate in monomelic and micellar systems by NMR spectroscopy [Text]/ D.S. Blokhin, E.A.Filippova, V.V. Klochkov // Applied Magnetic Resonance - 2014 - Vol. 45,1. 8, P. 715721.

10.Блохин, Д.С. Пространственная структура декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly, определенная анализом величин остаточного диполь дипольного взаимодействия. [Текст] / Д.С. Блохин//Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского Университета. Сборник тезисов - Казань, КФУ —2010 — С.40.

11.Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly, определенное анализом величин остаточного диполь дипольного взаимодействия. [Текст] / Д.С. Блохин, С.В. Ефимов, А.В. Клочков, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, В.В. Клочков //III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА ": Сборник материалов - Москва, МГУ -2010,- Т. 1 - С. 189-191.

12.Блохин, Д.С. Пространственная структура декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly, определенная анализом величин остаточного

22

диполь дипольного взаимодействия. [Текст] / Д.С. Блохин, C.B. Ефимов, A.B. Клочков, А.Р. Юльметов, A.B. Филиппов, A.B. Аганов, В.В. Клочков//Магнитиый резонанс в химической и биологической физике: Сборник тезисов - Новосибирск - 2010. - С. 76.

13.Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в водном растворе и в комплексе протеин -мицеллы додецилсульфата натрия [Текст] / Д.С. Блохин, C.B. Ефимов,

A.B. Клочков, А.Р. Юльметов, A.B. Филиппов, A.B. Аганов, В.В. Клочков//У Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» при участии зарубежных учёных с элементами школы для молодых исследователей: Сборник тезисов -Казань, КФУ - 2011. - С. 86-87.

14.Рахматуллин, И.З. Пространственное строение усиливающего ВИЧ гептапептида Glu-Ile-Leu-Asn-His-Met-Lys в растворе и комплексе: гептапептид-модель биологической мембраны [Текст] / И.З. Рахматуллин, Д.С. Блохин, А.Р. Юльметов, A.B. Филиппов, A.B. Аганов,

B.В. Клочков//У Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» при участии зарубежных учёных с элементами школы для молодых исследователей: Сборник тезисов -Казань, КФУ-2011.-С. 131-133.

15.Blokhin, D.S. Methods to control formation of micellar systems of sodium dodecyl sulfate in solution [text] / D.S. Blokhin, V.V. Klochkov // XV International Youth Scientific School. "Actual problems of magnetic resonance and its application": Program lecture notes proceedings - Kazan, Kazan University - 2012. - P. 52-55.

16.Блохин, Д.С. Структура начального фрагмента РАР248-261 ВИЧ-активного пептида РАР248-286 в растворе и в комплексе с модельными мембранами [текст] / Д.С. Блохин, A.B. Филиппов, О.Н. Анцуткин, В.В Клочков // Сборник трудов международного симпозиума «Биохимия -основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования кафедры биохимии Казанского университета - Казань, Казанский Федеральный Университет - 2013. — С.61-62.

17.Блохин, Д.С. Установление активных центров пептида РАР248-286, отвечающего за усиление инфекционной активности вируса ВИЧ методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения [текст] / Д.С.Блохин, А.В.Филиппов, В.В. Клочков // Материалы конференции «XX Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых ученых»- Ижевск, УдГУ - 2014. - С.368-369.

Подписано в печать 06.11.2014. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Тираж 100 экз. Заказ 22/11.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59,233-73-28