Полифункциональные биосовместимые материалы на основе магнетита и пектина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Захарова Наталья Григорьевна

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЬШ БИОСОВМЕСТИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ МАГНЕТИТА И ПЕКТИНА

Специальность 02.00.04 - Физическая химия (технические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

005557037

Нижний Новгород - 2014

005557037

Работа выполнена в Московском авиационном институте (национальном исследовательском университете) и Институте прикладной биохимии и машиностроения (ОАО «Биохиммаш»).

Научный руководитель: доктор химических наук

Кыдралиева Камиля Асылбековна

Официальные оппоненты: Курский Юрий Алексеевич

доктор химических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН, лаборатория физико-химических методов исследования, заведующий лабораторией

Гуткович Сергей Александрович

доктор технических наук

ЗАО «Биохимпласт», заместитель директора

по направлению поливинилхлорид

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего !

профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", Химический факультет

Защита диссертации состоится «05» декабря 2014 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 212.165.06 при Нижегородском государственном техническом университете им. P.E. Алексеева по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного технического университета им. P.E. Алексеева и на сайте http://www.nntu.ru/content/aspirantura-i-doktorantura/dissertacii.

Автореферат разослан «16» октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н. Соколова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Композиционные материалы на основе наночастиц оксидов железа, в частности магнетита представляют собой перспективное поколение материалов для авиакосмической отрасли, включающее применяемые в "стелс-технологиях" радиопоглощающие покрытия, терморегулирующие покрытия космических аппаратов, контрастирующие магнитные агенты для методов неразрушающего контроля, биомедицинские препараты для систем жизнеобеспечения людей, работающих в экстремальных и экологически неблагоприятных условиях, в том числе в условиях длительных космических полетов. В связи с этим актуальным является поиск новых и оптимизация существующих подходов для синтеза биосовместимых магнитных наноматериалов с заданными химическим и фазовым составом, определяющих морфологические, структурные, физические, физиологические и токсикологические особенности наноматериалов. Важным также является тип модификации поверхности наночастиц, определяющей возможность формирования дополнительной биосовместимой защитной оболочки с целевыми функциональными характеристиками.

Целью настоящей работы являлось выявление особенностей создания и структуры биосовместимых композиционных материалов на основе наночастиц магнетита и макромолекулы пектина и оценка их функциональных (сорбционных и противоопухолевых) свойств.

Использование в качестве полимерной стабилизирующей оболочки магнитных частиц макромолекул пектина, выделяемого из любого растительного сырья и сочетающего нетоксичность, водорастворимость с уникальным комплексом биологических свойств, приведет к созданию материалов полифункционального биомедицинского назначения, в том числе сорбентов для эфферентной терапии, иммуномодуляторов для лечения злокачественных опухолей, детоксикантов и др. Преимуществом синтезированных нанокомпозитов на основе магнетита и свекловичного пектина является синергизм свойств полимерной матрицы и наноразмерных частиц магнетита, с одной стороны, и высокая комплексообразующая способность низкометилированного свекловичного пектина, с другой.

3

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) оптимизация технологии экстракции-гидролиза и очистки пектина по показателям содержания уронидных компонентов (показателю чистоты пектина) и его физико-химическая характеристика;

2) установление условий синтеза и структуры пектиновых накономпозитов с магнетитом, включая инкапсулированные ионами Са2+, механизма их образования и стабилизации;

3) анализ сорбционных свойств по отношению к токсическим компонентам лимфы и ионам РЬ2+;

4) оценка противоопухолевых и хемисенсибилизирующих свойств пектиновых композитов на моделях перевиваемых опухолей Уокера \V256 и Плисса.

Механизм образования нанокомпозитов исследовался по влиянию ряда факторов (варьирование концентрации пектина и ионов кальция в реакционной среде) на средний размер наночастиц магнетита и характер распределения частиц по размерам, в конечном итоге определяющих структуру пектиновых нанокомпозитов с магнетитом и их функциональные свойства.

Научная новизна. При выполнении поставленных задач в работе впервые:

1. Оптимизирована технология и разработана аппаратурно-технологическая схема экстракции-гидролиза и очистки пектина из свекловичного жома с содержанием уронидных компонентов не менее 90 %.

2. Разработаны условия синтеза нанокомпозитов на основе Ре304 и пектина, взятого в качестве стабилизирующего агента, и ионов Са2+.

3. Показана эффективность сорбции токсикантов с использованием нанокомпозитов на основе магнетита и пектина.

4. Показано, что нанокомпозиты на основе магнетита и пектина проявляют терапевтическое (противоопухолевое и хемисенсибилизирующее) действие. .

Практическая значимость.

1. Оптимизированы технологические режимы и разработана на их основе

лабораторная аппаратурно-технологическая схема получения пектина высокой

чистоты, послужившая основой для составления «Исходных данных для разработки

малогабаритной опытно-промышленной линии по производству высококачественного

4

свекловичного пектина производительностью 1 т в год» и позволяющая получить препарат, содержащий не менее 90 % уронидных компонентов.

2. Разработаны условия синтеза нанокомпозитов на основе наночастиц магнетита и пектина с контролируемыми составом, размерами и свойствами дисперсной фазы.

3. Нанокомпозиты на основе наночастиц магнетита, фунционализированные пектином, предложены в качестве сорбентов для связывания ионов тяжелых металлов и токсических компонентов лимфы.

4. Нанокомпозиты на основе наночастиц магнетита и пектина проявляют выраженное терапевтическое (противоопухолевое и хемисенсибилизирующее) действие.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Технология экстракции-гидролиза и очистки пектина высокой чистоты, содержащего не менее 90 % уронидных компонентов.

2. Концентрационная зависимость изменения размеров наночастиц магнетита в среде пектинового полимера и характера распределения частиц по размерам.

3. Сорбционные свойства нанокомпозитов на основе магнетита и пектина.

Работа выполнялась в рамках проекта Международного научно-технического

центра KP-1880 "Создание композиционных материалов на основе пектиновых веществ для биомедицинских целей".

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных конференциях в виде докладов, в том числе «Электронные и оптические свойства наноразмерных материалов» (Испания, 2011), «Макромолекулярные металлокомплексы» (ММС-14, Финляндия, 2011), «Структурные аспекты биосовместимых ферроколлоидов: стабилизация, контроль свойств и применение» (Дубна, 2011), на 2-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), Международной конференции «Биополимеры и композиты» (Венгрия, 2012), «НаноБиоТех» (Швейцария, 2013). Материалы работы использованы при чтении курса

лекций «Нанотехнологии в биомедицине» для студентов 4 курса специализации «Инженерное дело в медико-биологической практике» МАИ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в т.ч. 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения и списка литературы из 213 наименований. Работа изложена на 178 страницах, содержит 70 рисунков и 32 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы исследования, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен аналитический обзор публикаций, посвященных физико-химическим и физиологическим свойствам пектина, методам получения и анализа магнитных наночастиц и композиционных наноматериалов на основе природных полимеров, в том числе пектина, для биомедицинских целей. Показано, что свойства наноматериалов находятся в зависимости от условий получения, что и определяет в дальнейшем химический состав частицы, фазовый состав, структуру и размер частиц и, в конечном итоге, свойства.

Рассмотрены перспективы применения композиционных наноматериалов на основе пектиновых веществ в качестве противоопухолевых препаратов. Библиометрический анализ периодической литературы по проблемам использования магнитных полимерных материалов в медицине показал неуклонный рост публикаций в этой области, что свидетельствует о значимости исследования выбранных объектов, однако нерешенными остаются проблемы прогнозируемости свойств синтезируемых материалов и поиск технологических способов получения пектина высокой чистоты для биомедицинских целей.

На основании проведенного анализа литературы по биомедицинскому

применению пектиновых нанокомпозитов сделан вывод о невозможности

систематизации данных в связи с использованием образцов пектина различного

6

генезиса, с различной степенью этерификации и чистотой препаратов, с одной стороны, и наночастиц магнетита с различной морфологией, с другой. В открытой литературе нет также данных по токсикологической оценке пектиновых композитов.

Вторая глава посвящена оптимизации технологии получения высокачественного пектина с низким содержанием балластных веществ из свекловичного жома, а также физико-химической характеристике очищенного пектина.

Для экстракции-гидролиза и очистки пектина использованы 2 схемы, включая классическую и многостадийный метод экстракции-гидролиза, заключающийся в периодическом способе экстракции и гидролиза сырья с целью освобождения от примесей и низкокачественного пектина; дополнительной промывке и концентрировании фракции гидролизата ультрафильтрацией и последующей трехстадийной очисткой полупродукта этанолом в различных средах соответственно (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристика образцов пектина, полученных различными методами

Показатель Классический Мн огостадийный

Выход, в % от исходного сырья 7±0,9 9±1,1

Балластные вещества, % 46±4,9 11±2,3

Содержание уронидных компонентов*, % н/о 87±1,4

""Показатель содержания П-галактуроновой кислоты в пектине, н/о - не определялось

С применением метода униформ-рототабельного планирования экспериментов определены оптимальные технологические режимы выделения пектина в периодическом процессе (Рис. 1): при температуре процесса от 55 до 70 °С, рН от 0,75 до 2,0 и продолжительности 1-2 часа. При этом, содержание пектина в готовом продукте не превышало 80 %, продукт представляет собой порошок кремового цвета и содержит примеси балластных веществ, поэтому показана целесообразность получения пектина в три основные стадии:

1. Промывка сырья при 30-35 °С, гидромодуль 1:10, рН 7, 15-20 мин;

2. Экстракция (трехкратная) при 60 °С, рН 3,5, гидромодуль - 1:20, 2 ч;

3. Гидролиз (трехкратный) при 65 °С, рН 1,5, гидромодуль - 1:20, 2 ч.

♦ 0.5 ч

рН

Рисунок 1. Зависимость содержания пектина в осадке этанолосаждаемых веществ

от рН и продолжительности процесса при 55 °С |

При исследовании многостадийного процесса экстракции-гидролиза показана ! целесообразность фракционирования гидролизата и использования на последующих | стадиях выделения пектина фракций 1-ого и 2-ого гидролизатов, содержащих | наиболее высокое содержание пектинсодержащих веществ. Применение ультрафильтрации (фильтрующий элемент "МППроге", порог отсечения - 10 кД)

;

позволило дополнительно очистить и сконцентрировать отобранные фракции ; гидролизата. Косвенным показателем удаления из гидролизата низкомолекулярных пигментов и солей являлись данные по снижению электропроводности конечного продукта - концентрата с 4,2 до 2,2 мСм и цветности.

Для очистки высушенного распылением коагулянта предложена его трехкратная промывка:

1. 65 % этанол + 5 об. % НС1, соотношение - 1:8, 10 мин (стадия набухания);

2. 65% этанол + 1% ЫаОН, соотношение 1:8, 10 минут (стадия деэтерификации);

3. 96 % этанол, соотношение —1:4, 10 мин (стадия обезвоживания).

Использованные схемы экстракции-гидролиза и очистки пектина позволили получить пектин с выходом в 3,8% (Таблица 2).

Показатель Значение

С,% 37,3

Н,% 5,2

Содержание уронидных компонентов, % 90,3±0,6

Содержание СООН, % 19,2±0,2

Содержание метоксильных групп, % 4,12±0,15

Средневесовая молекулярная масса, Д (метод гель-хроматографии, Т8К-Се1 Н\\^-55 Р) 23000

Степень этерификации, % 11,2±0,56

Содержание золы, % 1,3±0,02

Влажность, % 9,2±1,1

РН 2,8±0,4

Растворимость в Н20, % 93

а б

Рисунок 2. СЭМ микрофотографии образцов пектина, полученных (а) классическим и многостадийным (б) до и после очистки (в) способами (Cari Zeiss Microscope Evo-40 с энергодисперсионной приставкой Inca, Oxford)

ИК-спектры (Spectrum 2, Perkin Elmer) очищенного пектина показывают интенсивные полосы валентных колебаний гидроксилов пиранозного кольца в области 3400 см-1, в области 3590 - 3650 см"1 и 3450 - 3500 см" полосы поглощения первичных и вторичных гидроксильных групп соответственно. В области 1010-1100 см~' присутствует характерная для пектиновых веществ группа интенсивных полос, соответствующих скелетным колебаниям пиранозного цикла и гликозидных связей. Наблюдается также интенсивная полоса при 1740 см"1, соответствующая колебаниям С=0 связи в составе СООН группы, указывающая на комплексообразующие свойства. Очень слабая полоса поглощения при 1550 см"' указывает на низкое содержание метоксильиых групп, что согласуется со степенью этерификации пектина (~11 %).

На основе полученных данных разработана лабораторная аппаратурно-технологическая схема (к.т.н. Муратов B.C., ОАО "Биохиммаш"), послужившая основой для составления «Исходных данных для разработки малогабаритной опытно-промышленной линии по производству высококачественного свекловичного пектина производительностью 1 т в год» и позволяющая получить препарат пектина, содержащий не менее 90 % уронидных компонентов.

В третьей главе представлены методы синтеза композитов на основе наночастиц магнетита (Fe304) и пектина и пектинатов кальция, изучена их структура и обсуждаются механизмы образования и стабилизации магнитной нанофазы в объеме полимерной пектиновой матрицы.

Для получения гибридных композитов на основе соединений железа и пектиновых производных использован метод химического соосаждения магнитных частиц в среде стабилизирующего вещества - пектина (Рес). В качестве неорганических компонентов для получения магнетита Fe304 использовали свежеприготовленные соли железа (II, III) согласно реакции:

2FeCL + FeCl2 + 8NHfiH -> Fe304 i +8NH,Cl + AH20 Раствор из 7 г FeCl3-6H20 в 63 мл Ы20 смешивали с 2,1 г FeCl2-2H20 в 18 мл Н20 и при интенсивном перемешивании добавляли 65 мл 25%-ного раствора NH4OH при 40 °С. Реакция проводилась при соотношении растворов солей Fe3+/Fe2+ = 2:1 с тем, чтобы получить магнетит требуемого состава (31 % FeO - вюстита и 69 % y-Fe203-маггемита). Образующийся в ходе реакции NH4C1 удаляли многократной промывкой дистиллированной водой. Затем осадок наночастиц магнетита сушили в роторном испарителе при 60 °С.

Содержание пектина в составе композита изменялось в процессе синтеза и составляло 2,5; 5; 10; 20; 50; 80 масс. % соответственно, на что указывает индекс в формуле композита (Fe304-Pec2,5; Fe304-Pec5 и т.д.). Согласно рентгенофазовому анализу (ДРОН-1Ж-2, Си(Ка)) образцов нанокомпозитов основным компонентом синтезированных материалов является магнетит Fe304 (рис. 3). Уширение линий и малое количество интенсивных рефлексов на дифрактограммах образцов характерны для наноразмерных систем. Межплоскостные расстояния d и распределение

10

интенсивностей / дифракционных полос хорошо согласуются с дифракционной картиной магнетита, что свидетельствует о наличии в исследуемом соединении железа в виде магнетита. РФА анализ выделенных из раствора образцов нанокомпозита продемонстрировал отчетливые рефлексы в области 20=53,85-54°, что указывает на наличие кристаллических фаз в составе соединений (рис. 3).

40 50 60 70 80 90 100 110 120

20

Рисунок 3. Дифрактограммы пектиновых нанокомпозитов с Fe304

Узкие высокие дифракционные пики образцов наночастиц магнетита и композитов указывают на хорошо кристаллизованный и однородный по параметрам решетки материал. Средние размеры кристаллитов были оценены по ширине рефлексов на рентгенограммах согласно формуле Шеррера и составляли для системы с концентрацией пектина 2,5-И 0 масс. % от ~ 14 до ~ 8 нм соответственно. Размер частиц с увеличением концентрации пектина до 10 масс. % снижался за счет межмолекулярного взаимодействия и стерической стабилизации частиц на границе раздела фаз.

С увеличением концентрации пектина выше 10 масс. % наблюдается увеличение размера наночастиц Fe304, измеренного методом акустической спектрометрии (DT-1200, Dispersion Technology Inc, рис. 4), вследствие заметного увеличения вязкости раствора в результате набухания и желирования пектина до состояния ксерогелей, обусловленного как содержанием остаточных ОСН3-групп в структуре пектина, так и

11

сшиванием СООН- и ОН-групп пектина ионными формами железа (III), перешедших в раствор в щелочной среде. При этом, макромолекула пектина подвергается конформационным превращениям за счет внутри- и/или межмолекулярного комплексообразовании с Ре3+, что приводит к сжатию макромолекулярного клубка и увеличению вязкости. Последнее приводит также и к широкому распределению наночастиц по размерам (рис. 4), что объясняется, вероятно, стерическим фактором, т.е. различным характером доступа промежуточных высокоактивных продуктов рекомбинации ионов железа к активным центрам конденсации.

. 7.0 1

<1>

5 б,о -ш

а 5,0 -

а 4,о -

I 3'°"

| 2,0 -

£ 1,0 -

6 '

ё 0,0 4--,—-—,-, — ,-,-5=—,

Л 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

с1ср.цы

Рисунок 4. Гистограммы распределения частиц по размерам для композитов: 1) Ре304-Рес20, 2) Ре304-Рес50, 3) Ре304-Рес80 (врезка: изменение среднего размера частиц магнетита от концентрации пектина)

Согласно данным СЭМ (рис. 5) магнитная фаза композита существует в виде упорядоченных наноразмерных структур, организованных в пространстве в форме цепочек из более мелких частиц. Частицы имеют узкое унимодальное распределение по размерам от 50 до 20 нм. Расстояния между ближайшими частицами фазы магнетита в пределах цепочки меньше их диаметров, что указывает на эффективную стабилизацию наночастиц полимерной матрицей даже при небольшой величине адсорбционных слоев пектина.

Рисунок 5. СЭМ микрофотографии Fe304 и нанокомпозита Fe304-Pecl0

Мёссбауэровские спектры Fe304 и нанокомпозитов (рис. 6), измеренные при комнатной температуре (MS-1101-Е, Mostee, доцент МГУ Чистякова Н.И.) и обработанные путем комплексного использования двух методов обработки — 1) восстановления распределения сверхтонкого магнитного поля р(Н) в области : расположения ядра 57Fe и 2) модельной расшифровки, показали, что первый ; парциальный спектр представляет собой секстет с широкими асимметричными j линиями и соответствует атомам железа в крупных частицах магнитоупорядоченной фазы (МФ), второй - квадрупольный дублет, соответствующий атомам FeJr в тетраэдрическом окружении кислорода.

N, %

100

99

98 100

99 98

-10

-5 0 5 V, мм/с

10

N, %

100

99

98

97 100

99

98 97 96

г

\ А /U Л л. :

v tí V V 3

Л

\AJ\!\Í 4

у /у V v

W -

-10

-5 0 5 v, мм/с

10

Рисунок 6. Мессбауеровские спектры при Т=300 К для образцов (1) Fe304; (2) Fe304-Pec2,5; (3) Fe304-Pec5; (4) Fe304-Pec 10 13

Этот спектр соответствует атомам железа, находящимся в парамагнитном состоянии (ПФ). Его наличие обусловлено присутствием более мелких частиц МФ (суперпарамагнитных частиц), и, вероятно, находящихся на поверхности частиц атомов железа. Добавление пектина в низких концентрациях в раствор незначительно снижает размер частиц магнетита (Таблица 3).

Таблица 3. Интенсивность парциальных спектров нанокомпозитов

Pec, масс. % /пф, % /мф, % <Н>, кЭ

0 0,7±0,4 99,3±0,4 399±4

2,5 3,6±1,3 96,4±1,3 352±7

5 3,6±1,2 96,4±1,2 376±7

10 4,0±1,1 96,0±1,1 360±7

ИК-спектры композитов (рис. 7) показывают слабые полосы при ~ 1700 см'1, соответствующие СООН группам, для композитов выявляются различной интенсивности полосы характеристичных колебаний СОО" групп при 1640 (vac) и 1400 (vac) см"1, что указывает на образование связей в наноструктурах композитов.

Fe304-Pecl0

Fe3C)4-Pec5

Fe304-Рес2.5

Pec

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumber, 1/cm

Рисунок 7. ИК спектры исходного пектина и композитов Fe304-Pec

Синтез нанокомпозитов Ре304-Рес с добавлением ионов Са2+ проводился с целью дополнительного структурирования нанокомпозита за счет сшивания остаточных карбоксильных групп пектина, что в перспективе позволит получать целевые материалы с контролируемым, пролонгированным освобождением лекарственных препаратов. Для получения капсулированных нанокомпозитов, состоящих из ядра -наночастиц Ре304 и внешней пектиновой оболочки, связанной ионами Са2+, использовали следующую схему синтеза: 1) получение наночастиц Ре304 химическим синтезом по реакции Элмора в среде пектина (Ре304-РесЮ); 2) последующее добавление раствора СаСЬв образовавшуюся дисперсную систему. Содержание ионов Са2+ составляло 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15 масс.% соответственно, на что указывают индексы в формуле - Ре3О4-РесСа0,03 и т.д.

Увеличение содержания ионов Са2+ в растворе от 0,03 до 0,15 масс.% приводит к уменьшению гидродинамических размеров наночастиц Ре304-Рес (рис. 8) и дзета-потенциала (от -49 до -12 мВ) согласно данным акустической спектрометрии за счет увеличения степени сшивания и агрегации частиц, что способствует образованию более плотного геля.

г 4

- 3,5

- 3

- 1

- 0.5

- 0

1 о1

40

140

340

Т. "С

Рисунок 8. Распределение по размерам наночастиц: 1) Ре304-Рес и 2) Ре3О4-РесСа0,15 (врезка: СЭМ микрофотография Ре304-РесСа)

Рисунок 9. ДСК-ТГА анализ образцов 1) Ре304-Рес10 и 2) Ре3О4-РесСа0,15

Введение Са2+ в нанофазу Ре304-Рес приводит к поперечному сшиванию СООН-групп пектиновых молекул с образованием сферических наноструктур (рис. 8 врезка),

15

о чем свидетельствуют результаты ИК-спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и термогравиметрического анализа (ТГА) (NETZSCH STA 409 PC/PG, 5 °С/мин) образцов. Начало термической декомпозиции пектина в Fe3O4-PecCa0,15 (244 °С) происходит при повышенной температуре по сравнению с Fe304-Pecl0 (220 °С) (рис. 9).

Оценка острой токсичности препаратов в тестах на крысах Вистар (РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина) с дозами 2000, 6000, 12000, 24000 и 48000 мг/кг методом пробит-анализа установила, что для Рес и Fe304-Pecl0 LD]6 составляет 30500 и 18600 мг/кг, LDso - 53800 и 22400 мг/кг, LD84 - 77100 и 36200 мг/кг, LD100 - 88800 и 43000 мг/кг. Морфологические исследования органов не выявили грубых структурных изменений при применении Рес в дозе 24000 мг/кг. В исследованиях функциональных свойств препаратов их концентрации будут существенно ниже данных по острой токсичности.

Четвертая глава посвящена исследованию функциональных (сорбционных, противоопухолевых и хемисенсибилизирующих) свойств нанокомпозитов пектина. Адсорбцию ионов РЬ2+ в присутствии пектина и Fe304-Pecl0, Fe3O4-PecCa0,15 соответственно изучали при добавлении водного раствора Pb(N03)2 к сорбенту (5 г/л) в диапазоне концентраций соли 0,44-16,02 ммоль/л при рН6.

При взаимодействии всех исследованных препаратов с РЬ2+ наблюдалась зависимость сорбционной емкости от рН среды. Сорбционная активность Fe304-Pec достигала максимальных значений уже при рН 5,0 и составила 320 мг/г (рис. 10). Области наибольшей сорбционной активности препарата исходного пектина Рес (рН 7,5) и Fe304-PecCa (рН 7) были близки, величины максимальной сорбционной емкости составляют 193 и 200 мг/г соответственно. Значения IgK сорбции РЬ2+ для сорбентов Рес, Fe304-Pec и Fe304-PecCa, равные 4,2; 4,9 и 4,6 М"1 соответственно, указывают на увеличение сорбции РЬ2+ нанокомпозитами по сравнению с Рес.

2 1 1.8 -.u 1,6 "

e i,4 -

ti

-§0,8 -

% 0,6 -о,

' ' 0,4 -0,2 0

• • • • *

А А А ♦ ♦ *

Ж ♦

А ♦

0 0,5 1 1,5 2

[РЬ2+]рав„,ммоль/л

2.5

Рисунок 10. Изотермы сорбции ионов свинца пектиновыми препаратами: 1) Рес, 2) Fe304-Pec, 3) Fe304-PecCa

Исследование сорбции токсических ингредиентов лимфы больной проводилось в биохимической лаборатории госпиталя (3-ий Центральный военный клинический госпиталь им. A.A. Вишневского МО РФ, д.ф.-м.н. Данилин А.Н.). Процедура проведения очистки лимфы заключается в ее пропускании через содержащую сорбент колонку, после чего очищенная среда возвращается в организм. В качестве контролируемых критериев величины сорбционной ёмкости использовали биохимические показатели содержания в лимфе их основных постоянных ингредиентов, по уровню концентрации которых можно судить о состоянии I клеточного, органного и общего гомеостаза при различных заболеваниях.

Для исследования сорбции готовили суспензию адсорбента в физиологическом растворе с концентрацией 12,0±1,0 мг/мл, которую обрабатывали ультразвуком в течение 40 мин в УЗ-ванне (Elmasonic-S-100-H) на частоте 37 кГц для дезагрегации частиц и их равномерного распределения по объему, затем смешивали 0,5 мл каждой полученной суспензии с 3 мл плазмы лимфы. Полученную смесь выдерживали при постоянном встряхивании в течение 3-х мин и после этого отделяли частицы центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение 15 мин. Содержание контролируемых ингредиентов в лимфе до и после сорбции определяли на лабораторных биохимических анализаторах (Olympus, Германия, Advia 1200, США-Германия) и системе клинического капиллярного электрофореза (Paragon, США).

Результаты сорбции основных ингредиентов лимфы с использованием образца нанокомпозита Ре304-Рес10 показали (Таблица 4), что введение нанокомпозита приводит к сорбции практически всех компонентов лимфы, за исключением билирубина. Содержание компонентов лимфы снизилось на 50 % и более по сравнению с исходным образцом.

Таблица 4. Концентрации компонентов лимфы до и после обработки сорбентом

Компонента лимфы Наименование образца

Лимфаисх Лимфа/Ре304-Рес

аланинаминотрансфераза, и/л 16,0 10,0

аспартатаминотрансфераза, и/л 15,0 10,0

билирубин общий, цМ 2,8 2,8

общий холестерин, цМ 1,72 1,03

креатинин, цМ 57,5 34,0

глюкоза, дМ 34,89 21,95

общий белок, г/л 28,0 17,0

* Числовые показатели соответствуют средней концентрации компонентов лимфы относительно их содержания до обработки сорбентом.

Терапевтическое действие (противоопухолевые и сенсибилизирующие свойства) препаратов Pec, Fe304-Pecl0 и Fe3O4-PecCa0,15 по отношению к цитостатикам изучались на 250 крысах линии Вистар (Медицинская академия КР, д.м.н. Кудайбергенова И.О.). Перевиваемые клетки опухоли Уокера (карциносаркома W256) и Плисса соответственно трансплантировались под кожу бедра в объеме 0,2 мл и разведении 1:1 средой 199. Лечение начинали через 72 ч после перевивки. Препараты вводили зондом per os 1 раз в сутки в дозе 400 мг/кг в течение 10 дней. На 7 и 14 дни от начала лечения контролировались размеры опухоли и учитывалась продолжительность жизни (т) экспериментальных животных. Статистическая обработка результатов проведена непараметрическими методами (критерий Вилкоксона- Манна-Уитни).

Таблица 5. Параметры противоопухолевого действия препаратов

Образец Размер опухоли, см3 Ингибирование роста опухоли, % т, дни Дт, %

7-й день | 14-й день 7-й день | 14-й день

карциносаркома Уокера \V256

Контрольная группа 11,6 ± 4,1 31,0 ±2,8 - - 16,38± 1,38 -

Рес 1,3 ±4,1 20,7 ±8,8 88,2 32,7 25,5 ±6,3 54,3

Ре304/Рес 1,6 ±0,5 4,7 ±2,2 91,0 84,7 25,8 ± 6,25 57,5

Ре304/РесСа 2,4 ± 0,7 19,2 ±2,4 79,5 36,8 23,5 ± 6,3 43,5

лимфосаркома Плисса

Контрольная группа 2,11 ±0,51 23,37 ±2,38 17,0 ±0,58

Рес 0,63± 0,14 16,71 ±0,20 69,7 28,5 20,5 ± 0,92 20,6

Ре304/Рес 0,57± 0,21 13,18 ±2,53 72,0 43,6 20,3 ±0,76 19,59

Ре304/РесСа 0,36 ± 0,19 7,48 ± 0,17 82,9 67,9 22,5 ±1,26 32,4

Терапия пектиновыми препаратами перевиваемых опухолей стабильно вызывала ингибирование ее роста от 60 до 80 %, что в итоге проявилось в виде статистически достоверного (р<0,05) увеличения продолжительности жизни животных (Таблица 5). Высокие показатели терапии характерны для начального этапа эксперимента, затем по мере увеличения сроков эти показатели снижались. Следует отметить, что основная масса, получавших пектиновые препараты животных, погибла от прогрессирования заболевания, однако, у ~ 28 % опухоль регрессировала. Это отразилось и на средней продолжительности жизни.

При изучении влияния пектиновых препаратов на эффективность цитостатической химиотерапии в качестве критериев морфологической оценки терапевтических эффектов выбраны апоптоз опухолевых клеток и их лекарственный патоморфоз. Цитостатики вводили в режиме, вызывающем 30-60 % торможения роста первичной опухоли и метастазов. В качестве основного химиотерапевтического средства использовали однократное внутрибрюшинное введение циклофосфана (ЦФ) в дозе 25 мг/кг на 5 сутки после перевивки. Пектин вводился зондом через желудок на 2-ые по 13-ые сутки после трансплантации опухоли. Сочетанное применение Рес и ЦФ вызвало эффект усиления при дозе ЦФ меньше рекомендуемой терапевтической, в 4-5 раз (рис. 11). Появившаяся опухоль в группе «Рес+ЦФ» в итоге регрессировала и все животные были полностью излечены.

10 15 20 25 30

продолжительность наблюденггя, днтг

Рисунок 11. Кинетика роста опухоли \V256: 1) контроль (вода), 2) ЦФ, 3) Рес+ЦФ

б

Рисунок 12. Поля некроза и сохранившиеся опухолевые клетки при терапии ЦФ (а) и апоптоз опухолевых клеток в системе "Рес+ЦФ" (б) (объектив 10, окуляр 40)

Для системы "Рес+ЦФ" практически весь ядерный материал клеток, находящихся в состоянии. апоптоза, сильно фрагментирован (ядерная пыль), сохранен в пределах цитоплазмы без нарушения цитоплазматической мембраны. Сохранившимися

Морфологические исследования на 20-е сутки после перевивки показали, что при терапии ЦФ в обширных полях некротических масс обнаружены жизнеспособные опухолевые клетки, а сами поля окружены массой неповрежденных опухолевых клеток, у части из которых отмечены митозы (рис. 12а), сочетание Рес и ЦФ ведет к резко выраженному апоптозу опухолевых клеток без образования очагов ' массированного некроза (рис. 126).

остались единичные опухолевые клетки. Во всей массе просмотренного гистологического материала не удалось обнаружить ни одного митоза.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована технология получения пектина из свекловичного жома, заключающаяся в периодическом многостадийном способе промывки и экстракции-гидролиза сырья, включая ультрафильтрацию для очистки и концентрирования и трехстадийную очистку полупродукта (65 % этанол + 5 об.% HCl, 65 % этанол +1% NaOH, 96 % этанол). Выход пектина (от сырья) по новой технологии составляет ~4 % (по сравнению с 1,8 в традиционном способе), степень этерификации 11 %, содержание уронидных компонентов - не менее 90 %.

2. Методом химического соосаждения растворов хлоридов железа (II, III) в среде пектина получены наночастицы Fe304, состав и структура которых регулируется при изменении концентрации полимера. Содержание 10 масс. % пектина в составе композита снижает размер частиц с ~14 (для чистого Fe304) до ~8 нм, увеличение концентрации пектина с 20-80 масс.% приводит к увеличению размеров Fe304 до 100 нм за счет увеличения вязкости раствора пектина и медленной кинетики стабилизации роста наночастиц.

3. Синтезированы инкапсулированные ионами Са2+ структуры на основе Fe304 и пектина. Варьирование концентрации ионов Са2+ в системе позволяет регулировать структуру и размеры частиц. Введение ионов Са2+ приводит к снижению размеров наночастиц Fe304-PecCa по сравнению с образцами Fe304-Pec за счет дополнительного сшивания ионами Са2+ карбоксильных групп пектина.

4. В результате тестирования препаратов на крысах Вистар на острую токсичность установлены допустимые дозы до 24000 и 2000 мг/кг для Рес и Fe304-РесЮ соответственно при пероральном введении при цитостатической терапии.

5. Продемонстрировано увеличение сорбционной способности нанокомпозитов на основе Fe304 и пектина и пектината кальция по отношению к модельным токсикантам по сравнению с нативным пектином. Значения IgK сорбции РЬ2+ для сорбентов Рес, Fe304-Pecl0 и Fe3O4-PecCa0,15 составляли 4,2; 4,9 и 4,6 1/М соответственно.

6. Противоопухолевая активность композитов в тестах на модельных штаммах опухолей Уокера W256 и Плисса отличалась для разных препаратов и штаммов опухолей. Статистически достоверное торможение роста опухоли отмечено только для W256 на 7 сутки с начала лечения у крыс, получавших Pec, Fe304-Pecl0 и Fe304-РесСаО,15, на 88, 91 и 80 % соответственно; увеличение продолжительности жизни животных при этом возросло на 54, 58, 43%. Комбинированное применение циклофосфана и пектина показало 90 %-ное торможение роста опухоли Уокера в течение 7 суток после окончания лечения, увеличение продолжительности жизни животных на 50 %.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Захарова Н.Г., Юрйщева А.А., Джардималиева Г.И., Помогайло С.И., Горбунова Н.В., Голубева Н.Д., Помогайло А.Д., Кыдралиева К.А. Синтез и свойства магнитных наночастиц, стабилизированных в полимерных матрицах // Технологии живых систем. - 2012. - № 7. - С. 48-54.

2. Захарова Н.Г., Юрйщева А.А., Карандин В.И., Рожков А.Г., Кыдралиева К.А. Использование наносорбентов и методов фракционирования в системах жизнеобеспечения // Вестник МАИ. - 2013. - № 2. - С. 21-24.

3. Zakharova N., Kydralieva К., Khudaibergenova Е., Gorbunova N., Pomogailo S., Dzhardimalieva G.I., Pomogailo A., Jorobekova S. Synthesis and Characterization of Nanosized Pectin-Based Formulations // Macromolecular Symposia. - 2012. - V. 317-318.-P. 175-179.

4. Захарова Н.Г., Стрельцова A.H., Фетисов Г.П., Горбунова Н.В., Кыдралиева К.А. Получение наночастиц магнетита контролируемых размеров для биомедицинского применения // Технология металлов. - 2012. - № 7. - С. 40-42.

5. Алимжанов Н.Ю., Чакеев И.Ш., Лепшин Б.Н., Кудайбергенова И.О., Шаймурзаева Ю.А., Захарова Н.Г., Серикова Л.В., Прохоренков В.А. Терапия карциносаркомы Уокера пектином и циклофосфаном // Вестник Кыргызско-Российского Славянского Университета. — 2014. — Т. 14. - № 5. — С. 11-14.

Тезисы докладов:

Захарова Н.Г., Кыдралиева К.А. Характеристика железосодержащих нанокомпозитов пектина // XI Конференция студентов и аспирантов. Научно-образовательный Центр по физике и химии полимеров, Научно-образовательный Центр по нанотехнологиям МГУ. - М.: ИНЭОС РАН, 2011. - С. 11. Худайбергенова Э.М., Захарова Н.Г., Кыдралиева К.А., Горбунова Н.В., Худайбергенова Б.М., Жоробекова Ш.Ж. Макромолекулярные металлокомплесы на основе пектина: синтез и свойства // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Волгоград, 25-30 сентября 2011 г. Том 2. Химия и технология материалов, включая наноматериалы. - С. 680.

N.G. Zakharova, Е.М. Khudaibergenova, К.A. Kydralieva, Sh.J. Jorobekova, G.I. Dzhardimalieva, A.D. Pomogailo. Fabrication of coating iron oxides magnetic nanoparticles with pectins // Proceedings of Intern. Workshop "Structural aspects of biocompatible ferrocolloids: stabilization, properties control and application", Dubna, Russia, 19-20 August 2011. - P. 40.

Zakharova N.G., Khudaibergenova E.M., Kydralieva K.A., Jorobekova Sh.J. Formulation and characteristics of micro- and nanosized pectin-containing materials // In proc.: 2nd International School "Nano 2011. Nanomaterials and nanotechnologies in living systems", Moscow region, Russia, 19-24 Sept. - P. 210.

Muratov V.S., Gorbunova N.V., Zakharova N.G., Kydralieva K.A., Jorobekova Sh.J. Technology optimization for pectin isolation from the beet roots (Beta vulgaris) // In Proced. of the Int. Conference "Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine", St. Petersburg, 2011. - P. 121. Худайбергенова E.M., Захарова Н.Г., Горбунова H.B., Муратов B.C., Кыдралиева К.А., Жоробекова Ш.Ж. Перспективы получения и использования пектин-содержащих композиционных бионаноматериалов // Информационные и управленческие технологии в медицине и экологии: Сборник статей V Всероссийской научно-технической конференции. - Пенза: Приволжский дом знаний, 2011.-С. 129-133.

Dzhardimalieva G.I., Pomogailo A.D., Jorobekova S.J., Zakharova N.G., Kydralieva K.A. Fabrication of coating iron oxides magnetic nanoparticles with pectins //

u

Proceedings of PCAM Summer School 2011 "Electronic and Optical Properties o Nanoscale Materials", San Sebastian, Spain, 4-7 July 2011. - P. 54.

8. K. Kydralieva, E. Khudaibergenova, N. Zakharova, A. Yurishcheva, Sh. Jorobekova. Synthesis and characterization of magnetic polymer-conjugated nanocomposites as promising carriers // In: Proceedings of International Congress "Nanotechnology Biology and Medicine" (BioNanoMed2012), Krems, Austria. 01-02 March 2012. - P10.

9. Kydralieva KA, Koroleva RP, Usupbaeva CA, Zakharova NG, Jorobekova SJ Development of metal-containing nanoscale pectin-based materials for adjuvan chemotherapeutics // Proceedings of International Congress "Nanotechnology Biology and Medicine" (BioNanoMed2012), Krems, Austria. 01-02 March 2012. - PI.

10. Yurishcheva A.A., Zakharova N.G., Gorbunova N.V., Pomogailo S.I., Dzhardimaliev G.I., Pomogailo A.D., Kydralieva K.A., Jorobekova Sh.J. Usage of natura biocompatible intermediators for magnetic nanocomposites development // In Proceedings of 6th SETAC World Congress, 20-24 May 2012. - WE 239. - P.432.

11. Zakharova NG, Gorbunova NV, Kydralieva KA, Jorobekova SJ, Preparation an characterization of magnetite-loaded calcium pectate I I Proceedings of the Int Conf o bio-based polymers and composites. BiPoCo 2012, 27-31 May 2012. Siofok, Hungary -P. 45. ID: 486.

12. Kydralieva KA, Dzhardimalieva GI, Serikova L, Pomogailo AD, Zakharova i Jorobekova ShJ. Fabrication of Pectin-Based Composite Materials for Biomedic Application. Proceedings: European Conference on Miniaturisation for the Bioscience (NanoBioTech2013), 18-20 Nov 2013, Montreux, Switzerland. - P. 29-30.