Потенциометрия в исследовании антиоксидантной активности объектов растительного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Шарафутдинова Елена Николаевна

ПОТЕНЦИОМЕТРИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ ЛНТИОКСИДАНТНОЙ

АКТИВНОСТИ ОБЪЕКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой

степени кандидата химических наук

Екатеринбург - 2007

003068662

Работа выполнена на кафедре химии ГОУ ВПО «Уральский государственный экономический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, заслуженный

деятель науки РФ, член-корреспондент АИН РФ, профессор Брайнина Х.З.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Касаикина О. Т.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Тоболкина Н. В.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный

университет им. В.И. Ульянова-Ленина»

Защита состоится 23 апреля 2007 года в !500 часов на заседании диссертационного совета Д 212.285.09 при Урапьском государственном техническом университете - УПИ (г. Екатеринбург, ул. Мира, 19, аудитория 1_).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УГТУ-УПИ.

Отзывы на автореферат просьба присылать по адресу:

620002, Екатеринбург, К-2, ул. Мира, 19, ГОУ ВПО «УГТУ-УПИ».

Ученому секретарю совета университета.

Автореферат разослан 16 марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Васин Б.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Загрязнение окружающей среды приводит к возрастанию риска развития окислительного стресса у людей. Окислительный стресс вызывается накоплением в организме человека свободных радикалов (CP), что сопровождается усугублением заболеваний сердечно-сосудистой, нервной систем, легких, глаз, крови и ускоряет старение организма. Вещества, способные снижать концентрацию или подавлять продуцирование свободных радикалов в организме, и защищать макромолекулы живой клетки, получили название антиоксидантов (АО). Источником антиоксидантов являются пищевые продукты или специально созданные вещества. Для организации целенаправленной диеты, которая привела бы к общему улучшению состояния здоровья населения, необходимо развитие простых и дешевых методов анализа упомянутых выше продуктов.

Группа веществ, предотвращающая образование сильных окислителей in vivo, довольно разнообразна. Сюда входят SH-содержащая аминокислота цистеин, пептиды и белки (глютатион, альбумин), токоферолы, каротиноиды, убихинон, флавоноиды и другие полифенольные соединения, мочевая кислота, аскорбиновая кислота. Однако исследование композиции веществ требует применения тех или иных процедур разделения, которые могут быть проведены только в условиях хорошо оснащенной исследовательской лаборатории. Кроме того, информации о составе антиоксидантов, как правило, недостаточно, чтобы судить об антиоксидантной активности в целом, так как в этом случае не учитываются процессы совместного действия антиоксидантов и влияние матрицы исследуемого объекта.

Оценить общую антиоксидантную активность (АОА) объектов можно с помощью интегральных методов. В основе таких методов, как правило, лежат реакции взаимодействия с долгоживущими свободными радикалами, которые служат моделью свободных радикалов, образующихся в живой клетке. Однако, следует отметить, что действие долго- и короткоживущих радикалов in vivo может оказаться совершенно разным. Обеспечивая получение информации об АОА того или иного образца, упомянутые методы имеют ряд особенностей, которые ограничивают возможности их широкого применения. А именно, анализ проходит в несколько стадий и занимает довольно продолжительное время, аналитический сигнал необходимо регистрировать с помощью дорогостоящего спектрофотометрического или флюорометрического оборудования, а также требуется использование дорогостоящих реактивов.

Взаимодействие антиоксидантов со CP и активными кислородными соединениями (О2", НО', Н2О2, 0\ и др.) в водных средах сопровождается передачей электрона и, следовательно, имеет электрохимическую природу. В связи с этим представляется целесообразным изучать взаимодействие активных кислородных соединений и АО с применением электрохимических методов. Электрохимические методы характеризуются высокой чувствительностью, быстротой процедуры анализа, относительно невысокой стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит, и анализа в целом. В этой ситуации наиболее доступным источником информации может

служить измерение электрохимических параметров системы реагент/антиоксидант, например, окислительно-восстановительного потенциала.

Целю работы являлись исследование взаимодействия медиаторной системы с АО и разработка нового нотенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантной активности чистых химических веществ и оценки антиоксидантных свойств объектов со сложной матрицей: продуктов питания, БАД и экстрактов лекарственных растений. Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

обосновать применение нового потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантной активности различных объектов: чистых химических веществ, продуктов питания и экстрактов лекарственных растений;

- сформулировать критерии выбора и подобрать медиаторную систему для потенциометрического определения антиоксидантной активности;

- исследовать реакции взаимодействия антиоксидантов с медиаторной системой;

исследовать антиоксидантиую активность индивидуальных веществ полифенольной природы (природных и синтетических) методом потенциометрии;

провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантных свойств различных объектов, полученных разными методами;

- исследовать антиоксидантиую активность объектов со сложной переменной матрицей: свежеприготовленных соков, соков и нектаров промышленного производства, алкогольсодержащих напитков, чая, овощей, ягод, некоторых фруктов, препаратов лекарственных растений;

определить основные метрологические характеристики потенциометрического метода с применением медиаторной системы для измерения антиоксидантной активности некоторых продуктов питания. Научная новизна. Предложен новый потенциомегрический метод исследования антиоксидантной активности. Дано термодинамическое обоснование выбора медиаторной системы для данного метода. Предложенным потенциометрическим методом изучена стехиометрия реакции некоторых полифенольных антиоксидантов растительного происхождения, аскорбиновой кислоты, ряда синтетических антиоксидантов с выбранной медиаторной системой гексацианоферрат (11/111) калия. Показано, что стехиометрические коэффициенты взаимодействия полифенольных антиоксидантов с К3[Ре(С]Ч)6] соответствуют количеству ОН-групп при бензольном кольце, флавоновом ядре или ненасыщенном гетероцикле (аскорбиновая кислота). На примере производных пирогаллола, пирокатехина и гидрохинона показано, что антиоксидантная активность этих соединений возрастает при введении в структуру молекулы карбонильной группы в соседнем с бензольным кольцом положении, а также при введение оксимной и тиосульфонатной групп. Снижение АОА наблюдается, когда метильная группа находится в соседнем положении с карбонильной и оксимной группами, а также когда один или два морфолинометильных остатка находятся в соседнем положении с бензольным

кольцом. Можно полагать, что подобные явления окажутся достаточно общими.

Показана высокая степень корреляции результатов определения антиоксидантной активности и противорадикалыгой активности методами потенциометрии, фотохемилюминесценции, фотоколоримстрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления в липосомах, а также антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений в вине. Коэффициенты корреляции составляют 80 - 90%. Практическая значимость. Разработан способ интегральной оценки антиоксидантной активности ряда природных объектов со сложной матрицей с использованием метода потенциометрии.

Предложена экспрессная и простая в исполнении методика определения АОА чистых химических веществ, оценки АОА продуктов питания и лекарственных препаратов растительного происхождения. Установлены пределы определения АОА в водном растворе и мицеллярном растворе а-токоферол/вода.

Определена АОА ряда продуктов питания. Установлены количественные метрологические характеристики измерения АОА продуктов питания. Обсуждается возможность использования этого параметра как одного из показателей качества продуктов питания. На защиту выносятся:

1. Обоснование применения нового потенциометрического метода исследования АОА веществ с использованием медиаторной системы.

2. Результаты исследования взаимодействия природных и синтетических АО с медиаторной системой Кз|Те(СМ)6]/ К4[Те(С1<[)б].

3. Результаты корреляционных исследований антиоксидантных свойств предложенным методом и методами фотохемилюминесценции, фотоколориметрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липосом, а также корреляции АОА и общего содержания фенолов в вине.

4. Результаты исследования АОА объектов со сложной переменной матрицей: продуктов питания растительного происхождения, препаратов лекарственного сырья.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2004» (г. Уфа, 2004); на научно-практическом семинаре «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения», Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН (г. Москва, 2004); на Всероссийской научно-технической конференции-выставке

«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (г. Москва, 2004); на II Международной конференции «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья» (г. Москва, 2004); на Всероссийской

научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (г. Екатеринбург, 2005); на 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (г. Пущино, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 статьи, 11 тезисов докладов.

Разработанные методики внедрены в текущий учебный процесс и используются в НИРС. По результатам НИРС опубликованы 3 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах, содержит 21 таблицу, 34 рисунка и библиографию из 110 наименований. Работа состоит из введения, литературного обзора, четырех глав экспериментальной части, в которых описана постановка задачи, аппаратура, объекты, техника экспериментов и изложены результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.

В литературном обзоре (глава 1) описаны общие механизмы формирования пула свободных радикалов в организме человека и их элиминации. Рассмотрено значение отдельных ветвей антиоксидантной защиты и методы их исследования. Описаны методы исследования общей антиоксидантной активности объектов и проанализированы их слабые стороны и достоинства.

Во второй главе изложены данные об объектах исследования, используемой аппаратуре и методах, описаны условия экспериментов.

Главы 3, 4 и 5 посвящены представлению и обсуждению полученных результатов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Потенциометрические измерения проводили с помощью вольтметров В7-34А (г. Минск, Беларусь), Щ-300 (Россия), иономера-вольтметра Denver-250 («Denver Instrument Company», США) на фоне 0,015 М K-Na фосфатного буфера рН=7,4 с рабочим платиновым электродом («Phoenix», США) и насыщенным хлорсеребряиым (г. Гомель, Беларусь) в качестве электрода сравнения. Для вольтамперометрических измерений использовали анализатор «ИВА-5» (НПВП «ИВА», г. Екатеринбург, Россия). Измерения проводили на фоне 0,1 М раствора NaCl, скорость развертки - 0,2 В/с. Рабочий электрод -дисковый платиновый («Metrohm», Швейцария), вспомогательный электрод -стеклоуглеродный, электрод сравнения - насыщенным хлорсеребряный. Для оптических измерений использовали фотометры КФК-3 и БХЛ-02 (Россия). Исследование АОА методом хемилюминесценции проводили на установке, разработанной в ИБХФ РАН (г. Москва). В работе использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а. и производства Aldrich, Merck, Sigma и Reanal.

Объекты исследования. Аскорбиновая кислота и полифенольные соединения (пирокатехин, флороглюцин, кофейная кислота, кверцетин, рутин,

(+)катехин, а-токоферол); синтетические производных пирогаллола, пирокатехина и гидрохинона (предоставлены кафедрой органической химии УГТУ-УПИ, г. Екатеринбург). Объекты природного происхождения со сложной матрицей переменного состава: экстракты и бальзамы из лекарственных растений, свежеприготовленные соки овощей, фруктов и ягод, соки и нектары промышленного производства, спиртосодержащие напитки;

свежеприготовленные экстракты лекарственного сырья. Драже и таблетированные формы витаминов и Б АД (в виде 1% растворов в этаноле). Продукты, экстракты лекарственных трав, витамины и БАД приобретали в розничной сети.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Реакции между активными кислородными соединениями и антиоксидантами включают передачу электронов. Последнее делает весьма перспективным применение электрохимических методов для получения информации о протекании этих реакций. Среди электрохимических методов, очевидно, следует искать метод, который обеспечивает получение адекватной информации о концентрации участвующих в реакции компонентов. Перспективными в этом отношении являются методы циклической вольтамперометрии (ЦВА) и потенциометрии.

Циклическая вольтамперометрии

В данной работе методом циклической вольтамперометрии (ЦВА) исследованы процессы окисления и восстановления ряда природных полифенольных АО и синтетических антиоксидантов (производных пирокатехина, гидрохинона и пирогаллола). Процедуру ЦВА проводили на фоне 0,1 М раствора ЫаС1, скорость развертки - 0,2 В/с. Для регистрации анодно-катодных вольтамперограмм а-токоферола в качестве фонового электролита использовали 0,1 М раствор Ь1С104 в ацетонитриле. В качестве примера на рис. 1 представлены циклические вольтамперограммы некоторых из исследованных веществ. В таблицах 1 и 2 указаны значения потенциалов пиков (Ещах) тока окисления полифенольных АО растительного происхождения и синтетических АО.

Рис. 1. Циклические вольтамперограммы рутина (1), аскорбиновой кислоты (2), а-токоферола (3)

Таблица 1

Потенциалы пиков тока окисления природных антиоксидантов

Вещество Етах> В Етах, В (лит. данные)

Рутин +0,37 -

Пирокатехин +0,23 -

Кверцетин +0,05 -

Аскорбиновая кислота +0,22 +0,15

(+)Катехин +0,20 +0,22

+0,65 +0,62

Кофейная кислота +0,26 +0,42

а-Токоферол +0,58 От 0,5 до 0,57 при разных рН

Таблица 2

Потенциалы пиков тока окисления синтетических антиоксидантов_

№ | Соединение Структурная формула Р В 1 -ГЛУХ. 11

J Пропил галл ат он о +0,25 +0,58

2 со-морфолино-3,4-диоксиацетофенон, гидрохлорид 110 АгО,м о +0,37 +0,75

3 и-пиперидино-3,4-диоксиацетофенон, гидрохлорид но +0,32 +0,75

4 со-пирролидино-3,4-диокеиацетофенон, гидрохлорид но 'НС| +0,35 +0,75

5 3,4-диокси-со- тиосульфонатоацетофенон, натриевая соль но о +0,35 +0,77

6 2,5-диокси-ю- тиосульфонатоацетофенон, натриевая соль но он о +0,15 +0,77

7 оксим-5-морфолинометил пирогаллового альдегида гидрохлорид он но^Д^он О^^К^^Ч^^^да,, . НС| +0,18 +0,45 +0,65

8 оксим-5-пиперидинометил пирогаллового альдегида, гидрохлорид он но^Хлн \ • нс1 +0,15 +0,47 +0,65

9 2,3,4-триокси-5- морфолинометилацетофенон, гидрохлорид но НОуЛ^ОН ° -НС1 +0,12 +0,47

Продолжение таблицы 2

10 5-морфолинометилгаллатацетофенон, оксим, гидрохлорид он у 4_' мои . на +0,53

11 4,6-бис-морфолинометил пирогаллол он но.Д^оч _о +0,18

12 4-морфолинометил пирогаллол но но^Ау-он +0,20

13 со-морфолиноацетофенон, гидробромид С^ЧУнв, О +0,85

Все исследованные вещества, как природного, так и синтетического происхождения являются электрохимически активными. Экспериментально полученные потенциалы пиков окисления исследованных веществ согласуются с данными, известными по источникам литературы. Разница потенциалов в данном случае определяется разницей в условиях проведения эксперимента: свойствами электролита, рН среды и т.п. В большинстве случаев на ЦВА не наблюдаются пики восстановления, что свидетельствует о необратимом окислении этих веществ. Кроме того, необходимость регенерации поверхности рабочего электрода, существенно затрудняет количественную оценку содержания антиоксидантов методом ЦВА.

Недостатками ЦВА как аналитического метода являются:

■ зависимость сигнала от состояния поверхности электрода;

■ невозможность выделения индивидуального сигнала из-за близости потенциалов окисления АО и необходимости регистрации количества электричества, что накладывает ограничения на воспроизводимость при определении интегрального содержания АО в объектах со сложной матрицей.

Потенциометрия

К сожалению, как следует из приведенных выше данных, электрохимические реакции исследованных антиоксидантов являются необратимыми. Помочь решить эту проблему может использование медиаторной системы, компоненты которой обеспечили бы, с одной стороны, установление равновесного потенциала в системе, и химическую реакцию с определяемыми антиоксидантами, с другой.

Выбор подходов и обоснование метода. В таблице 3 приведены окислительно-восстановительные потенциалы основных реакций, в которых участвуют кислородные радикалы (Е°./й) (Ваге! АЛ. ей а1., 1985).

Таблица 3

Окислительно-восстановительные потенциалы некоторых оксндантов

Оксиданты Еох/гесЬ В (ОТН. Н.В.Э)

Н027Н202 +1,44

Н02/Н20 +1,65

02'70Н" +0,65

н2о2/он' +1,44

Н202/ Н20 + 1,76

Н0/Н20 +2,38

Окислительно-восстановительные потенциалы антиоксидантов (Е°АОох1М>) лежат в более отрицательной области. Например, потенциал аскорбиновой кислоты относительно Н.В.Э составляет +0,08 В (Слесарев В.И., 2001). В качестве реагента-оксиданта для определения АО может быть использована система, окислительно-восстановительный потенциал (Е которой

удовлетворяет условию:

Ео > р0 > Р0

/¡•/а ^ОхШ-еЛ '-'АОт/АО-

Кроме того, такая система:

■ должна быть электрохимически обратимой;

■ потенциал системы должен быть устойчив;

■ изменение потенциала медиаторной системы при изменении концентрации компонентов должно подчиняться уравнению Нернста;

■ химическая реакция реагента с основными антиоксидантами должна происходить с достаточно большой скоростью.

Этим требованиям наиболее полно отвечает сочетание комплексных соединений железа К3[Те(СЫ)й] и К4[Ре(СМ)6]. Стандартный потенциал такой системы относительно Н.В.Э. составляет +0,36 В. Таким образом, между антиоксидантами и окисленным компонентом медиаторной системы будет происходить химическая реакция согласно уравнению:

а-Ре(Ш) + а-АОге(1 а-Ре(Н)+ с1-А0ох (1). Отсюда следует, что для определения антиоксидантной активности предлагаемым потенциометрическим методом можно использовать химическое взаимодействие антиоксидантов с Ге(Ш), которое приводит к изменению соотношения Ре(Ш)/ Ее(П) и, следовательно, изменению окислительно-восстановительного потенциала медиаторной системы.

Согласно уравнению Нернста, потенциал медиаторной системы описывали следующим выражением:

Е=Ео+Ь • ^Сох/С ге<] (2).

После введения в раствор образца, содержащего антиоксиданты, потенциал системы изменяется в соответствии с уравнением:

ЕI=Е0+Ь ■ 1£(С0х-Х)/(С ге<1+Х) (3).

Используя уравнения (1) и (2) активность (концентрацию) антиоксидантов в растворе можно рассчитать по формуле:

аС -С

X = "х ^ (4)

где Е, Е1 - потенциалы, устанавливающиеся в системе до и после введения

анализируемого источника антиоксиданта, В;

Е„ - стандартный потенциал медиаторной системы, В;

Сох - концентрация окисленной формы медиатора, моль экв./дм3;

Сге(1 - концентрация восстановленной формы медиатора, моль экв./дм3;

X - эквивалентная концентрация антиоксидантов, вступивших во взаимодействие с

окисленным компонентом медиаторной системы, моль экв./дм3;

а=10<Е-Е1)/ь-Сге<1/Сох, Ь=2,ЗЯТ/пР, п=1.

Принимая во внимание, что в процессе анализа ионная сила раствора практически не изменяется и источником информации является изменение потенциала, а не его абсолютная величина, достаточно корректно не делать разницы между активностью и концентрацией. Далее именно эта величина используется для характеристики антиоксидантной активности. Оптимизация условий определения. Исследование влияния материала рабочего электрода, кислотности реакционной среды, соотношения компонентов медиаторной системы и соотношения объемов исследуемого раствора и раствора медиаторной системы показали, что оптимальными условиями определения являются следующие: * нейтральная реакция среды;

■ использование платинового электрода в качестве рабочего;

■ соотношение компонентов медиаторной системы в электрохимической ячейке 0,01 М К3[Ре(С1чГ)6]/0,0001 М К4[Ре(СЫ)6];

■ объем исследуемого раствора или объекта - 0,2-0,8 см3. Алгоритм анализа.

1 - стеклянную электрохимическую ячейку заполняли 10 мл 0,015 М К-Ыа фосфатного буферного раствора,

2 - добавляли 100 мкл 1М раствора Кз[Ре(СЫ)6] и 100 мкл 0,01 М раствора К4[Ре(СН)6];

3 - погружали в ячейку электроды;

4 - выдерживали систему до установления значения потенциала, который далее считали начальным и обозначали его Е;

5 - добавляли аликвоту исследуемого раствора или объекта;

6 - измеряли потенциал также, как в п.З, обозначали его Еь

7 - рассчитывали активность (концентрацию) антиоксидантов в растворе в соответствии с формулой (4).

Исследование природных соединений. Большинство полифенольных АО растворимы в воде. Исследование АОА жирорастворимых АО, проводили на модели а-токоферола в мицеллярной системе. Мицеллярную систему получали методом замены растворителя, вводя аликвоту этанолыюго раствора а-токоферола в ячейку, содержащую К-Ма буферный раствор и медиаторную систему.

Стехиометрические коэффициенты. Стехиометрические коэффициенты реакции (1) определяли для установления закономерностей окисления антиоксидантов при взаимодействии с медиаторной системой

Кз[Ре(СЫ)6]/К1[Ге(СК)г,]. В таблице 4 приведены стехиометрические коэффициенты реакции (1) с природными АО.

Таблица 4

Название соединения АО А 0,01М раствора, ммоль экв./дм3 а:с1

Катехол он СУ" 19,9 0,07 2:1

Флороглюцин А 29,4 0,01 3:1

Кофейная кислота он О г^Ц^0" 25,2 0,04 2:1

Кверцетин он 48,6 0,05 5:1

он о

Рутин он 39,7 0,01 4:1

^т^ >| О-плшсне ОН 0

(+)Катехин он 49,4 0,01 5:1

он

Аскорбиновая кислота о^чАоцон 22,1 0,05 2:1

но он

а-Токоферол

11,0 0,02 1:1

сн> га, сн, сн, сн, '

При введении аликвот растворов этих соединений в электрохимическую ячейку наблюдали сдвиг потенциала медиаторной системы, что свидетельствует о протекании реакции между Кз[Ге(СЫ)б] и исследованными веществами.

Стехиометрические коэффициенты реакции (1) определяли следующим образом: СК=а:ё=2ре(ш):2Ао, где грС(Ш) и гА0 - числа эквивалентности Кз|Те(СМ)б] и антиоксидантов. Число эквивалентности для каждого исследованного вещества рассчитывали в соответствии с выражением гА0= АОА/М, где АОА -аптиоксидантная активность исследуемого вещества, моль экв./дм3; М -молярная концентрация раствора исследуемого вещества. Полученные для исследованных соединений стехиометрические коэффициенты реакции (1) отражают количество гидроксильных групп, присоединенных к бензольному кольцу, флавоновому ядру или ненасыщенному гетероциклу (аскорбиновая кислота).

Метод «введено-найдено». В таблице 5 приведены данные исследования АОА модельных растворов некоторых антиоксидантов методом «введено-найдено». Результаты составили величины, близкие к 100%.

Таблица 5

Определение АОА некоторых антиоксидантов методом «введено-найдено» (11=6, р=0,95) _________

Вещество Введено АОА (С,), ммоль экв./ди^ Найдено Найдено я = ^Моо,% С,

АОА (С2), ммоль экв./дм3

Аскорбиновая кислота 10,0 10,6 0,01 106

20,0 19,1 0,05 98

Кофейная кислота 10,0 10,4 0,04 104

20,0 21,6 0,03 108

Кверцетин 25,0 23,0 0,01 92

50,0 47.2 0,02 94

а-Токоферол 10,0 11,0 0,02 110

5,0 4,8 0,06 96

Предел определения. Аскорбиновую кислоту использовали в качестве модельного антиоксиданта для установления предела определения по Зо-критерию для водорастворимых АО. Предел определения АОА в водных растворах составил 3,5• 10"6 моль экв./дм3 (п=6, р=0,95). А-Токоферол использовали в качестве модельного антиоксиданта для установления предела определения АОА в мицеллярном растворе. В данном случае предел определения составил 4' 10~6 моль экв./дм3 (п=6, р=0,95).

Исследование синтетических антиоксидантов. Потенциометрическим методом исследовали АОА синтетических соединений - производных пирогаллола, пирокатехина и гидрохинона, перечисленных выше. Таблица 6 отражает результаты определения антиоксидантной активности 0,01 М водных растворов этих веществ. Номера соединений соответствуют номерам в таблице 2.

Таблица 6

АОА синтетических аитиоксндантов (п=6, р=0,95)

Экспериментально полученные значения

№ АОА, ммоль экв./дм"' 8Г а (1 Ожидаемые значения а:<3

1 39,8 0,03 4 1 3 1

2 36,5 0,04 4 1 2 1

3 30,4 0,02 3 1 2 1

4 36,5 0,04 4 1 2 1

5 36,9 0,01 4 1 2 1

6 31,4 0,06 3 1 2 1

7 50,4 0,04 5 1 3 1

8 50,0 0,01 5 1 3 1

9 22,9 0.09 2 1 3 1

10 20,9 0.04 2 1 3 1

11 18,4 0,07 2 1 3 1

12 25,4 0,04 2 1 3 1

13 8,6 0,05 1 1 -

Как уже упоминалось ранее, антиоксидантные свойства полифенольных веществ определяются присутствием ОН-групп при бензольном кольце в структуре молекулы. Результаты эксперимента показали, что введение дополнительных функциональных групп приводит к изменению АОА веществ по сравнению с ожидаемой. Более высокие значения АОА получены при исследовании:

• веществ, содержащих карбонильную группу в соседнем с положении с бензольным кольцом (соединения 1, 2, 3, 4);

• соединений с тиосульфонатной группой (соединения 5, 6), по всей вероятности за счет присутствия атома серы в степени окисления (2+);

• веществ, содержащих оксимную группу с атомом азота в степени окисления (3+) (соединения 7, 8).

Уменьшение АОА получены при исследовании:

• веществ, где присутствовал метальный остаток в соседнем положении с оксимной и кетогруппами (соединения 9, 10);

• ди- и мономорфорлинометильных производных пирогаллола (соединения 11,12).

Гидробромид са-морфолиноацетофенона (соединение 13) занимает до некоторой степени промежуточное положение: в этом соединении при бензольном кольце нет ОН-групп, которые обычно обеспечивают антиоксидантные свойства вещества, но с другой стороны, здесь присутствует карбонильная группа, которая, как показали приведенные выше результаты исследований, увеличивает антиоксидантную активность соединения.

Таким образом, новый потенциометрический метод применим для определения АОА, водорастворимых и жирорастворимых АО. Кроме того, в ряде случаев проявляется возможность исследовать взаимосвязь антиоксидантной активности и структуры синтетических соединений.

Корреляционные исследования. Сравнивали результаты определения АОА ряда объектов, полученные предлагаемым методом и известными принятыми методами фотоколориметрии, фотохемилюминесценции и люминесценции продуктов перекисного окисления липосом.

Существует довольно широкий круг методик оценки АОА, основанных на гашении антиоксидантами исследуемого объекта люминесценции люминофоров (люминола, люцигенина, кроцина, фикоэритрина и др.) или сложных модельных систем (суспензий животных тканей или органелл). В данной работе были использованы два хемилюминесцентных метода: метод определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов, накапливающихся в липосомах желтка куриного яйца (ПОЛ) и метод индуцированной светом люминесценции продуктов окисления дипептида глицил-триптофана (фотохемилюминесцентный).

Наиболее адекватной моделью ПОЛ принято считать реакции свободнорадикального окисления, протекающие в липидной фазе биологических мембран. Исходя из этого, для корреляционных исследований был выбран люминометрический метод определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов, накапливающихся в липосомах желтка куриного яйца. Антиоксидантную активность в данном случае оценивали в относительных единицах согласно выражению:

где Мк - результат контрольного опыта, М0 - результат опыта с испытуемым объектом (Сернов Л.Н. с соавт., 2000). Потенциометрическим методом и методом ПОЛ исследовали АОА ряда образцов свежеприготовленных экстрактов лекарственных растений Кавказа (разных видов полыни, василька шипиконосного, тысячелистника широколопастного, предоставленных Пятигорской государственной фармацевтической академией).

Фотохемилюминесцентный метод основан на гашении антиоксидантами

пробы люминесценции продуктов окисления дипептида глицил-триптофана,

индуцированной светом. Антиоксидантной активности также оценивали в

относительных единицах в соответствии с выражением:

с" Ч/

А = -^г>

где - концентрация стандарта, вызывавшая 50% ингибирование

хемилюминесценции по сравнению с контролем; Су - концентрация

антиоксидантов, вызывавшая 50% ингибирование хемилюминесценции по сравнению с контролем. В качестве стандартного вещества использовали рутин (Лозовская Е.Л. с соавт., 1993). Объекты исследования - бальзамы и экстракты лекарственных растений промышленного изготовления.

2,2-Дифенил-1-пикрилгидразил - стабильный свободный радикал. Применение этого долгоживущего свободного радикала для исследования противорадикальной активности (ПРА) чистых веществ сыворотки крови,

15

продуктов питания основано на его способности взаимодействовать с антиоксидантами - «гасителями радикалов», которую регистрируют по уменьшению поглощения при длине волны 517 нм (¡УЫЫеБеп е1 а1, 1997, Оийг й а1, 2002). В данной работе использовали модификацию этого метода, при которой реакцию проводили в водно-метанольной среде, насыщенной аргоном. Определен максимум поглощения растворов ДФПГ в водно-метанольной среде (550 нм), а также область линейности зависимости оптической плотности от концентрации 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразила (0,1-1,0 мМ). Для определения содержания антиоксидантов учитывали разность оптической плотности до и после добавления аликвоты раствора аскорбиновой кислоты или растительного экстракта к раствору ДФПГ. ПРА выражали в мМ аскорбиновой кислоты. Зависимость изменения оптической плотности от молярной концентрации этого АО подчинялась уравнению ОЭ = X ■ 12,2(±0,1). Потенциометрическим методом и методом с использованием ДФПГ исследовали свежеприготовленные водные и водно-этанольные экстракты лекарственных растений.

Дополнительно сравнивали результаты определения АОА и общего содержания полифенольных соединений в вине. Общее содержание полифенолов в вине определяли методом Фолина-Чокальтеу, основанном на восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот совокупностью полифенольных веществ до окрашенных в синий цвет соединений (1=750) (Директивы и регламенты Европейского союза, 2000). В качестве стандартного вещества использовали (+)катехин. Зависимость оптической плотности раствора от концентрации (+)катехина подчинялась уравнению ОЭ = X • 23,5( ± 0,5).

В таблице 7 представлены результаты определения коэффициентов корреляции результатов, полученных потенциометрическим и перечисленными выше методами.

Таблица 7

Коэффициенты корреляции результатов определения АОА

Метод сравнения Коэффициент корреляции

Метод ПОЛ 0,88

Метод хемилюминесценции 0,76

Метод ДФПГ 0,99

Метод Фолина-Чокальтеу 0,97

Таким образом, показана высокая степень корреляции общего содержания полифенолов и АОА вина, а также результатов определения антиоксидантной активности методом потенциометрии и методами фотоколориметрии с использованием долгоживущего радикала 2,2-дифеНил-1-пикрилгидразила, хемилюминесценции и люминесценции продуктов перекисного окисления липосом.

Результаты определения стехиометрических коэффициентов реакции природных АО с выбранной медиаторной системой, результаты определения АОА методом «введено-найдено», близкие к 100 %, и высокие коэффициенты

корреляции антиоксидаитной активности, измеренной потенциометрическим и другими методами, дают основание перейти к исследованию объектов со сложной матрицей и использовать для оценки их антиоксидантных свойств интегральный параметр антиоксидаитной активности.

Исследование антиоксидаитной активности объектов

со сложной матрицей. В таблице 8 представлены результаты исследования АОА методом «введено-найдено» в образцах со сложной матрицей (фруктовых и спиртосодержащих напитках). В качестве вводимого антиоксиданта использовали аскорбиновую кислоту. Найденные величины близки к 100%.

Таблица 8

Исследование АОА ряда объектов со сложной матрицей методом «введено-пайдено» (п=6, р=0,95)______

Образец АОА образца (С,), ммоль экв./дм3 я, Введено АОА (С2), ммоль экв./дм3 Найдено Найдено, % С -С л= 3 1 100 С;

АОА (С3), ммоль экв./дм3 8Г

Вино натуральное красное полусладкое 12,7 0,05 10 21,6 0,05 90

Вино натуральное белое полусладкое 5,1 0,04 10 15,4 0,04 103

Напиток винный «Кизил на коньяке» 5,1 0,05 10 15,3 0,05 102

Сок яблочный 5,0 0,02 10 14,5 0,03 95

Предложенным потенциометрическим методом определяли АОА свежеприготовленных соков ягод, фруктов и овощей (30 объектов), АОА фруктовых и овощных соков и нектаров промышленного производства (12 видов сока различных производителей). На рис.2 представлены результаты определения АОА некоторых из исследованных продуктов питания.

18 16 14" 1210 8 " 6

4 -

2-1

АО А, мм оль экв./дм3

0

10

Рис. 2. АОА некоторых соков и чая

(Апельсиновые соки: 1 -свежеприготовленный, 2-3-промышленного изготовления. 4-Сок ягод смородины. 5- сок кольраби, 6-си к перца сладкого. Зеленый чай: 7л истовой, К-разового затаривания, Мерный чай: 9-листовой, 10-разового заваривания. 11-Напиток из цветов гибискуса)

Анализ полученных результатов показал, что АОА промышленных соков разных производителей отличался. АОА свежеприготовленных соков был несколько выше (6,4-1,1 ммоль шв. /дм3), чем промышленных соков (4,3-0,8 ммоль экв. /дм"*), приготовленных из фруктов того же наименования.

В ¡1 редставленной работе были исследованы АОА 20 сортов чая и 2 сорта напитка «Каркаде» из цветков гибискуса, приобретенных и розничной торговле. Самая низкая антиоксидантная активность была найдена в напитках из цветков гибискуса (0,7- 0,8 ммоль экв./дм'). Согласно литературным данным, несколько более высокими ангиоксидантными свойствами обладает зеленый чай. Тем не менее, примерно одинаковая АОА была определена как у зеленых, так и у черных листовых чаев (5-7 ммоль экв./дм '). У некоторых образцов черного чая этот показатель был довольно высок (12,7-10,4 ммоль экв./д>г), ч то может быть обусловлено хорошим качеством сырья и точным соблюдением технологии его переработки.

На рис.З представлены результаты исследования 60 образцов спиртных напитков, предоставленных испытательной лабораторией ФГУ «Уралтест» (г. Екатеринбург). Исследованные в представленной работе спиртные напитки были объединены в группы в соответствии с особенностями технологии изготовления. Далее потенциометр ическим методом была измерена АОА каждого образца и рассчитан средний показатель

г

ЛОЛ, и моль эквУдм3 5«

щ

М

12 jo*

В 6 4

г о

•'Г

7

для каждой группы. Наибольшие значения АОД были характерны для красных вин, как натуральных, гак и специальных. Далее в порядке убывания располагались: вино розовое, портвейны, настойки, вино белое и вишше напи чки. Полученные результата согласуются с известными по литературным источникам данными о том. что АОА белых вин существенно ниже, чем красных. Кроме того, уровень АОЛ коррелировал с количеством растительного

материала, используемого мри производстве той или иной группы нагштков

1'ис. 3. АОА спиртосодержащих напитков

('1-випо натуральное красное, 2-вино специальное красное. З-вино натуральное розовое. 4-Портвёйны, 5-настсйки, 6-ыино натуральное белое, 7-винные нанитки)

Исследовали АОА 14 образцов пива. Анализ АОА различных сортов пива позволил прийти к выводу, что этот показатель коррелирует с содержанием экстрактивных веществ в сусле. Наименьший уровень АОА наблюдали в безалкогольном пиве, а наибольший - в темных сортах пива с содержанием экстрактивных веществ в сусле ¡5-16%. В таблице 9 представлены результаты определения АОА пива, подученные методом потенциометрии. которые аналогичны литературным данными определения содержания восстанавливающих соединений в пиве с 2,6-дихлорфенол-индофе>1олятом N8 методом вольтамиерометрии (5оЫееЬ ег. я1., 1998).

Таблица 9

цнх веществ в разных образцах нива

АОЛ н ;

Образец пн в а

Темное

Безалкогольное Pilsencr

Содержание редуцирующих вешсств,

_'jKi^jicKQpD. к-ты (лит. данные)

2,50-3,56

1,14- 1,66 1^57-2,01

ЛОЛ, \iмоль зкб. /дм;

2,0 - 2,2

0,4

0,8-1,4

Таким образом, результаты определения ангиоксидантной активности, полученные потен ц неметрическим методом, хорошо согласуются с литературными данными. АОА продуктов и продовольственного сырья может быть использована для оценки качества и соблюдения технологии при производстве и храпении. Поскольку информация о величине АОА пищевых продуктов растительного происхождения имеет практическое значение, возникает необходимость установления метрологических характеристик определения этого параметра.

Учитывая тот факт, что на данный момент не существует аттестованных методик и стандартных образцов для определения АОА, а также при анализе продуктов питания с их сложным и изменчивым составом невозможно учесть

все меняющиеся факторы, для определения прецизионности, правильности и точности методики определения АОА продуктов питания был выбран метод разбавления анализируемого образца. Таблица 10 объединяет результаты определения АОА методом разбавления и оценки прецизионности, правильности и точности методики определения АОА ряда продуктов питания, БАД и витаминов. Показатели прецизионности (повторяемости (аг) и воспроизводимости (ок)), правильности (+8С) и точности (+8) методики определения АОА продуктов питания, БАД и витаминных препаратов рассчитывали в соответствии с требованиями РГМ 61-2003.

Таблица 10

Основные метрологические характеристики метода (п=30, р=0,95)_

Среднее арифметическое

результатов Метрологические

№ Название образца определения АОА, ммоль экв./дм3 характеристики

Без разбавления С

разбавлением »7=2 Or, % +8И % ±5, %

1 Шардоне, вино белое натуральное сухое 1,6 0,9 11 15 21 37

2 Нектар «Персик» 1,9 0,9 5 6 6 13

3 Совиньон, вино белое натуральное полусладкое 2,1 1,2 12 17 15 37

4 Нектар «Овощная смесь» 2,4 1,3 6 8 7 17

5 Портвейн, вино белое специальное крепкое 2,5 1,2 10 14 13 31

6 Сок яблочный 2,6 1,4 6 8 7 17

7 Коньяк 3,0 1,4 4 5 5 11

8 Мускат, вино белое специальное полусладкое 3,4 1,7 10 13 11 28

9 Пиво, экстрактивность сусла 14% 3,6 1,8 8 7 9 18

10 Сок апельсиновый 3,8 1,8 6 8 8 18

11 Настойка на коньяке 4,4 2,3 10 15 12 32

рябиновая, сладкая

12 Апельсины 4,5 2,4 9 8 10 19

13 Дыни 4,6 2,3 7 7 9 17

14 Нектар «Апельсин, банан» 4,6 2,2 5 7 6 15

15 Наливка черносмородиновая 6,1 3,0 5 8 7 18

16 Красный китайский чай Oolong 6,7 3,4 6 8 7 16

Продолжение таблицы 10

17 Портвейн, вино розовое специальное крепкое 9,6 4,5 ■ 3 4 6 10

18 Черный китайский чай 12,4 6,1 5 8 6 15

19 Яблоки 15,9 7,6 4 4 5 10

20 Эликсир «Демидовский» 15,2 8,4 7 7 9 16

21 Драже кислоты аскорбиновой 22,8 11,0 4 4 4 8

22 Зеленый китайский чай 21,7 10,5 5 6 6 13

23 Свекла 24,1 11,1 4 4 7 11

24 Мерло, вино красное натуральное полусладкое 24,2 12,4 8 11 9 24

25 Ундевит 5,0 2,6 4 4 5 9

26 Смородина 26,2 13,1 6 6 7 14

27 Настойка полыни 29,0 14,1 8 7 9 16

28 Аскорутин 30,0 14,6 6 6 7 14

29 Кагор, вино красное специальное десертное 37,1 16,5 4 6 5 13

30 Капилар 6,0 3,0 6 6 6 14

31 Экстракт родиолы 263,2 133,3 3 з ! 4 8

На основании рассчитанных значений метрологических характеристик, можно выделить следующие поддиапазоны определения АОА: от 0,9 до 5,0 ммоль экв./дм3 с точностью 37%, от 5,0 ммоль экв./дм3 и выше с точностью 25%. Показатель повторяемости по исследованным продуктам, БАД и витаминам в относительных единицах составил не более 12%. Показатель воспроизводимости - не более 17%. Интервалы относительной систематической погрешности (правильности) - не более 21%. Наиболее высокие значения метрологических характеристик найдены для тех продуктов, где антиоксидантная активность исследованных образцов составляла 2,0 ммоль экв./дм3 и менее, а АОА параллельных образцов, приготовленных разведением, 1,0 ммоль экв./дм3 и менее.

Таким образом, потенциометрический метод определения АОА с использованием медиаторной системы может быть с успехом применен для определения АОА широкого круга растительных или созданных на их основе объектов со сложной матрицей переменного состава. Полученные значения прецизионности, правильности и точности подтверждают стабильность потенциометрических измерений АОА, полученных в условиях повторяемости и воспроизводимости.

ВЫВОДЫ

1. Получены данные, свидетельствующие о необратимости процессов окисления-восстановления ряда антиоксидантов природного и синтетического происхождения.

2. Дано термодинамическое обоснование применения потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения

антиоксидантных свойств различных объектов, сформулированы критерии выбора и подобрана соответствующая им медиаторная система.

3. Потенциометрическим методом исследована антиоксидаитная активность ряда природных и синтетических антиоксидантов, определены стехиометрические коэффициенты реакции взаимодействия AOred с

K3[Fe(CN)6].

4. Показана высокая чувствительность нового потенциометрического метода: пределы определения АОА в водном растворе и эмульсии масло/вода составили 3,5' 10"6 и 4■ 1 О*6 моль экв./дм3 (п=6, р=0,95).

5. Показана взаимосвязь антиоксидантной активности и строения молекулы синтетических антиоксидантов.

6. Достоверность результатов, получаемых предлагаемым методом, доказана:

а) хорошей корреляцией с данными, полученными известными методами. Коэффициенты корреляции составили: с методом ПОЛ - 0,94; с методом фотохемилюминесценции - 0,87; с методом фотометрии с использованием ДФПГ - 0,99; с методом Фолина-Чокальтеу - 0,99.

б) Близкими к 100% результатами определения АОА, полученными методом «введено-найдено» на модельных растворах и объектах со сложной матрицей.

7. Исследована АОА объектов со сложной матрицей: продуктов питания, БАД, препаратов лекарственных трав. Показана возможность использования параметра АОА как одной из характеристик качества продуктов растительного происхождения.

8. Определены метрологические характеристики методики потенциометрического определения антиоксидантной активности.

9. Разработан новый потенциометрический метод определения антиоксидантной активности, который отличается экспрессностью процедуры анализа, и позволяет проводить количественную оценку антиоксидантной активности сложных объектов с матрицей без использования токсичных и дорогостоящих вспомогательных материалов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. 2004. - № 4. -С. 73-75.

2. Применение потенциометрии для определения антиоксидантной активности растительных экстрактов. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова // Тез. докл. на VI Всероссийской конференции с международным участием по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2004». г. Уфа, 23-27 мая 2004. -С. 190-191.

3. Методы и сенсоры для мониторинга безопасности и контроля качества продуктов питания. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, H.A. Малахова, Л.Э. Стенина, E.H. Шарафутдинова // Сб. научных трудов Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые

технологии, методы и средства для их реализации». М.: МГУПП, 2004. - 4.1. -С. 157-159.

4. Определение Си, Cd, Pb, Zn, As, Hg и антиоксидантной активности в сельскохозяйственном сырье, почвах и природных водах. [Текст] / H.IO. Стожко, Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова // Материалы II Международной конференции «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья», г. Москва, 6-9 декабря 2004. - С. 46-47.

5. Исследование антиоксидантной активности жидкостей методом погенциометрии и использованием медиаторной системы. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова. JI.B. Алешина // Сб. докладов на научно-практическом семинаре «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения», г. Москва, 14-15 сентября 2004.-С. 173-175.

6. Антиоксидантная активность как новый показатель свойств спиртных напитков. [Текст] / A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова // Тез. докладов на Всероссийской научно-практической конференции «Товарный консалтинг и аудит качества: современные проблемы товароведения», г. Екатеринбург, 17-18 ноября 2004. - С. 109-111.

7. Мониторинг безопасности и качества продуктов питания: новые подходы. [Текст] / В.М. Камышов, E.H. Шарафутдинова, А.В.Иванова, H.A. Малахова, Х.З. Брайнина // Тез. докладов на региональной научно-практической конференции «Качественные и безопасные продукты - залог здоровья нации», г. Екатеринбург, 9 декабря 2004. - С. 45-47.

8. Потенциометрическое определение антиоксидантной активности вина. [Текст] / E.H. Шарафутдинова. A.B. Иванова, Х.З. Брайнина // Тез. докладов на Общероссийской конференции молодых ученых «Пищевые технологии», г. Казань, 14 апреля 2005. - С. 101-102.

9. Сравнение противорадикальной и антиоксидантной активности экстрактов лекарственных трав. [Текст] / A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова. Х.З. Брайнина // Тез. докладов на всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005». г. Екатеринбург, 23-27 мая 2005. - С. 91.

10. Потенциометрия как альтернативный метод исследования антиоксидантной активности биологических жидкостей, пищевых продуктов и добавок. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова. Е.И. Шкарина // Тез. докладов на второй всероссийская конференции «Аналитические приборы», г. Санкт-Петербург, 27 июня-1 июля 2005.-С. 166-167.

11. Сравнительные исследования антиоксидантной активности лекарственных трав. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова. Е.И. Шкарина, Д.А. Коновалов // Сб. трудов 4-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», г. Смоленск, 26-30 сентября 2005. - С. 10-11.

12. Потенциометрический тестер для оценки антиоксидантных свойств различных объектов. [Текст] / Х.З. Брайнина, A.B. Иванова, E.H. Шарафутдинова, JI.B. Алешина, Е.Г. Мирошникова // Материалы научно-практической конференции «8-й Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов», г. Пущино, 18-19 ноября 2005. -С. 161-163.

13. Potentiometrie determination of antioxidant activity of food and herbal extracts [Text] / Kh. Brainina, A. Ivanova, E. Sharafutdinova, S. Saraeva // ECSA News Letter 2006. - v.2, in press.

14. Антиоксидантная активность как показатель качества продуктов питания растительного происхождения / E.H. Шарафутдинова, Е.В. Пастушкова, А. В. Иванова, М.В. Федоров, А.З. Брайнина // Материалы Международной научно-практической конференции «Продовольственна безопасность в системе народосбережения». г. Екатеринбург, 7-8 декабря 2006. - С. 264-268.

15. Potentiometry as a method of antioxidant activity investigation [Text] / Kh.Z. Brainina, A.V. Ivanova, E.N. Sharafutdinova, E.L. Lozovskaya, E.I. Shkarina //Talanta, 2007. - V. 71. -№ l.-P. 13-18.

Диссертация выполнена при поддержке проектов Международного научно-технического центра 2132 и 342, проекта ЬЧГГАЯ 00-273, проекта Министерства науки и образования РФ «Разработка многофункционального программируемого потенциометрического анализатора и лабораторного практикума по потенциометрическим методам анализа».

Автор благодарит руководство и сотрудников ИОС УрО РАН и кафедры органической химии УГТУ-УПИ за предоставленные образцы синтетических антиоксидантов. Автор выражает признательность руководству и сотрудникам Института биохимической физики им. Эммануэля РАН (г. Москва) и Пятигорской государственной фармацевтической академии за участие в корреляционных исследованиях. Автор благодарит руководство и сотрудников испытательной лаборатории ФГУ Уралтест (г. Екатеринбург) и НИИ Уралпромсертификат УрГЭУ за предоставленную возможность анализа образцов алкогольной продукции.

Автор признателен коллегам по НИЦ сенсорных технологий УрГЭУ за помощь и поддержку при выполнении диссертационной работы.

Подписано в печать 12.03.2007. Формат бумаги 60x84. Бумага для множительных аппаратов. Печать плоская Усл., печ. л. 1,5 Заказ 85 Тираж 110 экз. Издательство

Уральского государственного экономического университета _Екатеринбург, ул. 8 Марта 62__

ПОП УрГЭУ Уральский государственный

Экономический университет

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Механизмы образования свободных радикалов.

1.1.1. Активация кислорода в ферментативных реакциях.

1.1.2. Радикальные окислительные процессы.

1.2. Основные механизмы защиты организма от активных форм кислорода.

1.2.1. Взаимодействие низкомолекулярных тиольных антиоксидантов с активными формами кислорода.

1.2.2. Взаимодействие низкомолекулярных фенольных антиоксидантов с активными формами кислорода.

1.3. Методы исследования составляющих антиоксидантной защиты.

1.4. Методы исследования общей антиоксидантной активности.

1.4.1. Спектрофотометрические и люминесцентные методы исследования.

1.4.2. Электрохимические методы определения антиоксидантов.

1.4.3. Другие методы определения антиоксидантной активности.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Реактивы.

2.3. Объекты исследования.

2.4. Методы исследования.

2.4.2. Фотохемилюминесцентный метод.

2.4.3. Исследование противорадикальной активности с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразила.

2.4.4. Метод хемилюминесцентного определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливающихся в мембранах липосом.

2.4.5. Метод Фолина-Чокальтеу.

2.4.6. Метод циклической вольтамперометрии.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИОКСИДАНТОВ.

3.1. Исследование электрохимических процессов окисления-восстановления природных и синтетических антиоксидантов методом циклической вольтамперометрии.

3.2. Исследование АОА потенциометрическим методом с использованием медиаторной системы.

3.2.1. Обоснование выбора медиаторной системы.

3.2.2.0птимизация условий определения АОА.

3.2.3. Исследование взаимодействия медиаторной системы с природными водорастворимыми антиоксидантами.

3.2.4. Исследование взаимодействия медиаторной системы с водорастворимыми синтетическими антиоксидантами.

3.2.5. Исследование взаимодействия медиаторной системы с жирорастворимыми антиоксидантами.

Глава 4. КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Определение корреляции АОА и общего содержания фенольных соединений в вине.

4.2. Определение АОА потенциометрическим методом и методом перекисного окисления липидов.

4.3. Хемилюминесцентные и потенциометрические исследования АОА лекарственных настоев и бальзамов.

4.4. Противорадикальная и антиоксидантная активность водных и водно-этанольных экстрактов лекарственных трав.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ОБЪЕКТОВ СО СЛОЖНОЙ МАТРИЦЕЙ.

5.1. Метод «введено-найдено».

5.2. Исследование антиоксидантной активности некоторых продуктов питания.

5.2.1. Антиоксидантная активность соков фруктов и овощей.

5.2.2. Исследование антиоксидантной активности чая.

5.2.3. Антиоксидантная активность алкогольсодержащих напитков.

5.3. Определение метрологических характеристик потенциометрического измерения антиоксидантной активности продуктов питания.

Актуальность темы: Общее ухудшение экологической обстановки увеличило риск развития окислительного стресса у людей. Окислительный стресс сопровождается накоплением в организме человека свободных радикалов (CP), что приводит к усугублению заболеваний сердечно-сосудистой, нервной систем, легких, глаз, крови и ускоряет старение организма. Вещества, способные снижать уровень свободных радикалов в организме и защищать макромолекулы живой клетки, получили название антиоксидантов (АО). Актуальность перечисленных выше причин привела к росту потребности оценки содержания такого рода веществ в природных или созданных на их основе объектах (продуктах питания, биологически активных добавках, лекарственных препаратах), которые могут служить источниками АО.

Исследование антиоксидантов в таких объектах в настоящее время проводится в двух направлениях: определение состава веществ, способных выполнять функции антиоксидантов, и определение общих антиоксидантных свойств объектов. Группа веществ, предотвращающая образование сильных окислителей in vivo, довольно разнообразна. К ним относится SH-содержащая аминокислота цистеин, некоторые пептиды и белки (глютатион, альбумин), убихинон, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, токоферолы, каротиноиды, флаваноиды и др. Определение состава антиоксидантов позволяет судить о возможной физиологической ценности продуктов, в которых они содержатся. Однако исследование композиции веществ требует применения тех или иных процедур разделения, которые могут быть проведены только в условиях хорошо оснащенной исследовательской лаборатории. Кроме того, информации о составе антиоксидантов, как правило, недостаточно, чтобы судить об антиоксидантных свойствах в целом, так как в этом случае не учитываются процессы взаимного восстановления антиоксидантов и влияние матрицы исследуемого объекта.

Оценить общую антиоксидантную активность (АОА) того или иного объекта можно с помощью интегральных методов. В основе методов оценки общей антиоксидантной активности, как правило, лежат реакции взаимодействия с долгоживущими свободными радикалами, которые служат прототипом свободных радикалов, образующихся в живой клетке. Обеспечивая получение информации об АОА того или иного образца, такие методы имеют ряд особенностей, которые ограничивают возможности их применения. А именно, анализ проходит в несколько стадий и занимает довольно продолжительное время, аналитический сигнал необходимо регистрировать с помощью дорогостоящего спектрофотометрического или флуорометрического оборудования, а также требуется использование дорогостоящих реактивов.

Взаимодействие антиоксидантов с CP и активными кислородными соединениями (02'~, НО', Н202, О!, и др.) в водных средах сопровождается передачей электрона и, следовательно, имеет электрохимическую природу. В связи с этим представляется целесообразным изучать взаимодействие АО и активных кислородных соединений с использованием электрохимических методов. Электрохимические методы характеризуются высокой чувствительностью, быстротой процедуры анализа, относительно невысокой стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит, и анализа в целом. В этой ситуации наиболее доступным источником информации может служить измерение электрохимических параметров системы реагент/антиоксидант, например, окислительно-восстановительного потенциала.

Целю работы являлись исследование взаимодействия медиаторной системы с АО и разработка нового потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантной активности чистых химических веществ и оценки антиоксидантных свойств объектов со сложной матрицей: продуктов питания, БАД и экстрактов лекарственных растений. Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи: обосновать применение нового потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантной активности различных объектов: чистых химических веществ, продуктов питания и экстрактов лекарственных растений;

- сформулировать критерии выбора и подобрать медиаторную систему для потенциометрического определения антиоксидантной активности;

- исследовать реакции взаимодействия антиоксидантов с медиаторной системой;

- исследовать антиоксидантную активность индивидуальных веществ полифенольной природы (природных и синтетических) методом потенциометрии; провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантных свойств различных объектов, полученных разными методами;

- исследовать антиоксидантную активность объектов со сложной переменной матрицей: свежеприготовленных соков, соков и нектаров промышленного производства, алкогольсодержащих напитков, чая, овощей, ягод, некоторых фруктов, препаратов лекарственных растений; определить основные метрологические характеристики потенциометрического метода с применением медиаторной системы для измерения антиоксидантной активности некоторых продуктов питания. Научная новизна. Предложен новый потенциометрический метод исследования антиоксидантной активности. Дано термодинамическое обоснование выбора медиаторной системы для данного метода. Предложенным потенциометрическим методом изучена стехиометрия реакции некоторых полифенольных антиоксидантов растительного происхождения, аскорбиновой кислоты, ряда синтетических антиоксидантов с выбранной медиаторной системой гексацианоферрат (II/III) калия. Показано, что стехиометрические коэффициенты взаимодействия полифенольных антиоксидантов с K3[Fe(CN)6] соответствуют количеству ОН-групп при бензольном кольце, флавоновом ядре или ненасыщенном гетероцикле (аскорбиновая кислота). На примере производных пирогаллола, пирокатехина и гидрохинона показано, что антиоксидантная активность этих соединений возрастает при введении в структуру молекулы карбонильной группы в соседнем с бензольным кольцом положении, а также при введение оксимной и тиосульфонатной групп. Снижение АОА наблюдается, когда метальная группа находится в соседнем положении с карбонильной и оксимной группами, а также когда один или два морфолинометильных остатка находятся в соседнем положении с бензольным кольцом. Можно полагать, что подобные явления окажутся достаточно общими.

Показана высокая степень корреляции результатов определения антиоксидантной активности и противорадикальной активности методами потенциометрии, фотохемилюминесценции, фотоколориметрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления в липосомах, а также антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений в вине. Коэффициенты корреляции составляют 80 - 90%. Практическая значимость. Разработан способ интегральной оценки антиоксидантной активности ряда природных объектов со сложной матрицей с использованием метода потенциометрии.

Предложена экспрессная и простая в исполнении методика определения АОА чистых химических веществ, оценки АОА продуктов питания и лекарственных препаратов растительного происхождения. Установлены пределы определения АОА в водном растворе и мицеллярном растворе а-токоферол/вода.

Определена АОА ряда продуктов питания. Установлены количественные метрологические характеристики измерения АОА продуктов питания. Обсуждается возможность использования этого параметра как одного из показателей качества продуктов питания. На защиту выносятся:

1. Обоснование применения нового потенциометрического метода исследования АОА веществ с использованием медиаторной системы.

2. Результаты исследования взаимодействия природных и синтетических АО с медиаторной системой K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6].

3. Результаты корреляционных исследований антиоксидантных свойств предложенным методом и методами фотохемилюминесценции, фотоколориметрии с использованием стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и методом определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липосом, а также корреляции АОА и общего содержания фенолов в вине.

4. Результаты исследования АОА объектов со сложной переменной матрицей: продуктов питания растительного происхождения, препаратов лекарственного сырья.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2004», г. Уфа, 2004; на научно-практическом семинаре «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения», Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва, 2004; на Всероссийской научно-технической конференции-выставке

Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», г. Москва, 2004; на II Международной конференции «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья», г. Москва, 2004; на Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005», г. Екатеринбург, 2005; на 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005», г. Пущино, 2005.

выводы

1. Методом ЦВА показано наличие окислительно-восстановительных свойств ряда антиоксидантов природного и синтетического происхождения. Определены потенциалы пиков окисления исследованных соединений.

2. Дано термодинамическое обоснование применения потенциометрического метода с использованием медиаторной системы для определения антиоксидантных свойств различных объектов, сформулированы критерии выбора и подобрана соответствующая им медиаторная система.

3. Потенциометрическим методом исследована антиоксидантная активность ряда природных и синтетических антиоксидантов, определены числа эквивалентности и стехиометрические коэффициенты реакции взаимодействия AOred и Кз[Ре(СЫ)б].

4. Показана взаимосвязь антиоксидантной активности и строения молекулы синтетических антиоксидантов.

5. Показана высокая чувствительность нового потенциометрического метода: предел определения АОА в водном растворе и эмульсии масло/вода составили 3,5" 10"6и 4i0"6 моль экв. /дм3 (п=6, р=0,95).

6. Достоверность результатов, получаемых предлагаемым методом, доказана: а) хорошей корреляцией с данными, полученными известными методами. Коэффициенты корреляции составили: с методом Фолина-Чокальтеу - 0,99; с методом ПОЛ - 0,94; с методом фотохемилюминесценции - 0,87; с методом фотометрии с использованием ДФПГ - 0,99. б) Близкими к 100% результатами определения АОА, полученными методом «введено-найдено» на модельных растворах и объектах со сложной матрицей.

7. Исследована АОА объектов со сложной матрицей: продуктов питания, БАД, препаратов лекарственных трав. Обсуждается возможность использования параметра АОА как одной из характеристик качества продуктов растительного происхождения.

8. Определены метрологические характеристики методики потенциометрического определения антиоксидантной активности.

9. Разработан новый потенциометрический метод определения антиоксидантной активности, который отличается экспрессностью процедуры анализа, и позволяет проводить точную количественную оценку антиоксидантной активности объектов с сложной матрицей без использования токсичных и дорогостоящих вспомогательных материалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неблагоприятное воздействие факторов внешней среды, таких как избыточная инсоляция, ионизирующее излучение, воздействие ксенобиотиков, попадающих в организм с воздухом, водой, пищей, могут приводить к избыточному образованию свободных радикалов и возникновению окислительного стресса. Окислительный стресс, в свою очередь, вносит существенный вклад в развитие ряда заболеваний и старение организма человека. В настоящее время существует большое количество дифференциальных и интегральных способов оценки антиоксидантных свойств как организма в целом, отдельных составляющих антиоксидантной защиты, так и АОА химических веществ, продуктов питания и биодобавок. Большинство существующих методов объединяет ряд особенностей, ограничивающих возможность их использования рамками исследовательских лабораторий. В связи с этим поиск простого в исполнении и информативного метода определения интегральной антиоксидантной активности природных и синтетических объектов по-прежнему представляет большой интерес.

Электрохимические методы исследования АОС выгодно отличает быстрота процедуры анализа, относительно невысокая стоимость необходимого оборудования. Тем не менее, разработанные к настоящему моменту методы предполагают применение либо дорогостоящих биохимических реактивов, либо использование достаточно токсичных вспомогательных веществ (Hg). В настоящей работе для интегральной оценки антиоксидантной активности предложен новый потенциометрический метод с использованием медиаторной системы, которая отвечает ряду требований: термодинамическая возможность химической реакции реагента с основными антиоксид антами, обратимость электродной реакции медиаторной системы, быстрое установление равновесного потенциала, Нернстовская зависимость потенциала от изменения концентрации компонентов системы, достаточно большая скорость реакции с основными АО. Поиск медиаторной системы, соответствующей этим требованиям, привел к выбору системы K4[Fe(CN)6]/

K3[Fe(CN)6], стандартный потенциал которой относительно Н.В.Э. составляет 0,36 В. Исследованы реакции взаимодействия ряда природных и синтетических антиоксидантов с данной медиаторной системой. Определены стехиометрические коэффициенты этих реакций. Показано, что стехиометрические коэффициенты взаимодействия исследованных природных антиоксидантов с медиаторной системой соответствуют количеству ОН-групп при бензольном кольце, флавоновом ядре и ненасыщенном гетероцикле. Для синтетических АО показана взаимосвязь АОА со структурой молекулы вещества. Новый потенциометрический метод позволяет определять антиоксидантную активность с высокой чувствительностью: предел определения АОА в водном растворе - 3,5'10"6 моль экв./дм3, в мицеллярном

А Ч растворе - 4' 10' моль экв./дм . Подтверждена достоверность результатов определения АОА, полученных потенциометрическим методом: результаты определения АОА методом «введено-найдено» на модельных растворах и в образцах со сложной матрицей составили величины, близкие к 100%. Получены высокие коэффициенты корреляции результатов определения АОА потенциометрическим методом и широко используемыми методами фотоколориметрии с использованием ДФПГ, Фолина-Чокальтеу, фотохемилюминесценции и люминесценции ПОЛ. Реализована возможность определения АОА объектов со сложной матрицей: продуктов питания, Б АД, препаратов лекарственного сырья. Показана значимость антиоксидантной активности как одного из показателей качества продуктов питания. Оценены метрологические характеристики методики потенциометрического определения антиоксидантной активности продуктов питания, БАД, витаминов. Готовится ее метрологическая аттестация (Приложение 1). Разработанные методики внедрены в текущий учебный процесс и используются в НИРС (Приложение 2).

Представляется перспективным дальнейшее развитие метода для определения АОА биологических жидкостей.

1. Зенков Н.К. Окислительный стресс Текст. / Н.К. Зенков, В.З. Панкин, Е.Б. Меньшикова // М.: МАИК «НАУКА/ИНТЕРПЕРИОДИКА», 2001. - 343с.

2. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами Текст. / Д.Н. Метелица // М.: Наука, 1982. 255с.

3. Эккерт Р. Физиология животных Текст. / Р. Эккерт, Д. Рэнделл, Д. Огастин // М.: Мир, 1992. Т 2.- 343с.

4. Cheung К. Luminol-dependent chemiluminescence produced by neutrophils stimulated by immune complexes Text. / K. Cheung, A. Archibald, F. Robinson // Austr. J. Exp. Biol. And Med. Sci. 1984. V. 62. -P. 403-419.

5. Kolb H. Nitric oxide: A pathogenic factor in autoimmunity Text. / H. Kolb, V. Kolb-Bchoten // Immunol. Today. 1992. V 13. - P. 157-160.

6. Shi X. Flavoenzymes reduce vanadium (V) and molecular oxygen and generate hydroxyl radical Text. / X. Shi, N.S. Dalai // Arh. Biochem. and Biophys. 1991. -V. 289.-P. 355-361.

7. Вольский Н.Н. Влияние супероксидного радикала на пролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном Текст. / Н.Н. Вольский, Р.И. Кашлаков, В.А Козлов. // Цитология. 1988. Т. 30, №7. - С.898-902.

8. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen Text. / A. Wendel // Enzymes Tools and Targets. - Basel: Karger, 1988. - P. 161-167.

9. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода Текст. / И. Фридович // В кн.: Свободные радикалы в биологии. Под. ред. У. Прайора. М.: Мир. - 1979. - т.1. - с.270-314.

10. Halliwell В. The antioxidants of human exracellular fluids Text. / B. Halliwell, M. Vasil, M. Grootveld // Arch. Biochem. and Biophys. 1990. V. 280. -P. 1-8.

11. Yagi K. Female hormones act as natural antioxidants a survey of our research Text. / K. Yagi // Acta Biochimica Polonica.1997. - V.44. - P.701-709.

12. Reiter R.J. Reactive oxygen intermediates, molecular damage, and aging. Relation to melatonin Text. / R.J. Reiter, J.M. Guerrero, J.J. Garcia, D. Acuna-Castroviejo // Ann. N.Y.Sci. 1998. V. 854. - P. 410-424.

13. Меньшикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов Текст. / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т. 113, № 4. - С. 442-455.

14. Finch J.W. Mass spectrometric identification of modifications to human serum albumin treated with hydrogen peroxide Text. / J.W. Finch, R.K. Crouch, D.R. Knapp, K.L. Schey // Arch. Biochem. And Biophys. 1993. V. 305. - P. 595-599.

15. Radi R. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide Text. / R. Radi, J.S. Beckman, K.M. Bush, B.A. Freeman//J. Biol. Chem. 1991.-V. 166. P. 4244-4250.

16. Рогинский B.A. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность Текст. / B.A. Рогинский // М.: Наука, 1988. 247 с.

17. Hicks М. Identification of products from oxidation of uric acid induced by hydroxyl radicals Text. / M. Hicks, L.S. Wong, R.O. Day // Free Radical Res. Commun. 1993.-V. 18.-P. 337-351.

18. Арутюнян A.B. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма Текст. / А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, Н.Н. Зыбина // СПб.: МФК «Фолиант», 2000. 104 с.

19. Fried R. Enzimatic and non- enzymatic assay of superoxide dismutase Text. / R. Fried // Biocemie. 1975. V.57, № 5. - P. 657-660.

20. L'Able M.R. Automated assay of superoxide dismutase in blood Text. / M.R. L'Able, P.W. F. Fisher // Method Enzimology. 1990. V.186. - P. 232-237.

21. Костюк В. А. Простой и чувствительный метод определения супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина Текст. / В.А. Костюк, А.И. Потапович, Ж.В. Ковалева // Вопросы медицинской химии. 1990.-Т. 36,№2.-С. 88-91.

22. Каган В.Е. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов Текст. / В.Е. Каган, О.Н. Орлов, JI.A Прилипко // Биофизика. Т. 18. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1986. -136 с.

23. Fletcher B.L. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues Text. / B.L. Fletcher, C.J. Dillard, A.Y. Tappel // Analitical Biocemistry. 1973.-V.52.-P. 1-9.

24. Mueller S. Sensitive and nonenzimatic measurement of hydrogen peroxide in biological systems Text. / S. Mueller // Free Radical Biology & Medicine. 2000. -V.29, № 5. P. 410-415.

25. Преснова Г.В. Биосенсоры на основе иммобилизованной пероксидазы для определения пероксида водорода Текст. / Автореф. дис. канд. хим. наук:02.00.15- Защищена 19.06.2001; Москва, 2001.-23 с.

26. Rice-Evance С. Total antioxidant status in plasma and body fluids Text. / C. Rice-Evance, N.J. Miller // Methods of Enzymology. 1994. V. 234. - P.279-293.

27. Strain J.J. Measurement of antioxidant (reducing) power and/or antioxidant concentration Text. / J.J. Strain, I. Benzie // U.S. Patent US6177260, МПК7 GO IN 33/48.-2001.-7 p.

28. Da Cruz G. Use of bathocuproine for the evaluation of the antioxidant power in liquids and solutions Text. / G. Da Cruz // Patent PCT IT99/00289, WO 00 16093, МПК7 G01N 31/00. 2000. - 9 p.

29. Prior R.L. In vivo total antioxidant capacity comparison of different analytical methods // Free Radical Biology & Medicine. 1999. - v.27. - P. 1173-1181.

30. Gizelli A. Fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability Text. / A. Gizelli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. A Ferro-Luzzi // Free Radical Biology & Medicine. 1995. V.18, № 1. - P. 29-36.

31. Ghiselli A. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data Text. / A. Ghiselli, M. Serafini, F. Natella, C. Scaccini // Free Radical Biology& Medicine. 2000.-V. 29, № 11.-P. 1106-1114.

32. Формазюк В.Е. Способ определения антиокисительной активности веществ Текст. / В.Е. Формазюк, Т.Н. Горшкова, В.И. Сергиенко // Патент РФ RU2163021, МПК7 G01N 33/483. 10.02.2001. - 7 с.

33. Cheng Z. Determination of antioxidant activity of phenolic antioxidants in Fenton-type reaction system by chemiluminescence assay Text. / Z. Cheng, G. Yan, Y. Li, W. Chang // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2000. - V.28, № 6. -P. 860-870.

34. Chevion Sh. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity Text. / Sh. Chevion, M.A. Roberts, M. Chevion // Free Radical Biology & Medicine. 2000. V.28, № 6. - P. 860-870.

35. Kohen R. Quantification of the overall reactive oxygen species scavenging capacity of biological fluids and tissues Text. / R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gaty, O. Tirosh // Free Radical Biology & Medicine. 2000. V.28, № 6. -P. 871-879.

36. Chen J. Electrochemical studies on antioxidants in bovine milk Text. / J. Chen, L. Gorton, B. Akersson // Analitica Chimica Acta, 2002, № 474. P. 137-146.

37. Chen J. Antioxidant capacity of bovine milk as assayedby spectrofotometric methods Text. / J. Chen, H Lindmarc-Mansson, L. Gorton, B. Akersson // Internationale Diary Journal, 2003, V.13. P.927-935.

38. Campanella L. Determination of antioxidant properties of aromatic herbs, Olives and fresh fruit using an enzymatic sensor Text. / L. Campanella, A. Bonnani, G. Favero, M. Tomassetti // Analiticaland Bioanalitical Chemistry. 2003. V.375. -P. 1011-1016.

39. Ignatov S. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for the detection of antioxidants Text. / S. Ignatov, D. Shishniashvili, B. Ge, F.W. Scheller, F. Lisdat // Biosensor & Bioelectronics. 2002. V. 17. - P. 191-199.

40. Короткова Е.И. Новый вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов Текст. / Е.И. Короткова, Ю.А. Карбаинов, О.А. Аврамчик // VI Международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 1619 апреля 2002. Тез. докл. С. 298-299.

41. Korotkova E.I. Study of antioxidant properties by voltammetry. Short Communication Text. / E.I. Korotkova, Y.A. Karbainov, A.V. Shevchuk // J. of Electroanalytical Chemistry. 2002. V.518. - P. 56-60.

42. Абдуллин И.Ф. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом Текст. / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // Журнал аналитической химии. 2001. Т.56, № 6. -С. 627-629.

43. Абдуллин И.Ф. Определение ионола методами вольтамперометрии и кулонометрического титрования. Текст. / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Ю.В. Паршакова, Г.К. Будников, Э.Л. Гоголашвили // Журнал аналитической химии. 2002. Т.57, № 3. - С. 296-300.

44. Абдуллин И.Ф. Применение электрогенерированного брома для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе Текст. / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.Х.

45. Гайсина, Г.К. Будников // Журнал аналитической химии. 2002. Т.57, № 6. -С. 666-670.

46. Турова Е.Н. Применение электрохимических методов для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и пищевых продуктов Текст. / Автореф. дис. канд. хим. наук: 02.00.15 -Защищена 15.11.2001; Казань, 2001.-23 с.

47. Зиятдинова Г.К. Определение сывороточного альбумина в крови методом гальваностатической кулонометрии Текст. / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников,

48. B.И. Погорельцев // Журнал аналитической химии. 2004. Т.59, № 7.1. C. 742-744.

49. Lindqvist А-М. Method for detection of potential co-antioxidants Текст. / AM. Lindqvist, K. Petersson, R. Stocker, C. Westerlund, P. Witting // U.S. Patent US6031008, МПК7 AO IN 31/08. 2000. - 14 p.

50. Zhang M.H. Determination of total antioxidant capacity in green tea by near-infrared spectroscopy and multivariate calibration Text. / M.H. Zhang, J. Luypaert, J.A. Fernandes Pierna, Q.S. Xu, D.L. Massart // Talanta. 2004. V.62. - P. 25-35.

51. Morelle J. Method for measuring the antioxidant activity of food products and for producing extracts with quantified antioxidant activity Text. / J. Morelle // Patent PCT/FR98/01164, W098/57168, MnK6G01N 30/02, A61K 35/78. -1998. 7 p.

52. Porter W.L. Method for visually detecting antioxidants in an organic mixture Text. / W.L. Porter, R.E. Kramer // U.S. Patent US4257776, МПК3 G01N 31/06, G01N 31/08.- 1981.-4 p.

53. Qian Y. Antioxidant activity profile assay Text. / Y. Qian, R.E.A. Leitz, D.W. Krempin // U.S. Patent US6429021, MnK7G01N 30/90, GO IN 30/94. 2002. - 5 p.

54. Лозовская E.JI. Сравнительная эффективность некоторых медицинских препаратов как акцепторов супероксид-радикала Текст. / E.JI. Лозовская, И.И. Сапежинский//Биофизика. 1993. Т.38. - С. 31-36.

55. ГОСТ 19885-74 Чай. Методы определения содержания танина и кофеина Текст. // М.: Издательство стандартов, 1990. 7 с.

56. Сернов Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии Текст. / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура // М.: 2000. 352 с.

57. Вино и алкогольные напитки. Директивы и регламенты Европейского союза Текст. // М.: «ИПК Издательство стандартов», 2000. 606 с.

58. Рекомендации и номенклатурные правила ИЮПАК по химии Текст. / Сост. Б.Ф. Мясоедов, Ю.А. Золотов, В.М. Иванов, Е.К. Корчемная // М.: «Наука», 2004. 158 с.

59. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 Текст. / в 6 частях // М.: ИПК Издательство стандартов, 2002. 208 с.

60. Дёрфель К.Статистика в аналитической химии Текст. / К. Дёрфель // М.: «Мир», 1994.-268 с.

61. Janeiro P. Catechin electrochemical oxidation mechanisms Text. / P. Janeiro, Brett A.M.O. // Analytica Chimica Acta. 2004. V. 518. - P. 109-115.

62. Marcovic J.M.D. Antioxidative capabilities of some organic acids and their co-pigments with malvine. Part I Text. / J.M.D. Marcovic, L.M. Ignatovic, D.A. Marcovic, J.M. Baranac // Journal of Electroanalitical Chemistry. 2003. V.553. -P. 169-175.

63. Dias T.G. Voltammetric behavior and determination of tocopherols with partial least square calibration: analysis in vegetable oil samples Text. / T.G. Dias, I.D. Meras, A.G. Cabanillas, M.F.A. Franco // Analitica Chimica Acta. 2004. V.511. -P. 231-238.

64. Standard potentials in aqueous solution Text. / edited by AJ. Bard, R. Parsons, J. Jordan // New York.: Marcel Dekker INC, 1985. 834 p.

65. Слесарев В.И. Химия: Основы химии живого Текст. / В.И. Слесарев // Санкт-Петербург: Химиздат, 2001. 784 с.

66. Будников Г.К. Основы современного электрохимического анализа Текст. / Г.К. Будников, В.Н. Майстренко, М.Р. Вяселев // М.: Мир, 2003. 592с.

67. Тарасевич М.Р. Электрохимия углеродных материалов. Текст. / М.Р. Тарасевич // М.: Наука, 1984. С. 18-94.

68. Меньшикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов Текст. / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1993. Т. 113. - Вып. 4. - С. 442-455.

69. Барабой В. А. Биологическое действие растительных фенольных соединений Текст. / В.А. Барабой // Киев, 1976. 260 с.

70. Павлов Б.А. Курс органической химии Текст. / Б.А.Павлов, А.П.Терентьев // М-Л.: «Химия», 1965. 686 с.

71. Robards К. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits Text. / K. Robards, P.D. Prenzler, G. Tucer, P. Swatsitang, W. Glover // Food Chemistry. 1999. -V. 66. P. 401-436.

72. Ruperes F.J. Determination of a-tocopheryl acetate in diets of experimental animals. Study of stability in diets Text. / F.J. Ruperes, C. Barbaras, M. Castro, E. Herrera // Journal of Chromatography A. 1999. V. 839. - P. 93-99.

73. Плесков В.А. Электродные потенциалы в ацетонитриле Текст. / В.А. Плесков // Ж. физической химии. 1948. -т. XXII. -№ 3. С. 352-361.

74. Колотыркин Я.М. Электрохимия металлов в неводных растворах Текст. / Я.М. Колотыркин // М.: «Мир», 1974. 440 с.

75. Соломатин В.Т. Ферроцен в анализе сталей и сплавов Текст. / В.Т. Соломатин // М.: «Металлургия», 1980. 160 с.

76. Шляпинтох В.Я. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов Текст. / В.Я. Шляпинтох, О.Н. Карпухин, JI.M. Постников, И.В. Захаров, А.А. Витучинский // Москва.: «Наука», 1966. 300 с.

77. Malterud К.Е. C-metilated digidrohalkone from Myrica gale L: effect as antioxidant and as scavengers of l,l-diphenil-2-picrilhydrasil Text. / K.E. Malterud, O.H. Diep, R.B. Sund // Pharmacol. Toxicol. 1996. -V. 78, №2. -P. 111-116.

78. Blois H.S. Antioxidant determination by use of stable free radical Text. / H.S. Blois // Nature. 1958.-Nol81.-P. 119-120.

79. Glaving J. Antioxidants in animal tissue Text. / J. Glaving // Acta Chem. Scand. 1963.-V. 17, № 13.-P. 1635-1640.

80. Litescu S. Antioxidative power evaluation of some phenolic antioxidants -electoanalitical approach Text. / S. Litescu, G-L. Radu, M. Diaconu // Electroanalysis. 2001. -V. 13, № 8-9. P. 804-806.

81. Dufor C. Gallic esters of sucrose as efficient radical scavengers in lipid peroxidation Текст. / С. Dufor, E. Da Silva, P. Potier, Y. Queneau , O. Dangler // J. Agric. Food Chem. 2002. V.50. - P. 3425-3430.

82. Булатов М.И. Практическое руководство по фотоколориметрическим методам анализа Текст. / М.И. Булатов, И.П. Калинкин //М.: «Химия», 1968. -384 с.

83. Физико-химические методы анализа Текст. / под. ред. В.Б. Алесковского // Л.: «Химия», 1988. 374 с.

84. Tiwari А.К. Imbalance in antioxidant defense and human diseases: Multiple approach of natural antioxidant therapy Text. / A.K. Tiwari // Current science. 2001. V.81, № 9. - P. 1179-1187.

85. Garcia-Alonso M. Evaluation of the antioxidant properties of fruits Text. / M. Garcia-Alonso, S. de Pascual-Teresa, C. Santos-Buelga, J.C. Rivas-Gonzalo // Food Chemistry. 2004 V.84, №1. - P. 13-18.

86. Dekker M. Analysing the Antioxidant Activity of Food Products: Processing and Matrix Effects Text. / M. Dekker, R. Verkerk, A.A. Van Der Sluis, S. Khokhar, W.M.F. Jongen // Toxicology in vitro. 1999. V. 13. - P. 797-799.

87. Higdon J.V. Tea Catehins and Polyphenols: Health Effects, Metabolism, and Antioxidant Functions Text. / J.V. Higdon, B. Frey // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2003. V.43, №1. - P. 89-143.

88. Robards K. Analitical Chemistry of Fruit Bioflavaniods Text. / K. Robards, V. Antolovich // Analist. 1997. V. 122. - P. 11R-34R.

89. Справочник по товароведению продовольственных товаров Текст. / под ред. Родиной Т.Г.// М.: «КолосС», 2001. 608 с.

90. Minussi R.C. Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines Text. / R.C. Minussi, M. Rossi, L. Bologna, L. Cordi, D. Rotilio, G. M. Pastore, N. Duran // Food Chemistry. 2003. V. 82, No 3. - P. 409-416.

91. Sobiech R.M. Automated Voltammetric Determination of Reducing Compounds in Beer Text. / R.M. Sobiech, R. Neuman, D. Wabuer // Electoanalysis. 1998. -V.10, Nol4.-P. 969-975.

92. РМГ 61-2003 Рекомендации по межгосударственной стандартизации. ГСИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки Текст. // М.: ИПК Издательство стандартов, 2004. 42 с.