Применение оптико-спектральных методов в исследованиях компонентов сыворотки крови тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

ВЛАСОВА Ирина Михайловна

ПРИМЕНЕНИЕ ОПТИКО - СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ В ИССЛЕДОВАНИЯХ КОМПОНЕНТОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

01.04.05-оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2005

Работа выполнена на кафедре общей физики физического факультета Московского государственного университета им MB Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор A.M. Салецкий, физический факультет МГУ им. М В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор физико-математических наук, профессор В.З. Пащенко, биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова; доктор химических наук, профессор Г.В. Мельников, Саратовский Государственный Технический Университет

Институт химической физики им Н Н. Семенова Российской академии наук

Защита состоится

«//»« ашл

» 2005 г. в

«'/if»

заседании Специализированного совета Д 50100145 при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, г Москва, Ленинские горы, ГСП-2, НИИЯФ МГУ, 19 корпус, аудитория 2-15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЯФ МГУ Автореферат разослан « ^^ » « ¿^АЬ&ЫЛ » 2005 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001 45 доктор физико-математических наук

А.Н Васильев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Быстрое развитие оптико - спектральных методов в последние годы послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине. В настоящее время оптико - спектральные методы являются незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. Данная диссертационная работа посвящена применению оптических методов для исследования биологических объектов - компонентов сыворотки крови. Внедрение методов оптики и спектроскопии в исследовательские задачи биологических систем является одной из важнейших задач современной физики.

Корреляционная спектроскопия квазиупруго рассеянного света (метод динамического светорассеяния) занимает прочное место в качестве стандартного способа измерения размера рассеивающих частиц. Метод статического рэлеевского рассеяния света является удобным способом определения молекулярного веса биологических объектов. Комбинационное рассеяние (КР) света, обширно используемое для исследования функций и структуры биологических молекул, имеет большой потенциал для применения его в биологической и медицинской областях науки. Изучение вида спектров люминесценции, их интенсивности нашло широкое применение в медицинских и биологических исследованиях. По интенсивности люминесценции можно судить об электронно-энергетическом состоянии биологических макромолекул, клеток и тканей организма

Одним из объектов исследования в данной работе является сывороточный альбумин человека Сывороточный альбумин человека представляет собой глобулярный белок, выполняющий в плазме крови транспортные функции. Многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином. Поэтому его агрегация в большие белковые комплексы в присутствии солей тяжелых металлов может вызывать серьёзные

фармакокинетические последствия Следовательно, результаты исследования методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света размеров, формы молекул альбумина при агрегации этого бежа в зависимости от количества хлорида цезия (CsQ) представляют интерес не только с точки зрения развития оптико - спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем, но и с точки зрения биологических и медицинских проблем Особое внимание в работе посвящено выяснению аминокислотного механизма агрегации альбумина в присутствии соли тяжелого металла методом ^ - спектроскопии

Исследования денатурации сывороточного альбумина методами лазерной спектроскопии не только представляют интерес в прикладной биохимии белков, но и показывают широкие возможности применения оптических методов исследования в биологических системах Многие биологические и фармацевтические системы содержат белки и детергенты Проведённые исследования размеров и формы сывороточного альбумина в зависимости от концентрации денатурирующего агента (додецилсульфата натрия) при различных значениях pH буферных растворов важны с точки зрения прикладных биологических и медицинских проблем Денатурация белков приводит к потере их нативности, и современная фундаментальная биология уделяет огромное внимание нарушению нативной конформации белков, связывая с нею важнейшие свойства клеток В работе также изучен вопрос термической денатурации белков, который имеет ценность в связи с большим интересом в последнее время к вопросам термотерапии ряда онкологических заболеваний

Большое внимание в работе посвящено вопросу применения оптико -спектральных методов для исследования повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови, в частности, на липопротеины низкой плотности Полученные в работе результаты говорят о перспективности

использования оптико-спектральных методов (спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентной спектроскопии) для оценки ишемических повреждений В развитии многих патологических состояний, в частности, вследствие ишемического воздействия, в организме животных принимают непосредственное участие свободнорадикальные реакции активных форм кислорода Изучение свободнорадикальных окислительных повреждений компонентов крови при ишемии оптико - спектральными методами помогает вникнуть в механизм этих реакций и, следовательно, понять, как их можно контролировать По этой причине исследование влияния ишемии на сыворотку крови оптическими методами значимо не только в области теоретической биологии и физики, но и в медицине

Цель работы и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в исследовании компонентов сыворотки крови (сывороточного альбумина крови человека и цельной сыворотки крови животных) оптико -спектральными методами методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света (динамическое и статическое светорассеяние), методами спектроскопии комбинационного рассеяния света, методами люминесцентного анализа.

В частности, в задачи диссертационной работы входило

1 изучение агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия - определение структурных особенностей образующихся белковых агрегатов в зависимости от pH раствора и концентрации соли (с помощью лазерной корреляционной спектроскопии), анализ аминокислотного механизма комплексообразования молекул альбумина (методом ^ -спектроскопии)

2 исследование процессов денатурации (тепловой и в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия) сывороточного альбумина в зависимости

от pH растворов (с помощью метода спектроскопии квазиупруго рассеянного света)

3 изучение влияния ишемии головного мозга на физические (размер и форму) параметры (методом спектроскопии квазиупруго рассеянного света) и химическую структуру компонентов сыворотки крови (с помощью ^ -спектроскопии и люминесцентного анализа) Научная новизна.

1 Методом ^ - спектроскопии впервые исследован аминокислотный механизм агрегации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия

2 Впервые исследованы размер и форма агрегатов сывороточного альбумина человека, образующихся в [трисутствии соли тяжелого металла (хлорида цезия), в зависимости от pH раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии

3 Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии додецилсульфата натрия в зависимости от значения pH раствора и концентрации додецилсулъфата натрия (ДСН) методом динамического светорассеяния

4 Исследована тепловая денатурация сывороточного альбумина человека в зависимости от значения pH раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии

5 Методами спектроскопии рассеянного света впервые установлено изменение размеров и плотности липопротеинов низкой плотности сыворотки крови животных вследствие ишемии головного мозга

6 Подтверждена с помощью метода ^ - спектроскопии и люминесцентного анализа предложенная теория свободнорадикального повреждения липопротеинов низкой плотности сыворотки крови вследствие окислительного стресса после ишемии головного мозга

Научная и практическая значимость результатов.

Результаты исследований методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа повреждающего воздействия ишемии на сыворотку крови животных говорят о перспективности использования оптико -спектральных методов для оценки ишемических повреждений компонентов крови

Результаты исследования агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжелого металла представляют интерес не только с точки зрения биологических и медицинских проблем (многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином, и поэтому его агрегация в большие белковые комплексы может вызывать серьезные фармакокинетические последствия), но и с точки зрения развития оптико-спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем

Полученные результаты изучения денатурации сывороточного альбумина в зависимости от концентрации ДСН при различных значениях pH буферных растворов, а также результаты исследований тепловой денатурации альбумина интересны не только для специалистов в области биохимии, но и показывают широкие возможности применения оптических методов в биологических системах

Основные защищаемые положения.

1 Присутствие хлорида цезия (CsQ) вызывает агрегацию молекул сывороточного альбумина человека Размер образующихся белковых агрегатов возрастает прямо пропорционально концентрации соли Зависимость гидродинамического радиуса белковых комплексов от pH буферного раствора в пределах каждого значения концентрации CsQ имеет параболический вид с максимумом в изоэлектрической точке белка Наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки Добавление хлорида цезия

приводит к слипанию молекул альбумина в агрегаты практически сферической формы Определен аминокислотный механизм CsQ-индуцированной агрегации и выяснены агрегационные химические связи, возникающие между цепями аминокислот сывороточного альбумина

2 Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии ионного отрицательно заряженного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) в зависимости от значения pH раствора и концентрации детергента Большая денатурация белка в присутствии ДСН имеет место при значениях pH буферного раствора меньших изоэлектрической точки альбумина

3 Денатурация сывороточного альбумина человека под влиянием температуры зависит от pH раствора Для выбранных значений pH тепловая денатурация происходит сильнее при тех значениях pH буферного раствора белка, которые более близки к изоэлектрической точке данного белка

4 Размер липопротеинов низкой плотности (ЛГТНП) сыворотки животных после ишемии головного мозга больше размера ЛГТНП контрольной здоровой сыворотки Плотность ЛГТНГТ после ишемии меньше плотности контрольных здоровых ЛПНП Увеличение размеров ЛТТНП и уменьшение их плотности после ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛТТНП объясняется разрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛПНП под действием свободнорадикалъных продуктов, появляющихся вследствие ишемии

5 Интенсивность люминесценции сыворотки крови животных после ишемии сильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки крови после ишемии головного мозга однозначно отражает повышенную концентрацию свободнорадикальных липтидных соединений в фосфолипидном слое постишемических ЛПНП Добавление флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико-

химических свойств ЛПНП сыворотки крови животных до и после ишемической процедуры

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях

1 Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, Россия, 2004 г),

2 Ш Международная конференция молодых ученых и специалистов «Оптика-2003» (Санкт-Петербург, Россия, 2003 г),

3 Международная конференция «Advanced Laser Technologies-ALT04» (Рим, Фраскати, Италия, 2004 г),

4 XI Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем - Яльчик - 2004» (Ялъчик, Россия, 2004 г),

5 III Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики-2004» (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г)

Публикации по материалам диссертации опубликовано 10 печатных

работ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 184 страницах, содержит 42 рисунка 6 таблиц и список цитируемой литературы из 200 наименований

Во введении рассматривается актуальность поставленных задач и обсуждаются цели настоящей работы

Первая глава, состоящая из шести параграфов, посвящена обзору литературы, относящейся к исследованию биологических макромолекул с помощью оптических методов (динамического и статического светорассеяния, комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа)

Вторая глава посвящена методической части экспериментов представлены методики приготовления биологических образцов, описаны экспериментальные методы исследования

В гчавах с третьей по пятую представлены и обсуждены полученные экспериментальные результаты

В заключение отдельным пунктом вынесены основные результаты и выводы работы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследований, показана новизна и научно-практическая значимость результатов, изложены основные защищаемые положения диссертации

Глава /, состоящая из шести параграфов, посвящена описанию строения белковых молекул (§1 1 ), описанию состава плазмы (сыворотки) крови высших млекопитающих и функций основных ее компонентов (§12), обзору литературы, относящейся к исследованию биологических макромолекул с помощью оптических методов динамического (§13) и статического (§1 4) светорассеяния комбинационного рассеяния света (§15), люминесцентного анализа (§1 6)

Глава 2 посвящена методической части экспериментов представлены методики приготовления биологических образцов (растворы сывороточного альбумина человека, растворы сыворотки крови животных, описание ишемической процедуры) (§2 1 ), описаны экспериментальные методы исследования динамическое и статическое светорассеяние (§22), комбинационное рассеяние света (§2 3 ), люминесцентно-спектральный анализ (§2 4)

Гчава 3 посвящена исследованию агрегации молекул сывороточного

альбумина человека в присутствии соли тяжелого металла (хлорида цезия CsCI)методами лазерной спектроскопии

В параграфе §3 1 представлены результаты исследований методом

лазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света размера, формы

молекул сывороточного альбумина человека при его агрегации в присутствии

соли тяжелого металла в зависимости от pH буферных растворов белка и

концентрации соли (хлорид цезия CsG)

На основании полученных данных заключено, что белковые агрегаты,

образующиеся в присутствии хлорида цезия, имеют практически сферическую

форму В отсутствие CsCl в буферных растворах белковые молекулы не

взаимодействуют друг с другом и имеют форму эллипсоидов вращения

Получена зависимость

гидродинамического радиуса

белковых комплексов от

концентрации хлорида цезия

при различных значениях pH

буферного раствора (рис 1)

Видно, что гидродинамический

радиус рассеивающих свет

Рис 1 Зжкыиость гидролитического радиуо Р, агрегатов частиц возрастает прямо ■киицп отьбуштоткошкюрптСвОнрН^ффногорктора.

пропорционально концентрации хлорида цезия (С8С1), что свидетельствует о слипании молекул альбумина в белковые агрегаты Для каждой концентрации СвС1 гидродинамический радиус агрегатов максимален при рН 5,0 (вблизи изоэлектрической точки альбумина)

В параграфе §3 2 представлены результаты исследования аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина в присутствии СвС! методом спектроскопии комбинационного рассеяния света

Из сравнения полученных ^ - спектрограмм буферных растворов альбумина (до и после добавления CsQ) видно, что наибольшее количество агрегационных химических связей разных типов между аминокислотными остатками возникает при добавлении соли при значении pH 5,0 буферного раствора, т е при наиболее близком к изоэлектрической точке альбумина значении pH раствора При pH 5,0 происходит разрыв наибольшего количества химических связей между аминокислотными радикалами по сравнению с другими неизоэлектрическими значениями pH Наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки, т е при pH 5,0

Глава 4 посвящена исследованию ДСН - вызванной и тепловой

денатурации_сывороточного_альбумина_человека_методом

корреляционной спектроскопии рассеянного света

В параграфе §4 1 представлены результаты исследований (проведенных с

помощью метода лазерной корреляционной спектроскопии квазиупруго рассеянного света) размера, формы молекул сывороточного альбумина

крови человека при

денатурации под воздействием денатурирующего агента ДСН (додецилсульфата натрия) при различных значениях pH растворов Зависимость

гидродинамического радиуса молекул альбумина от концентрации ДСН и величины pH буферного раствора представлена на рис 2

Из рис 2 видно, что происходит увеличение размера белка (т е его денатурация) при увеличении концентрации ДСН до значения 7 мМ, после

которого, несмотря на дальнейшее добавление ДСН, размер белка остается неизменной величиной Те при достижении данной (7мМ) концентрации детергента происходит насыщение «посадочных» для мицелл детергента мест на белке Как следует из рис 2, ДСН, как отрицательно заряженный детергент, лучше связывается с белком при значениях pH буферного раствора, меньших величины изоэлектрической точки альбумина (р1 4,7), то есть в той области pH, в которой белок заряжен положительно Следовательно, большая денатурация белка в присутствии ДСН имеет место при значениях pH раствора, меньших изоэлектрической точки альбумина

В параграфе §4 2 методом лазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света изучена тепловая денатурация сывороточного альбумина человека при различных значениях pH раствора

Показано, что до температуры, равной 45°С, гидродинамический радиус молекул альбумина практически не меняется Увеличение размера белковых молекул начинается при температуре свыше 45°С (в области температур 45°С-48°С происходит денатурация белка) Показано, что денатурация молекул альбумина происходит сильнее при pH, лежащих ближе к изоэлектрической точке этого белка ^ 4,7) Чем больше значение pH раствора удалено от изоэлектрической точки, «ем денатурация белка происходит слабее

Глава 5 посвящена исследованию повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови животных оптико - спектральными методами

В параграфе §5 1 представлены результаты исследований с помощью метода лазерной корреляционной спектроскопии квазиупруго рассеянного света размеров, формы компонентов сыворотки крови животных и влияния на них ишемического воздействия При исследовании влияния ишемии головного мозга на сыворотку крови крыс были обнаружены изменения в зоне, соответствующей по диаметру липопротеинам низкой плотности (ЛПНП)

С помощью метода динамического рассеяния света зарегистрировано, что размер ЛПНП сыворотки животных после ишемии головного мозга больше размера ЛПНП здоровой сыворотки примерно на 20-30% для различных значений pH буферного раствора разведения сыворотки

Согласно литературным данным, здоровые ЛПНП представляют собой сферические частицы Для определения формы ЛПНП ишемической сыворотки при разных значениях pH были получены зависимости диффузного уширения Г от квадрата синуса половины угла рассеяния Диффузное

уширение спектра рассеянного света для ЛПНП ишемической сыворотки линейно зависит от квадрата синуса половины угла рассеяния, следовательно, несмотря на увеличение радиуса ЛПНП вследствие ишемии их форма остается сферической

В параграфе §5 2 представлены исследования (методом статического рэлеевского рассеяния света) по определению молекулярной массы и плотности ЛПНП Была получена масса ЛПНП, равная 2,5 млнДа при всех значениях pH, одинаковая для обеих групп (до и после ишемии) животных Были рассчитаны значения плотности контрольных ЛПНП и ЛПНП сыворотки после ишемии при различных значениях pH При увеличении размеров ЛПНП ишемической сыворотки относительно размеров ЛПНП здоровой сыворотки происходит уменьшение плотности ишемических ЛПНП по сравнению с плотностью здоровых ЛПНП в 1,75-2,30 раз

Зарегистрированные изменения ЛПНП, произошедшие вследствие ишемии головного мозга, объясняются в рамках свободнорадикальной теории окислительного стресса разрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛПНП под действием свободнорадикальных продуктов, появившихся вследствие ишемии

В параграфе §5 3 представлено исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови методом спектроскопии

комбинационного рассеяния света, те за счет определения изменения молекулярной структуры ЛПНП

После ишемической процедуры пропадают пики рамановского смещения, отвечающие за двойные связи (СИГ) в ненасыщенных жирных кислотах, входящих в состав фосфолипидов ЛПНП На спектрограммах ишемической сыворотки появляются пики, соответствующие окислению жирных кислот в фосфолипидах ЛПНП по ненасыщенным двойным связям В спектрограммах ишемической сыворотки появляются пики, соответствующие образованию липоперекисных продуктов, пероксикислот и пероксиэфиров вследствие окисления жирных кислот в фосфолипидах ЛПНП

Основным субстратом свободнорадикального окисления в ЛПНП служат, как видно из спектрограмм комбинационного рассеяния, полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидного слоя Свободнорадикалъное окисление ЛПНП приводит к изменению их химического состава, что характеризуется снижением в них содержания свободных жирных кислот (ЬЫ) и значительным повышением содержания продуктов окисления (липоперекисей ЬООЫ. диалкилперекисей ЬОО1 , пероксикислот I СОООН, пероксиэфиров ЬСОООЬ) Таким образом, методом комбинационного рассеяния света получено подтверждение высказанной в работе гипотезы, объясняющей изменения ЛПНП после ишемии в рамках свободнорадикальной окислительной теории

В параграфе §5 4 представлено исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови методами люминесцентного анализа Продукты свободнорадикалъных реакций, образующиеся при ишемическом повреждении сыворотки крови, обладают способностью к фотолюминесценции Как видно из рис 3, после ишемической процедуры интенсивность люминесценции сыворотки крови возрастает (в 5,3 раза) по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови В

норме в здоровой сыворотке крови концентрация свободных радикалов очень

мала, поэтому мала и интенсивность люминесценции (рис.3). Увеличение

люминесценции после ишемии обусловлено наличием неспаренных электронов в свободнорадикальных соединениях ишемической сыворотки, и, соответственно, большей вероятностью возбуждения молекул этих соединений при облучении светом. Таким образом, с помощью методов ;поминесцентно -спектрального анализа подтверждается предложенная гипотеза об

определяющей роли

свободнорадикального окисления в повреждениях ЛПНП при ишемии.

Липоперекисное свободнорадикальное окисление фосфолипидов амфипатического слоя ЛПНП после ишемической процедуры подтверждено в данной работе также при помощи использования флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) Зарегистрировано, что интенсивность люминесценции родамина при добавлении его в ишемическую сыворотку больше аналогичной интенсивности родамина, добавленного в здоровую сыворотку (примерно в 1,5 раза) Данное увеличение интенсивности связано с тем, что родамин 6Ж выступает в данной системе как флуоресцентный зонд, принимающий на себя энергию с возбужденных липидных свободнорадикальных соединений в составе фосфолипидного слоя ЛПНП, появляющихся по причине ишемического окислительного повреждения фосфолипидного слоя ЛПНП.

При исследовании люминесценции нильского синего, добавленного в образцы сыворотки крови, показано, что интенсивность люминесценции нильского синего при добавлении его в ишемическую сыворотку больше

аналогичной интенсивности нильского синего, добавленного в здоровую сыворотку крови (примерно на 30 %) Данное увеличение интенсивности люминесценции нильского синего объясняется тем. что нильский синий проникает в фосфолипидный слой ЛПНП, который после ишемии становится разрыхлённым, и связывается с ненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов ЛПНП После ишемии в составе фосфолипидов ЛПНП присутствуют липидные свободнорадикальные соединения, которые при возбуждении их светом, передают свою энергию возбуждения на связавшиеся с ними молекулы нильского синего

В заключительной части диссертации отдельным пунктом вынесены основные результаты и выводы работы

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 Методом динамического светорассеяния показано что присутствие соли тяжелого металла (хлорида цезия ОзСТ) вызывает агрегацию молекул сывороточного альбумина человека При этом размер образующихся белковых агрегатов возрастает прямо пропорционально концентрации этой соли Зависимость гидродинамического радиуса образующихся белковых комплексов от pH буферного раствора в пределах каждого значения концентрации С«С1 имеет параболический вид с максимумом в изоэлектрической точке белка Показано, что наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки Установлено, что добавление хлорида цезия приводит к слипанию молекул альбумина в агрегаты практически сферической формы

2 Методом комбинационного рассеяния света получено свидетельство агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжёлого металла (050), зарегистрировано, что наибольшая агрегация сывороточного альбумина человека имеет место вблизи его изоэлектрической точки (т е при рН 5,0), а при удалении от изоэлектрической точки (как в сторону возрастания

значения pH, так и в сторону убывания pH) степень агрегации молекул альбумина уменьшается Объяснен аминокислотный механизм CsQ-индуцированной агрегации и выяснены агрегационные химические связи, возникающие между цепями аминокислот сывороточного альбумина

3 Методом динамического рассеяния света показано, что присутствие мицелл ионного отрицательно заряженного детергента ДСН приводит к денатурации молекул альбумина, при этом в работе определена величина денатурации белковых молекул в зависимости от значения pH раствора и концентрации детергента Определена концентрация насыщения сывороточного альбумина человека детергентом (7 мМ ДСН) Зарегистрировано, что большая денатурация белка в присутствии ДСН имеет место при значениях pH буферного раствора, меньших изоэлектрической точки альбумина, что объясняется электростагическими причинами

4 Методом динамического светорассеяния исследована денатурация сывороточного альбумина человека под влиянием температуры в зависимости от pH раствора Установлено, что тепловая денатурация сывороточного альбумина зависит от pH раствора Показано, что для рассмотренных в работе значений pH тепловая денатурация происходит сильнее при значениях pH буферного раствора белка, близких к изоэлектрической точке данного белка

5 Методами лазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света зарегистрированы отличия в сыворотке крови животных, перенёсших ишемию головного мозга, по сравнению с сывороткой контрольной группы здоровых животных размер ЛПНП сыворотки животных после ишемии больше размера ЛПНП здоровой сыворотки, плотность ишемических ЛПНП значительно меньше плотности здоровых ЛПНП

6 Методом комбинационного рассеяния света получено подтверждение выдвинутой теории, объясняющей увеличение размеров ЛПНП и уменьшение их плотности после ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛПНП

разрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛПНП под действием свободнорадикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии 7 С помощью применения люминесцентно - спектрального анализа подтверждена предложенная теория об определяющей рож свободнорадикального окисления в повреждениях ЛПНП при ишемии Показано, что интенсивность люминесценции сыворотки после ишемии сильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки крови после ишемии однозначно отражает повышенную концентрацию свободнорадикальных липидных соединений в фосфолипидном слое ишемических ЛПНП Добавление флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико-химических свойств ЛПНП сыворотки крови животных до и после ишемической процедуры

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Баранов А Н, Власова И М , Салецкий А М Исследование процессов агрегации сывороточного альбумина ЖПС, 2004, т 71, № 2, с 204-207

2 Власова И М, Потапов А В Применение методов корреляционной спектроскопии для определения размеров и формы молекул сывороточного альбумина В сборнике трудов III Международной конференции молодых ученых и специалистов "0птика-2003", Санкт-Петербург СпбГУ ИТМО, 2003, с 292-293

3 Vlasova IМ, Miknn V Е, Saletsky A M Investigation of CsCl-induced aggregation of serum albumin depending on pH by Raman spectroscopy method Laser Physics Letters, 2005, v 2, № 4, p 204-207

4 Баранов А Н, Власова И М, Микрин В Е, Салецкий А М Лазерная корреляционная спектроскопия процессов денатурации сывороточного альбумина ЖПС,2004, г 71, №6, с 831-835

5 Власова И М, Микрин В Е , Салецкий А М Применение методов лазерной спектроскопии динамического светорассеяния при исследовании денатурации сывороточного альбумина плазмы крови человека В сборнике трудов Третьего межд оптического конгресса «Оптика-ХХТвек», Третьей межд конференции «Фундаментальные проблемы оптики-2004», Санкт-Петербург СпбГУ ИТМО, 2004, с 291-292

6 Vlasova 1М, Dolmatova Е V, Koshelev V В, Saletsky A M Investigation of ischemia damaging action on blood serum structure by laser spectroscopy methods Laser Physics Letters, 2004, v 1, № 8, p 417-420

7 Власова И М, Микрин В Е Регистрация повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови методами спектроскопии динамического и статического светорассеяния В сборнике тезисов межд конференции «Ломоносов-2004», секция «Физика», МГУ, физ ф-т, 2004, с 209

8 Власова И М, Салецкий А М Регистрация ишемических изменений сыворотки крови методами лазерной спектроскопии В сборнике тезисов докладов и сообщений на XI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем-Ялъчик-2004», Москва-Йошкар-Ола-Уфа-Казань, 2004, с 64

9 Saletsky А М, Vlasova IM Application of laser spectroscopy methods for investigation of ischemia damaging action on blood serum ALT04 Conference "Advanced Laser Technologies", Scientific programme, Rome and Frascati, 2004, p 106

10 Baranov A N, Vlasova IM, Saletsky A M Investigation of ischemia damaging action on blood serum by Raman spectroscopy method Laser Physics Letters 2004, v 1, № 11,p 555-559

ООП Физ ф-та МГУ Заказ 50-100-05

О {.0i

ÍC2

Введение.

Глава 1. Оптические методы исследования биомакромолекул (литературный обзор)

§1.1. Строение белковых молекул и их свойства.

§1.2. Состав плазмы крови и функции основных компонентов плазмы крови высших млекопитающих.

§1.3. Динамическое рассеяние света. Исследование биологических объектов (определение размеров и формы рассеивающих свет частиц) с помощью лазерной корреляционной спектроскопии.

§1.4. Применение статического рэлеевского рассеяния света в растворах для определения массы биомакромолекул.

§1.5. Исследование физико-химических свойств биологических объектов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света.

§1.6. Применение электронной УФ спектроскопии (спектры люминесценции) для исследования свойств биологических систем.

Глава 2. Методическая часть эксперимента

§2.1. Приготовление объектов исследования (растворы белков, растворы сыворотки крови, ишемическая процедура)

§2.1.1. Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования белковой агрегации в присутствии соли тяжёлого металла (СвС1).

§2.1.2. Приготовление растворов сывороточного альбумина человека для исследования ДСН - вызванной денатурации и тепловой денатурации белка.

§2.1.3. Приготовление сыворотки крови животных дня исследования ишемического воздействия на её компоненты.

§2.2. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследования динамического и статического рассеяния света.

§2.3. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследования комбинационного рассеяния света.

§2.4. Экспериментальная установка и методика эксперимента для исследований сыворотки крови люминесцентно — спектральным анализом.

Глава 3. Исследование агрегации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжёлого металла (хлорида цезия СбС1) методами лазерной спектроскопии

§3.1. Лазерная корреляционная спектроскопия процессов агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (СбО).

§3.2. Исследование аминокислотного механизма агрегации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии соли тяжёлого металла (СбС1) методом спектроскопии комбинационного рассеяния света.

Глава 4. Корреляционная спектроскопия рассеянного света ДСН - вызванной и тепловой денатурации сывороточного альбумина человека

§4.1. Исследование денатурации сывороточного альбумина плазмы крови человека в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) методом динамического рассеяния света.

§4.2. Изучение тепловой денатурации сывороточного альбумина при различных значениях рН буферных растворов методом динамического рассеяния света.

Глава 5. Исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови оптико - спектральными методами

§5.1. Определение размеров компонентов сыворотки крови липопротеинов низкой плотности) методом корреляционной спектроскопии рассеянного света для оценки повреждающего действия ишемии.

§5.2. Определение молекулярной массы и плотности липопротеинов низкой плотности здоровой и ишемической сыворотки крови методом статического рэлеевского рассеяния света.

§5.3. Исследование повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови методом спектроскопии комбинационного рассеяния света.

§5.4. Изучение повреждающего воздействия ишемии на сыворотку крови животных с помощью люминесцентного анализа.

Быстрое развитие оптико — спектральных методов в последние годы послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине. В настоящее время оптико -спектральные методы являются незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. Данная диссертационная работа посвящена применению оптических методов для исследования биологических объектов - компонентов сыворотки крови.

Корреляционная спектроскопия квазиупруго рассеянного света (метод динамического светорассеяния) занимает прочное место в качестве стандартного способа измерения размера рассеивающих частиц. Этот метод характеризуется высокой точностью и не возмущающим исследуемую систему способом измерений. Метод статического рэлеевского рассеяния света является удобным способом определения молекулярного веса биологических объектов, охватывая исключительно широкий интервал молекулярных масс. Светорассеяние, как метод, не вторгается в состав биологических систем, поэтому спектроскопия рассеянного света получила широкое распространение в медицинских, биохимических и биофизических исследованиях [1,2].

Комбинационное рассеяние (КР) света, обширно используемое для исследования функций и структуры биологических молекул, имеет большой потенциал для применения его в биологической и медицинской областях науки. Развитие комбинационной спектроскопии ближней инфракрасной области с фурье-преобразованием расширило возможности применения данного метода в биомедицинских целях. Методы КР - спектроскопии позволяют получать уникальную информацию о структуре различных химических связей в биологических макромолекулах.

Изучение вида спектров люминесценции, их интенсивности нашло широкое применение в медицинских и биологических исследованиях. По интенсивности люминесценции можно судить об электронно-энергетическом состоянии биологических макромолекул, клеток и тканей организма

Одним из объектов исследования в данной работе является сывороточный альбумин человека. Сывороточный альбумин человека представляет собой глобулярный белок, выполняющий в плазме крови транспортные функции. Многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином. Поэтому его агрегация в большие белковые комплексы в присутствии солей тяжелых металлов может вызывать серьёзные фармакокинетические последствия. Следовательно, результаты исследования методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света размеров, формы молекул альбумина при агрегации этого белка в зависимости от количества хлорида цезия (СбС1) представляют интерес не только с точки зрения развития оптико — спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем, но и с точки зрения биологических и медицинских проблем. Особое внимание в работе посвящено выяснению аминокислотного механизма агрегации альбумина в присутствии соли тяжелого металла методом КР - спектроскопии.

Исследование денатурации сывороточного альбумина представляет интерес в прикладной биохимии белков. Многие биологические и фармацевтические системы содержат белки и детергенты. Проведённые исследования размеров и формы сывороточного альбумина в зависимости от концентрации денатурирующего агента (додецилсульфата натрия) при различных значениях рН буферных растворов важны с точки зрения прикладных биологических и медицинских проблем. Денатурация белков приводит к потере их нативности, и современная фундаментальная биология уделяет огромное внимание нарушению нативной конформации белков, связывая с нею важнейшие свойства клеток. В работе также изучен вопрос термической денатурации белков, который имеет ценность в связи с большим интересом в последнее время к вопросам термотерапии ряда онкологических заболеваний.

Большое внимание в работе посвящено вопросу применения оптико -спектральных методов для исследования повреждающего действия ишемии на компоненты сыворотки крови, в частности, на липопротеины низкой плотности. Полученные в работе результаты говорят о перспективности использования оптико-спектральных методов (спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентной спектроскопии) для оценки ишемических повреждений. В развитии многих патологических состояний, в частности, вследствие ишемического воздействия, в организме животных принимают непосредственное участие свободнорадикальные реакции активных форм кислорода Изучение свободнорадикальных окислительных повреждений компонентов крови при ишемии оптико — спектральными методами помогает вникнуть в механизм этих реакций и, следовательно, понять, как их можно контролировать. По этой причине исследование влияния ишемии на сыворотку крови оптическими методами значимо не только в области теоретической биологии и физики, но и в медицине.

Цель и задачи диссертационной работы

Цель диссертационной работы состояла в исследовании компонентов сыворотки крови (сывороточного альбумина крови человека и цельной сыворотки крови животных) оптико — спектральными методами: методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света (динамическое и статическое светорассеяние), методами спектроскопии комбинационного рассеяния света, методами люминесцентного анализа В частности, в задачи диссертационной работы входило: 1. изучение агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия - определение структурных особенностей образующихся белковых агрегатов в зависимости от рН раствора и концентрации соли (с помощью лазерной корреляционной спектроскопии), анализ аминокислотного механизма комплексообразования молекул альбумина (методом КР - спектроскопии).

2. исследование процессов денатурации (тепловой и в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия) сывороточного альбумина в зависимости от рН растворов (с помощью метода спектроскопии квазиупруго рассеянного света).

3. изучение влияния ишемии головного мозга на физические (размер и форму) параметры (методом спектроскопии квазиупруго рассеянного света) и химическую структуру компонентов сыворотки крови (с помощью КР -спектроскопии и люминесцентного анализа).

Научная новизна работы

1. Методом КР - спектроскопии впервые исследован аминокислотный механизм агрегации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии хлорида цезия.

2. Исследованы размер и форма агрегатов сывороточного альбумина человека, образующихся в присутствии соли тяжелого металла (хлорида цезия), в зависимости от рН раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии.

3. Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии додецилсульфата натрия в зависимости от значения рН раствора и концентрации додецилсульфата натрия (ДСН) методом динамического светорассеяния.

4. Исследована тепловая денатурация сывороточного альбумина человека в зависимости от значения рН раствора методом лазерной корреляционной спектроскопии.

5. Методами спектроскопии рассеянного света впервые установлено изменение размеров и плотности липогтротеинов низкой плотности сыворотки крови животных вследствие ишемии головного мозга.

6. Подтверждена с помощью метода КР - спектроскопии и люминесцентного анализа предложенная теория свободнорадикального повреждения липопротеинов низкой плотности сыворотки крови вследствие окислительного стресса после ишемии головного мозга.

Научная н практическая значимость результатов

Результаты исследований методами лазерной спектроскопии квазиупруго рассеянного света, спектроскопии комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа повреждающего воздействия ишемии на сыворотку крови животных говорят о перспективности использования оптико - спектральных методов для оценки ишемических повреждений компонентов крови.

Результаты исследования агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжелого металла представляют интерес не только с точки зрения биологических и медицинских проблем (многие лекарственные препараты в кровеносном русле связываются с альбумином, и поэтому его агрегация в большие белковые комплексы может вызывать серьёзные фармакокинетические последствия), но и с точки зрения развития оптико-спектральных методов изучения сложных макромолекулярных систем.

Полученные результаты изучения денатурации сывороточного альбумина в зависимости от концентрации ДСН при различных значениях рН буферных растворов, а также результаты исследований тепловой денатурации альбумина интересны не только для специалистов в области биохимии, но и показывают широкие возможности применения оптических методов в биологических системах.

Основные защищаемые положения

1. Присутствие хлорида цезия (СбО) вызывает агрегацию молекул сывороточного альбумина человека. Размер образующихся белковых агрегатов возрастает прямо пропорционально концентрации соли. Зависимость гидродинамического радиуса белковых комплексов от рН буферного раствора в пределах каждого значения концентрации СэО имеет параболический вид с максимумом в изоэлектрической точке белка. Наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки. Добавление хлорида цезия приводит к слипанию молекул альбумина в агрегаты практически сферической формы. Определен аминокислотный механизм С$С1-индуцированной агрегации и выяснены агрегационные химические связи, возникающие между цепями аминокислот сывороточного альбумина.

2. Определена величина денатурации молекул сывороточного альбумина человека в присутствии ионного отрицательно заряженного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) в зависимости от значения рН раствора и концентрации детергента. Большая денатурация белка в присутствии ДСН имеет место при значениях рН буферного раствора, меньших изоэлектрической точки альбумина.

3. Денат>грация сывороточного альбумина человека под влиянием температуры зависит от рН раствора. Для выбранных в работе значений рН тепловая денатурация происходит сильнее при тех значениях рН буферного раствора белка, которые более близки к изоэлектрической точке данного белка.

4. Размер липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) сыворотки животных после ишемии головного мозга больше размера ЛПНП контрольной здоровой сыворотки. Плотность ЛПНП после ишемии меньше плотности контрольных здоровых ЛПНП. Увеличение размеров ЛПНП и уменьшение их плотности после ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛПНП объясняется разрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛГТНП под действием свободнорадикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии. 5. Интенсивность люминесценции сыворотки крови животных после ишемии сильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови. Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки крови после ишемии головного мозга однозначно отражает повышенную концентрацию свободнорадикальных липидных соединений в фосфолипидном слое постишемических ЛИНИ. Добавление флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико-химических свойств ЛИНИ сыворотки крови животных до и после ишемической процедуры.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 184 страницах, содержит 42 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из 200 наименований.

Основные результаты и выводы

1. Методом динамического светорассеяния показано, что присутствие соли тяжелого металла (хлорида цезия СбС1) вызывает агрегацию молекул сывороточного альбумина человека. При этом размер образующихся белковых агрегатов возрастает прямо пропорционально концентрации этой соли. Зависимость гидродинамического радиуса образующихся белковых комплексов от рН буферного раствора в пределах каждого значения концентрации СбС1 имеет параболический вид с максимумом в изоэлектрической точке белка. Показано, что наибольшая агрегация альбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки. Установлено, что добавление хлорида цезия приводит к слипанию молекул альбумина в агрегаты практически сферической формы.

2. Методом комбинационного рассеяния света получено свидетельство агрегации сывороточного альбумина человека в присутствии соли тяжёлого металла (СбО), зарегистрировано, что наибольшая агрегация сывороточного альбумина человека имеет место вблизи его изоэлектрической точки (т.е. при рН 5,0), а при удалении от изоэлектрической точки (как в сторону возрастания значения рН, так и в сторону убывания рН) степень агрегации молекул альбумина уменьшается. Объяснен аминокислотный механизм СбС1-индуцированной агрегации и выяснены агрегационные химические связи, возникающие между цепями аминокислот сывороточного альбумина.

3. Методом динамического рассеяния света показано, что присутствие мицелл ионного отрицательно заряженного детергента ДСН приводит к денатурации молекул альбумина, при этом в работе определена величина денатурации белковых молекул в зависимости от значения рН раствора и концентрации детергента. Определена концентрация насыщения сывороточного альбумина человека детергентом (7 мМ ДСН). Зарегистрировано, что большая денатурация белка в присутствии ДСН имеет место при значениях рН буферного раствора, меньших изоэлектрической точки альбумина, что объясняется электростатическими причинами.

4. Методом динамического светорассеяния исследована денатурация сывороточного альбумина человека под влиянием температуры в зависимости от рН раствора. Установлено, что тепловая денатурация сывороточного альбумина зависит от рН раствора. Показано, что для рассмотренных в работе значений рН тепловая денатурация происходит сильнее при значениях рН буферного раствора белка, близких к изоэлектрической точке данного белка.

5. Методами лазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света зарегистрированы отличия в сыворотке крови животных, перенёсших ишемию головного мозга, по сравнению с сывороткой контрольной группы здоровых животных: размер ЛПНП сыворотки животных после ишемии больше размера ЛПНП здоровой сыворотки; плотность ишемических ЛПНП значительно меньше плотности здоровых ЛПНП.

6. Методом комбинационного рассеяния света получено подтверждение выдвинутой теории, объясняющей увеличение размеров ЛПНП и уменьшение их плотности после ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛПНП разрыхлением фосфолипидного амфипэтического слоя ЛПНП под действием свободнорадикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии.

7. С помощью применения люминесцентно - спектрального анализа подтверждена предложенная теория об определяющей роли свободнорадикального окисления в повреждениях ЛПНП при ишемии. Показано, что интенсивность люминесценции сыворотки после ишемии сильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровой сыворотки крови. Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки крови после ишемии однозначно отражает повышенную концентрацию свободнорадикальных липидных соединений в фосфолипидном слое ишемических ЛИНИ. Добавление флуоресцентных зондов (родамина 6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико-химических свойств ЛПНП сыворотки крови животных до и после ишемической процедуры.

В заключении хочу выразить благодарность моему научному руководителю доктору физико-математических наук профессору Александру Михайловичу Салецкому за предоставление интересной темы диссертации, за внимание и заботу, без которых написание этой диссертации было бы не возможно.

Также хочу выразить свою благодарность за ценные рекомендации при обсуждении работы и всестороннюю помощь сотрудникам и аспирантам лаборатории молекулярной спектроскопии и люминесценции, особенно, Баранову А.Н., Бобровской Е.А., Домниной H.A., Акимову А.И., Потапову A.B., Гордеевой Ю.А., Крашенинникову В.В., Буравцовой В.Е.

1. Лебедев А.Д., Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин В.А. Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии. Киев: Наукова Думка, 1987, 253 с.

2. Приезжев АВ., Тучин В.В., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989,240 с.

3. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974, 957 с.

4. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М: Агар, 1999, 512 с.

5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека в 2-х томах. М.: Мир, 1993, т. 2,415 с.

6. Физиология человека в 3-х томах. Под редакцией Шмидта Р., Тевса Г. М: Мир, 1996, 879 с.

7. Физиология человека в 2-х томах. Под редакцией Покровского В.М., Коротько Г.Ф. М.: Медицина, 2001, т.1,448 с.

8. Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов. Под редакцией Камминса Г., Пайка Э. М.: Мир, 1978, 584 с.

9. Бендат Дж., Пирсол А, Применение корреляционного спектрального анализа М.: Мир, 1983, 312 с.

10. Dahneke B.E., Hutchins D.K. Characterization of particles by modulated dynamic light scattering. I. Theoiy. Jour. Chem. Phys., 1994, v. 100, № 11, p. 7890-7902.

11. Hutchins D.K., Dahneke B.E. Characterization of particles by modulated dynamic light scattering. II. Experiment. Jour. Chem. Phys., 1994, v. 100, № 11, p. 7903-7915.

12. Stepanek P. Static and dynamic properties of multiple light scattering. Jour. Chem. Phys., 1993, v. 99, № 9, p. 6384-6393.

13. Meyer W.V., Cannel D.S., Smart A.E., Taylor T.W., Tin P. Multiple-scattering suppression by cross correlation. Applied Optics, 1997, v. 36, № 30, p. 7551-7558.

14. Bailey A.E., Cannel D.S. Practical method for calculation of multiple light scattering. Phys. Rew. E, 1994, v. 50, № 6, p. 4853-4864.

15. Jany G., Steimer E., Damaschini V., Epifanie M., Jurczak M., Kaiser R Coherence and polarization of light propagating through scattering media and biological tissues. Applied Optics, 1998, v. 37, № 31, p. 7357-7367.

16. Kato T., Gancheiyonok II, Fujimura Y. Photon-polarization effects on intermolecular interaction-induced quantum beats in femtosecond time-resolved light scattering from molecular pairs. Jour. Molecular Structure, 1997, v. 410-411, p. 69-72.

17. Knast К. Analysis of polarization effects in time-dependent Rayleigh light scattering by optically active molecules. Chemical Physics, 1996, v. 213, p. 465-482.

18. Lebedev AD., Ivanova M.A., Lomakin A.V., Noskin V.A. Heterodyne quasi-elastic light-scattering instrument for biomedical diagnostics. Applied Optics, 1997, v. 36, № 30, p. 7518-7522.

19. Chance В., Cope M., Gratton E., Ramanujam N., Tromberg B. Phase measurement of light absorption and scatter in human tissue. Rev. Scien. Instr., 1998, v. 69, № 10, p. 3457-3481.

20. Biyant G., Abeynayake C., Thomas J.C. Improved particle size distribution measurements using multiangle dynamic light scattering. 2. Refinements and applications. Langmuir, 1996, v. 12, p. 6224-6228.

21. Grasso V., Neri F., Fucile E. Particle sizing with a simple differential light-scattering photometer: homogeneous spherical particles. Applied Optics, 1997, v. 36, № 12, p. 2452-2458.

22. Hanus L.H., Ploehn H.J. Conversion of intensity-averaged photon correlation spectroscopy measurements to number-averaged particle size distributions. 1. Theoretical development. Langmuir, 1999, v. 15, p. 30913100.

23. Ломакин A.B., Носкин B.A. Эффекты негауссовости в спектроскопии оптического смешения. Тез. докл. II Всесоюз. конф. по флуктуационным явлениям в физических системах. Вильнюс, 1979, с. 35.

24. Sigel R., Pispas S., Vlassopoulos D., Hadjichristidis N., Fytas G. Structural relaxation of dense suspensions of soft giant micelles. Phys. Rev. Lett., 1999, v. 83, № 22, p. 4666-4669.

25. Georgalis Y., Kierzek A.M., Saenger W. Cluster formation in aqueous electrolyte solutions observed by dynamic light scattering. Jour. Phys. Chem. B, 2000, v. 104, p. 3405-3406.

26. Torre J.G. de la, Bloomfield V.A. Hydrodynamic properties of complex rigid biological macromolecules; theory and application. Quart. Revs. Biophys., 1981, v. 14, № 1, p. 81-139.

27. Cummins H.Z. Analysis of diffusion of biological materials by quasi-elastic light scattering. Application of laser scattering to the stady of biological motion. New York : Plenum Press, 1983, p. 171-208.

28. Климова A.H., Шмелев Г.Е., Носкин В.А., Мамонтова И.Ф., Петрова-Маслакова Л.Г., Парфенова КС. Измерение распределения поразмерам липопротеидов плазмы крови человека. Биофизика, 1982, т. 27, №3, с. 458-462.

29. Лозовский В.Т., Шмелев Г.Е., Носкин В.А., Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е., Кузнецов А.С., Климов А.Н. Распределение плазменных липопротеидов по размерам. Биофизика, 1987, т. 32, № 2, с. 285-291.

30. Носкин В. А, Шмелев Г.Е., Ломакин А.В. и др. Конформационные изменения липопротеинов высокой плотности в процессе насыщения холестерином. Биополимеры и клетка. 1987, т. 2, № 6, с. 293-301.

31. Киселев М.А., Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., Комарова М.Н. Размеры молекулы сывороточного альбумина человека в растворе. Биофизика, 2001, т. 46, № 3, с. 423-427.

32. Aggeli A., Fytas G., Vlassopoulos D., McLeish T.C.B., Mawer P.J., Boden N. Structure and dynamics of self-assembling p-sheet peptide tapes by dynamic light scattering. Biomacromolecules, 2001, v. 2, p. 378-388.

33. Zarutskie J.A., Sato A.K., Rushe M.M., Chan I.C., Lomakin A., Benedek G.B., Stem L.J. A conformational change in the human major histocompatibility complex protein HLA-DR1 induced by peptide binding. Biochemistry, 1999, v. 38, p. 5878-5887.

34. Pelta J., Berry R, Fadda G.C., Pauthe E., Lairez D. Statistical conformation of human plasma fibronectin. Biochemistry, 2000, v. 39, p. 5146-5154.

35. Добычин П. Д., Ломакин А.В., Мевх Н.Г. и др. Исследование полидисперсных растворов актина методами квазиупругого светорассеяния. Биополимеры и клетка. 1986, т. 2, № 1, с. 23-29.

36. Aymard P., Nicolai T., Durand D. Static and dynamic scattering of 0-lactoglobulin aggregates formed after heat-induced denaturalion at pH 2. Macromolecules, 1999, v. 32, p. 2542-2552.

37. Yasuda M, Murakami Y., Sowa A., Ogino R, Ishikawa R Effect of additives on refolding of a denatured protein. Biotechnol. Prog., 1998, v. 14, p. 601-606.

38. Gao J.Y., Dubin P.L., Muhoberas B.B. Capillaiy electrophoresis and dynamic light scattering studies of structure and binding characteristics of protein polyelectrolyte complexes. Jour. Phys. Chem. B, 1998, v. 102, p. 5529-5535.

39. Bowman W.A., Rubinstein m., Tan J.S. Polyelectrolyte gelatin complexation: light-scattering study. Macromolecules, 1997, v. 30, p. 3262-3270.

40. Valstar A, Brown W., Almgren M. The lysozyme sodium dodecyl sulfate system studied by dynamic and static light scattering. Langmuir, 1999, v. 15, p. 2366-2374.

41. Beretta S., Chirico G., Arosio D., Baldini G. Role of ionic strength on hemoglobin interparticle interactions and subunit dissociation from light scattering. Macromolecules, 1997, v. 30, p. 7849-7855.

42. Grigsby J. J., Blanch H.W., Praunitz J.M. Diffusivities of lysozyme in aqueous MgCl2 solutions from dynamic light-scattering data: effect of protein and salt concentrations. Jour. Phys. Chem. B, 2000, v. 104, p. 36453650.

43. Bolten M., Niermann M., Eimer W. Structural analysis of G-DNA in solution: a combination of polarized and depolarized dynamic light scattering with hydrodynamic model calculations. Biochemistiy, 1999, v. 38, p. 12416-12423.

44. Borsali R., Nguyen R, Pecora R. Small-angle neutron scattering and dynamic light scattering from a polyelectrolyte solution: DNA. Macromolecules, 1998, v. 31, p. 1548-1555.

45. Klenin K., Hammermann M., Langowski J. Modeling dynamic light scattering of supercoiled DNA. Macromolecules, 2000, v. 33, p. 14591466.

46. Ivanova M.A., Arutyunyan A.V., Lomakin A.V., Noskin V.A. Study of DNA internal dynamics by quasi-elastic light scattering. Applied Optics, 1997, v. 36, № 30, p. 7657-7663.

47. Seils J., Dorfmuller T. Internal dynamics of linear and superhelical DNA as studied by photon correlation spectroscopy. Biopolymers, 1991, v. 31, p. 813-825.

48. Soda K., Wada A. Dynamic light-scattering studies on thermal motions of native DNAs in solution. Biophys. Chem., 1984, v. 20, p. 185-200.

49. Данилова И.Г., Синогеева Н.И., Шавловский M.M., Гайцхоки B.C., Носкин JI.А. Характер взаимодействия лактоферрина с плазмидными ДНК по данным лазерной корреляционной спектроскопии. Биофизика, 2001, т. 46, № 3, с. 436-444.

50. Oupicky D., Konak С., Dash P.R., Seymour L.W., Ulbrich К. Effect of albumin and polyanion on structure of DNA complexes with polycation containing hydrophilic nonionic block. Bioconjugate Chem., 1999, v. 10, p. 764-772.

51. Roy К.В., Antony Т., Saxena A, Bohidar Н.В. Ethanol-induced condensation of calf thymus DNA studied by laser light scattering. Jour. Phys. Chem. B, 1999, v. 103, p. 5117-5121.

52. Mourant J.R., Freyer J.P., Hielscher A.H., Eick A.A. Shen D., Johnson T.M. Mechanisms of light scattering from biological cells relevant to noninvasive optical-tissue diagnostics. Applied Optics, 1998, v.37, № 16, p. 3586-3593.

53. Mourant J.R., Bigio I.J., Boyer J., Conn R.L., Johnson Т., Shimada T. Srectroscopic diagnosis of bladder cancer with elastic light scattering. Lasers Surg. Med., 1995, v. 17, p. 350-357.

54. Mourant J.R., Bigio I.J., Boyer J., Johnson Т., Lacey J. Detection of gastrointestinal cancer by elastic-scattering spectroscopy. Jour. Biomed. Opt., 1996, v. 1, p. 192-199.

55. Beauvoit В., Evans S.M., Jenkins Y.W., Miller E., Chance B. Correlation between the light scattering and the mitochondrial content of normal and tissues and transplantable rodent tumors. Anal. Biochem., 1995, v. 226, p. 167-174.

56. Jacques S.L., Alter C.A., Prahl S.A. Anngular dependence of HeNe laser light scattering by dermis. Lasers Life Sci., 1987, v. 1, p. 309-333.

57. Lehner D., Lindner Н., Glatter О. Determination of the translational and rotational diffusion coefficients of rodlike particles using depolarized dynamic light scattering. Langmuir, 2000, v. 16, p. 1689-1695.

58. Jarry G., Henry F. Anisotropy and multiple scattering in thick mammalian tissues. Jour. Opt. Soc. Am. A, 2000, v. 17, № 1, p. 149-153.

59. Peters M.H., Ying R. Rotational and translational dynamics of flexible macromolecules. Jour. Chem. Phys., 1993, v. 98, № 8, p. 6492-6503.

60. Левшин Л В., Салецкий А.М. Оптические методы исследования молекулярных систем. 4.1. Молекулярная спектроскопия. М.: Издательство Московского университета, 1994, 320 с.

61. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров. М.: Наука, 1973, 350 с.

62. Фабелинский И.Л. Молекулярное рассеяние света. М.: Наука, 1965, 511 с.

63. Viebke С., Williams P. A. The influence of temperature on the characterization of water-soluble polymers using asymmetric flow field-flow-fractionation coupled to multiangje laser light scattering. Anal. Chem., 2000, v. 72, p. 3896-3901.

64. Norwood D.P., Benmouna M, Reed W.F. Static light scattering from mixtures of polyelectrolytes in low ionic strength solutions. Macromolecules, 1996, v. 29, p. 4293-4304.

65. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. Электростатические взаимодействия в растворах биополимеров по данным рэлеевского рассеяния света. Весгн. Моск. Ун-та. Сер. 3, Физика. Астрономия, 1994, т. 35, № 3, с. 45-50.

66. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Алексеев С.Г., Иванов А.В. Метод рэлеевского рассеяния в диагностике онкологических заболеваний. Сборник научных трудов конф. «Медицинская физика-2002». Москва, МГУ, физический факультет, 2002, с. 156-167.

67. Пентин Ю.А., Вилков JI.B. Физические методы исследования в химии. М.: Мир, 2003, 683 с.

68. Граселли Дж., Снейвили М., Балкин Б. Применение спектроскопии КР в химии. М.: Мир, 1984,216 с.

69. Накамото К. ИК спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений. М.: Мир, 1991,535 с.

70. Волькенпггейн М.В., Грибов Л.А., Ельяшевич М.А., Степанов Б.И. Колебания молекул. М.: Наука, 1972, 699 с.

71. Грибов Л. А Введение в молекулярную спектроскопию. М.: Наука, 1976, 399 с.

72. Кэри П. Применения спектроскопии КР и РКР в биохимии. М.: Мир, 1985, 272 с.

73. Nakamura К., Era S., Ozaki Y., Sogami M., Hayashi Т., Murakami M. Conformational changes in seventeen cystine disulfide bridges of bovine serum albumin proved by Raman spectroscopy. FEBS Letters, 1997, v. 417, p. 375-378.

74. Maksimov G.V., Maksimova N.V., Churin A.A., Orlov S.N., Rubin A.B. Study on conformational changes in hemoglobin protoporphyrin in essential hypertension. Biochemistiy, 2001, v. 66, № 3, p. 295-299. (translated from Biokhimiya, v. 66, № 3, p. 365-370).

75. Iconomidou V.A, Chiyssikos G.D., Gionis V., Willis J.H., Hamodrakas S.J. "Soff-cuticle protein secondary structure as revealed by FT-Raman, ATR FT-IR and CD spectroscopy. Insect Biochemistiy Molecular Biology, 2001, v. 31, № 9, p. 877-885.

76. Osada M., Gniadecka M., Brandrup F., Kjaergard Hansen L., Wulf H.C. Raman spectroscopy analysis of protein structure of hair in patients with trichothiodystrophy. British Journ. Dermatology, 2003, v. 148, № 3, p. 600-601.

77. Siebenga I., Vrensen G.F., Otto K., Puppels G.J., De Mul F.F., Greve G. Aging and changes in protein conformation in the human lens: a Raman microspectroscopy study. Exp. Eye Res., 1992, v. 54, p. 759-767.

78. He L., Zeng Y., Ye Y., Hu J. Surface-enhanced Raman spectroscopy of some Schiff base complexes and their interaction with DNA Vibrational Spectroscopy, 1999, v. 20, № 1, p. 1-4.

79. Neault J.F., Naoui M., Manfait M., Tajmir-Riahi H.A. Aspirin-DNA interaction studied by FTIR and laser Raman difference spectroscopy. FEBS Letters, 1996, v. 382, p. 26-30.

80. Vo-Dinh T., Stokes D.L., Griffin G.D., Volkan M., Kim U.J., Simon M.I. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) method and instrumentation for genomics and biomedical analysis. Journ. Raman Spectrosc., 1999, v. 30, p. 785-793.

81. Duindam J.J., Vrensen G.F., Otto C., Puppels G.J., Greve J. New approach to assess the cholesterol distribution in the eye lens: confocal Raman microspectroscopy and filipin cytochemistry. Journ. Lipid Res., 1995, v. 36, p. 1139-1146.

82. Asher S.A UV resonance Raman studies of molecular-structure and dynamics-application in physical and biophysical chemistry. Ann. Rev. Phys. Chem., 1988, v. 39, p. 537-558.

83. Stanicova J., Sutiak V., Chinsky L., Fabriciova G., Miskovsky P.

84. Amantadine-DNA interaction as studied by classical and resonance Raman spectroscopy. Joum. Molecular Structure, 1999, v. 478, p. 129-138.

85. Feofanov A.V., Baranov A.Y., Fleury F., Riou J.-F., Nabiev I.R., Manfait M. DNA topoisomerase I changes the mode of interaction between camptothecin drugs and DNA as probed by UV-resonance Raman spectroscopy. FEBS Lett., 1996, v. 396, p. 289-292.

86. Wen Z.Q., Overman S.A., Thomas G.J. Jr. Structure and interactions of the single-stranded DNA genome of filamentous virus fd: investigation byultraviolet resonance Raman spectroscopy. Biochemistry, 1997, v. 36, p. 7810-7820.

87. Wen Z.Q., Thomas G.J.Jr. UV resonance Raman spectroscopy of DNA and protein constituents of viruses: assignments and cross sections for excitation at 257, 244, 238 and 229 nm. Biopolymers, 1998, v. 45, p. 247256.

88. Manoharan R, Wang Y., Dasari R.R., Singer S., RavaR.P., Feld M.S. UV resonance Raman spectroscopy for detection of colon cancer. Lasers Life Sci., 1995, v. 6, p. 217-227.

89. Yazdi Y., Ramanujam N., Lotan R, Mitchell M.F., Hittelman W., Richards-Kortum R. Resonance Raman spectroscopy at 257 nm excitation of normal and malignant cultured breast and cervical cells. Applied Spectroscopy, 1999, v. 53, p. 82-85.

90. Pappas D., Smith B.W., Winefordner J.D. Raman spectroscopy in bioanalysis. Talanta, 2000, v. 51, p. 131-144.

91. Baraga J.J., Feld M.S., Rava RP. Rapid near-infrared Raman spectroscopy of human tissue with a spectrograph and CCD detector. Applied Spectroscopy, 1992, v. 46, № 2, p. 187-190.

92. Schräder В., Dippel В., Fendel S., Keller S., Lochte Т., Riedl M., Schulte R, Tatsch E. NIR FT Raman spectroscopy a new tool in medical diagnostics. Journ. Molecular Structure, 1997, v. 408/409, p. 23-31.

93. Hanlon E.B., Manoharan R, Koo T.-W., Shafer K.E., Motz J.T., Fitzmaurice M., Kramer J.R, Itzkan I., Dasari RR, Feld M.S. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Phys. Med. Biol., 2000, v. 45, p. R1-R59.

94. Kalasinsky V.F., Johnson F.B., Fervverda R. Fourier transform IR and Raman microspectroscopy of materials in tissue. Cell Mol. Biol., 1998, v. 44, p. 141-144.

95. Keller S., Schräder В., Hoffman A., Schräder W., Metz К., Rehlaender A., Pahnke J., Ruwe M., Budach W. Application of near-infrared Fouriertransform Raman spectroscopy in medical research. Joum. Raman Spectrosc., 1994, v. 25, p. 663-671.

96. Lawson E.E., Валу B.W., Williams A.C., Edwards KG. Biomedical applications of Raman spectroscopy. Joum. Raman Spectrosc., 1997, v. 28, p. 111-117.

97. Manoharan R, Wang Y., Feld M.S. Review: histochemical analysis of biological tissues using Raman spectroscopy. Spetrochem. Acta A, 1996, v. 52, p. 215-249.

98. Erckens R.J., Motamedi M., March W.F., Wicksted J.P. Raman spectroscopy for non-invasive characterization of ocular tissue: potentional for detection of biological molecules. Joum. Raman Spectrosc., 1997, v. 28, p. 293-299.

99. DOU X., Yamaguchi H., Yamamoto H., Doi S., Ozaki Y. A highly sensitive, compact Raman system without a spectrometer for quantitative analysis of biological samples. Vibrational Spectrosc., 1997, v. 14, p. 199205.

100. Schräder B., Keller S., Lochte T., Fendel S., Moore D.S., Simon A,

101. Sawatzki J. NIR FT Raman spectroscopy in medical diagnosis. Joum. Mol. Struct., 1995, v. 348, p. 293-296.

102. Schräder B., Dippel B., Erb I., Keller S., Lochte T., Schulz H., Tatsch E., Wessel S. NIR-Raman spectroscopy in medicine and biology: results and aspects. Joum. Mol. Struct., 1999, v. 480/481, p. 21-32.

103. Brennan J.F., Wang Y., Dasari R.R., Feld M.S. Near infrared spectrometer systems for human tissue studies. Applied Spectroscopy, 1997, v. 51, № 2, p. 201-208.

104. Berger AJ., Wang Y., Feld M.S. Rapid, noninvasive concentration measurements of aqueous biological analytes by near-infrared Raman spectroscopy. Applied Optics, 1996, v. 35, № 1, p. 209-212.

105. Pilotto S., Pacheco M.T.T., Silveira L., Baibin Villaverde A, Zangaro R.A. Analysis of near-infrared Raman spectroscopy as a new technique for a transcutaneous non-invasive diagnosis of blood components. Lasers Med. Sei., 2001, v. 16, p. 2-9.

106. Wicksted J.P., Erckens R.J., Motamedi M., March W.F. Raman spectroscopy studies of metabolic concentrations in aqueous solutions and aqueous humor specimens. Applied Spectroscopy, 1995, v. 49, № 7, p. 987-993.

107. Berger A.J., Koo T.-W., Itzkan I., Horowitz G., Feld M.S. Multicomponent blood analysis by near-infrared Raman spectroscopy. Applied Optics, 1999, v. 38, № 13, p. 2916-2926.

108. Berger A.J., Itzkan I., Feld M.S. Feasibility of measuring blood glucose concentration by near-infrared Raman spectroscopy. Spectrochimica Acta A, 1997, v. 53, p. 287-292.

109. Wang Y., Hasty C.E., Watson P., Wicksted J.P., Stith R.D., March W.F. Analysis of metabolites in aqueous solutions by using laser Raman spectroscopy. Applied Optics, 1993, v. 32, p. 925-929.

110. Deinum G., Rodriguez D., RomerT.J., Fitzmaurice M., Kramer J.R, Feld M.S. Histological classification of Raman spectra of human coronary artery atherosclerosis using principal component analysis. Applied Spectroscopy, 1999, v. 53, p. 938-942.

111. Weinmann P., Jouan M., Dao N.Q., Lacroix B., Groiselle C., Bonte P., Luc G. Quantitative analysis of cholesterol and cholesterol esters in human atherosclerotic plaques using near-infrared Raman spectroscopy. Atherosclerosis, 1998, v. 140, p. 81-88.

112. Rava RP., Baraga J.J., Feld M.S. Near infrared Fourier transform Raman spectroscopy of human artery. Spectrochimica Acta A, 1991, v. 47, № 3/4, p. 509-512.

113. Salenius J.P., Brennan J.F., Miller A., Wang Y., Aretz T., Sacks B., Dasari RR, Feld M.S. Biochemical composition of human peripheral arteriesusing near infrared Raman spectroscopy. Journ. Vase. Surg., 1998, v. 27, p. 710-719.

114. Mahadevan-Jensen A., Richards-Kortum R. Raman spectroscopy for detection of cancers and precancers. Joum. Biomed. Opt., 1996, v. 1, p. 3170.

115. Mahadevan-Jansen A., Mitchell M.F., Ramanujam N., Malpica A., Thomsen S., Utzinger U., Richards-Kortum R. Near-infrared Raman spectroscopy for in vitro detection of cervical precancers. Photochem. Photobiol., 1998, v. 68, p. 123-132.

116. Hawi S.R., Campbell W.B., Kajdacsy-Balla A., Murphy R., Adar F., Nithipatikom K. Characterization of normal and malignant human hepatocytes by Raman microspectroscopy. Cancer Lett., 1996, v. 110, p. 35-40.

117. Mizuno A., KitajimaH., Muraishi S., Ozaki Y. Near infrared Fourier transform Raman spectroscopic study of human brain tissues and tumours. Joum. Raman Spectrosc., 1994, v. 25, p. 265-269.

118. Alfano R.R., Liu C.H., Sha W.L., ZhuH.R., Akins D.L., Cleaxy J., Prudente R., Clemer E. Human breast tissue studied by IR Fourier transform Raman spectroscopy. Lasers Life Sci., 1991, v. 4, p. 23-28.

119. Frank C.J., McCreeiy R.L., Redd D.C. B. Raman spectroscopy of normal and diseased human breast tissues. Anal. Chem., 1995, V. 67, P. 777-783.

120. Frank C.J., Redd D.C. B., Gansler T.S., McCreeiy R.L. Characterization of human breast specimens with near-IR Raman spectroscopy. Anal. Chem., 1994, v. 66, p. 319-326.

121. Ramser К., Bjemeld E.J., Fant С., Kail M. Importance of substrate and photo-induced effects in Raman spectroscopy of single functional erythrocytes. Journ. Biomed. Opt., 2003, v. 8, № 2, p. 173-178.

122. Sato H., Chiba H., Tashiro H., Ozaki Y. Excitation wavelength-dependent changes in Raman spectra of whole blood and hemoglobin: comparison of the spectra with 514,5-, 720-, and 1064-nm excitation. Journ. Biomed. Opt., 2001, v. 6, № 3, p. 366-370.

123. Venkatesh В., Ramasamy S., Mylrajan M., Asokan R, Manoharan P.T., Rifkind J.M. Fourier transform Raman approach to structural correlation in hemoglobin derivatives. Spectrochimica Acta A, 1999, v. 55, p. 1691-1697.

124. Caspers P. J., Lucassen G.W., Wolthuis R, Bruining H. A., Puppels G.J. In vitro and in vivo Raman spectroscopy of human skin. Biospectroscopy, 1998, v. 4, p. S31-S39.

125. Puppels G.J., Demul F.F.M., Otto C., Greve J., Robertnicoud M., Arndtjovin D.J., Jovin T.M. Studing single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature, 1990, v. 347, p. 301-303.

126. Puppels G.J., Otto C., Greve J., Robertnicoud M., Arndtjovin D.J., Jovin T.M. Raman microspectroscopic study of low pH induced changes in DNA structure of polytene chromosome. Biochemistry, 1994, v. 33, p. 33863395.

127. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука, 1965, 232 с.

128. Trynda-Lemiesz L., Luczkowski M. Human serum albumin: spectroscopic studies of the paclitaxel binding and proximity relationships with cisplatin and adriamycin. Journ. Inorg. Biochem., 2004, v. 98, № 11, p. 1851-1856.

129. Zamora R., Hidalgo F.J. Comparative methyl linoleate and methyl linoleate oxidation in the presence of bovine serum albumin at several lipid/protein ratios. Journ. Agric. Food Chem., 2003, v. 51, № 16, p. 4661-4667.

130. Bito R., Shikano T., KawabataH. Isolation and characterization of denatured serum albumin from rats with endotoxicosis. BBA, 2003, v. 1646, p. 100-111.

131. Singh A.K., Darshi M. A fluorescence study of (4-((lE,3E)-4-(4-(dimethylamino)phenyl)buta-l,3-dienyl)phenyl)methanol and its bioconjugates with bovine and human serum albumins. New Journ. Chemistry, 2004, v. 28, № 1, p. 120-126.

132. Minniti G., Cerone R., Armani U., Piana A. Determination of plasma and serum homocysteine by high-performance liquid chromatography withfluorescence detection. Journ. Chromatography A, 1998, v. 828, № 1-2, p. 401-405.

133. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980, 320с.

134. MacCrehan W.A., Schönberger E. Determination of vitamin K1 in serum using catalytic-reduction liquid chromatography with fluorescence detection. Journ. Chromatography B: Biomed. Sei. Applications, 1995, v. 670, № 2, p. 209-217.

135. Yoshida S., Miyazaki M., Takeshita M., Sakai K., Zhang Q.Z. Quantification of concanavalin A binding to rat brain microsomal membranes detected by fluorescence polarization technique. BBA/Biomembranes, 1998, v. 1370, № 2, p. 235-242.

136. Remmel N.N., Titova N.M., Kratasyuk V.A. Oxidative stress monitoring in biological samples by bioluminescent method. Bull. Exp. Biol. Med., 2003, v. 136, № 2, p. 209-211.

137. Makrigiorgos G.M., Kassis A.I., Mahmood A., Bump E.A., Savvides P. Novel fluorescein-based flow-cytometric method for detection of lipid peroxidation. Free Radical Biol. Med., 1997, v. 22, № 1/2, p. 93-100.

138. Singh S., Suri R., Agrawal C.G. Fluorescence properties of oxidized human low-density lipoproteins. BBA, 1995, v. 1254, № 2, p. 135-139.

139. Pinchuk I., Lichtenberg D. Continuous monitoring of intermediates and final products of oxidation of low density lipoprotein by means of UV-spectroscopy. Free Radic. Res., 1996, v. 24, № 5, p. 351-360.

140. Knipping G., Gogg-Fassolter G., Frohnwieser B., Krempler F., Kostner G.M., Malle E. Quantification of apolipoprotein D by immunoassay with time-resolved fluorescence spectroscopy. Joum. Immunological Methods, 1997, v. 202, № 1, p. 85-95.

141. Райченок Т.Ф. Свечение сыворотки крови человека в длинноволновой области спектра. ЖПС, 1999, т. 66, № 3, с. 433-436.

142. Kalnina I., Meirovics I. A new fluorescent probe, ABM: properties and application in clinical diagnostics. Journ. Fluorescence, 1999, v. 9, № 1, p. 27-32.

143. Gorog P., Kovacs I.B. Lipid peroxidation by activated platelets: a possible link between thrombosis and atherosclerosis. Atherosclerosis, 1995, v. 115, p. 121-128.

144. Heidi and A., Sebekova K., Frangiosa A., de Santo L.S., Cirillo M., Rossi

145. F., Cotrufo M., Pema A., Klassen A., Schinzel R, De Santo N.G. Paradox of circulating advanced glycation end product concentration in patientswith congestive heart failure and after heart transplantatioa Heart, 2004, v. 90, p. 1269-1274.

146. Vukovic V., Nicklee Т., Hedley D.W. Multiparameter fluorescence mapping of nonprotein sulfhydryl status in relation to blood vessels and hypoxia in cervical carcinoma xenografts. Int. Journ. Oncology Biol. Phys., 2002, v. 52, № 3, p. 837-843.

147. Баранов A.H., Власова И М., Салецкий A.M. Исследование процессов агрегации сывороточного альбумина ЖПС, 2004, т. 71, № 2, с. 204207.

148. Vlasova I.M., Mikrin V.E., Saletsky А.М. Investigation of CsCl-induced aggregation of serum albumin depending on pH by Raman spectroscopy method. Laser Physics Letters, 2005, v. 2, № 4, p. 204-207.

149. Баранов A.H., Власова И.М., Микрин B.E., Салецкий A.M. Лазерная корреляционная спектроскопия процессов денатурации сывороточного альбумина ЖПС, 2004, т. 71, № 6, с. 831-835.

150. Vlasova I.M., Dolmatova E.V., Koshelev V.B., Saletsky A.M. Investigation of ischemia damaging action on blood serum structure by laser spectroscopy methods. Laser Physics Letters, 2004, v. 1, № 8, p. 417420.

151. Saletsky A.M., Vlasova I.M. Application of laser spectroscopy methods for investigation of ischemia damaging action on blood serum. ALT04. Conference "Advanced Laser Technologies", Scientific programme, Rome and Frascati, 2004, p. 106.

152. Baranov A.N., Vlasova I.M., Saletsky A.M. Investigation of ischemia damaging action on blood serum by Raman spectroscopy method. Laser Physics Letters, 2004, v. 1, № 11, p. 555-559.

153. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989, 277 с.

154. Савченко Г.Е., Ступак А.П., Ключарева Е.А. Исследование динамических свойств липидного слоя внутрипласгидных мембран спомощью липофильных флуоресцентных зондов. ЖПС, 2002, т. 69, № 4, с. 497-501.

155. Greenspan P., Fowler S.D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. Journ. Lipid Research, 1985, v. 26, p. 781-789.

156. Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К., Владимиров Ю.А. Активированная нильским синим железоинициированная хемилюминесценция желточных липопротеидов. Биофизика, 1995, т. 40, № 3, с. 531-535.

157. Lee S.H., Suh J.K., Li М. Determination of bovine serum albumin by its enhancement effect of nile blue fluorescence. Bull. Korean Chem. Soc., 2003, v. 24, № 1, p. 45-48.