Химико-атомно-эмиссионные методы анализа биологических образцов для решения задач биотехнологии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Ордена Ленина Сибирское отделение

«1НСТЛТУТ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМЩ

На правах рукописи

УДК 543.423:542.61:612.126

Трошкова Галине Павловна

»»1К0-АТ0Ш0-Э1#ШЮННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДМ-РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ БИОТЕХНОЛОГИЙ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Институте неорганической химии Ордена Ленина Сибирского отделения РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Юделевич Л.Г. кандидат химических наук Децлна А.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Малахов Б.В.

кандидат хи:.ическ«*х наук

Коетровский Б.Г. поли

Ведущая организация - ТомскийТехнический университет

Занята состоится ИЮНЯ Х992 г. в часов на

заседании специализированного Совета Д.002.52.01 при Лнституте неорганической химии СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск 90,.пр. академика Лаврентьева 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института неорганической химии СО РАН

Автореферат разослан " Г " хдд£ г.

Ученый секретарь специализированного ^

Совета, кандидат химических наук ку£ Л.М.Буянова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время наиболее приоритетным направлением в производстве вакцин, диагностических и про-, филактических препаратов, многих биологически активных веществ становится клеточная биотехнология. Воспроизводимость биотехног логических процессов, связанных с культивированием клеточных линий млекопитающих и насекомых, а также качество биопрепаратов могут в значительной степени зависеть от содержания микроэлементов в питательных средах и сыворотке крови животных - основном источнике микроэлементов в питательной среде. Необходима стандартизация питательных сред и, соответственно, сыворотки крови животных по содержанию микроэлементов. Поскольку существует •взаимозависимость влияния микроэлементов на клеточные системы, когда эффект влияния одного элемента зависит от концентрации другого, то возникает необходимость одновременного контроля ряда микроэлементов в сыворотке кровк на уровне 1-Юмкг/л. Наибольшими возможностями для решения этой задачи обладают многоэлементные методы анализа.

Атомно-эмиссионный анализ благодаря доступности, простоте, высокой чувствительности вполне пригоден для серийного анализа биологических образцов при решении задач биотехнологии. Поскольку определение следовых элементов в сыворотке крови прямым этомно-эмиссионным методом на фоне высокого содержания основных элементов практически невозможно, становится необходимым предварительное концентрирование л разделение элементов перед их непосредственным определением. Использование концентрирования в сочетании с методом- атсмно-эшссионного анализа позволяет устранить влияние матричного эффекта и снизить предел: об-нарукения микроэлементов до уровня Ю^-Ю-^ г/г.

Следовательно, разработка новых кногоэлементных методов анализа биологических образцов с предварительным концентрированием микроэлементов (10) яьдяется весьма актуальной задачей. Успех решения этой задачи определяется прежде всего эффективностью концентрирования 1ЛЭ, позволяющего расширить возможности применения существующих инструментальных методов анализа.

Цель работы. Целью диссертации является разработка унифицированных химико-атомно-эмиссионных методов анализа сыворотки крови, позволяющих оценить влияние микроэлементов на качество

питательных сред.

Для решения поставленной задачи было необходимо: выбрать сорбционную систему для извлечения микроэлементов из минерализованной сыворотки крови; ■

исследовать влияние на эффективность извлечения микроэлементов способа.подготовки сорбента;

исследовать- влияние, остатков макрокомпонентов на интенсивность спектральных линий микроэлементов;

выбрать эффективный и достаточно ёмкий экстрагент для отделения основных компонентов при атомно-амиссионном анализе сыворотки крови;

изучить поведение микроэлементов в выбранной экстракционной системе;

оценить возможность и целесообразность использования разработанных аналитических методов в реальных биотехнологических процессах.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность использования суспензии дибензо-18-краун-б (ДБ18К6) в £>,$'-дихлорди-этиловом эфире, как эффективного и избирательного экстрагента для одновременного извлечения N3, К и Ре из солевых растворов.

Предложен способ разделения микро- и макрокомпонентов при анализе сыворотки крови, заключающийся в экстракционном извлечении основных компонентов суспензии* ДБ18К6 в хлорексе.

Исследована экстракщя Иа и К ДБШК6 в хлорексе из хло -ридно-перхлоратных растворов, сделан вывод о составе экстрагируемых комплексов.

Показана возможность сорбционного извлечения из минерализованной сыворотки крови б рекомендуемых условиях II микроэлементов хелатообразующим сорбентом полиарсеназо.

Продемонстрирована применимость разработанных аналитических методов для серийного анализа промышленных образцов сыворотки крови животных, используемой в биотехнологии.

Экспериментально доказана целесообразность введения понятия "минимальная предельно допустимая концентрация микроэлементов" применительно к компонентам биотехнологических питательных сред.

Практическая ценность работы. Разработан метод сорбционно-атомно-эмиссионного анализа сыворотк/, крови, позволяющий проводить определение II микроэлементов с пределами обнаружения

0,8-5,0 мкг/л.

Разработан метод экстракционно-атомнб-эмиссионного анализа сыворотки крови, дающий возможность определять 21 элемент с-пределами обнаружения 0,2-100 мкг/л.

Продемонстрирована возможность количественного описания влияния микроэлементов на пролиферащю клеточных систем, что позволяет проводить сопоставление чувствительности клеток к воздействию микроэлементов.

Впервые обнаружено снижение содержания микроэлементов в сыворотке крови после обработки её полиэтиленгликолем (ПЭГ); показана возможность увеличения пролиферативной активности сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС), обработанной. ПЭГ, путём введения в неё ионов металлов до уровня их содержания в сыворотке крови плодов коровы.

Разработанные химико-атомно-эмиссионные методы использованы Новосибирским медицинским институтом для анализа крови здоровых людей (доноров) и людей, контактирующих с комплексом токсических веществ, а также НЮ "Вектор" для анализа различных видов сыворотки крови животных.

Автор защищает: обоснование пригодности использования сорбента полиарсена-зо для сорбционного концентрирования микроэлементов при анализе сыворотки кроЕи;

обоснование возможности использования суспензии ДБ18К6 в хлорексе для экстракционного отделения К и Ре при анализе сыворотки крови;

выводы по экстракции Ма и К из хлоридно-перхлоратных сред; методические разработки по анализу сыворотки крови; результаты изучения концентрационных зависимостей влияния микроэлементов на пролиферацию различных клеточных систем (клетки почек сирийского хомячка (ВНЮ; клетка легких эмбриона человека (ЛЭЧ1, клетки непарного шелкопряда ($СЕс1 -135).

Апробация работы. Результаты работы доложены на сессии Сибирского отделения Научного совета по аналитической химии Кемерово, 1968 г.), Х1У годичной сессии Научного совета АН СССР по аналитической химии (Суздаль, 1989 г.), Всесоюзной конференции по разработке и производству препаратов медицинской био -технологии (Махачкала, 1990 г.), Ш Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990 г.),

Ki Всесоюзной конференции по.методам концентрирования в аналитической химии.(Черноголовка, 1990 г.), XI Международной, конференции по аналитической спектроскопии (Москва, 1990 г.), УП Европейской конференции по .аналитической химии (Вёна, 1990 г.), Всесоюзной конференции по питательным средам- и сывороткам для культур клеток (Кольцово, 1991 г.).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, трёх экспериментальных глав, выводов, списка литературы и приложения. Она изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, I? таблиц и библиографию из 195 наименований.

Методика исследований. Поведение микро- и макрокомпонентов в минерализованной сыворотке крови при сорбционном концентрировании ¡.¡3 изучали атомно-абсорбцлонным и атомно-змиссионным методами.

^ежфозное распределение натрия и калия определяли по их эмиссии в воздушно-ацетиленовом пламени с использованием спектрофотометра фирмы "Реикш EtmeR", модель 303. Поведение микроэлементов при экстракции изучали атомно-змиссионным методом, используя кварцевый спектрограф ЛСП-2Ь. Почернение аналитических линий элементов измеряли на микрофотометре Ш?-2.

В качестве объектов анализа служила сыворотка крови животных производства НПО "Вектор". Перевиваемые клеточные культуры, охарактеризованные в соответствии с паспортными данными, получали из музея клеточных культур НПО "Вектор". Счет клеток производили в камере Горяева.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В 1-2 разделах литературного обзора показано влияние МЭ на качество питательных сред, 'используемых для культур клеток, отмечено особое значение контроля Ш в сыворотке крови животных. Рассмотрено современное состояние многоэлемен'тных методов анализа биологических объектов. Показано отсутствие унифицированных химико-атомно-эмиссионных методов анализа сыворотки крови и необходимость их разработки с целью создания доступных высокочувствительных методов определения широкого круга микроэлементов.

В следующем разделе приведены данные, свидетельствующие

о том, что разработка новых методов атомно-эмиссионного анализа сыворотки .крови с низкими пределами обнаружения возможна лишь при использовании эффективных способов концентрирования МЭ. Среди способов концентрирования наиболее перспективны такие, как сорбция МЭ на полимерных комплексообразующих сорбентах, характеризующаяся высокой эффективностью и удобством в работе, и экстракционное отделение основных компонентов из минерализованной сыворотки., крови с помощью макроциклйческих соединений.

С0РБЦИ0НН0-АТ0Ш0-®ШССИ0ННЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА СЫВОРОТКИ КРОВИ

Выбор сорбционной системы для извлечения микроэлементов из сыворотки крови. Для сорбционного концентрирования микроэлементов из минерализованной сыворотки крови наибольший интерес представляют хелатообразующие сорбенты, представляющее собой нерастворимые полимерные матрицы с введенными в них функциональными группами. Сопоставление сорбционной ёмкости ряда сорбентов, химических свойств сорбируемых элементов, содержания микро- и макрокомпонентов в минерализованной сыворотке крови позволило выбрать в качестве хелатообразующего сорбента - полиар-сеназо.

Влияние - размера частиц полиарсеназо на кинетические характеристики сорбции ¡<0 изучали в статических условиях на модельных системах, используя сорбент в Н-форме. Как видно из рис. I,

измельчение сорбента приводит к ускорению процесса сорбции, увеличению его эффективности, что подтверждает значительный вклад в процесс сорбции внешнедиффузи-онных механизмов.

Рис. I. Зависимость сорбции элементов от времени контакта фаз': I - О , 2 - N1, 3 - К .

(Сплошная линия- размер частиц 0,10-0,22 мм, прерывистая линия - 0,04-0,06. мм).

Однако, использование сорбента в мелкодисперсном состоянии приводит к увеличению величины контрольного опыта в случае отделения сорбента от водной фазы фильтрацией или к существенным потерям МЭ (30-40%) при отделении сорбента центрифугированием. Поэтому, несмотря на некоторое увеличение времени сорбции, применение сорбента в виде гранул более целесообразно, так как это позволяет устранить систематические погрешности при химико-атомно-экиссионном анализе сыворотки крови и•значительно снизить величину контрольного опыта.

Избирательность процесса сорбции обеспечивается установлением необходимой кислотности раствора. Проведённые эксперименты свидетельствуют о том, что рН=б является наиболее оптимальным для группового извлечения МЭ из минерализованной сыворотки крови (табл. I). Увеличение значения рН приводит к увеличению степени сорбции щелочных и щелочно-земельных элементов, оказывающих значительное влияние на интенсивность спектральных линий при атомно-эмиссионном определении, и уменьшению сорбции ' легкогидролизующихся элементов, образующих полиядерные структуры. В то же время в сильнокислых средах необходим 3-5 молярный избыток полиарсеназо для подавления диссоциации комплекса «¡е-арсеназо. После двух часов встряхивания пробы минерализованной сыворотки крови с сорбентом полиарсеназо при рН=6 Вх, Со, Сг, 1п, Мп,'Мо, N1 , МЬ, РЬ, сорбируются практически

полностью, в то время как извлечение Ма и К менее 1%, а кальция - око ад 10%

Изученная сорбционная система была выбрана для концентрирования микроэлементов при разработке метода анализа крови и сыворотки крови.

Влияние макрокомпонентов на интенсивность спектральных линий. После проведения процесса сорбции микроэлементов сорбент озоляли, к остатку, обработанному хлористоводородной кислотой, добавляли графитовый порошок. Подготовленный таким образом графитовый концентрат Ю содержит, как правило, № и К менее 0,Ъ%, железа 0,002Й, кальция ОД %. Влияние Ыа и К можно компенсировать, используя атомно-эмиссионные методики, предусматривающие в качестве усиливающей добавки хлористый натрий. С целью применения в анализу графитового концентрата унифицированной методики с 0,5% МаСЕ, разработанной в ИНХ 00 РАН, исследовано влияние Са на интенсивность спектральных линий опре-

Ь

Таблица I

Влияние кислотности раствора на степень извлечения элементов

Элемент Степень извлечения элементов, %

рН=2 . рН=6 рН=Ю

АС, 100 80

Ва 85 100

Вх 100 -

Са 10 100

М 50 70

Со 100 100

Сг 60 100

Си 52 90

Ре 60 20

1а 100 100

К <1 40

Щ 24 100

Мп 70 100

Мо 90 100 80

№ <1 40

N1 100 100

ЫЬ 100 100

РЬ 100

Тх 100 100 60

V 100 100

V/ 80 90

2п 70 100

2г 100 80

деляемых элементов в интервале его концентраций 0,05-2,0%. Показано, что при содержании Са 0,1-0,5% для ряда элементов наблюдается увеличение интенсивности спектральных линий. При дальнейшем увеличении концентрации Са происходит уменьшение интенсивности спектральных линий, связанное с резким возрастанием интенсивности непрерывного фона. Поэтому для анализа графитового концентрата ГО использовали методику с усиливающей добавкой хлористого натрия 4%, так как в присутствии до 1% кальция в графитовом концентрате с 4% МаСЕ. заметного влияния Са

ня интенсивность спектральных линий не наблюдается.

« петрологические характеристики. Ввиду отсутствия образцов сравнения сыворотки крови с известным содержанием микроэлементов, оценку правильности и воспроизводимости проводили методом "введено-найдено". В таблице 2 приведены метрологические характеристики разработанного сорбционно-атг.мно-эмиссионного метода анализа сцворотки крови. Оценку пределов'обнаружения проводили с использованием 4-Э критерия для доверительной вероятности 0,95 и коэффициенте концентрирования 100.

Таблица 2

метрологические характеристики сорбцнонно-атомно-эмиссионного метода анализа сыворотки кроЕи (Р=0,95)

Эле- Аналити- Вве; ].ено, Найдено мгДи п Предел •

мент ческая мг/г 5Л обнадук. икг/л

линия,нм

£>1 306,6 •1.6 (1,7±0,17) ю~5 12 0,16 0,6

Со 242,4 6,2 ю-6 (6,Ь±0,9?) Ю"6 10 0,20 1,0

Сг 2аЗ, 6 5,0 10"6 (4,Б±0,55) Ш"6 10 0,16 2,0

Ш 325,6 9,4 Ю"6 (Ь,5±1,34) Ю"6 10 0,22 0,9

л'И 2Ь9.,1 ь,2 10"^ (7,8^1,24) ТО"6 8 0,19 0,8

гаО 317,0 6,0 ю-^ (6,6^1,09) ю-5 8, 0,1Ь 5,0

N1 305,1 6,4 ю-ь (6,6^1,05) 10"^ Ь 0,19 5,0

ыь 292,7 4,0 ю-5 (3,6±0,46) го-5 8 0,16 5,0

РЬ 2ь2,3 6,2 10"^ (6,0±0,93) ю~5 10 0,23 ■ г,о

Т1 326, Ь 3,6 ю-ь (3,3*0,31) Ю"5 12 0,15 1,3

V 316,5 6,0 Ю"5 (6,1±0,66) Ю"5 12 0,17 1,3 ,

Ьлткым достоинством разработанного сорбцлонно-атомно-оуиссисннере-кетода анализа является возможность использования •ля количественного определения МЭ единой серии образцов срав-нония на основе графитового порошка не только для анализа сыворотки крови, но и для других биологических жидкостей после проведения предварительной их подготовки к анализу (минерализации 1.' ' -

' ЭКСТРАКЦИОННО-АТОМНО-ЭМИССИОНШГ ■ ■ МЕТОД АНАША СЫВОРОТКИ КРОВИ

С целью расширения числа определяемых элементов в сыворотке крови разработан атомно-эмиссяонный метод анализа с отделением основных компонентов экстракцией. Настоящая глава посвящена выбору условий экстракции щелочных элементов' дибензо-18-краун-б. (ДБ16К6), обеспечивающих полное и экспрессное их извлечение из минерализованной сыворотки крови для дальнейшего атом-но-эмнссионного анализа концентрата микроэлементов.

Влияние состава органической и водной фаз на экстракцию щелочных элементов краун-эфирами.

Основными компонентами минерализованной сыворотки крови являются не только щелочные элементы, но и обладающее богатым собственным эмиссионным спектром железо, поэтому целесообразным прелставалялось выбрать такой растворитель для ДБ16К6, который оановременно является экстрагентом для железа. Сравнение физических характеристик ряда растворителей, а также их селективности при извлечении железа и коэффициентов распределения натрия и калия при экстракции ДВ18К6 в данных растворителях позволило остановиться на $,|>'-чихлордиэтиловсм эфире (хлорексе). Однако, максимальная растворимость ДБ1ЬК6 в хлорексе не превышает 60 Такие концентрации ДБ1БК6 мало пригодны для аналитических целей из-за увеличения объёма органической фазы для экстракции. В то же Еремя известно, что некоторые комплексы краун-эфиров с соля-' ми металлов имеют более высокую растворимость в органической фазе, чем краун-эфнры. Поэтому для количественного извлечения натрия и калия из минерализованной сыворотки крови нами предложено использовать избыточное, полностью нерастворимое в хлорексе, количество краун-эфира. Устойчивая суспензия соответствует концентрации- ДОТБЕб в хлорексе, раЕнсй 90-100 мМ. При встряхивании суспензии ДБ1ьК6 в хлорексе с кислотными растворами солей щелочных металлов избыточное количество ДБ16К6 растворяется полностью, что может служить качественным подтверждением образования комплекса краун-эфира с солями щелочных металлов. В аналитической практике гетероциклических соединений факт более высокой растворимости в органических растворителях комплексов крзун-эфирсг? с солями, чем чистых краун-эфиров, использован впервые.

Максимальней степень извлечения железа хлорексом наблюдается из 8-12 М хлористоводородной кислоты. Коэффициенты распределения натрия и калия из растворов хлористоводородной кислоты монотонно возрастают с увеличением концентрации НСЕ, однако, получить высокие коэффициенты распределения не удается даже из 10 М НС?. Изучена экстракция .натрия и калия ДБ18К6 в хлорексе из хлоридно-перхлоратных растворов. Показано, что максимальная степень извлечения N8 и К наблюдается в области 0,2 М НСЕО^ (концентрация НСЕ*9М). , ,

Представление о вероятной стехиометрии экстракции получены на основании изучения изотерм экстракции натрия и калия и биологарифмической зависимости их коэффициентов распределения от концентрации экстрагента. Тангенс угла наклона обеих кривых близок к I, что свидетельствует о том, что наиболее вероятный состав экстрагируемого комплекса отвечает формуле : Ме(ДБ18К6)+(Сео4)~.

Поведение микроэлементов при экстракции основных компонентов.

Контроль содержания основных компонентов в водной фазе показал, что после первой ступени экстракции 5 мл) концентрация натрия 60-68 мкг/мл, калия ~ I мкг/мл, после второй ступени На < 1,4 мкг/мл, К < 0,01 мкг/мл, что по отношению к массе гра-

фитового коллектора составляет соответственно < 1,4-и

масс. Железо практически полностью извлекается за I ступень экстракции, его содержание в водной фазе после экстракты <'-п т мкг/мл, что по отношению к графитовому коллектору

Содержание кальция в графитовом концентрате не превышает 0,6%, и не оказывает влияние на интенсивность спектральных линий определяемых микроэлем?нтов при использовании агомно-эмис-сионной методики с 4% МаСЕ.

Для изучения поведения микроэлементов в выбранной экстракционной системе исследовано распределение 27 элементов на уровне 10~®-10""%. Изучение проводили атомно-эмиссионным методом путем анализа графитового концентрата. Показано, что в графитовом концентрате элементов отсутствуют 1п, 9а, БЬ, 5п, наблюдается потери Аы, ТЕ за счёт экстракции хлорексом. Полностью в водной фазе остаются Ад, А1, Ва, Ве, Вх, Со1, Со, Сг, Мп, Ыо, ЫЬ, N1 , РЬ , Рс1, Pi, Та, Те, ,1п .

Полученные результаты положены в основу разработанного экстракционно-атомно-эмиссионного метода анализа сыворотки крови. Схема анализа приведена на рис. 2. Правильность и воспроизводимость разработанного метода анализа оценивали на основания статистической обработки' результатов экспериментов "введено-найдено".

Сыворотка крови '

[ шо3, ± °С

< 80°С, упаривание

Шконц. + Ю04

Р Экстракция Ма, К, Ре ДБ18К6 в хлорексе

Водная фаза | | Органическая

-г -

АЭ анализ¡Сброс

Рис. 2. Схема экстракционно-атомно-эмиссионного анализа сыворотки крови

В таблице 3 приведены данные, свидетельствующие об отсутствии систематической погрешности при экстракционно-атомно-эмиссионном определении 21 микроэлемента в сыворотке крови, а также пределы обнаружения МЭ, рассчитанные в соответствии с 4-5 критерием.

Важно отметить, поскольку физиологическая роль ионов металлов в процессах жизнедеятельности представляет значительный' интерес, в число определяемых элементов входят как жизненноне-обходимые элементы, так и являющиеся токсичными. Предложенный нами метод по своим метрологическим характеристикам сопоставим с нейтронно-активационным, но превосходит последний по доступности и простоте выполнения.

Таблица 3 '

Оценка правильности и воспроизводимости определения микроэлементов в сыворотке крови (Ре0,95, К=Ю0)

Г"- " — - Элемент Введено, С % Найдено, ■(С±«Г), % л Эг Предел об-наруж.мкг/л

АЯ 6,1 10"8 (Б.э^мо"8 10 0,18 0,2

А1 6,3 1077 (6,4^0,8)" 10""7 ю' 0,18 I

Ва 8,4 го-6 . (8,5-1,3)"10"® .10 0,22 20

Ве 1,6 га-6 (1,5*0,2)'10"6 10 0,20 3

В1 4,8 ю-7 (4,6*0,6) МО"7 10 0,19 I

Сс1 6,0 ю-7 (5,7*0,9)'КГ7 10 0,24 I

Со 9,1 ю-7 (8,9-1,3)'ГС""7 10 0,23 3

Сг 1,0 ю-6 (о.э^о.п-ю-6 10 0,20 3

Мп 2,0 Ю"6 (г.г^о.з)*^ 10 0,20 5

Мо 2,3 ю-6 (2,5*0,4)'КГ6 8 0,22 5

МЬ 5,1 ТО"6 (4,7*0,9)'ГС"^ ' 8 0,24 10

N1 3,2 ю-6 (3,1±0,3)"Ю"6 10 0,15 10

РЬ 3,4 ю-7 (3,4±0;5)"10~7 10 0,21 I

Рс1 5,0 ю-6 (5,1*0,9)'КГ6 8 0,22 10

Р* 5,1 ГС"6 (5,0*0,9)' КГ6' 8 0,22 10

Та 1,2 ю-5 (1,1*0,2)'КГ5 8 0,23 40

Те 3,1 ю-5 (2,9*0,5)'КГ5 8 0,21 100

Т1 6,2 10-7 (5,9*0,8)'Ю-7 8 0,17 2

У 2,0 Ю"6 (2,1*0,2)'га-6 10 0,14 5

ы 1,7 ю-5 • (1,6*0,2)'КГ5 10 0,20 . 50

!?п 3,2 ю-6 1 (3,4*0,4)-Ю-6 1 10 0,17 ю

ВЛИЯНИЕ МИКРОЭШЕНТОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

К нарушению функционирования клеточных систем может приводить отсутствие, недостаточное или избыточное количество микроэлементов в питательной среде. Поэтому целесообразно детальное изучение связи между ростовыми характеристиками питательных сред (сывороток крови животных) и содержанием в них микроэлементов. Разработанные химико-атомно-эмиссионные методы балм применены для анализа различных видов сывороток крови животных. Рассмотрено влияние содержания элементов в питатель- 14

ных средах на пролиферативную активность клеток почек сирийского хомячка (ВНК-21) и легких эмбриона человека (ЛЭЧ). Наблюдается отчетливая тенденций снижения пролиферативной активности клеток в среде после достижения определённой (предельно допустимой) концентрации. Для изученных клеточных'систем установлены ряды цитотоксичности ионов металлов, определяемые по их концентрации в питательной среде,, приводящей к 50%-!снижению пролиферативной активности клеток (С^). (ВНК-21) медь » цинк > кобальт» никель > железо.(ЛЭЧ) ' цинк » кобальт» медь > никель > железо. Обнаружено наличие корреляционной зависимости Сзд^ и С^^, позволяющей проводить статистически достоверно сопоставление чувствительности клеточных культур к ионам металлов, механизмы действия которых на клеточные системы аналогичны.

Проведено определение микроэлементов в сыворотке крови ■ крупного рогатого скота' (КРС) до и после.обработки полиэтилен-гликолем (ПЭГ), а также в сыворотке крови .плодов коровы, обладающей высокими ростстимулирующими свойствами.

Впервые показано, что при обработке' сыворотки КРС поли-этиленгликолем для удаления гамма-глобулиновой фракции белков, снижения микоплазменной и вирусной контаминации происходит одновременное снижение концентрации функционально важных элементов, что в определённых условиях может оказаться фактором, лимитирующим клеточную пролиферацию.То обстоятельство, что клетки имеют низкую ростовую активность на питательных средах, содержащих сыворотку КРС (ШГ), позволило сделать вывод о наличии определённого минимального уровня содержания ионов металлов (предельно допустимые минимальные концентрации).

Предложено для повышения ростстимулирующих свойств сыворотки КРС (ЮГ) вводить в неё микроэлементы до уровня их содержания в сыворотке крови плодов коровы, обладающей высоким качеством, но весьма дорогостоящей. - На различных клеточных культурах (ВНК-21, 5сЫ -135): показано, что модификация сыворотки крови КРС, обработанной;ПЭГ, путём добавления микроэлементов, повышает её ростстимулирующие. свойства. Это может быть использовано для разработки.биотехнологических процессов, основанных на культивировании клеток.Насекомых (непарный шелкопряд).

вывода

1. Обоснована, и экспериментально подтверждена пригодность хелатообразующего,сорбента полиарсеназо для концентрирования микроэлементов в минерализованной сыворотке крови. Выбраны условия количественного извлечения микроэлементов.

Исследовано влияние остаточных количеств кальция на интенсивность спектральных линий определяемых микроэлементов. Показано, что при использовании.'в качестве усиливающей добавки 4% хлористого натрия отсутствует матричный эффект на стадии атомно-эмиссионного анализа графитового концентрата.

2. Разработан сорбционно-атомно-эмиссионный метод определения II микроэлементов с пределами обнаружения 0,8-5,0 мкг/л и относительным стандартным отклонением 0,15-0,23 в сыворотке крови. После проведения предварительной подготовки образцов к анализу (минерализации) метод может быть использован и для других биологических жидкостей.

3. Разработан новый приём разделения микро- и макроэлементов .в минерализованной сыворотке крови, основанный на экстракционном извлечении К1а, К и Ре суспензией ДБ18К6.В хлорексе из хлоридо-перхлоратных растворов.

4. Разработан экстракционно-атомно-эмиссионныи метод анализа сыворотки крови, позволяющий определять 21 микроэлемент с пределами обнаружения 0,2-100 мкг/л.и относительным стандартным отклонением 0,14-0,24. В число определяемых элементов входят как жизненнонеобходимые, так и токсичные.

5. Изучено влияние содержания элементов в питательных средах на пролиферативную активность клеток почек сирийского хомячка (ВНК-21) и легких эмбриона человека (ЛЭЧ). Отмечено снижение пролиферативной активности клеток по мере увеличения содержания элемента _в -среде.- Обнаружена корреляционная зависимость между величинами С^ для клеточных линий ВНК-21 и ЛЭЧ.

6. Проведено определение элементов в сыворотке крови крупного рогатого скота (КРС) до и после обработки полиэтиленгли-колем (ПЭГ). Показано,, что обработка сыворотки крови КРС поли-этиленгликолем приводит к снижению в ней содержания функционально важных микроэлементов. Предложено для повышения рост-стимулирующих свойств сыворотки КРС (ПЭГ) вводить в неё микроэлементы до уровня их содержания в высокоактивной, но дорого-

стоящей сыворотки крови плодов коровы.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Трошкова Г;П., Юделевич И.Г. Методы определения ртути и ряда тяжёлых металлов в биологических объектах// В сб. Поведение ртути и других тяжёлых металлов в экосистемах. Новосибирск,-1988.- С. I2I-I34.

2. Трошкова Т.П..» Юделевич И.,Г. Химико-атомно-эмиссионный метод определения'микроэлементов в сыворотке крови// В сб. Новое в практике-химического анализа веществ. М., 1989.-С.82-86.

3. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Химико-атомно-эмиссионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови// Х1У- Менделеевский съезд по общей и прикладной химии.- М.- I989.-C.499.

4. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Химико-атомно-эмиссионное определение микроэлементов в биологических жидкостях// Ж.Ана-лит. химии.- 1990.- Т.45, №6.- С. 1234-1237. ■

5. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционное концентрирование для химико-спектрального анализа сыворотки крови// Ш Все-союз. конф. по методам концентрирования в аналитической химии. Черноголовка.- 1990.- С. 33.

6. Децина А.Н., Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Андреева М.А. Повышение ростстимулирующей активности сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем// Ш Всесоюз.со-вещ. по культивированию клеток животных и человека. Пущино.-1990.- С. 21-22.

7. ¥udelevicli I.G., Troshkova G.P. Atomic emission methods for the determination microelements in blood serum with preliminary chemical concentration// Eur.conf. on analytical chemistry, Euroanalysis VII, Vienna, Austria.-1990.- V.1.- A2.2-P-Fr-23.

8. Troshkova O.P., Yudelevich I.G. Atomic emission methodo for the determination of microelements in biological liquids with preliminary chemical concentration// XI Conf. of analytical atomic spectroscopy, Uoscow.-1990.- £.273.

9. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Методы контроля содержания микроэлементов в сыворотке крови// Всесоюз.конф. по разработке и производству препаратов медицинской биотехнологии.- Махачкала.- 1990.- С. 69-70.

.10. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционно-атомно-эмис-сионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови. I. Выбор экстрагента// Сибирский хим.журнал.- 1991.- № 4.-С.55-57.

11. Трошкова Г.П., Юделевич И.Г. Экстракционно-атомно-эмис-сионный метод определения микроэлементов в сыворотке крови. 2. Методика анализа//.. Сибирский хим.журнал.- 1991.- № 4.-С.58-60.

12. Трошкова Г.П.,. Децина А.Н., Мартынец Л.Д., Кондрахин Ю.А. Концентрационные зависимости влияния микроэлементов на клеточную пролиферацию// Всесоюз.конф, по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток. Новосибирск.- 1991.- С.19.

г

Подписано к печати /. оV- 92

Формат бумаги 60x84 1/16. Объём 0,7 уч.-ирд.л.,

1,0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 50

Отпечатано в Институте катализа СО РАН

630090 Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева 5