Радиационно-химические превращения антиоксидантов фенольной природы и их комплексов с ионами металлов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.09 ВАК РФ

На правах рукописи

Шарифуллина Лилия Ринатовна

РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ ФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ.

02.00.09 - Химия высоких энергий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Российском Химико-Технологическом Университете им. Д.И. Менделеева.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ревина А.А.

Научный консультант: кандидат химических наук, доцент

Брянцева Н.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Кабакчи С.А. доктор химических наук, профессор Атанасянц А.Г.

Ведущая организация: Московский Государственный Университет

им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 16 декабря 2004 года в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.024.04 при Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я.Карпова» по адресу: 105064 г. Москва, ул. Воронцово поле, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в

библиотеке ФГУП «Научно-исследовательского физико-химического института им. Л.Я. Карпова»

Автореферат разослан 16 ноября 2004 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Воронцов П.С.

£00 5- Ч

Общая характеристика работы. Актуальность работы.

Неотъемлемый компонент метаболических процессов кислород может быть причиной гибели живых организмов. Основной путь утилизации кислорода в клетках различных тканей - восстановление с образованием воды. Однако часть кислорода претерпевает одноэлектронное восстановление, образуя промежуточные продукты - активные формы кислорода (АФК). Основным из них является супероксид-анион-радикал (О2-) который легко превращается в перекись водорода (Н2О2), а перекись, в свою очередь может образовывать гидроксил-радикал (ОН-)- В ходе других реакций с участием кислорода образуются пергидроксид-радикал (НОО), а также пероксид- и алкоксид-радикалы. Эти чрезвычайно активные радикалы в небольших количествах необходимы живому организму для уничтожения бактерий, отживших клеток, окисление чужеродных соединений. Однако, будучи в избытке, они повреждают биологические мембраны, жизненно-важные молекулы (белки, нуклеиновые кислоты и липиды), вызывая нарушение регуляторных и защитных функций, обладают токсическим и канцерогенным действием. Поэтому свободно-радикальное окисление рассматривается с одной стороны как необходимое звено метаболизма, обеспечивающее нормальную жизнедеятельность, а с другой стороны, нарушение регуляции этого процесса, его замедление или ускорение (особенно в стрессовых условиях) является универсальной основой патогенеза многих заболеваний.

Механизмы антирадикальной защиты клетки можно разделить на ферментативные (ферменты катализируют превращение АФК в неактивные) и неферментативные (антиоксидангы, например витамины Е, Р, способные нейтрализовать свободные радикалы). В настоящее время производится много различных лекарственных препаратов и БАДов, в состав которых входят антиоксиданты.

Многие растительные пищевые продукты содержат естественный комплекс антиоксидантов, включающий в свой состав биофлавоноиды, каротиноиды, витамины, эфирные масла и микроэлементы, влияющие на процессы свободно-радикального окисления (селен, медь, железо, цинк). Однако в ряде работ отмечается способность флавоноидов {¥{) и их комплексов с ионами металлов проявлять прооксидантные свойства.

Общепринятых стандартных методов определения антиоксидантной активности в настоящее время не существует. Однако становится ясно, что методы, основанные только на определении концентрации активного вещества или концентрации продукта, для понимания механизмов проявления биологической активности соединения не достаточны.

Все вышесказанное обуславливает актуальность физико-химических исследований, позволяющих моделировать окислительно-восстановительные реакции с участием флавоноидов и микроэлементов в различных системах.

Цель исследования:

Радиационно-химическое и электрохимическое моделирование в различных средах окислительно-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА I

¿яши

природных антиоксидантов фенолыюй природы в отсутствие и присутствии молекулярного кислорода и ионов переходных З^ металлов.

Задачи исследования;

• Провести сравнительное изучение радиационной устойчивости флавоноидов различной структуры.

• Установить особенности образования продуктов окисления флавоноидов в зависимости от природы и свойств (структуры, организации) растворителя.

• Определить влияние ионов переходных З-1 металлов на изменение спектральных характеристик растворов флавоноидов.

• Выяснить электрохимическими методами условия формирования комплексов между флавоноидом и ионами 3d-MeTaллов в отсутствие и присутствии кислорода

• Показать возможность и определить условия изменения антиоксидантной активности в зависимости от природы и состава образующихся комплексов ионов металлов и флавоноидов.

• Выяснить влияние кислорода на радиационную устойчивость флавоноидов и их комплексов.

• Провести моделирование биологических процессов окисления путем воздействия на водные и водно-органические растворы флавоноидов малых доз ионизирующего излучения.

• Показать возможность применения современных электрохимических методов для оценки антиоксидантной активности биологических соединений в присутствии микроэлементов.

Научная новизна.

Впервые экспериментально доказано образование обратимых разнолигандных комплексов флавоноидов с ионами металлов и молекулярным кислородом. Показано влияние структуры комплексных соединений на их физиологическую активность и направление окислительно-восстановительных реакций в водных и водно-органических модельных системах.

Теоретическое и практическое значение работы:

Определена зависимость антирадикальной активности от структуры молекулы фенольных и полифенольных соединении, присутствия ионов' металлов и природы растворителя. Определены условия, в которых природные пигменты флавоноиды являются ингибиторами свободно-радикальных реакций, выступают в качестве радиопротекторов в экстремальных условиях или напротив, проявляют прооксидантные свойства.

Исследования могут помочь в решении ряда важных прикладных задач химии биологически активных веществ, радиобиологии, радиационной фармакологии, повысить эффективность использования природного сырья и разработку безотходных экологически чистых производств.

Апробация работы:

Материалы настоящей работы докладывались и демонстрировались на: XXI Симпозиуме молодых ученых по кинетике и катализу (Клязьма, февр.2003), XVII Международном Менделеевском Съезде по общей и прикладной химии (Казань, сент.2003), 5-ой Международной Научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, МГУПБ, 22-23

октября 2003г.), 2-ая Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения», (Москва, МГУПБ, 21 октября 2003г.), Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии (Москва, РХТУ, окт.2003), Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь 28сент.2003), Симпозиуме «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» (ИБХФ им. Эмануэля РАН, Москва, Россия, 2-3дек.2ООЗ.), Научной Сессии МИФИ. (Москва, янв.2004), XXII Всероссийской школе-симпозиуме молодых ученых по химической кинетике (Моск.обл, март2004), Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты" (Санкт-Петербург, 20-21 мая 2004 года), 50th International Conference "Modern Trends in Organoelement and Polymer Chemistry" (INEOS-2004) (A.N.Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds 24-28мая 2004), IX Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (28 июня -2 июля 2004, Плес, Россия)

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установление сложного характера процессов окисления фенольных соединений и выявление промежуточных и обратимых стадий, является дальнейшим развитием теории химических реакций, связанных с участием активных форм кислорода.

2. Организация среды, природа растворителя влияют на радиационную устойчивость и образование продуктов окисления флавоноидов различного строения.

3. На основании спектрофотометрических и вольтамперометрических исследований обратимых взаимодействий биологически активных соединений с кислородом сделан вывод о стабилизации лабильных комплексов с кислородом за счет частичного переноса заряда.

4. Образование комплексных соединений флавоноидов с ионами переходных 3d- металлов существенным образом влияет на их биологическую активность.

5. Восстановление кислорода протекает внутрикомплексно. В зависимости от состава зарегистрированных лабильных комплексных соединений (Фл*О2*Ме2+) восстановление кислорода может быть как облегчено, так и затруднено.

6. Радиационно-химическое моделирование при воздействии малых доз ионизирующего излучения на биологические объекты позволяет изучать механизмы окислительно-восстановительных процессов, протекающих в стрессовых условиях.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов исследования, глав результатов экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Список включает источников, из них _ отечественных и _ иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована_ таблицами и _ рисунками.

Содержание работы.

Обзор литературы.

В этом разделе обсуждаются существующие данные о механизмах клеточной регуляции биологического окисления, об участии и роли флавоноидов в свободнорадикальных процессах, о влиянии ионов металлов на метаболизм полифенольных соединений. Обозначен круг нерешенных проблем, намечены задачи и определены пути их исследования.

Материалы и методы исследования.

Объектом исследования выбраны природные соединения полифенольной природы - флавоноиды, структурные формулы которых приведены ниже: Рис. 1. Структурная формула а) рутина, б) кверцетина.

Исследовалось также простое производное бензола соединение 5-метилрезорцин обладающий антиоксидантной активностью и являющийся биологическим предшественником полифенольных соединений и продуктом метаболизма микроорганизмов.

В работе использованы: В качестве источников ионизирующего излучения: ^ установки Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН:

• ГУРХ 10 000(у- 60Со) при дозах облучения2-10кГр;

• Импульсного радиолиза на базе ускорителя электронов ЭЛУ-12 с энергией электронного пучка 4,5 МэВ при длительности импульса 2,2мкс. Доза за импульс при варьировании тока накала инжектора менялась от Лампа анализирующего света ДКСШ-500 работала в импульсном режиме синхронно с подачей импульса электронов. Для ограничения фотовоздействия электронами на образец использованы стеклянные фильтры. Дозиметрия источников излучения была проведена стандартными методами;

установка РХМ у-20 (Со) Российского химико-технологического Университета им. Д.И. Менделеева при дозах облучения 0,5-2кГр. Мощность дозы определялась ферросульфатной дозиметрией. Растворы облучались в темноте при комнатной температуре. ДЛЯ аналитических целей использовали:

•S Жидкостной хроматограф Aligent 1100 Series (Agilent Technologies, США) с градиентным насосом Agilent 1100 Series Quaternaly Pump с инжектором Agilent 1100 Series Manual Injector с петлей-дозатором объемом 20мкл, воздушным термостатом Agilent 1100 Series Thermostatted Column Compartment, с диодно-матричным детектором Agilent 1100 Series Diode Array and multiple Wavelength Detectors и программным обеспечением обработки хроматографических данных Chemstation A.08.03 (Agilent technologies, США). Хроматографические разделения проводили на колонке (100х2.1)мм с сорбентом Hypersil ODS (Змкм) с использованием предколонки (20х2.1)мм с сорбентом Hipersil C18 (5мкм). Пробы вводили стеклянным микрошприцем для ВЭЖХ Microliter Hamilton (Reno, США) Объемом 10мкл. S Двухлучевой спектрофотометр Specord М-40 (CarlZeiss, Германия); S Спектрофотометр «СФ-2000» (Россия); кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 и 10 мм;

Вольтамперометрический анализатор ABC-1.1, представляющий собой программно-аппаратный комплекс, состоящий из микропроцессорного измерительного блока (полярографа) и персонального компьютера типа IBM PC с установленной на нем программой «AVS».

Основные экспериментальные результаты и их обсуждения.

Спектрофотометрическое исследование флавоноидов в различных средах.

Флавоноиды хорошо растворимы в спиртах и практически нерастворимы в воде, поэтому часто используют смешанные растворители. Ранее было изучено влияние рН буферно-спиртового раствора на изменение коэффициента экстинкции. В наших экспериментах было показано, что соотношение компонентов в составе растворителя (спирт - фосфатный буфер, рН6Уфер=7,7) заметно сказывается не только на интенсивность полос поглощения, но и на их смещение по оси длин волн, а также на появление новых пиков, отсутствующих в спиртовых растворах кверцетина. Традиционно принято считать, что интенсивные полосы поглощения при Х=260 и 375 им отвечают хромофорным группам кольца «А» и «В» соответственно (рис. 1-6, 2-а,б). Незначительный по своей интенсивности пик при Х.=300нм приписывают наличию окисленных хиноидных таутомерных форм фенольных колец.

Изменение коэффициента экстинкции (е) буферно-спиртовых растворов Qr в зависимости от содержания спирта имеет экстремальный характер с максимумом при 40об.% этилового спирта.

Однако гликозид кверцетина - Rut, спектры спиртовых растворов которого мало чем отличаются от аналогичных для агликона, в случае использования смешанных растворителей проявляет иные свойства. Так, для буферно-спиртовых растворов Rut уже нехарактерна дуплетная структура полосы, отвечающей поглощению кольца «А», но наблюдается смещение всех полос в длинноволновую область. Коэффициент экстинкции Rut мало зависит от изменения доли спирта в растворе.

Рис. 2. Спектры оптического поглощения [<2г]=5ЧСГ5 моль/дм3 а) спиртового раствора, б) буферно-спиртового раствора, содержащего этилового спирта в концентрации (об.%): 1-10, 2-20; 3-50; 4-40.

400 450 длина волны, нм

Эти данные показали, что, что структура F1 играет определенную роль в формировании водородных связей в растворах.

Природа используемого в качестве растворителя спирта (одноатомный, двухатомный, трехатомный) не влияет на спектральные характеристики спиртовых растворов F1. Различие проявляется при использовании бинарных растворителей. Коэффициенты экстинкции, характерные для поглощения хромофорных групп кольца «А» и «В» уменьшаются при использовании двухатомного спирта. При этом соотношение пиков основных полос поглощения, характерных для кольца «А» и кольца «В» молекулы Qr изменяется от 1 до 2. Следовательно, более чувствительным к наличию ОН-групп растворителя спирта является кольцо «В», интенсивность пика оптического поглощения которого уменьшается сильнее при увеличении ОН-групп в растворителе спирте.

Для дальнейшего выяснения роли структуры среды было важно посмотреть поведение молекулы FI в организованных средах. Для этого использовали обратно-мицелярные системы (Mi-системы): 0,15М АОТ (ди-2-этилгексилсульфосукцинат натрия) в изооктане с различным коэффициентом солюбилизации

Для Mi-растворов Qr по сравнению с буферно-спиртовыми растворами наблюдается снижение для хромофора кольца и смещение всех полос поглощения в коротковолновую область. В выше рассмотренных системах Rut проявлял индифферентность по отношению к используемому растворителю, однако для Mi-систем, в отличие от раствор^Чаблюдается пик с высокой интенсивностью при длине волны Поскольку отличаются друг от

друга только наличием глнкозидного «хвоста», то именно через него

происходит активное взаимодействие молекулы Rut с молекулами растворителя в обратной мицелле.

Таким образом, анализируя спектры оптического поглощения растворов FI, можно сделать заключение, что структура среды зависит не только от природы флавоноида, но и от используемого растворителя, взаимодействие хромофорных групп FI с растворителем носит неоднозначный характер. Для подтверждения спектральных данных о влиянии о растворителя на формируемую структуру среды в растворе нами был выбран метод ВЭЖХ.

Хроматографическое исследование кверцетина в различных средах.

Для работы были выбраны длины волн детектирования 240, 265, 280, 334, 380, 420нм. Из анализа хроматографических данных фенольных и полифенольных соединений в спиртовых растворах полцчены следующие значения для Qr: время удерживания мин, индекс удерживания

ИУ=804,9. При помощи метода высокоэффективной жидкостой хроматографии (ВЭЖХ) нам впервые удалось разделить ассоциаты флавоноидов, существующие спиртовых и буферно-спиртовых растворах, более того, зарегистрировать их спектр оптического поглощения.

Хроматографический анализ спиртового раствора Qr (рис.4) показал, что в нем содержится преимущественно одна форма растворенного с

характерным временем удерживания и спектром оптического поглощения. В буферно-спиртовых растворах (рис.3), помимо этого, присутствует еще одна структурная модификация молекулы имеющая время удерживания t = и спектр оптического поглощения с максимумами при длине волны X — 300 и ЗбОнм. Поскольку данная структура формируется только в растворах, имеющих водную фазу, то можно сделать вывод об образовании связей с молекулами воды. Отметим, что в спиртовых и буферно-спиртовых растворах присутствует незначительное количество таутомерной формы Qr с временем удерживания имеющей идентичный спектр оптического

поглощения как в водных, так и в спиртовых растворах. Этот пик принадлежит к окисленной форме Qr хиноидной природы.

Таким образом, было показано методом ВЭЖХ, что дуплетность полосы кольца «А» в буферно-спиртовых растворах связано с существованием некой конформационной формы Qr, обусловленной его взаимодействием с водородными группами молекул растворителя.

Изучение комплексообразования флавоноидов с нонами З-d металлов.

- Флавоноиды чрезвычайно чувствительны к своему окружению, можно предположить неоднозначное поведение этих растворов в присутствии ионов металлов. Так, в нанотехнологии используется формирование наноагрегатов ионов металлов за счет восстанавливающей способности кверцетина в обратных мицеллах.

Исследование комплексообразования флавоноидов с ионами металлов в отсутствие и присутствии кислорода проводили в буферно-спиртовыч растворах двумя методами: оптическим и электрохимическим.

Исследовали аэрированные буферно-спиртовые растворы флавоноидов с различным содержание спирта и ионов таких металлов, как N¡2\ Cu2\ Zn2+.

Рис.3 Хроматограмма раствора кверцетина [(.}г]=1*1(Г4М/л. Растворитель 40(об.)% этиловый спирт, 60(об.)% фосфатный буфер (рН=7,7). На вставках показаны спектры оптического поглощения разделяемых веществ.

шли:

ЦуАН 8.337

шли 70

во

50 40

20 10 О

А

\

300 400 500 воо и

1[УАР 11 ЗГО

1 12.50 -----

Рис.4 Хроматограмма раствора кверцетина [()г]=1*1(Г4М/л. Растворитель этиловый спирт. На вставках показаны спектры оптического поглощения разделяемых веществ

Спектр оптического поглощения вещества, имеющего время удерживая 11.662 11667

тли

10 '

тли ' 50 » Л Л л ^

40 \ / 1 1 1 1

30 ! / :

20

10 1

0 ('ч..................

300 400 500 600 им

91эо !\ 1

А-

13 т!п

Табл. 1. Изменение оптической плотности растворов кверцетина в присутствии ионов металлов. ______

^-^Комплекс <2г:Ме1+, АБ= ^^^^ где Ме1+ , отн. ед.^—^ при X Со2+ Си2+ Ре5* Мп2*

260280 нм +0.1 -0.05 -0.3 +0.1 -0.2 -0.1 -0.2

300330 нм +0.14 +0.03 0 +0.04 0 +0.2

370380 нм -0.05 -0.4 -0.4 -0.2 -0.05 -0.5

400500 нм +0.1 +0.55 +0.2 0 +0.17 0

Д. — оптическая плотность раствора комплекса, Оч - оптическая плотность раствора кверцетина.

Зарегистрировано (табл.1) образование комплексных соединений с некоторыми ионами переходного З-1 периода. Изменение спектральных характеристик можно объединить в три группы: смещение полос оптического поглощения в длинноволновую область, появление новой полосы в области 400-500нм, увеличение е хромофорной группы кольца «А».

Важный вопрос биоорганической химии - активация и обратимое связывание кислорода. Обратимые комплексы Оз с некоторыми фенольными соединениями были обнаружены спектральными методами ранее Известно, что некоторые металлы могут выступать в качестве переносчиков молекулярного кислорода. Среди них Со2+, Ре2+, Си2+, Мп2+. Возникает вопрос - связывают ли эти ионы металлов кислород, если они существуют в растворах в виде комплексов с антиоксидантами. Для решения этой задачи нами был использован электрохимический метод переменнотоковой вольтамперометрни со стационарным ртутным электродом в виде висящей капли (полярография).

Примененный метод характеризуется тем, что высоты переменнотоковых пиков деполяризаторов, восстанавливающихся с участием одного и того же количества электронов, могут уменьшаться в 10 и более раз при переходе от обратимого к необратимому электродному процессу.

Изучалось взаимодействие с молекулярным кислородом в

водных растворах. На переменнотоковой вольтамперограмме восстановления О2 в изученной среде (0,1М ЫаСЮ« рН = 5,6-6,6) наблюдается два пика различной высоты с Е „(С^) = -30 мВ и Е^НгОг) = -1040 мВ. Заметное различие в высотах первого и второго переменнотоковых пиков восстановления Ог (1„02 : ¡ПН202=6:1) обусловлено различной степенью обратимости (а) их электродных процессов. Для первого пика аог = 0,45, а для второго - 0,25. Величина а рассчитывалась по формуле - соответственно

ширина полностью обратимого и экспериментально наблюдаемого

переменнотокового пика на его полувысоте в мВ. Для одно- и двухэлектронных электрохимических процессов соответственно равна

90,5 и 45 мВ. Следовательно, наблюдаемое уменьшение высоты пика при переходе от первой ко второй ступени восстановления О2 согласуется с теорией переменнотоковой вольтамперометрии.

ОТ в отсутствии кислорода в условиях переменнотоковой полярографии восстанавливается в 0,1М растворе NaClÛ4 С рН = 5,6 в одну двухэлектронную ступень с Е„Си = +80 мВ. На переменнотоковой вольтамперограмме растворов, содержащих Feî+ наблюдается пик их восстановления с Ере„=-1310 мВ. Вольтамперограммы растворов металлов в аэробных условиях содержали большее количество пиков восстановления реагирующих компонентов и их продуктов взаимодействия.

В условиях избытка Fe2+ (рис.5) кривые зависимости от мольного отношения Z = [ОгМРе2*] высот пиков восстановления О2 И Feî+ при потенциалах их максимума характеризуются наличием точек перегиба и точек пересечения касательных к ним при Z = 0.16, 0.25, 0.32, 0.5. Это соответствует образованию комплексных соединений стехиометрического состава 4Fe2*:02,3Fen:0lt 2Fe2\-0

2, ¿re

В .условиях избытка Ог

кривые зависимости от мольного отношения 2*=[Ре'£*]/[02] высот пиков восстановления О2" (Ьп°2) и каталитического восстановления НО2" (¡к) при потенциале максимумов их пиков и при постоянном потенциале (-470мВ) в растворах с рН = 5,6-6,6 И рН=4,3 а также величина Е„°2' имеют сложный вид. Величины 1, в растворах с рН = 5,6-6,6 и рН = 4,3 при Z' <1.2 имеют одно и тоже значение. Это указывает на независимость I, от концентрации Н*. Кривые характеризуются наличием точек пересечения касательных к ним при 2? = 0.5, 0.66, 1.0, 1.5. Найденные значения Z' соответствуют образованию комплексных соединений стехиометрического состава Fгг+*20л 2Реп*303, Ге^О* ЗFeJ+*202

Рис. 5.

Зависимость от 2 = [О^е2*] (избыток Ре2*) высоты пика (И) при потенциале максимума восстановления Ре2* (1), 02 (4), каталитического восстановления НО](2') и его высоты (3) при постоянном потенциале —420мВ в растворе 0,1 ЫаСЮ4 с рН=5,6-6,б. Стрелками указаны точки пересечения касательных к кривым.

При постоянных величинах радиуса ртутной капли и времени контакта реагирующих

компонентов вследствие постоянной скорости развертки потенциала величина ^ определяется скоростью и химической реакции:

v = k*[Fe]*[HO;'J

где к — константа скорости реакции, [Ре2+] - концентрация ионов Ие2* при образовании данного комплексного соединения, моль/см', [Н02'] = [02]. Тогда

к= " [Л2>]г[Я02]

Так как величина!) определяет величину ¡„ то получим:

-

Табл.2. Значение константы (к) скорости реакг/ии окисления Ре1' ионами НО/ в приэлектродном слое в комплексных соединениях Ге2' с Ог, образующихся при избытке Ре 2* и при избытке кислорода Ог в растворах с рН=5,6-б,6 при 2СРС.

Состав комплексных соединений Cw/IO', моль/дм5 CO2*10\ моль/дм3 1кат) отн. ед. тока К*1014 0тн..едл10ка ' (моль/дм')'

6Fe2t.02 2,13 0,34 556 3,6

4Fe2+.02 2,00 0,51 889 4,4

3Fe2+.02 1,94 0,62 1204 5,2

2Fe2%02 1,75 0,84 1390 5,4

Fe^.O, 3,00 3,00 8125 3,0

2Fei+»302 1,82 3,00 3194 3,2

Fe".202 1,49 3,00 2361 3,5

Расчет показал (табл.2), что величины к. полученные в условиях избытка ионов Ре2* и избытка Ог изменяются в диапазоне от 3*1014 до 5,4*1014 отн.ед.тока/(моль*дм3)3.

В аналогичных экспериментах было показано образование комплексных соединений ионов меди и молекулярного кислорода.

Поскольку полифенольные соединения - сложный объект для исследования, кроме того они практически нерастворимы в воде, нами было выбрано соединение — 5-метилрезорцин (далее С7), имеющий хорошую растворимость в воде.

Показано, что при добавлении в аэрированные растворы С7 пики восстановления Ог резко изменяются. В водных растворах фенольные соединения хелатируют молекулярный кислород, образуя комплексные соединения, стехиометрического состава [Ог*Ст], [02*2С7], [02*ЗС7].

В присутствии металла на вольтамперограммах деаэрированных растворов Fe2* - С, наблюдалось увеличение ширины пика восстановления Fe2* с ростом содержания С, до мольного отношения [C7]:[Fe2*] = 1:1, а затем ширина пика остается неизменной. Это указывает на образование комплекса состава 1:1 ([FeI+]:[C7]), что согласуется с известным фактом образования л-комплексных соединений ионов металлов с бензольным кольцом ароматических соединений. Для определения состава образующихся комплексов в аэрированных растворах (рис.5) проанализированы зависимости h„Fe2+ и h„T от мольного отношения Z = [C7]/[Fe2*| (при [От] = const = 3*10" 4моль/дм3) при постоянных потенциалах —475 И -635 мВ, а также высоты пика восстановления О2 по первой ступени при -2 10мВ.

Рис.5. Переменнотоковы е вольтамперограммы растворов РеБ04 — 02 -(С 7) на фоне 0,1М ШСЮ4 с рН=5,6-6,6; содержащем 3*104 моль/дм3 02.

Концентрации /•е.УОу и С7, моль/дм3, С*1&: 1,25 и 0 (1); 1,22 и 1,22 (2); 1,14 и 4,55 (3); 1,09 и 6,52 (4); 0 и 2,4 (5).

200 -200 -600 -1000 -1400 -1800 Анализ указанных

кривых показывает, что их точки экстремумов и

пересечения касательных к ним соответствуют значениям Ъ = 1, 2, 4, 5, 6. что свидетельствует об образовании комплексных соединений и в

частности комплексы состава

Исследование электрохимического поведения Qг в буферно-спиртовых растворах показало, что в данном случае также происходит комплексообразование флавоноида с растворенным молекулярным кислородом.

Поскольку концентрация растворенного кислорода в наших экспериментах не изменялась, то мы следили за изменением вольтамперных характеристик (смещение потенциала максимума пика, изменение поляризационного тока) в зависимости от различных соотношений концентраций ()г и меди в растворе Z = [С}г]/[Си2+]. Необходимо отметить, что нами использовались буферно-спиртовые растворы, и уже это вызывало изменение потенциалов восстановления кислорода. Электрохимический метод (рис.6.и.7) позволил показать возможность образование комплексных соединений различного стехиометрического состава пСи1**кр1*т От.

По изменению положения пиков, изменению их высот можно судить о том, насколько облегчается или затрудняется внутрикомплексное восстановление кислорода. Такой подход позволяет определять влияние структуры образующихся комплексных соединений на скорость реакций присоединения электрона к кислороду. Так для аэрированных растворов, содержащих и ионы серебра, изменение потенциала восстановления кислорода по первой ступени имеет представленную в табл.3 зависимость. Из полученных данных следует, что восстановление кислорода может смещаться как в катодную, так и в анодную область в зависимости от соотношения ионов металла и кверцетина, Соответственно комплекс способен проявлять антиоксидантные свойства (восстановление кислорода облегчено), так и прооксидантные свойства (восстановление кислорода затруднено).

Изученные в данной работе окислительно-восстановительные реакции природных фенольных соединений и их комплексов с ионами металлов

позволяют сделать определенные выводы о важной роли этих процессов в биологических средах. Данные реакции могут протекать в различных системах, и в первую очередь, в липидных мембранах митохондрий, где образуются АФК в процессе одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода различными компонентами транспортной цепи переноса электронов.

Рис. б Полярографические кривые растворов, содержащих концентрации кверцетина и ионов меди в соотношении 2 = [ОгНСи1*]: 1.- О, 2- 0,8; 3.-1,4; 4 — 2.8; 5.-6; 6.-18. в присутстви кислорода.

Табл.3. Изменение потенциала внутрикомплексного восстановления

г=[о2]/[Аё+] 3 2 1 0.6 0.3 0.1

ДЕ,(02)=ДЕо - ДЕС, мВ +25 +10 0 -5 -10 -15

Радиационио-химические превращения флавоноидов.

Наиболее сложные радиационио-химические процессы протекают при облучении биологических объектов. На молекулярном уровне эти объекты могут быть определены как высокоорганизованные системы сложных органических молекул в водных и водно-органических (мицелярных) растворах. Выяснение молекулярной природы первичных радиобиологических процессов, используя весь арсенал физико-химических и биохимических методов, создает предпосылки не только для более глубоких теоретических обоснований и системного моделирования процессов, происходящих в организме при воздействии ионизирующей радиации, но и для решения вопросов прикладной радиобиологии - пострадиационного восстановления организма, противолучевой защиты, поиска новых эффективных радиопротекторов. Радиационно-химическое генерирование в модельных системах радикалов, которые участвуют в нормальных процессах метаболизма, помогает выяснить механизм ряда биохимических реакций, связанных с ферментативной активностью клетки в норме и при определенной патологии, вызванной активацией свободно-радикальных процессов в организме. Существует возможность изучать синергические и антагонистические эффекты при воздействии различных физико-химических факторов на изучаемые системы, моделируя различные условия метаболизма живых организмов.

В последнее время большое внимание уделяется процессам, протекающим в системах под воздействием малых доз ионизирующего излучения. Во-первых, это связано с моделированием стрессовых условий, которым подвергаются биологические объекты в современной действительности и адаптацией организма к ним. Во-вторых, при малых дозах радиации различен механизм процессов окисления, существует возможность регенерации исходных состояний и обратимость радиационно-химических превращений. Последнее обусловлено тем, что природные антиоксиданты имеют высокую скорость переноса заряда и энергии возбуждения промежуточных форм, которые соответствуют равновесным конфирмационным формам флавоноидов, а также способность флавоноидов принимать участие в коллективном отклике на стрессовые воздействия и часть энергии возбуждения высвечивать в виде световой, тем самым снижая уровень свободных радикалов.

Мерой радиационного воздействия на структуру FI являлось изменение оптической плотности в полосе собственного поглощения пигментов в зависимости от дозы облучения. Из начальных участков кривых обесцвечивания определяли радиационно-химический выход. Спектры оптического поглощения облученных растворов Rut (рис.9) заметно отличались от аналогичных для Qr (рис.8). Расчет радиационно-химического выхода продуктов радиолиза флавоноидов с различных средах показал, что наиболее устойчивыми к воздействию ионизирующего излучения являются спиртовые растворы Rut. Интенсивность пиков оптического поглощения, ответственных за кольцо «А» в спиртовых растворах Rut практически не изменяется, что свидетельствует о роли гликозидного фрагмента молекулы Rut.

Рис 8-а Спектры оптического Рис 8-6 Спектры оптического

поглощения буферно-спиртовых поглощения спиртовых растворов

(доля этанола 25объ%) растворов [О?] = ¡*1(У3 М/л 1-исходный

[<2г] = 1*1(Г3 М/л■ 1-исходный раствор, 2-облученный раствор дозой

раствор, 2-облученный раствор 2кГр, 3-облученный раствор дозой

дозой 2кГр, 3-облученный раствор ЮкГр дозой ЮкГр

60 42 34 26 '1000/см

Рис 9-а Спектры оптического Рис 9-6 Спектры оптического

поглощения буферно-спиртовых (доля поглощения спиртовых растворов

этанола 12.5 об%) растворов [Rut] = [Rut] = 5* 10"1 Мл ¡-исходныйраствор,

5*1(Г4 М/л' 1-исходный раствор, 2- 2-облученный раствор дозой 2кГр, 3-

облученный раствор дозой 2кГр, 3- облученный раствор дозой ЮкГр облученный раствор дозой ЮкГр

Для подтверждения этого предположения нами был проведен эксперимент, в котором радиолизу подвергались растворы, содержащие агликон Qг и моносахарид рамнозу. Было обнаружено, что спектры буферно-спиртовых растворов (2г имеют отличную форму от буферно-спиртовых растворов Qг и рамнозы. При облучении дозой О = 2кГр высота пиков спектров оптического поглощения уменьшается, а при дозе О =10кГр остается пик на

ЗЗОнм и новый пик па 285нм. Изменяется состав продуктов радиолиза растворов (2г с рамнозой при проведении процесса в различных средах. После облучения дозой 0=10кГр в растворе наблюдаются две хромофорные группы, имеющие полосы поглощения при Л.=280 и 325нм (рис. 10-6). Присутствие рамнозы в растворе изменило механизм радиационно-химических превращений.

раствор, 2-оОлученный раствор

Присутствие рамнозы оказывает влияние на образование окисленных форм Qг при больших дозах облучения. Так, спектральные полосы окисленной формы фенольного кольца и бензопирилиевого ядра имеют приблизительно одинаковую интенсивность, что не наблюдалось в спектрах Qг в буфере.

В спиртовых растворах Qг (рис.8-б) с увеличением дозы облучения происходит уменьшение интенсивности основных полос хромофорных групп и рост полосы поглощения окисленной формы, которая при дозе 10кГр остается единственной. Аналогичное поведение наблюдается в спиртовом растворе Qг с рамнозой. Следовательно, в этих растворах определяющим является взаимодействие Qг с продуктами радиолиза, Qг блокирует генерацию радикальных форм рамнозы. Акцептирующая активность флавоноида по отношению к свободным радикалам не изменяется при введении в раствор молекулы рамнозы, то есть Qг способен предотвращать образование продуктов радиолиза Сахаров, ответственных за деструктивные процессы в организме.

Однако дальнейшие эксперименты показали, что природные аминополисахариды (хитозаны), имеющие одинаковые физико-химические свойства, но отличающиеся по радиопротекторной эффективности (что было

установлено биологическими методами) способны конкурировать в процессах перехвата активных радикалов, изменяя тем самым механизм радиационно-химических превращений флавоноидов. Это может быть использовано для разработки методов радиационно-химического определения биологической активности природных полисахаридов.

Вопрос о влиянии среды на реакционную способность ингибиторов радикального окисления связан с высокой чувствительностью к природе растворителя, что показано выше. Использование в качестве растворителя двухатомного спирта приводит к изменению спектральных характеристик облученных растворов. Так, после облучения растворов, не содержащих водной составляющей, не происходит формирования окисленных продуктов при Хмах=300-330нм. Буферно-спиртовые (этиленгликоль) растворы Qг после радиолиза образуют окисленную форму, однако изменение концентрации спирта в растворе не влияет на интенсивность полос поглощения основных и окисленных форм флавоноида.

Табл 4. Радиационно-химические выходы продуктов радиолиза

флавоноидов в различных средах.

В Mi-растворах Qr и Rut после облучения полоса поглощения кольца «В» уменьшается в 2,5 раза по сравнению с необлученным раствором. Незначительно изменяется полоса окисленных форм. Полоса поглощения кольца «А» увеличивается, что не наблюдалось ранее в других растворителях.

Структура среды может изменить направленность радиационно-химических процессов и привести к образованию иных продуктов радиолиза. Образование водородных связей между субстратом и растворителем оказывается определяющим фактором, влияющим на скорость и направление радикальных реакций. Моделирование антиокислительных и аитирадикальных процессов требует изучения механизма реакций в различных средах.

Хроматографическое исследование продуктов радиолиза кверцепшиа.

Методом ВЭЖХ нам удалось зарегистрировать продукты радиолиза в буферно-спиртовых и спиртовых растворах, подвергнутых различным дозам ионизирующего излучения. Суммарно все продукты охарактеризованы в таблице 5 и в диаграммном построении на рис. 11-а и И-б. Подтверждено влияние организации среды на состав продуктов радиолиза флавоноида. Можно

отметить продукт (временем удерживания 13,5-13,9), появляющийся в пострадиационный период независимо от используемого растворителя.

Табл.5, Характеристики хроматографически разделенных продуктов радиолиза кверцетина._

Растворитель Доза 0 кГр

спирт продукт Л1тах А2тах 1 удерж. впика %выхода

1 300 330 9.13 1.09 3.52

2 10.27 2.05 6.61

3 10.38 2.59 8.37

4 260 380 11.67 22.91 74.02

5 13.48 2.23 7.20

прочие 0.28

Буфер-спирт Доза 0 кГр

1 300 320 8.34 3.48 35.15

2 260 380 11.37 2.96 29.90

3 260 380 11.49 2.12 21.41

4 12.12 0.55 5.56

5 12.50 0.26 2.58

6 250 340 13.55 0.39 3.94

прочие 1.46

Буфер-спирт доза 2 кГр

1 300 320 8.26 0.36 3.75

2 290 330 9.00 0.11 1.34

3 290 330 9.08 0.11 1.15

4 10.09 0.16 1.67

5 260 380 11.48 8.6 89.58

6 250 340 13.50 0.15 1.56

прочие 0.94

Спирт доза 10 кГр

1 300 330 9.04 2.88 35.12

2 260 380 11.45 0.36 4.39

3 260 350 12.25 1.08 13.11

4 12.81 0.28 3.41

5 13.01 0.36 4.39

6 250 340 13.93 3.08 37.56

прочие 2.01

Буфер-спирт Доза 10 кГр

1 300 320 8.23 0.45 5.17

2 290 330 9.00 1.40 16.09

3 290 330 9.08 0.74 8.45

4 290 330 9.80 1.30 14.94

8 290 330 9.90 1.34 15.3

9 10.1 0.23 2.59

7 260 380 11.52 2.12 24.33

8 250 340 13.51 1.05 12.07

прочие 1.02

Рис.11-а. Диаграмма распределения продуктов хроматографического разделения необлученных и облученных дозой 0=10кГр спиртовых растворов кверцетина Ш4М/л

Рис.11-6. Диаграмма распределения продуктов хроматографического разделения необлученных и облученных дозой й=2 и 10 кГр буферно-спиртовых растворов кверцетина [Qr]=4*¡0Г4M/л

8.34 9 08 10 1 12.12 13 55

время удерживания, мин

Радиационно-химические превращения комплексов флавоноидов с ионами металлов переменной валентности. В условиях стационарного радиолиза со спектрофотометрическим анализом продуктов радиолиза были исследованы комплексы FI различного строения с ионами металлов переходного З-1 периода.

После воздействия ионизирующего излучения на растворы, содержащие ионы Со , наблюдается увеличение пиков окисленных форм по сравнению со спектрами необлученных растворов, а оптическая плотность полосы поглощения в области 380 нм, напротив, снижается. Изменение спектров оптического поглощения облученных растворов, содержащих ионы скорее всего, связано с природой самого металла (марганец сильный окислитель). С высоким радиационно-химическим выходом в данном случае образуется окисленная форма С^г. После облучения комплексов С^г с ионами наблюдалось устойчивость хромофорной группы, имеющей полосу поглощения в области 280нм. Полоса при длине волны 450нм, отвечающая комплексу с металлом, проявляет устойчивость к воздействию ионизирующего излучения. При облучении комплексов с ионами №2+ деструкция молекулы Qг незначительна, хотя полосы, отвечающей комплексу, спектрофотометрически не зафиксировано. Присутствие ионов Zn2+ приводит к усилению окислительных процессов под действием ионизирующего излучения. Комплексы с ионами

Си2* (рис.12) в зависимости от стехиометрического состава проявляют различную радиационно-химическую устойчивость. Однако в любом случае интенсивность пика кольца «А» выше, чем в облученных растворах Qг, а радиационно-химический выход продуктов окисления в присутствии ионов меди значительно ниже, чем в облученных растворах Qг

Рис. 12. Спектры оптического поглощения (1=]см) облученных дозой О.ЗкГр растворов, содержащих /0г/=2*/0~' М/л и ионы меди различной концентрации.. Соотношение [()г]:[Си'г]: 1)1:0 2)1:0.3, 3) 1:2, 4) 1:4.

Таким образом можно сказать о том, что влияние природы металла неоднозначно в радиационно-химический превращения флавоноидов. Образующиеся комплексы могут изменить протекание процессов радиолиза.

Комплексы могут проявлять как большую, так и меньшую устойчивость к процессам радиационного окисления. Состав комплексов также оказывает большое значение на радиационную устойчивость антиоксидантов.

Импульсныйрадиолиз буферно-спиртовыхрастворов кверцетшш и ионовмеди в аэробных и анаэробныхусловиях.

Использование метода импульсного радиолиза со спектрофотометрической регистрацией промежуточных короткоживущих частиц позволило в рамках изучения супероксидцисмутазноЙ активности биологически активных соединений сравнить поведение анион-радикала в модельном буферном водно-спиртовом растворе при рН 7.7 и в этом же растворе в присутствии С^г. На рис. 13 представлены спектры оптического поглощения: О2"' (1), и супероксокомплекса [(^...СУ (2), соответствующие интенсивности поглощения через I = 60 мкс после конца импульса ( Т =2.2 МКС, ДОза/имп= 25 Гр). Можно видеть, что X ми [(3г...02]' по сравнению с 02 имеет батохромный сдвиг на 8-10 нм, в то время как интенсивности полос этих частиц в максимуме и кинетики их гибели (рис. 13-14) отличаются мало.

Рис.13.

Спектры оптического поглощения радикала О2'

1- в фосфатном буфере с рН=7,7,

2- в присутствии /£>7 = 1 * 1 (Т'моль/л,

3- в присутствии [<2г]:[Си2']-1:1

Образование и участие лабильных комплексов флавоноидов с на

ранних стадиях

окислительно-восстановительных реакций, доказанное (Ревина, 1995) спектральными методами было в нашей работе подтверждено данными ПТВА. Действительно, потенциалы восстановления различны. Использование этих двух методов позволило на примере регистрации взаимодействия кислорода с электроном в присутствии Qг и ионов меди доказать не только формирование разнолигандных комплексов, определить спектральные характеристики полос их поглощения (рис. 13, кривая 3), но определить кинетические характеристики внутрикомплексной гибели супероксид- иона (рис. 14 кривая 3) в соответствии со схемой реакций:

Ме + Фл + 02 (Ме2+...Фл...02) (Ме2*...Фл...02")

Рис 14. Кинетика гибели радикала 0{ в фосфатном буфере с рН=7,7 в присутствии [(¿г] = 1*Ш моль/л и ионов меди [Си3*]=0.5*моль/л

Важно подчеркнуть, что в ходе реакций диспропорционирования образуется перекись водорода, и окисленная форма („,) (X. ми ~330 нм), а в ходе восстановления разнолигандного комплекса происходит быстрое каталитическое восстановление кислорода до воды, а комплекс регенерирует. Подтверждает это меньшее содержание (}г (0Х) и низкий выход обесцвечивания полосы поглощения комплекса. На примере этой модельной системы можно проследить защитные реакции с участием молекул антиоксидантов в присутствии ионов меди, которые предотвращают стабилизацию Ог" и нет последующего образования перекиси водорода, потенциального источника вторичных радикалов ОН.

ВЫВОДЫ

1. Радиационно-химические исследования водно-органических растворов природных антиоксидантов, моделирующие окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, показали, что радиационная чувствительность флавоноидов зависит от их структуры и природы растворителя.

2. Проведены спектрофотометрические исследования конечных продуктов радиолиза флавоноидов. Продукты радиолитического окисления кверцетина были дополнительно изучены методом ВЭЖХ: определены времена удерживания и спектры оптического поглощения индивидуальных соединений.

3. Сравнение радиационно-химических превращений флавоноидов различного строения агликона и глюкозида - позволило определить протекторную

роль сахарного фрагмента рамнозы в молекуле Ru, но не в качестве добавки в облучаемый раствор Qг.

4. Спектрофотометрическим методом исследованы условия формирования комплексов флавоноидов с ионами металлов 3-с1 периода: Си , Ре , Ъп1\ Мп , Со 2+; проведено сравнение радиационной устойчивости флавоноидов и их комплексов с металлами.

5. Методом переменнотоковой вольтамперометрии в широком диапазоне изменения относительных концентраций в буферных растворах алкилрезорцина , полифенольных соединений флавоноидов и различных ионов металлов в отсутствие и присутствии молекулярного кислорода получены результаты, доказывающие существование, на примере С^г, таких комплексов, как (п<Зг..тМе2+), (пРг..к02), (тМе2+ ..кОг) и разнолигандных комплексов

6. Методом импульсного радиолиза со спектрофотометрической детектированием промежуточных частиц радиолиза зарегистрированы сигналы, и, соответственно построены спектры оптического поглощения супероксид анион-радикалов в буферных водно-спиртовых растворах и супероксокомплексов в присутствии кверцетина в этих растворах и ионов меди. Проведено сравнение спектральных и кинетических характеристик (V и супероксид-ион-содержащих комплексов.

7. Данные импульсного радиолиза подтверждают механизм образования

а) супероксокомплексов флавоноидов при взаимодействии е*ю|» с лабильными комплексами (С2г8*...028 ") с частичным переносом заряда, ответственным за раннюю стадию активирования молекулярного кислорода природными соединениями;

б) разнолигандных супероксокомплексов с ионами меди (п(5г..тМе2+ ..кОг), кинетика гибели которых отличается от супеоксокомплекса, а механизм трансформации внутрикомплексного супероксид-иона до воды имеет каталитический характер с регенерацией исходного комплекса.

8. Анализ результатов изучения электрохимического восстановления кислорода в

буферных растворах в присутствии кверцетина и ионов металлов позволил сделать вывод о важном влиянии состава комплексов на

механизм последующих редокс реакций, в которых флавоноиды проявляют антиоксидантные, или проантиоксидантные свойства.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. ЛР. Шарифуллина, ВИ Доброе, П.М. Зам.ев, АА Ревша Исследование компгкксообрггювания в растворах системы ионы железа (П) - Фпараметил-реюрвдш - молекулярный кислород методом переменнотоковой вольтамперометрии. //Тезисы XXI Всероссийского симпозиума молодых ученых по химической кинегаке. Моск. обл. 10-14фараля 2003. с_59.

2. ЕМ Зайцев, АА Ревина, ДВ. Красный, ЛР. Шарифуллина, В.И. Доброе. Особешкхли электрохимического воосгановления моно и разнолигандных комплексов юное 3-ё металлов с молекулярным кислородом и фенапшыми соединениями. //Тезисы XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии «^Достижения и перспективы химической туки». Казань, 21-26

3. Шарифуплииа ЛР, Ревина АА, Брянцгва Н.В. Хромагогрофическое исследование проаукгов радиогапа квершгина //Материалы Международной конферен! щи молодых ученых «Ог фундаментальной науки- к новым технологиям». Тверь, 28 сяп\2003, выпЗ, стр.24.

4. ШОАксенова, ЛРШарифуллина, ААРевюи, ВМДрбров. Изучение юмплексообраоования кпсрцетши и тюв серебра метолом переменнагоковой вальтамперометрии. //Успехи в химии и химической технологии: Сб.тучтр. Т. XVU, №10. М: РХТУ им. ДИ. Менделеева2003. Стр.41 -52.

5. ЗДПеткова, ЛРШарифуллина, ААРевина, НВБряшева. Влияние структуры молекул фгавоноцдов ш редтииошю-химические превращения в спиртовых и буферно-апфтовых растворах// //Успехи в химии и химический технологии: С&научлр, Т. XVII, №10. Mj РХТУ им. ДИ. Менделеева2003. Стр53-60.

6. АА Ревина, ЛРШарифуллга и, НВ. Брянцева. Роль комгтеквооброэования с исками Си» в редиащюнно-хим^еских цжврашениях флавоноцпа кверцепой. //Мягертвлы V-Международной научно-технической км френиии «Пиив. Экология. Человек», Москва, МГУПБ, 2003г, сгр.95.

7. Шарифуллша JLP, Ревши АА, Брянцжа НВ. Комппежсообртование кверцетана и мепшрсюрцш и с hoi ими Си2*. Метод геремв а кжжовой вояьтамперометрииУ/Сборник тезияж 2-ой Международной ночной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения».Москва,МГУПБ,21оюября 20Q3r.cip.48.

8. АА Репина, ЯРШарифулшпа, ILB. Брянцева. Исследование свойств Rut и его комплексов с ионами металлов в молельных системахУ/ Сборник докладов Симпозиума «Функциональное питание, гоодевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса». Москва, МГУПБ^ декабрь2003, стр.94.

9. Шарифуллина ЯР, Рейна АА, Брянцева НВ. Раоиаиионнохимическое моделирование процеооов аюбеанорадикашюго окисления в присутствии грирадных анпюксипэнговУ/Сборник |иучных трудов «Научная сессия МИФИ-2004. К 100-леггию ПА Черенкша», Москва,TJfe 5,2004.

10. ЯР. Шарифуллина, Зо Найнг У, АА Ревина, НВ. Брянцева Полярографическая каталимелрия аэрированных распоров комплексных соединений пня цинка (П) и флввонола кверцэтина. //Тезисы XXII Всероссийской школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. Моск. обл. 15-18марга 2004. с.46.

П.Пилипчатна OA Чуркин АА, Шостенюо АГ, Фенин АА Шарифуллша JIP. Кинетика пострадиационной гибели радикалов в облученном моносахариде галактозе. // Тезисы ХХП Всероссийской шкалы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. Моск. обл. 15-18марга20(М.с.47.

ИШарифуплина ЯР, Ревина АА Брянцева НБ. Определение радиопреггекторных свойств аминополисахаршюв в разлитых средах методами радиаиионно-химичесного моделирования. //Материалы Российской тучной конференции «Медико-биологические проблемы протиюг1>чмойипрст®охимическойзаииг№>^

13 L.R. Sharifullina, A.A. Revina, N.V.Bryanceva. Catalysis of natural redox processes by flavonoids metal ion Complexes.// Abstr. International Conference "Modem Trends in Organoelement and Polymer Chemistry" dedicated to 50,b Anniversary of AN.Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds (INEOS)", Russian Academy of Sciences. Moscow, Russia, May 30- June 4,2004. P.197.

14. Шарифуллина Л.Р., Ревина A.A., Брянцева H.B., Наинг Мьо. Радиационное окисление природных пигментов в водных и водно-органических средах.// Сборник тезисов IX Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах», 28 июня -2 июля 2004, Плес, Россия

15. Зайдев ПМ, Репина АА, Шфифуллина ЯР, Красный ДВ. "Переменнотокввая воныамперометрия водных аэрированных растворов Fe(II) и каталитическое элеюроооссганоиление IКХ™ Электронный жур<ал "Исследовано в России", 159, сгр. 1724-1731, 2004 г. Imn.'Vhnnul ;nx- iitanm ¡alii Ь'2(Х) 1/159 nil"

16. АА Ревина, ПМ. Зайцев, ЯР. Шарифуллина, Брянцева НВ. Изучение комплексообразования ионов железа (II) с 2,6- дигидроксигалуотм и кислородом в водных растворах методом переменнопжооой вальтамперометрии. //Электронный журнал «Исследовано в России» (в печати).

Заказ 22_Подписано в печать 03 11 04 Тираж 100 экз

Типография ООО «Унипапирус»

M1 5 г J

РНБ Русский фонд

2005-4 19016

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 .Современные представления о механизме биологического окисления.

1.1.1 .Функции биологического окисления.

1.1.2,Образование активных форм кислорода и перекисное окисления липидов.

1.1.3. Клеточные механизмы антирадикальной защиты.

1,2.Исследования природных соединений фенольной природы.

1.2.1.Строение и распространение флавоноидов в природе.

1.2.2.Исследование антиоксидантной активности полифенольных соединений.

1.2.3 .Изучение комплексообразования флавоноидов.

1.2.4.Радиационно-химические исследования флавоноидов и их комплексов с ионами металлов.

1.3 .Существующие методы моделирования окислительных реакций.

ГЛАВА II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1.Объекты исследования и квалификация чистоты реактивов.

2.2.Приготовление образцов для радиационно-химических исследований.

2.3.Источники ионизирующего излучения. Техника облучения. Дозиметрия.

2.3.1.Установка импульсного радиолиза.

2.3.2.Установка для стационарного радиолиза.

2.4.Аналитические методы определения и идентификации продуктов

2.4.1 .Спектрофотометрические исследования.

2.4.2.Анализ продуктов радиолиза методом ВЭЖХ.

2.4.3 .Полярографическое детектирование комплексов фенольных и полифенольных соединений с ионами металлов.

2.5.Математический анализ экспериментальных данных.

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1.Исследование растворов флавоноидов.

3.1.1 Спектры оптического поглощения растворов флавоноидов различного строения в зависимости от среды растворителя.

3.1.2. Хроматографическое исследование состава растворов кверцетина в зависимости от природы растворителя.

3.2.Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами 3-d металлов.

3.2.1 .Спектрофотометрическое исследование комплексообразования флавоноидов с ионами металлов.

3.2.2.Полярографическое исследование комплексообразования антиоксидантов фенольной природы с ионами металлов.

3.3.Радиационно-химические превращения природных антиоксидантов флавоноидов.

З.ЗЛ.Спектрофотометрические исследования продуктов радиолиза флавоноидов.

3.3.2.Хроматографическое исследование продуктов радиолиза кверцетина.

3.4.Влияние сахаридов на радиолиз природных антиоксидантов.

3.4.1.Радиационно-химические превращения кверцетина в присутствии моносахарида рамнозы.

3.4.2.Радиационно-химические превращения природных аминополисахаридов хитозанов в присутствии Qr.

3.5.Радиационно-химические превращения комплексов флавоноидов с ионами металлов переменной валентности.

3.5.1.Спектрофотометрическое исследование продуктов стационарного радиолиза комплексов Qr с ионами металлов переходного З-d периода.

3.5.2.Импульсный радиолиз водно-спиртовых растворов Qr и Си2+ в аэробных и анаэробных условиях.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1.Влияние организации среды на радиационно-химические превращения флавоноидов.

4.2.Изменение физико-химических свойств растворов флавоноидов в присутствии ионов металлов.

4.3.Радиационно-химическое моделирование окислительно-восстановительных процессов в присутствии флавоноидов и их комплексов с ионами металлов.

4.4.Механизм взаимодействия супероксид анион-радикала Ог*" с природными полифенольными соединениями и их комплексами с ионами металлов.

ВЫВОДЫ.

Изучение ранних биохимических изменений, наступающих в живой клетке после облучения имеет существенное значение для понимания патогенеза лучевого поражения человека и животных, а также для изучения механизма действия и поиска новых более эффективных средств химической защиты от лучевого поражения. [1]

Как известно, объектами биологической химии являются несколько классов органических соединений, выполняющих в клетке жизненно важные функции - структурную (белки и липиды), энергетическую (липиды и углеводы), регуляторную (ферменты), сигнальную (гормоны) и информационную (нуклеиновые кислоты) [2,3,4]. Из неорганических соединений жизненно важными всегда представлялись в первую очередь вода (как универсальный растворитель) и кислород, изучению активных форм которого уделяется большое внимание [5].

Активные формы кислорода — группа свободнорадикальных молекул, являющихся частично восстановленными производными кислорода (Ог) и обладающих очень мощной окислительной способностью. Они, как правило, являются побочными продуктами работы дыхательной цепи - группы митохондриальных белков, утилизирующих кислород и непрерывно поставляющих клетке энергию в форме соединения АТФ - аденозинтрифосфорная кислота. Основным свободным радикалом является супероксид-радикал (ОгО- Сам по себе он не опасен, но легко превращается в перекись водорода (Н2О2), а перекись, в свою очередь — в гидроксил-радикал (ОН-). В ходе других реакций с участием кислорода образуются пергидроксид-радикал (НОО ), а также пероксид - и алкоксид-радикалы. Будучи сильнейшими окислителями, эти соединения крайне опасны для клетки. Они повреждают белки, нуклеиновые кислоты и липиды клеточных мембран. "Всплеск" генерации свободных радикалов (например, при ишемии мозга) способен привести к тотальной гибели клеток и отмиранию больших участков ткани [5,6].

Клетка обладает целым рядом механизмов антирадикальной защиты, которые можно разделить на ферментативные (специальные белки-ферменты катализируют превращение активных форм кислорода в неактивные) и неферментативные (соединения-антиоксиданты, например витамины Е, Р, способные непосредственно реагировать со свободными радикалами, нейтрализуя их) [7,8].

В наши дни производится множество антиоксидантов, входящих в состав самых различных лекарственных препаратов [9]. Антиоксидантные препараты представляются перспективными в профилактики и лечении стрессов, инсультов, ишемических и других заболеваний, так или иначе связанных с повышенной генерацией свободных радикалов. Многие исследователи-геронтологи полагают, что непрерывно накапливающиеся в клетках свободно-радикальные соединения напрямую ответственны за процессы старения организма [10,11]. Однако свободные радикалы -жизненно важные для клетки соединения. Многие из них несут важные физиологические функции. Так, гидроксид-радикал необходим для синтеза ряда биологических регуляторов (например, простагландинов), радикалы оксида азота (NO) участвуют в регуляции сокращения стенок кровеносных сосудов, а пероксинитрит стимулирует запрограммированную клеточную гибель (апоптоз). Поэтому роль свободных радикалов в организме далеко неоднозначна. Именно из-за этого многие антиоксидантные препараты оказались не только малоэффективными, но и вредными для здоровья.

Антиоксиданты можно получать из пищевых продуктов [12]. Флавоноиды кверцетин и рутин известны как витамины группы «Р». Многие растения, традиционно применяющиеся в народной медицине, содержат естественный комплекс антиоксидантов: биофлавоноиды, каротиноиды, витамины, эфирные масла. В их состав входят и микроэлементы, влияющие на свободнорадикальное окисление, такие как селен, медь, железо, цинк. Антиоксидантные свойства флавоноидов связаны, во-первых, с их способностью захватывать свободные радикалы и, во-вторых, с их хелатирующими свойствами, так как многие фенольные соединения обладают способностью образовывать комплексы с ионами переходных металлов, участвующих в реакциях перекисного окисления липидов [13].

Однако в литературе в последнее время стали появляться сведения о том, что комплексы флавоноидов с ионами металлов способны проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства [14]. На фармацевтическом рынке стали появляться сообщения о нежелательном антагонистическом взаимодействии между отдельными витаминами и минеральными веществами, в связи с чем подчеркиваются преимущества раздельного, не одновременного приема тех или иных витаминных или минеральных препаратов. Однако совершенно очевидно, что это не решение проблемы. В физиологии известно о явлении энтерогепатической циркуляции, т.е. постоянном круговороте пищевых веществ, в том числе витаминов и минералов. Поэтому актуальными становятся исследования комплексообразования флавоноидов и изменения функциональной активности антиоксидантов в присутствии ионов металлов. В начале 90-х годов было предложено использовать радиационно-химическое моделирование процессов свободно-радикального окисления для изучения биохимических реакций, протекающих с участием природных биологически активных соединений [15].

Изучению факторов, влияющих на изменение антиоксидантной активности флавоноидов методами радиационно-химического моделирования, посвящена данная работа.

выводы

1. Радиационно-химические исследования водно-органических растворов природных антиоксидантов, моделирующие окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, показали, что радиационная чувствительность флавоноидов зависит от их структуры и природы растворителя.

2. Проведены спектрофотометрические исследования конечных продуктов радиолиза флавоноидов. Продукты радиолитического окисления кверцетина были дополнительно изучены методом ВЭЖХ: определены времена удерживания и спектры оптического поглощения индивидуальных соединений.

3. Сравнение радиационно-химических превращений флавоноидов различного строения агликона -Qr и глюкозида - Rut позволило определить протекторную роль сахарного фрагмента рамнозы в молекуле Rut, но не в качестве добавки в облучаемый раствор Qr.

4. Спектрофотометрическим методом исследованы условия формирования комплексов флавоноидов с ионами металлов З-d периода:

Zn2+, Mn2+, Co2+; проведено сравнение радиационной устойчивости флавоноидов и их комплексов с металлами.

5. Методом переменнотоковой вольтамперометрии в широком диапазоне изменения относительных концентраций в буферных растворах алкилрезорцина С7 , полифенольных соединений флавоноидов и различных ионов металлов в отсутствие и присутствии молекулярного кислорода получены результаты, доказывающие существование, на примере Qr, таких комплексов, как (nQr.mMe2+), (nQr.k02), (mMe2+.Юг) и разнолигандных комплексов (nQr.mMe2+.k02).

6. Методом импульсного радиолиза со спектрофотометрической детектированием промежуточных частиц радиолиза зарегистрированы сигналы, и, соответственно построены спектры оптического поглощения супероксид анион-радикалов в буферных водно-спиртовых растворах и супероксокомплексов в присутствии кверцетина в этих растворах и ионов меди. Проведено сравнение спектральных и кинетических характеристик 02"' и супероксид-ион-содержащих комплексов.

7. Данные импульсного радиолиза подтверждают механизм образования: а) супероксокомплексов флавоноидов при взаимодействии e'soiv с g I в лабильными комплексами (Qr .О2 ") с частичным переносом заряда, ответственным за раннюю стадию активирования молекулярного кислорода природными соединениями; б) разнолигандных супероксокомплексов Qr с ионами меди (nQr.mMe .Ю2)", кинетика гибели которых отличается от супеоксокомплекса, а механизм трансформации внутрикомплексного супероксид-иона до воды имеет каталитический характер с регенерацией исходного комплекса.

8. Анализ результатов изучения электрохимического восстановления кислорода в буферных растворах в присутствии кверцетина и ионов металлов позволил сделать вывод о важном влиянии состава комплексов (nQr.mMe2+ .Ю2) на механизм последующих редокс-реакций, в которых флавоноиды проявляют антиоксидантные, или прооксидантные свойства.

1. Романцев Е.Ф., Блохина В.Д., Н.Н. Кощеенко, И.В. Филиппович. Ранние радиационно-химические реакции. // Москва, Атомиздат, 1966, 271с.

2. Белозерский А.Н. Молекулярная биология новая ступень в познании биологии. - М.: Наука, 1996.

3. Березов Т.Т. и др. Биологическая химия. М.: Просвещение, 1990.

4. Альберте Б. Молекулярная биология клетки. М.: Наука, 1978.

5. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита. //Соросовский образовательный журнал, №1, 1999, с.2-7.

6. Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг. //«Соросовский образовательный журнал», том.7, №4,2001.

7. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты.//Вестник РАМН.- 1998. -№7.-С.43-51.

8. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. Итоги Науки и Техники, серия Биофизика, том.29. In: Москва: ВИНИТИ, 1992:3-250.

9. Максимова Т.В., Пахомов В.П. Лекарственные средства природного происхождения, обладающие антиоксидантной активностью. //Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума. Тюмень: Изд-во Тюменского гос. ун-та, 1997.

10. Волькенштейн М.В. Молекулы и жизнь. М.: Наука, 1965.

11. И. Голиков А. П,. Бойцов С. А,. Михин В. П, Полумисков В. Ю. Свободнорадикальное окисление и сердечно-сосудистая патология: коррекция антиоксидантами. //Лечащий Врач, №4, 2003.

12. Бокаева С.С., Пашина О.Т., Бикбулатова Т.Н. Изучение влияния растительных полифенолов на результаты лучевой терапии вэксперименте. //Тезисы докладов пятого всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Таллин, 1987г., с21.

13. Гордиенко А.Д., Комиссаренко Н.Ф., Левченко В.В., Воскобойникова Т.Н. Антиоксидантные свойства природных фенолов. //Тезисы докладов V всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Таллин, 1987г., с32.

14. Sugihara N., Arakawa Т. Anti- and pro-oxidative effects of flavonoids on metal-induced lipid hydroperoxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepatocytes loaded with alpha-linolenic acid. //Free radical Biol. Med., 27(11-12), 1999, pp 1313-23.

15. Ревина А.А. Радиационно-химическое моделирование быстропротекающих процессов с участием промежуточных кислородсодержащих реакционных центров в различных системах. Автореферат докт. дисс., Москва, 1995.

16. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.

17. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. //Биохимия человека (в 2-х томах).М.: Мир, 1993

18. Филиппович Ю.В. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1969.

19. Бресслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. М.: Высшая школа, 1966.

20. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука,1972. - 256 с.

21. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в билогических мембранах. Москва, Наука, 1972.

22. Ланкин В. 3., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. М., 2001. - 78 с.

23. Szarka Andras; Stadler Krisztian; Jenei Veronika; Margittai Eva; Csala Miklos; Jakus Judit; Mandl Jozsef; Banhegyi Gabor. Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. //

24. Journal Of Bioenergetics And Biomembranes, Volume 34, Issue 4, 2002, Pages 317-323.

25. Зенков H. К., Ланкин В. 3., Меньшикова E. Б. Окислительный стресс. М.: Наука, 2001. 342 с.

26. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты. Новосибирск, 1994.-203С.

27. Jenkinson SG: Oxygen toxicity./ J. Intensive Car Med. 1988.

28. Физиология человека. В 3-х т. .Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса М.: Мир, 1996.

29. Осипов А.Н., Савов В.М., Зубарев В.Е., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Участие железа в образовании ОН-радикалов в системе, генерирующей супероксидный радикал. //Биофизика, 1981, т.26, №2, с. 193-197.

30. Осипов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа.//Биофизика 1993, т.38, №3, с.390-396.

31. Jose L. Quiles, Jesus R. Huertas, Maurizio Battino, Jose Mataix and M. Carmen Ramirez-Tortosa. Antioxidant nutrients and adriamycin toxicity //Toxicology, Volume 180, Issue 1, 2002, Pages 79-95.

32. Kagan V.E.; Kisin E.R.; Kawai K.; Serinkan B.F.; Osipov A.N.; Serbinova E.A.; Wolinsky I.; Shvedova A.A. Toward mechanism-based antioxidant interventions: lessons from natural antioxidants./Ann N Y Acad Sci., 2002, Vol. 959, p. 188-198.

33. Lhami Gul^in, O. Irfan Kufrevioglu, Mtinir Oktay and Mehmet Emin Buyukokuroglu. Antioxidant, antimicrobial, antiulcer and analgesic activities of nettle.// Journal of Ethnopharmacology, Vol. 90, Issues 2-3, 2004, Pages 205-215.

34. Запрометнов M.H. Фенольные соединения. Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993.-272с.

35. Исследование биологически активных веществ плодовых культур. Методические указания. Ленинград: ВИР им. Н.И. Вавилова, 1989. -81с.

36. Fanburg BL. Oxygen toxicity: Why can't a human be more like a turtle? /Intens. Care Med. 1988.

37. M. Careri, F. Bianchi and C. Corradini. Recent advances in the application of mass spectrometry in food-related analysis //Journal of Chromatography, Volume 970, Issues 1-2,2002, Pages 3-64.

38. Запрометнов M.H. Фенол ьные соединения растений и их биогенез. «Биологическая химия»//Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР, М.,1988, Т.27, С.1-188.

39. Березовский В.М. Химия витаминов, М, Пищепромиздат, 1959г.

40. Запрометнов М.Н. Образование и функции фенольных соединений в высших растениях. /Журнал общей биологии.-1970.-Т.31. Вып2.-с.201-221.

41. Кретович B.JI. //Основы биохимии растений. .М.: Высшая школа, 1971.

42. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. М.: Наука, 1985.

43. Харборн Дж. Фенольные гликозиды и их распространение в природе. В кн.: Биохимия фенольных соединений. М.: Мир, 1968, с. 70-108.

44. Swain Т. Flavonoids as evolutionary markers in primitive Tracheophytes. — In: Chemistry in botanical classification. Nobel Symp. 25, New York, London: Acad.press, 1974, p. 81-92.

45. Харборн Дж. Флавоноидные пигменты. В кн.: Биохимия растений. М.: Мир, 1968, с. 374-388.

46. Hsieh R.J.; German J.B; Kinsella J.E. Relative inhibitory potencies of flavonoids on 12-lipoxygenase of fish gill. // Lipids, V.23, Iss.4, 1988, pp.322-326.

47. Бахтина С.М., Соловьёва У.Г. К вопросу об антиоксидинтной активности препарата «Оксофил» //Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума. Тюмень: Изд-во Тюменского гос. ун-та, 1997.

48. Takuya Sugahara, Chau-Ching Liu, Т. Govind Pai and Ming-Cheh Liu. Molecular cloning, expression, and functional characterization of a novel zebrafish cytosolic sulfotransferase //Biochemical and Biophysical

49. Research Communications, Volume 300, Issue 3, January 2003, Pages 725-730.

50. Биохимия фенольных соединений /под ред. Дж. Харборна. М.: Мир, 1968.-451с.

51. Лебедева Т.С., Сытник К М. Пигменты растительного мира. К.: Наукова думка, 1986. -84с.

52. Бриджит Г. Биохимия природных пигентов. М.:Мир, 1986, 422с.

53. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Комиссаренко Н.Ф. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения. Кумарины и фурокумарины. //Растительные ресурсы. 1997, Т.ЗЗ, вып.З, стр.32-36.

54. Коспок В.А., Потапович А.И., Терещенко С.М., Афанасьев И.Б. Антиокислительная активность флавоноидов в различных системах перекисного окисления липидов. //Биохимия. 1988.Т.53. с. 1365-1370

55. Тюкавкина Н.А. Некоторые аспекты современных исследований в области фенольных соединений. //Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям, Москва 2004, с 11-12.

56. Луцик Т.К. Исследование промежуточных продуктов импульсного радиолиза флавоноидов. //Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Кишинев, 1989.

57. Запрометнов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. -М.: высшая школа, 1974.-214с.

58. Takahama Umeo. Hydrogen peroxide-dependent oxidation of flavonols by intact spinach chloroplasts//Plant Physiol.-1984.-V.74, No.5.p.852-855.

59. Brenda Winkel-Shirley. Biosynthesis of flavonoids and effects of stress //Current Opinion in Plant Biology, Vol.5, Issue 3, June 2002, Pages 218223.

60. Takahama Umeo: Redox reaction between kacmpferol and illuminated chloroplasts// Plant physiol. -1983.-V.71, No.3.-p.598-601.

61. Музафаров Е.Н. Механизм действия и физиологические функции флавоноидов при фотосинтезе высших растений. //Автореферат докт. дис. Тбилиси,1990.

62. Мальян А.Н., Акулова Е.А., Музафаров Г.Н. Кверцетин -аллостерический регулятор активности сопрягающего фактора фотофосфорсоединений. //Биоорг. химия, 1977, т., №5, с635-645

63. Гришакова В.Г., Вшивцев B.C., Хандобина Л.М. Физиологическая роль ряда фенольных соединений, образующихся в тканях моркови под воздействием гриба Phoma Rostripii.//Hay4Hbie докл. Высшей школы. Биологические науки. 1984, №6, с.63-67.

64. Любимов В.Ю, Назарова Г.Н. Музафаров Е.Н. Влияние флавоноидов на фотосинтетическую ассимиляцию С02 изотированными хлоропластами шпината. В кн.: Свойства флавоноидов и их функций в метаболизме растительной клетки. Пущино, 1986, с. 104-115.

65. Прохорчик Р.А., Волынец А.П. Действие флавонолов на активность хлоропластов люпина и пороха. //Физиолог. Биохим. Культ.раст., 1973. Т.5., №.6. - С623-627.

66. Ткемаладзе Г.Ш., Морчиладзе З.Н., Джимаслигивили Ц.Ш., Кретович B.JI. Влияние фенольных соединений на активность малатдегидрогеназы чайного растения. //Прикл. Биох. и микробиол., 1972, т.8, №3, с.275-281.

67. Ревина А.А., Луцик Т.К. Роль кислорода в радиационно-химических превращениях полифенольных соединений //Сборник докладов 3-го рабочего совещания по радиационным воздействиям. —ГДР, Лейпциг, 1984. -№98.-с.702-708.

68. Фролов Ю.Л., Сапожников Ю.М., Барер С.С. и др. Электронные спектры поглощения флавоноидов//Известия АН СССР. Серия химическая. -1974.-№6., с.1294-1298.

69. Орлов В.Д., Боровой И.А., Лаврушин В.Ф. Электронные спектры поглощения 41-замещенных флавонолов// ЖОХ, 1975, Т.45, вып.1.-с.126-130.

70. Kurtin W Е, Soon Electronic Structures and spectra of some natural products of theoretical Interest. -1 Molecular orbital studies of anthocyanoids // Tetrahedron -1968, Vol.24, pp 2255-2267

71. Be-Jen Wang , Yen-Hui Lien and Zer-Ran Yu. Supercritical fluid extractive fractionation study of the antioxidant activities of propolis //Food Chemistry, V.86, Issue 2,2004, Pages 237-243.

72. Broulillard R. Flavonoids and flowwer colour. //In: The flavonoids. Edited by Harborne J.B. London, 1989, pp.268.

73. Дороненко А.Н., Бродский А.В., Афанасьев И.Б. Хелатирующее и антирадикальное действие рутина в процессе перекисного окисления липидов микросом и липосом. //Биохимия, т.53, вып. 10, 1988.

74. Brian J. Denny, Peter A. Lambert and Patrick W. J. WestThe flavonoid galangin inhibits the LI metallo-^-lactamase from Stenotrophomonas maltophilia //FEMS Microbiology Letters, Volume 208, Issue 1, 2002, Pages 21-24.

75. Brown J.E., Khodr H., Hider R.C., Rice-Evans C.A. Structural dependence•y .of flavonoid with Cu ions: implications for their antioxidant properties. //Biochemistry J. 1998.Vol.330. Pp.1173-1178.

76. Геллерт P., Бау P., Мартин P., Мариам Я., Зигель X., Джек Т., Давыдова С. //Ионы металлов в биологических системах. Том 8 (пер. с англ. под ред. Давыдовой СЛ.) М.: Мир, 1982

77. Potapovich A.I., Vladykovskaya Е.М., Kostyuk V.A. Influence of metal ions on biological activity of natural flavonoids. //Doklady of the national Accademy of sciences of Belarus. Vol.46, N.6,2002, pp.60-63.

78. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Руленко И.А., Колесник Ю.А., Тюкавкина Н.А. Взаимодействие дигидрокверцетина с ионами двухвалентного железа. //Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума. Тюмень: Изд-во Тюменского гос. ун-та, 1997

79. Рошаль А.Д., Сахно Т.В. Теоретический анализ структуры комплексов 5-гидрокисфлавонолов с ионами металлов и производными бора //Вестник Харьковского нац. университета. 2001. №532. Химия. Вып.7(30). С.123-129.

80. Макашева И.Е., Головкина М.Т. Взаимодействие кверцетина с ионами меди(П) в водно-спиртовых растворах. //ЖОХ, 1973, Т.43, вып.7, с.1641-1645.

81. Monika Soczynska-Kordala, Anna Bakowska. Metal Ion-flavonoid association in bilayer phospholipids membranes.//Cellular and molecular biology letters. Vol.6, 2001, pp277-281.

82. Сорокин B.A., Валеев B.A., Гладченко Г.О. Природа различий в связывании ионов переходных металлов 3d-rpynnbi с гуанозин-5 -монофосфатом. //Биофизика. 1999, Т.44. №1, с.38-44.

83. Mario Е. Bodini, М. A. del Valle, R. Tapia, F. Leighton and P. Berrios .Zinc catechin complexes in aprotic medium. Redox chemistry and interaction with superoxide radical anion. //Polyhedron, V.20, Iss. 9-10, 2001, pp. 1005-1009.

84. Fernandez M.T., Mira M.L., Florencio M.H. et al. Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study//J. Inorg. Biochem. 2002. Vol.92, №2. P. 105-111.

85. Boadi, William Y; Iyere, Peter A; Adunyah, Samuel E. Effect of quercetin and genistein on copper- and iron-induced lipid peroxidation in methyl linolenate, Journal Of Applied Toxicology: JAT, Vol.23, Issue 5, 2003, Pages 363-369.

86. M. Tereza Fernandez, M. Lurdes Mira, M. Helena Florencio and Keith R. Jennings. Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study //J. of Inorganic Biochemistry, V.92, Iss.2, 2002, pp 105-111.

87. Seoud O.A., Chinelatto A.M., Shimizu M.R. Asid-base indication equilidria in the presence of Aerosol-OT aggregates in heptane. //Journal of Colloid and Interface Science. 1982. Vol.88, №2. pp. 420-427.

88. Sharon A. Mechanism of protection by the flavonoids, quercetin and rutin, against tert-butylhydroperoxide- and menadione-induced DNA single strand breaks in Caco-2 cells.//Free Radical Biology and Medicine, V.29, Is.6,2000, pp.507-514.

89. Назаренко B.A., Бирюк E.A., Равицкая P.B. Антопович В.П. Взаимодействие солей титана с кверцетином. //Укр. Хим. Журн., 1968, Т.34, в.2, с.115-120.

90. Ревина А.А., Егорова Е.М., Каратаева А.Д. Взаимодействие природного пигмента кверцетина с наночастицами серебра в обратных мицеллах. //Журнал Физической Химии. 1999.Т.73, №10. с. 1897-1904

91. Egorova Е.М., Revina А.А. Synthesis of metallic nanoparticles in reverse micelles in the presence of quercetin. //Colloids and Surfaces. A.2000.Vol.168, pp.87-96.

92. Fujii H., Kawai Т., Nishikawa H., Ebert G. Determination of pH in reversed micelles. //Colloid & Polymer Science. 1982.Vol.260, pp.697701.

93. Дей К., Селбин Д. Теоретическая неорганическая химия. Изд-е 3-е / Пер. с англ. М.: Химия, 1976, -568с.

94. Хьюи Дж. Неорганическая химия. Строение вещества и реакционная способность. Пер. с англ. (Под.ред. Б.Д. Степина, Р.А. Лидина. -М.: Химия, 1987. -696с.

95. Улахович Н.А. Комплексы металлов в живых организмах. // Соросовский образовательный журнал, №8, 1997.

96. Vachalkova, A; Novotny, L; Nejedlikova, M; Suchy, V. Potential carcinogenicity of homoisoflavanoids and flavonoids from Resina sanguinis draconis (Dracaena cinnabari Balf.). //Neoplasma, Volume 42, Issue 6,1995, Pages 313-316.

97. Georgievskil, V P. Physico-chemical methods of analyzing phytochemical preparations and vegetal raw materials. II. Electrochemical methods. //Farmatsevtychnyi Zhurnal, Issue 2, 1977, Pages 64-68.

98. Sakaguchi Т., Nakajima A. Accumulation of Uranium by Biopigments. //J. Chem. Tech. Biotechnol. 1987.Vol.40. pp. 133-141.

99. Zhonghong Gao, Huibi Xu, Xiaojun Chen and Hao Chen. Antioxidant status and mineral contents in tissues of rutin and baicalin fed rats //Life Sciences, Volume 73, Issue 12, August 2003, Pages 1599-1607.

100. Дороненко A.H.,Бродский A.B, Афанасьев И.Б. Хелатирующее и антирадикальное действие рутина в процессе перекисного окисления липидов, липосом и макросом. //Биохимия, Т.53, вып. 10, 1988г.

101. Astashov V.V. Blood flow in the popliteal lymph node region of rats in experimental myocardial ischemia and its treatment with dog-rose polyphenols. //Biulleten' Eksperimental'Noi Biologii i Meditsiny, Volume 112, Issue 7,1991, Page 107.

102. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. Оценка антиокислительной активности с применением желточных липопротеидов. //Лабораторное дело. -1988.-№5. — С.59-62.

103. Maitra A. Determination of size parameters of Water-Aerosol OT-Oil reverse micelles from their nuclear magnetic resonance data. //J. Phys.Chem. 1984.Vol.88. pp.5122-5125.

104. Majid Y. Moridani, Jalal Pourahmad, Hoang Bui, Arno Siraki and Peter J. O'Brien. Dietary flavonoid iron complexes as cytoprotective superoxide radical scavengers //Free Radical Biology and Medicine, V.34, Iss.2, 2003, pp. 243-253.

105. Andrew L. Feig, Stephen J. Lippard. Reactions of non-heme Iron (II) centers with Dioxygen in biology and Chemistry //Chemical Reviews, 1994, V.94, № 3, p.759-805.

106. Roginsky V.A., Barsukova Т.К., Remorova A.A., Bors W. Moderate antioxidative efficiencies of flavonoids during peroxidation of methyl linoleate in homogeneous and micellar solutions. //JAOCS, Vol.73, No6, 1996.

107. Mary Satterfield and Jennifer S. Brodbelt. Structural characterization of flavonoid glycosides by collisionally activated dissociation of metal complexes //J. of the American Society for Mass Spectrometry, V.12, Iss.5, 2001, pp. 537-549.

108. Cesar G. Fraga and Patricia I. Oteiza. Iron toxicity and antioxidant nutrients //Toxicology, Volume 180, Issue 1,2002, Pages 23-32.

109. Santosh Khokhar and Richard. K. Owusu Apenten. Iron binding characteristics of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations//Food Chemistry, Volume 81, Issue 1, May 2003, Pages 133-140.

110. Pereira, T A; Das, N P. Assay of liver cytosol lipoxygenase by differential pulse polarography. // Analytical Biochemistry, V.197, Iss.l, 1991, Pages 96-100.

111. Borsari M., Gabbi C., Ghelfi F. et al. Silybin, a new iron-chelating agent //J. Inorg. Biochem.2001. Vol.85, №2. P.123-129.

112. E. Reichart and D. Obendorf. Determination of naringin in grapefruit juice by cathodic stripping differential pulse voltammetry at the hanging mercury drop electrode. //Analytica Chimica Acta, Volume 360, Issues 1-3, 1998, pp. 179-187.

113. Kelly E. Heim, Anthony R. Tagliaferro and Dennis J. Bobilya. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships //The Journal of Nutritional Biochemistry, Vol. 13, Issue 10, 2002, Pages 572-584.

114. Mary Satterfield, Jennifer S. Brodbelt. Enhanced detection of flavonoids by metal complexion and electrospray ionization mass spectrometry. //Analit.Chem. V.72, 2000, pp5898-5906.

115. Romanova D; Vachalkova A. UV spectrometric and DC polarographic studies on apigenin and luteolin. //Archives Of Pharmacal Research, Volume 22, Issue 2, April 1999, Pages 173-178

116. Chenyang Zhao, Yimin Shi, Wenfeng Wang. Fast repair activities of quercetine and rutin toward dGMP hydroxyl radical adducts. //Radiation physics and Chemistry. V.63, 2002, pp.137-142.

117. Robinson B.H., Khan-Lodhi A.N., Towey T. Microparticle synthesis and characterization in revers micelle, //in Pilrni M. (Ed.), Structure and reactivity in reverse micelles, Elsevier, Amsterdam, 1989, pp. 199-219.

118. Mishra В, Priyadarsini К, Kumar M. Effect of O-glycosilation on the antioxidant activity and free radical reactions of a plant flavonods. //Biooganic and medicinal chemistry. V.l 1, 2003, pp.2677-2685.

119. Mario Foti, Mario Piattelli, Maria Tiziana Baratta. Flavonoid, coumarins and cinnamic acid as antioxidant in a micellar system. Structure-activity relationship. //J. Agric.Food Chem., Vol.44, No2, 1996.

120. Potapovich, A I; Kostyuk, V A. Comparative study of antioxidant properties and cytoprotective activity of flavonoids, Biochemistry.// Biokhimiia, Volume 68, Issue 5, May 2003, Pages 514-519.

121. Southern P.A, Powis G. Free radicals in medicine. II. Involvement in human disease. Mayo Clin. Proc. 1988.

122. Оганесянц JI.А., Телегин Ю.А. и.др. Новый метод определения антиоксидантной активности красный вин.//«Виноделие и виноградство», №5,2003, стр.27-29.

123. Рогинский В.А. Антиоксидантные свойства природных полифенолов. // Доклады VI Симпоз. по фенольным соединениям, Москва 2004, С105-106.

124. Фархутдинов P.P. Изучение антиокислительной активности продуктов природного происхождения. //Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сборник научных трудов. Вып. 10, Москва, 2003.

125. Xu L X. Application of polarography in the determination of active constituents of Chinese materia medica. //Zhong Yao Tong Bao (Beijing, China: 1981), Volume 7, Issue 5, September 1982, Pages 39-42.

126. Xu, L X; Zhang, X Q. Determination of total flavonoids in Epimedium brevicornum maxim by differential pulse polarography. //Yao Xue Xue Bao/Acta Pharmaceutica Sinica, Volume 24, Issue 8, 1989, Pages 606-610.

127. Zhang X Q; Xu L S. Determination of avicularin in Polygonum aviculare by square wave polarography. //Proceedings Of The Chinese Academy Of Medical Sciences And The Peking Union Medical College,V.4, Iss.4, 1989, Pages 193-195.

128. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection □. //Talanta. 2000. V.51, №4. P.709-716.

129. Yasuko Sakihama, Michael F. Cohen, Stephen C. Grace and Hideo Yamasaki. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants //Toxicology, V.177, Iss. 1,2002, pp. 67-80.

130. Galati G., Ssbzevari O., Wilson J.X. et.al. Prooxidant activity and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenols //Toxicology 2002. Vol.177. N1. P.91-104.

131. S. Azam , N. Hadi , N. U. Khan and S. M. Hadi. Prooxidant property of green tea polyphenols epicatechin and epigallocatechin-3-gallate: implications for anticancer properties //Toxicology in Vitro, V.3, 2004, pp. 116-125.

132. Пикаев A.K., Кабакчи С.А., Макаров И.Е., Ершов Б.Г. Импульсный радиолиз и его применение. — М.: Атомиздат, 1980, 280с.

133. Пикаев А.К. Современная радиационная химия (в 3-х томах). -М., Наука, 1985.

134. Васильев В.П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа. М., «Дрофа», 2002г., с.211-230.

135. Крюкова Т.А. Синякова С.И., Арефьева Т.В. Полярографический анализ. М.: Госхимиздат, 1957. -772с.

136. Кольтгоф И.М., Белчер Р., Стенгер В.А., Матсуями Дж. Объемный анализ. Том III. Практическая часть. Методы окисления — восстановления. /Пер.с англ. М.: Госхимизадт. 1961. -840с.

137. Яноши JI. Теория и практика обработки результатов измерений. -М., Мир, 1968,462с.

138. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии . -М. «Химия», 1988.

139. Сердюк А.И., Кучер Р.В. Мицеллярные переходы в растворах поверхностно-активных веществ. Киев: «Наук, думка», 1987.

140. Зайцев П.М., Ревина А.А., Федулов Д.М. //Журнал Физ.химия, 2003, т.77, №2, с. 339-344.

141. Яцимирский К.Б., Братушко Ю.И., Бударин Л.И. и др. Биологические аспекты координационной химии. /Под общ.ред. К.Б. Яцимирского — Киев: Наук, думка, 1979. -268с.

142. Feig F., Land Lippard S.J.//Chem.Rev., 1994, №94, p.759-805.

143. Каплан Б.Я., Пац Р.Г., Салихджанова Р.М.-Ф. Вольтамперометрия переменного тока. Серия «Методы аналитической химии», -М.: Химия, 1985.-264с.

144. Картмелл Э., Фоуле Г.В.А. Валентность и строение молекул/ Пер. с англ. М.: Химия, 1978, -360с.

145. Дей К., Селбин Д. Теоретическая неорганическая химия. Изд-е 3-е/ Пер. с англ. М.: Химия, 1976, -568с.

146. Крюкова Т.А., Синякова С.И., Арефьева т.В. Полярографический анализ. М.:Госхимиздат. 1957, -772с.

147. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. /Пер. с польск. М.: Мир, 1974, -552с.

148. Турьян Я.И. Окислительно-восстановительные реакции и потенциалы в аналитической химии. М.: Химия, 1989. -248с.

149. Дорофеева Г.И., Канте С.А. Молодкин А.К., Селезнева Н.Г., Зайцев П.М. // Координационная химия. 1998, т. 24. № 6, с. 445-448.

150. Турьян Я.И., Рувинский О.Е., Зайцев П.М. Полярографическая каталиметрия. М.: Химия, 1998. -272с.

151. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. 5-е изд., М.: Химия, 1979.-480с.

152. Ревина А.А., Ларионов О.Г., Кочетова М.В. и др. Спектрофотометрическое и хроматографическое исследование продуктов радиолиза аэрированных водных растворов алкилрезорционов. //Изв. АН, Сер. Химия, 2003, №11, с.2257-2263.

153. Engelkemeir D.W., Geissnam Т. A., Crowell W.R. Flavononts and recated compounds. The reduction of some naturally-occurring flavones at the dropping mercury electrode. //J.Am.Chem. Soc., 1947.-V.65, ppl55-159.

154. Сараева B.B. Окисление органических соединений под действием ионизирующих излучений. Москва, МГУ, 1991.-264с.