Разработка иммуносенсора для определения Escherichia coli и антигена вируса кори с использованием нанокомпозитов на основе Fe3O4 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

9 15-2/86

На правах рукописи

„М-

МАЛЫШЕВА Наталья Николаевна

РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ESCHERICHIA COLI И АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe,04

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Екатеринбург - 2015

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химико-технологического института федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Матери Анатолий Иванович

Евтюгин Геннадий Артурович,

доктор химических наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», заведующий кафедрой аналитической химии Химического института им. A.M. Бутлерова

Стожка Наталия Юрьевна,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Уральский государственный экономический университет», заведующая кафедрой физики и химии Института торговли, пищевых технологий и сервиса

ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г. Уфа

Защита состоится 13 октября 2015 г. в 15 ч 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.285.09 на базе ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина» по адресу: 620002, г. Екатеринбург, ул. Мира 19, зал Ученого совета (И-420).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»: http://dissovet.science.urfu.ru/news2/

Автореферат разослан « 21» шОи^Х 2015 г.

Ученый секретарь у . ,

диссертационного совета ¿А^^е.*»*.* Ямщиков Леонид Федорович

Общая характеристика Актуальность работы. В связи с увеличением плотности населения,

проблема инфекционного загрязнения биологических и природных объектов

актуальна как для стран «третьего мира», так и для развитых стран. Быстрое

обнаружение инфекционных агентов чрезвычайно важно для эффективной

профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций.

В медицинском практике для идентификации и определения концентрации

бактерий и вирусов в различных объектах используются методы:

бактериального посева, ПЦР, ИФА. Основными недостатками метода

бактериального посева являются его длительность (от 3-х дней) и высокие

требования к стерильности лаборатории. Опосредованное определение

возбудителя инфекции методом ИФА путем измерения количества

выработавшихся антител может дать искаженный результат в случае

запоздалого или слабого иммунного ответа организма. Кроме того, ИФА

требует применения нестабильных при хранении ферментов. При анализе

методом ПЦР существует вероятность получения ложноположительных

результатов, т.к. данный метод не способен «отличить» мертвую инфекцию от

живой. Актуальным вопросом является разработка недорогих экспрессных

методов, которые возможно реализовать в небольших лабораториях, в полевых

условиях пли «у постели» больного.

Стенень разработанности темы исследования. Применение для

детекции инфекционных агентов электрохимических методов, позволяющих

быстро п с высокой точностью определять различные аналиты в объектах

биологического и природного происхождения, с использованием относительно

недорогого оборудования, активно обсуждается в литературе. С другой

стороны, еще одним перспективным направлением является использование в

разработке методов обнаружения инфекционных агентов наноматериалов.

Особый интерес представляет применение нанокомпозитных частиц,

сочетающих в себе магнитное ядро и функциональное полимерное покрытие.

Сочетание простоты, доступности и чувствительности электрохимических

г-„,Г0ССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ! библиотека

методов с последними достижениями в области напотехпологий позволит разработать новые экспрессные, чувствительные и селективные методы и сенсоры, а также исключить применение ферментов при определении бактерий и вирусов.

Цель работы. Разработка бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода для количественного определения:

— бактерий (на примере E.coli АТСС 25922) с использованием нанокомпозитных частиц Fe304 с электроактивпым покрытием в качестве сигналообразующей метки;

- антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори NovO/96) с использованием конъюгатов антител и магнитных нанокомпозитных частиц.

Сочетание магнитных свойств Fe30^ и электроактивного покрытия нанокомпозита (НК), генерирующего прямой стабильный, хорошо выраженный электрохимический сигнал, даст возможность упростить, удешевить н ускорить процедуру определения бактерий в биологических и природных объектах. Синтез и применение конъюгатов антител с магнитными НК позволит разработать простой и чувствительный метод определения антигенов вирусов.

Научная новизна работы

1. Методом электронной микроскопии исследованы размер, форма и степень агрегированности синтезированных по оригинальным методикам НК на основе Fe304, с электроактивпым покрытием (полипиррол; поливинилбензилхлорид, модифицированный хинолином; оксид кремния, модифицированный ферроценом), а также скорость и мера проникновения их в клетку бактерии E.coli. Установлено, что размер НК зависит от используемого метода полимеризации. Метод эмульсионной полимеризации и золь-гель метод, в отличие от метода in-situ, позволили получить НК размером < 100 им. Показано, что степень и скорость проникновения в клетку зависит от природы покрытия НК.

2. Исследованы электрохимические свойства НК. Показано, что все виды синтезированных НК проявляют электрохимическую активность в рабочем

диапазоне потенциалов водных растворов ог -1 до +1 В, что позволяет использовать их в качестве сигналообразующей метки в водных средах.

3. Впервые показана возможность использования в электрохимическом бесферментном нммуноаналпзе синтезированных магнитных НК в качестве «прямой» сигналообразующей метки. Установлена линейная зависимость между величиной прямого электрохимического отклика НК - «метки», входящей в состав иммунокомплекса и концентрацией бактерий в пробе. Установлено оптимальное время инкубации НК с бактериями и время образования иммунокомплекса.

4. Найдены оптимальные условия проведения процедуры иммуноанализа, обеспечивающие экспрессное (4а„„шм = 60 мин), чувствительное (диапазон линейности 2.3-Ю2 - 2.3-I07 КОЕ/мл) и специфичное количественное детектирование бактерий E.coli. Показана применимость разработанного подхода к определению содержания E.coli в реальных объектах (пробах воды и воздуха). Установлено, что на результат количественного определения целевого апалита не влияет присутствие в пробе бактерий других видов.

5. Показана и обоснована возможность применения разработанного гибридного варианта иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с магнитными ПК, для селективного определения антигена вируса кори в модельной системе. Установлено влияние на величину сигнала времени инкубации конъюгата с антигеном и времени образования «сэндвич» -иммунокомплекса.

Практическая значимость работы

1. Получены по оригинальным методикам электрохимически активные НК с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры и конъюгаты антител с НК на основе FejC^c оксидкремниевым покрытием.

2. С использованием предложенного иммуносенсора и алгоритма гибридного иммупоэлектрохимического метода анализа, с применением синтезированных электроактивпых папокомпозитных частиц, разработан метод иммуноанализа для определения бактерий.

3. Проведены исследования по сравнительному определению содержания бактерии E.coli в модельных и реальных объектах с использованием разработанного иммуносенсора и традиционно-используемых методов ИФА и бактериального посева.

4. Разработан подход к определению антигенов вирусов методом электрохимического иммуноанализа с использованием конъюгатов антител с ПК.

Положения, выносимые на защиту

1. Оригинальные методики получения стабильных во времени электрохимически активных НК на основе Fej04 с хинолин-модифицированным поливинилбензилхлоридным покрытием, покрытием из полипиррола, ферроценмодифицированным оксидкремниевым покрытием с узким распределением по размерам, определенной формы, состава, структуры.

2. Результаты ИК-спектроскопии подтверждающие наличие электроактивного полимерного покрытия на наночастицах Fe30_|.

3. Результаты исследований размеров, формы и морфологии синтезированных НК, полученные с помощью микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией и метода динамического светорассеяния.

4. Результаты электрохимических исследований синтезированных ПК.

5. Результаты исследования взаимодействия синтезированных НК на основе Fe304 с различными электроактивпыми полимерными покрытиями с культурой бактерии E.coli.

6. Иммуносенсор и метод электрохимического определения содержания бактерии E.coli.

7. Результаты определения с использованием разработанного иммуносенсора и метода содержания бактерии E.coli в реальных объектах, подтвержденные данными полученными в независимой лаборатории ФБУП ГН1Д ВБ «Вектор» (г.Новосибирск) методами ИФА и бактериального посева.

8. Метод электрохимического иммуноанализа для определения антигенов вирусов на примере антигена вируса кори NovO/96.

Работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Х'ГИ УрФУ в рамках госбюджетной темы H687.421.002/12, поддержана грантами РФФИ: 09-03-12242-офи_м, 14-0301017, грантом У.М.Н.И.К. (тема №9, проекта 14151).

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов обеспечена использованием при исследованиях современных методов и приборов и подтверждена сравнением полученных результатов с данными, полученными в независимой лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Новосибирск) с использованием стандартно-применяемых для анализа подобных систем методов ИФА и бактериального посева.

Основные результаты исследований представлены на конференциях: «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010), «Теория и практика электроаналитической химии» (г. Томск, 2010), «9-th spring Meeting of Ihe International Society of Electrochemistry, Electrochemical Sensors: from nanoscale engineering to industrial application» (Турку, Финляндия, 2011), «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011). «ЭМА-2012» (Абзаково, 2012), «Nanoformulation - 2012» (Барселона, Испания, 2012), «Химия и медицина» (Уфа, 2013), «Второй съезд аналитиков России (Москва, 2013), «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014).

Публикации. По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 2 патента и 14 тезисов докладов на конференциях различного уровня.

Личный оклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в решении ключевых задач, проведении основных экспериментальных исследований в области синтеза и модификации ПК, в изучении нх электрохимического поведения, интерпретации, систематизации результатов, разработке метода и сенсора для электрохимического определения бактерии E.coli и антигена вируса кори.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов, списка использованных библиографических источников (194 источника). Изложена на 147 страницах компьютерной верстки, содержит 37 рисунков, 14 таблиц.

Во введении раскрыта актуальность и степень разработанности темы исследования, определены цели и задачи, сформулирована научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен анализ литературных данных о современном состоянии методов определения бактериальных патогенов в модельных и реальных объектах. Особое внимание уделено рассмотрению биосспсоров и их применению для идентификации инфекционных агентов. Рассмотрены варианты использования в иммуноанализе наночастиц и нанокомпозитов.

Во второй главе представлены сведения о реагентах, материалах и оборудовании, использованных в работе. Изложены методики синтеза ПК на основе Fej04 с электроактивным полимерным покрытием на основе полипиррола, модифицированного хинолином поливинилбепзилхлорнда, модифицированного ферроценом оксида кремния. Приведены методики подготовки образцов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии НК и клеток E.coli после взаимодействия с 11К.

Третья глава посвящена синтезу и результатам ИК-спектроскопин, подтверждающим состав синтезированных НК на основе FejO^ с электроактивным покрытием, результатам определения методом просвечивающей электронной микроскопии размера и формы НК и исследованию их электрохимических свойств.

Четвертая глава посвящена разработке бесферментного электрохимического иммуносенсора и метода определения содержания бактерий E.coli в модельных и реальных объектах, с использованием синтезированных НК на основе Fe304 с электроактивным полимерным покрытием. Представлены результаты определения концентрации E.coli в

модельных и реальных пробах разработанным методом и референсными методами: ИФЛ и бактериального посева.

Пятая глава посвящена разработке метода бесферментного иммуноанализа для определения антигенов вирусов с использованием синтезированных коныогатов антител и НК.

Методология и методы исследования. При синтезе IIK использовали методы соосаждения, полимеризации in situ и эмульсионной полимеризации. Морфологию, размерные характеристики НК и взаимодействие бактериальных клеток с НК изучали методом электронной микроскопии. Для исследования электрохимических свойств НК и при разработке метода иммуноанализа, использовали методы циклической и инверсионной вольтамперометрии.

Аппаратура и реактивы. Электрохимические исследования проводили с использованием вольтамперометрического анализатора ИВА-5 («ИВА», г. Екатеринбург) и потенциостата/гальваностата (iAutolab type III (Metrohm, Швейцария). Применяли трехэлектродную электрохимическую ячейку объемом 10 см1. В качестве вспомогательного электрода использовали стеклоуглеродный стержень, электрода сравнения - насыщенный Ag/AgCl электрод (Metrohm, Швейцария). В качестве рабочего электрода и твердой подложки для иммобилизации антител использовали толстопленочный графито-эпоксидпый электрод (ТГЭ) (Рисунок 1), хорошо зарекомендовавший себя в качестве основы для фиксации веществ белковой природы.

В работе использовали верхнеприводную мешалку IKA Eurostar digital 2482000, ультразвуковой гомогенизатор Ultrasonic processor 500W, инкубатор «GFL-4010» («Labortechnik», Германия). В синтезе наночастиц Ре304 и НК использовали магнит, сконструированный в институте физики металлов УрО

Рисунок I - Общий вид ТГЭ: I - подложка из полимерного материала; 2 - дорожка из графи го-эпоксидной насты (контактная зона электрода); 3 - слой изолятора; 4 -рабочая зона электрода.

РАН, с величиной магнитного ноля 37.40*К)'1 А/м. Для магнитной сепарации м

концентрирования И К применяли магнитный штатив «MagneSphere®» («Promega», США) с величиной напряженности магнитного поля 31.83х103 А/м.

1. Синтез нанокомпозитных частиц

Для применения в иммуноанализе необходимо было получить НК постоянного состава с магнитным ядром и электроактивным покрытием, генерирующим стабильный сигнал, с размерами, позволяющими проходить сквозь клеточную мембрану бактерии (не >300 нм). По оригинальным методикам синтезированы три типа НК на основе наночастиц магнетита: с поливинилбензилхлоридным покрытием, модифицированным хинолином (Ре304 - ХПВБХ) (Рисунок 2а); с покрытием из полипиррола (Ре304 - Г1П) (Рисунок 26); с модифицированным ферроценом оксидкремнневым покрытием (Ре304 - ФЦ 8Ю2) (Рисунок 2в).

В процессе синтеза варьировали количественные соотношения реагентов с целью получения НК с различной толщиной покрытия. Для всех типов ПК наличие полимерного покрытия подтверждено методом ИК-спектроскопии.

2. Микроскопические исследования НК

Проведены электронно-микроскопические исследования образцов НК, синтезированных при разных количественных соотношениях реагентов. На основании полученных данных (степени агрегированности, размера, толщины и равномерности покрытия) из всех образцов для дальнейшего исследования выбраны образцы ПК, микрофотографии которых представлены на рисунке 3.

Основные результаты н их обсуждение

Рисунок 3 - Микрофотографии НК: FeiOi - ХПВБХ (соотношение компонентов m нч незо4/тв„„„„бензш1хлорида = 1: Ю) (a); Fc304 - ПП (соотношение m (НЧ Fe304) / ш (пиррола) = 1:1) (б); Fe304 - ФЦ Si02 (m (НЧ Fe304) / m (ТЭОС) = 1:1) (в). Микроскоп JEM 1400

(Jeol, Япония).

НК с покрытием всех типов представлены сферическими образованиями. Темные области на микрофотографиях — магнетитные ядра НК (подтверждено методом электронной дифракции), оптически менее плотное «гало» вокруг более темного центра соответствует полимерному покрытию НК. Максимум распределения по размерам для НК Ре304 - ХПВБХ 20 нм, Fe304 - ПП - 170 нм, Fe304 - ФЦ Si02 20 нм.

Агрегативная устойчивость НК, диспергированных в воде, является одним их ключевых факторов при подборе оптимальной концентрации рабочей суспензии для использования в иммуноанализс. Методом динамического светорассеяния провели выбор устойчивой системы в серии суспензий каждого типа НК с разными концентрациями, предварительно обработанными УЗ. По результатам выбраны суспензии НК с концентрацией 0.25 г/л.

4. Электрохимические исследования выбранных образцов При проведении электрохимических исследований образцов НК проводили модифицирование ТГЭ путем нанесения 10 мкл водной суспензии образца на поверхность рабочей зоны электрода с последующей сушкой на воздухе до полного испарения дисперсионной среды.

4.1 Электрохимическое поведение НК Fe^Q^ - ХПВБХ На рисунке 4 приведены циклические вольтамперограммы (ЦВА) зарегистрированные для НК Fe304 - ХПВБХ. В качестве аналитического сигнала выбран электрохимический отклик при потенциале ~-1.15 В. /= 8-Ю'7 х C-610-6(Sr= Ю.6%, при п = 5, г =0.97).

15 I, мкА

U, В

1.5

Рисунок 4 ЦВА НК Ре304 ХПВБХ: фон 0.1 М КШ3 в воде (1); НК, нанесенный на ТГЭ (2 -

4): Смод = 4 г/л (2), Смод = 10 г/л (3), Смод = 14 г/л (4). уРе, -™ = 200 мВ/с.

4.2 Электрохимическое поведение нанокомпозитов Fe3Q4 - ПП

На рисунке 5 приведены ЦВА зарегистрированные для НК Ре304-ПП. В

качестве аналитического сигнала выбран электрохимический отклик при

потенциале =(-0.15- 0) В. /= 210"4 х С- 3-10_6 (Бг= 7.2% при п = 5, г= 0.97).

600 '•»»А Рисунок 5 - ЦВА НК Ре304 - ПП. 400 У1* Фон 0.1 МКЫ03(1);НК, ---------- ъ нанесенный на ТГЭ (2 - 4):

'Я™___0 25 г/л <2)- С"<™ = °'75 г/л

С (3)-Смод= 15 г/л (4)-

•1 ^ -0.5 0 оГ7"Гв У„,

4.3 Электрохимическое поведение нанокомпозитов Ре3Од - ФЦ БЮр

На рисунке 6 приведены ЦВА зарегистрированные для НК Ре304 - ФЦ

8Ю2. В качестве аналитического сигнала выбран электрохимический отклик

при потенциале ~ 0.55 В. /=710"7 * С-5-10_* (Эг = 8.3% при п = 5, г = 0.98).

и I, мкд Рисунок 6 ЦВА НК

, Ре304 - ФЦ ЗЮ2. Фон

^У] 0.1 МКЫ03вводе(1),

/ ~~ ■ , . .__—¡А НК, нанесенный на ТГЭ

/ < ■ ^»аГ/ (2-5): Смод = 0.2 г/л (2);

/ /Т""-с«™=°-3 г/л (3); С«°Д=

Н А—*--— 045 г/л (4); Сит = 06 г/л

//// (5). Уре|-ии = 0.1 В/С.

Таким образом, для всех трех НК, выбранных по результатам электронной микроскопии, были зарегистрированы аналитические электрохимические сигналы. Следующим этапом работы, являлось получение информации о взаимодействии синтезированных НК всех типов с бактерией E.coli.

5. Микроскопические исследования взаимодействия НК с E.coli

Были проведены исследования по взаимодействию суспензий всех типов синтезированных НК (Сисх=0.25 г/л) с бактериальной культурой E.coli АТС 25922. Инкубацию бактерий с НК проводили в стерильном физ.растворе, фиксируя препарат по истечении 10 и 30 минут. На рисунке 7 представлены микрофотографии клеток до взаимодействия с НК, на рисунке 8 после.

На микрофотографиях среза бактериальных клеток после 10-ти минутной инкубации клеток E.coli с НК видно, что происходит адсорбция всех типов НК на мембране клетки или проникновение единичных частиц (Рисунок 8 а,в,д). После 30-ти минут (Рисунок 8 б,г,е), НК Fe304 - ХПВБХ остаются на мембране, Fe304 - ФЦ Si02 проникают в примембранное пространство, а частицы Fe304 -ПП, проходят глубоко в цитоплазму.

Рисунок 7 Микрофотография (ЕмаНММ^^ИН ультратонкого среза клеточной

культуры E.coli (микроскоп JEM 1400 (Jeol, Япония)).

Рисунок 8 Микрофотографии ультратонкого среза клеточной культуры E.coli после 10-ти

(а, в, д) и 30-ти (б, г, е) минутной инкубации с нанокомпозитными частицами Fe304 ХПВБХ (а,б); Fe304 ПП (в-г); Fe.504 ФЦ Si02 (д,е) (микроскоп JEM 1400 Jeol, Япония).

Проведенные исследования показали, что степень поглощения зависит от природы покрытия НК. С увеличением времени инкубации, количество НК, поглощенных клетками, возрастает. После прохождения клеточной стенки (иногда с её повреждением) частицы локализуются в объеме цитоплазмы клетки или во внутреннем примембранном пространстве.

6. Разработка сенсора и метода электрохимического иммуноанализа для определения содержания бактерий

Проведены исследования возможности использования синтезированных НК в качестве электрохимической «метки» для определения бактерий с использованием предложенной процедуры иммуноанализа (Рисунок 9).

Рисунок 9 -

>' V: •

—II

у fr- /

• • .4

S мим

Л

Схема иммуноанализа

Добавление НК к Магнитная сепарация Образованна Регистрация сигнала

бактериям имыужжомплакса

• К анализируемой суспензии, содержащей E.coli, добавляли суспензию НК и инкубировали в течение 30 мин в 0.9% NaCl при Т = (37±0.1 )°С.

• Поместив пробирку в магнитный штатив, отделяли несвязавшиеся с бактериями НК.

• В пробирку вносили ТГЭ с предварительно иммобилизированными антителами к E.coli выдерживали при Т = (37±0.1)°С в течение 30 минут.

• ТГЭ с образовавшимся на рабочей поверхности иммупокомплексом помещали в трехэлектродную электрохимическую ячейку (в качестве рабочего электрода) и выполняли регистрацию вольтамперограммы на анализаторе.

В качестве холостого использовали опыт, когда модифицированный антителами ТГЭ инкубировали в растворе, не содержащем бактерий E.coli.

В ходе проведения процедуры иммуноанализа с использованием НК Fe304 - ХПВБХ в качестве сигналообразукмцей метки было установлено, что при

длительном нахождении НК (более 10 мин) в водных растворах происходит потеря электроактивности, что не позволяет использовать его в иммуноанализе.

После проведения процедуры иммуноанализа с использованием НК Fe304 - ПП сигналы на вольтамперограмме плохо выражены, несмотря на большую определяемую концентрацию Е.соН (6.4-107 КОЕ/мл). Невыраженность сигналов может являться следствием быстрого и глубокого проникновения наночастиц внутрь бактериальной клетки (что согласуется с данными, полученными микроскопическим методом) и, как следствие, экранированием электроактивного соединения на поверхности частиц клеточным веществом, что не позволяет использовать данный тип НК в дальнейших исследованиях.

На рисунке 10 представлены ЦВА, зарегистрированные после проведения

процедуры иммуноанализа по приведенной выше схеме с использованием 1ГК

Fe304 - ФЦ Si02 в качестве сигналообразующей метки.

Рисунок 10-ЦВА, зарегистрированные после проведения процедуры иммуноанализа в суспензиях, содержащих

(Ce.cu = 3.210' КОЕ/мл) (1) и не содержащих (2) бактерии Е.соН, меченые НК Не30„ - ФЦ Si02; фон 0.1 М KN03 (3). Vncr-m. = 0.250 В/с.

Таким образом, в предлагаемом методе иммуноанализа, выраженный электрохимический отклик зарегистрирован только для образца Ре304 -ФЦ8Ю2. Для предложенного алгоритма были выбраны оптимальные времена инкубации и образования иммунокомплекса, составившие 30 мин.

Полученные результаты иммуноанализа согласуются с результатами электронно-микроскопических исследований. НК Ре304 - ФЦ 8Ю2 после 30-ти минутной инкубации (рисунок 8 д, е), в отличие от НК Ре304 - ПП (проникающих в цитоплазму) (рисунок 8 в, г) остаются в примембранном пространстве клетки. Проникновение НК вглубь клетки не позволяет получить выраженный сигнал после реализации процедуры иммуноанализа.

Получена линейная зависимость величины аналитического сигнала от десятичного логарифма концентрации бактерий Е.соИ в исходной суспензии в соответствие со следующим градуировочным уравнением: / (мкА) = 0.0732±0.0013*1о§ СЕ.сои - 0.20Э±0.007 (г = 0.98). Предел обнаружения составляет 1.2 -101 КОЕ/мл.

В таблице I приведены аналитические сигналы, зарегистрированные при определении содержания Е.соИ в модельных суспензиях с использованием НК Ре}04 - ФЦ БЮг. Величины 5Г не превышают 15% (при п=5). Таким образом, предложенный метод обеспечивает воспроизводимые результаты измерения бактерий Е.соИ в диапазоне концентраций 2.3-10 - 2.3 •107 КОЕ/мл.

Таблица 1 - Аналитические характеристики определения содержания

бактерий Е. coli, полученные в разные дни (п = 5, Р = 0.95)

Концентрация Е.соИ, КОЕ/мл Аналитический сигнал /±Д/, мкА Sr, %

1 день 2 день 3 день

2.3-10' 0.0273±0.0100 14.79 0.0271±0.0105 14.89 0.0270±0.0106 14.95

2.3 I0J 0.0533±0.0|90 14.23 0.0538±0.018б 14.11 0.0530±0.0194 14.5

2.3 К)" 0.1237±0.0314 10.24 0.1185±0.0310 10.11 0.1232±0.0320 10.47

2.3 10' 0.1707±0.0397 9.38 0.1910±0.0385 9.31 0.1803±0.0391 9.70

2.3 10" 0.2393±0.0448 7.54 0.2480±0.0480 8.62 0.2289±0.0491 9.1

2.3 10' 0.3613±0.0658 7.33 0.3820*0.0621 6.35 0.3508±0.0661 7.55

6.1. Определение правильности, специфичности и селективности

метода электрохимического иммуноанализа

С целью определения правильности разрабатываемого метода электрохимического иммуноанализа с использованием НК Fe304 - ФЦ Si02, методом «введено-найдено» проведен сравнительный анализ модельных суспензий, содержащих микроорганизм Е. coli АТСС 25922, выполненный в независимой лаборатории методами ИФА и бактериального посева и разработанным нами электрохимическим методом (Таблица 2).

Таблица 2 — Сравнительные результаты анализа модельных проб,

содержащих E.coli, с помощью различных методов (п = 3, Р = 0.95)

Концентрация E.coli, КОЕ/мл ИФА*, КОЕУмл Бактериальный посев*, КОЕ/мл Электрохимический метод, КОЕ/мл

5-10" 4.70-10" 5-10" (4.6±0.3) I06

5103 5.32 103 5105 (4.9±0.4) • Ю5

5-104 4.65 10' 5-10" (4.7±0.4) Ю4

5-10J 5.65 I0J 5I0J (5.2±0.5) 10J

5-10' 5.20-1 - (4.8*0.6) Ю'

510' - - -

*проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Новосибирск).

Из полученных результатов видно, что минимальная концентрация для бактерии E.coli, определяемая электрохимическим методом, составляет =102 КОЕ/мл, что совпадает с возможностями ИФА анализа.

Проведены исследования специфичности разрабатываемого метода. ТГЭ с иммобилизованными антителами к Е. coli инкубировали в двух суспензиях, одна из которых содержала микроорганизмы Е. coli АТСС 25922, а другая Salmonella infantis В-1281. При инкубации в суспензии, не содержащей Е. coli (содержащей S. infantis), откликов не наблюдалось, поскольку не происходило формирование иммунокомплекса на поверхности ТГЭ. Эти результаты подтверждают отсутствие влияния неспецифических взаимодействий и адсорбции на результат анализа.

С целью определения селективности электрохимического метода иммуноанализа были проанализированы модельные системы, в которых помимо бактерий E.coli содержалось бактерии другого вида (Таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительные результаты определения концентрации Е. coli в

смесях с бактерией другого вида (п = 3, Р = 0.95)

Состав смеси С гы, = 7104 КОЕ/мл С 2 компоненте смссн ~ 10 КОЕ/МЛ Содержание бактерии E.coll КОЕ/мл

ИФА* Метод бактериального посева* Электрохимический метод

Escherichia coli АТСС 25922 + Salmonella infantis B-I28I 8104 =7104 (7.5*0.3)104

Escherichia coli АТСС 25922 + Micrococcus flavits В-1132 6104- =6104 (6.6±0.3)104'

Escherichia coli АТСС 25922 + Bacillus licheniformis B-299 6-10" =8104 (7.1±0.5)104

^проведены в лаборатории ФБУН ГН1ДВБ «Вектор» (г.Повосибирск).

Из таблицы видно, чго результаты определения содержания E.coti с использованием разработанного иммуносенсора удовлетворительно согласуются с результатами определения методом ИФА и методом посева.

6.2. Анализ реальных объектов

Провели анализ реальных объектов разработанным методом и сравнительными методами ИФА и бактериального посева (Таблица 4).

Таблица 4 - Сравнительные результаты определения концентрации микроорганизмов Е. coli в пробах воды и воздуха (п = 3, Р = 0.95)

Проба Результат определения бактерии Е. coli, КОЕ/мл

ИФА* Метод бактериальною посева'' Электрохимический метод

11роба воздуха Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено

Вода из природного водоема (р.н. Кольцово, Новосибирская область) Дата нробоотбора 30.07.2014. M0J = 10' (9.4±0.3) I0Z

Вода из искусственного водоема (г. Новосибирск) Дата нробоотбора 30.07.2014. 510' (5.2±0.3)102

""проведены в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Новосибирск).

Приведенные данные подтверждают корректность использования для определения бактерии Е.соИ в реальных объектах разработанного электрохимического метода и иммуносенсора.

7. Применение НК с оксндкремниевым покрытием, модифицированным ниппелями (КедС>,| - АТ8Ю2) для определения антигенов вирусов

Разработан метод определения антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием синтезированных конъюгатов антител к вирусу кори с НК па основе Ре^с оксндкремниевым покрытием (Рисунок 11).

н , Рисунок 11 - Конъюгат

/«■"л о/ ч

" "г еюэх о' антител к вирусу кори с НК

Ре30«-АТ8Ю2.

ищу ,0В

-¥

Была разработана следующая схема иммуноанализа:

• На рабочей зоне графитовой подложки иммобилизировали антитела к вирусу кори.

• Подложку помещали в пробирку с пробой, содержащей антиген вируса кори и инкубировали при Т=(37±0.1)°С в течение 20 мин.

• Далее в пробирку добавляли конъюгат НК ИезО^ - ATSi02 и инкубировали для образования «сэндвич» - иммунокомплекса на поверхности подложки.

• Проводили разрушение иммунокомплекса методом кислотного разложения, в результате которого магнетит переходит в ионы Fe31, концентрация которых определялась вольтамперометрическнм методом.

В случае, если в анализируемом растворе содержался антиген,, на

вольтамперограмме наблюдали появление пика восстановления ионов Fe3+

(Рисунок 12а). В холостом опыте изменения фонового тока не происходило

(Рисунок 126), вследствие отсутствия образования иммунокомплекса. Также

полученные результаты свидетельствуют об отсутствии неспецифического

связывания конъюгатов Fe304 - AT Si02 с подложкой.

Рисунок 12 - Производные

вольтамперограмм Fe зарегистрированные после анализа проб, содержащих (а) и не содержащих антиген вируса кори (б): фон (I); проба (2); проба+ добавка ГСО 1-е (3). Си,цтиив — 2.33-102 мг/мл.

Е|1а11 = 0.1 В, W = 60 с, Vper-Hu = 0.5 В/с. Фон: 0.1 моль/дм3 раствор ClIjCOONa (pH 7.5), 5 10 4 моль/дм3 пирокатехола.

Получена линейная зависимость изменения величины аналитического сигнала от логарифма концентрации антигена вируса кори в интервале концентраций 2.33-104 - 2.33 мг/мл: с1ШЕ [мкА/В] = 2.441±0.002><к^ Сттиггиа -11,63±0.05 (г = 0.967). Предел обнаружения составляет 1.87-10"5 мг/мл.

Установленные значения коэффициентов воспроизводимости и повторяемости не превышают 0.01. Таким образом, предложенный метод обеспечивает воспроизводимые результаты определения содержания антигена вируса кори в диапазоне концентраций 2.33-10'4 - 2.33 мг/мл.

Дня оценки специфичности разработанного метода проводили анализ по предложенной схеме, однако вместо антигена вируса кори использовали антиген вируса клещевого энцефалита. Откликов не наблюдали, поскольку иммунокомплекс на поверхности ТГЭ не формировался, что подтверждает отсутствие влияния на аналитический сигнал неспецифических взаимодействий и адсорбции. Таким образом, можно заключить, что данная процедура анализа с использованием НК на основе Ре304 в качестве сигнапообразующей метки, позволяет определять содержание антигена вируса кори в модельном растворе с минимальной концентрацией 1.85-10"5 мг/мл.

ВЫВОДЫ

1. С использованием оригинальных методик синтезированы НК на основе магнетита (Ге30,() с полимерным покрытием из полипиррола (средний размер 170 нм); поливинилбензилхлорида, модифицированного хинолином (средний размер 20 нм); оксида кремния модифицированного ферроценом / антителами (средний размер 20 нм). Структура и размерность каждого вида НК подтверждены методом ИК-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с электронной дифракцией.

2. Исследована возможность применения магнитных НК на основе Ре304 с электроактивным покрытием в качестве «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый аналитический электрохимический отклик.

3. Показано взаимодействие синтезированных НК всех типов с клетками бактерии Е.соН.

4. Разработаны новый электрохимический иммуносенсор и метод определения бактерий (па примере Е.соН штамм АТС 25922) с использованием нанокомпозигных частиц Ре,04 - ферроценмодифицированный оксид кремния в качестве метки в диапазоне концентрации 2.3-10 - 2.310' КОЕ/мл Предел обнаружения составляет 1.2-101 КОЕ/мл.

5. Надежность и правильность результатов определения содержания Е.соН в модельных системах и реальных объектах (пробы воды и воздуха)

подтверждены сравнением данных полученных с применением разработанного и стандартных методов (бактериального посева и ИФА).

6. Разработан метод электрохимического определения антигенов вирусов (на примере антигена вируса кори) с использованием конъюгатов антител с нанокомпоэитными частицами Fe30.| - Si02 в диапазоне концентраций 2.33'10^ - 2.33 мг/мл. Предел обнаружения составляет 1.87-10"5 мг/мл.

Автор выражает благодарность к.х.н., доценту Козициной А Н. за помощь в постановке исследований и анализе полученных экспериментальных данных; сотрудникам лаборатории ГС НОС УрО РАН и кафедры органической химии ХТИ УрФУ за помои/ь в разработке методик синтеза НК. сотрудникам ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) за помощь в проведении работ с культурам!i бактерий и электронно-микроскопические исследования.

Основные публикации по теме диссертационной работы Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК

1. Малышева, H.H. Бесферментный электрохимический метод определения E.coli с использованием нанокомпозитов FejO^ с оболочкой SiO^, модифицированной ферроценом / А.Н. Козицина, H.H. Малышева, И.А. Утепова, Ю.А. Глазырина, А.И. Матерн, Х.З. Брайнина, О.Н. Чупахип // Журнал аналитической химии. - 2015. - Т. 70. - № 5. - С. 1-7 (2,3 пл./ 0,4 н.л.).

2. Малышева, H.H. Бесферментный электрохимический метод определения антигена вируса кори с использованием синтезированных конъюгатов IgG -(Fe304 - Si02) в качестве сигналообразующей метки / H.H. Малышева, Ю.А. Глазырина, В.О. Ждановских, Т.С. Свапова, А.И. Матерн, А.Н. Козицина // Известия РАН. Серия химическая. - 2014. - № 7. - С. 1633-1638 (2,1 п.л./ 0,4 п.л.).

3. Малышева, H.H. Синтез и исследование электрохимических превращений магнитных нанокомпозитов на основе Fe304 / А.Н. Козицина, H.H. Малышева, Е.В. Вербицкий, И.А. Утепова, Ю.А. Глазырина, Т.С. Мигрофанова, Г.Л. Русинов, А.И. Матерн, О.Н. Чупахин, Х.З. Брайнина // Известия РАН. Серия химическая. -2013. -№ 1.-С. 2327-2336 (2,1 п.л./ 0,3 п.л.).

22

Патенты РФ:

4. Пат. 2542487 РФ. М1Ж C12Q 1/04, C12N 1/02, G01N 33/53, В82В 1/00 Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде / Козицина А.Н., Малышева H.H., Глазырина Ю.А., Матерн А.И.; заявл. 15.07.2013: опубл. 20.02.2015, бюл. № 5.

5. Пат. 2550955 РФ. МПК G01N33/58, G01N33/53 Способ электрохимического иммуноаиализа для определения вирусов/антигенов вирусов / Козицина А.Н., Малышева H.H., Глазырина Ю.А., Матерн А.И., Иванова A.B.; заявл. 11.12.2013: опубл. 20.05.2015, бюл. № 14.

Материалы научных конференций:

6. Малышева, H.H. Бесферментный электрохимический метод определения антигена вируса кори на основе нанокомпозитных частиц Fe30,i в биоматериале / В.О. Ждановских, H.H. Малышева, Ю.А. Глазырина, А.П. Козицина // Химия в федеральных университетах: сборник статей материалов конференции. Екатеринбург: УрФУ, 2014. С. 80 (0,1 п.л./ 0,02 пл.).

7. Малышева, H.H. Синтез конъюгатов IgG-(Fe304-Si02) для определения антигена вируса кори / В.О. Ждановских, H.H. Малышева, Ю.А. Глазырина, А.Н. Козицина // Проблемы теоретической и экспериментальной химии: тезисы докладов XXIV Российской молодежной научной конференции. Екатеринбург, 2014. С. 107 (0,12 пл./ 0,03 пл.).

8. Малышева, H.H. Определение E.coli с использованием электрохимического бесфермептного иммуносенсора на основе магнитных нанокомпозитных частиц, модифицированных производным ферроцена / H.H. Малышева, И.А. Утепова, Ю.А. Глазырина, О.Н. Чунахин, А.И. Матерн, А.Н. Козицина, Х.З. Брайнина // Тезисы докладов Второго съезда аналитиков России. Москва, 2013. С. 84 (0,12 пл./ 0,02 пл.).

9. Malysheva, N.N. Electrochemical sensor for detection of pathogen microorganisms (Salmonella thyphimurium) using ferrocen modified magnetic nanocomposites / N.N. Malysheva, Y.A. Glazyrina, A.N. Kozitsina, A.I. Matem //

Тези IX Всеукра'ш. конференшя з аналггичноТ xímíí. Донецьк: «Ноулщж», 2013. С. 134 (0,12 п.л./0,03 п.л.).

10. Малышева, H.H. Бесферменгный электрохимический сенсор для определения E.coli на основе магнитных нанокомпозитных частиц, модифицированных производными ферроцена / H.H. Малышева, И.А. Утепова, Ю.А. Глазырнна, О.Н. Чупахин, А.И. Матерн, А.Н. Козицина, Х.З. Брайннна // Химия и медицина: тезисы докладов IX Всероссийской конференции. Уфа: РИЦБашГУ, 2013. С. 237 (0,12 п.л./0,02 п.л.).

П.Малышева, H.H. Синтез и использование для электрохимическою определения E.coli электроактивных магнитных напокомпозитов на основе Fe304 / H.H. Малышева, H.A. Утепова, А.Н. Козицина, А.И. Матерн, О.Н. Чупахин // Физика и химия наноразмерных систем: сборник тезисов докладов Всероссийской молодежной конференции. Екатеринбург: УрФУ, 2012. С. 103-104 (0,12п.л./ 0,02 п.л.).

12. Glazyrina, Y.A. Electrpactive nanocomposite based on Fe304 nanoparticles for electrochemical immunosensors / Malysheva N.N., E.V. Verbitsky, I.A. Ulepova, A.I. Matem, A.N. Kozilsina, G.L. Rusinov, O.N. Chupakhin., V.N. Charusin // Book of abstracts of «Nanoformulation-2012». Spain. 2012. P. 99 (0,12 п.л./0,1 п.л.).

П.Малышева, H.H. Синтез ферроценмоднфицированных магнитных напокомпозитов и использование их для электрохимического определения E.coli / H.H. Малышева, И.А. Утепова, А.Н. Козицина, О.Н. Чупахин, А.И. Матери // Материалы VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012». Уфа: БашГУ, 2012. С. 107 (0,12 п.л./0,02 н.л.).

14. Малышева H.H. Новые метки в иммуноанализе на основе модифицированных органическими соединениями наночастиц магнетита / H.H. Малышева, Е.В. Вербицкий, Т.С. Митрофанова, A.B. Охохонин, А.Н. Козицина, A.B. Иванова, Г.Л. Русинов, А.И. Матерн, Х.З. Брайннна, Чарушин В.Н. // Разделение и концентрирование в аналитической химии и

' 5 - - б 9 0 8

радиохимии: материалы Ш Всероссийскою симпозиума. Краснодар: «Офис-Альянс», 20П. С. 120 (0,12 п.л. / 0,01 пл.).

15. Malysheva, N.N. Electrochemical sensors based on nanoparticles of metalls/metall oxides for clinical diagnostics / A.N. Kozitsina, N.N. Malysheva, S.S. Dedeneva, A.V. Ivanova, G.L. Rusinov, V.N. Charushin, K.Z. Brainina // The 9lh spring Meeting of the International Society of Electrochemistry, Electrochemical Sensors: from nanoscale engineering to industrial application. Finland. 2011. P. 227 (0,12 пл./0,02 пл.).

16. Малышева, H.H. Электроактивные нанокомнозиты для иммуноанапиэа на основе FejO^ / H.H. Малышева, А.И. Матери // Достижения в химии и химической технологии: тезисы научной конференции. Екатеринбург, 2011. С. 75 (0,12 п.л./0,7 пл.).

17. Малышева, H.H. Магнитные нанокомнозиты на основе наночастиц Fe304 п электроактнвных полимеров для иммуноанализа / H.H. Малышева, Е.В. Вербицкий, А.И. Матерн, А.Н. Козицина, Ю.А. Глазырина, Г.Л. Русинов,

B.Н. Чарушин // Аналитическая химия - новые методы и возможности: тезисы докладов конференции. Москва: МИСиС, 2010. С. 181 (0,12 нл. / 0,02 пл.).

18. Малышева, H.H. Электрохимические методы в бесферментных иммуносенсорах на основе металлоорганнческпх комплексов, наночастиц металлов/оксидов. Токсичность наночастиц / А.Н. Козицина, Ю.А. Глазырина, E.JI. Поморцева, H.H. Малышева, Х.З. Брайнииа // Теория и практика электроапалитической химии: материалы симпозиума. Томск: Изд-во Томскою политехнического университета, 2010. С. 6-9 (0,3 п.л. / 0,06 пл.).

19. Малышева, H.H. Электроактивные нанокомнозиты для иммуноанализа па основе FejOo / H.H. Малышева, Е.В. Вербицкий, А.И. Магерн, А.Н. Козицина, Ю.А. Глазырина, Г.Л. Русинов, В.Н. Чарушин // Актуальные проблемы органического синтеза и анализа. Екатеринбург: ПИСО УрО РАН, 2010.

C. 317-329 (1,15 п.л./0,2 пл.).

Подписано в печам, 15.07.2015 г. Формат 60x84 1/16. ГСумага офсетная. Усл. меч. л. 1,4. Тираж 110 эт. Заказ № 78. Отпечатано: Копировальный центр «Таймер» 620075. г. Пкатернпбург ул. Луначарского, 136.

2015674563

2015674563