Электрохимический иммуносенсор для диагностики клещевого энцефалита тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ОГЛАВЛЕНИЕ

Сокращения

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Биосенсоры

1.2. Иммуносенсоры

1.2.1. Типы иммуноанализа

1.2.2. Типы детектирования, используемого в иммуноанализе. Прямое и непрямое детектирование

1.2.2.1. Пьезоэлектрические иммуносенсоры

1.2.2.2. Оптические иммуносенсоры

1.2.2.3. Электрохимические иммуносенсоры

1.3. Постановка задачи

Глава 2. Аппаратура и техника эксперимента

2.1. Оборудование и средства измерений

2.2. Реактивы, приготовление растворов

2.3. Методика эксперимента

Глава 3. Предварительные исследования

3.1. Выбор трансдьюсера

3.2. Выбор методики иммобилизации биорецептора на поверхности графитсодержащих трансдьюсера

3.3. Нанокомпозиционные материалы

3.4. Трансдьюсеры, модифицированные формазанами

Глава 4. Исследование возможности применения белка А в электрохимических иммуносенсорах

4.1. Белок А, меченый пероксидазой хрена.

4.2. Использование и разработка методов детектирования с использованием металлической метки 82 4.2.1. Белок А, меченый коллоидным золотом

4.2.2. Белок А, меченый коллоидным серебром

4.2.3. Использование а-фетопротеинов (АФП) в качестве модельной системы

Выводы

Актуальность темы. Здоровье населения, диагностика опасных заболеваний на ранних стадиях, определение факторов, способствующих развитию в организме человека заболеваний, в том числе инфекционных, - все эти проблемы особенно остро стоят в настоящее время.

Огромной по своей важности проблемой является распространение в последние годы на достаточно обширных территориях опасных инфекций, таких как коклюш, дифтерия, гепатиты А, В и С, корь и многих других. Ситуацию с опасными инфекциями, как одну из наиболее актуальных, продемонстрируем на примере клещевого энцефалита. Энцефалит воспалительное заболевание головного мозга инфекционной или аллергической природы. Иксодовые клещи - переносчики вируса - обитают на огромной территории от берегов Тихого до Атлантического океана, от зоны вечной мерзлоты до степей и субтропиков. Естественно, что природные очаги заболевания разбросаны по всей этой территории. В 60-70-е годы вирус клещевого энцефалита поразил Дальний Восток. В начале 90-х годов отмечен резкий рост этого заболевания на Урале. В конце 90-х началось "продвижение" клещевого энцефалита в центр России. Зарегистрировано несколько случаев заболевания в США. Вирус выявлен в Германии, Австрии, скандинавских странах, Северной Италии, республиках бывшей Югославии. В России от клещевого энцефалита ежегодно страдают от 10 до 15 тысяч человек.

Первичный энцефалит - самостоятельное заболевание, которое обычно вызывается нейротропными вирусами, чаще всего передается человеку при укусе зараженными кровососущими членистоногими (клещами).

По тяжести клещевой энцефалит подразделяется на лихорадочную форму, менингиальную и самую тяжелую - паралитическую. На фоне заболевания развиваются общемозговые (нарушение сознания, психические расстройства) и очаговые неврологические симптомы. Может развиться отек мозга, который является наиболее частой непосредственной причиной смерти больного энцефалитом. Клещевой энцефалит - одно из немногих инфекционных заболеваний, способных переходить в хроническую стадию, которая зачастую приводит к летальным исходам или тяжелой инвалидности.

Существующие методы диагностики вируса клещевого энцефалита, во-первых, длительны во времени, во-вторых, требуют дорогостоящего оборудования (метод "иммунно-ферментного анализа" (ИФА)).

Именно в случае опасных вирусных инфекций особенно важной является диагностика, в идеальном случае, - на месте, в небольших клиниках, поскольку это является залогом успешного лечения и полного выздоровления больного.

Для решения этой проблемы требуется создание дешевых, простых, чувствительных и экспрессных методов диагностики и приборного обеспечения указанных методов. Привлечение электрохимических методов анализа, основывающихся на использовании биосенсоров для диагностики опасных инфекций, представляется весьма перспективным. Доказательством этому служит высокая чувствительность таких методов, хорошая воспроизводимость и селективность, простота аппаратурного оформления и возможность создания портативных приборов, пригодных для использования, как в лабораторных условиях, так и в небольших клиниках, низкая стоимость анализа по сравнению с другими методами. В последние годы наблюдается "взрыв" в количестве публикаций, посвященных развитию электрохимических биосенсоров для различных целей.

Настоящая диссертационная работа посвящена развитию новых подходов к созданию электрохимического иммуносенсора.

Ее актуальность определяется как изложенными выше соображениями, так и ожидаемым эффектом: упрощением и ускорением получения необходимой медицинской информации. Работа является частью исследований, проводимых на кафедре химии Уральского государственного экономического университета в рамках заданий Министерства образования РФ по следующим направлениям: «Развитие теоретических и практических основ электрохимического анализа объектов окружающей среды и биологических материалов» (1996-2000гг.), INCO - Copernicus "Biosensors for direct monitoring of environmental pollutants in field" (1998-2001 гг.), «Разработка лабораторного практикума по электрохимическим методам анализа. Аппаратурное и методическое обеспечение», (2003-2004 гг.). По теме: «Исследование и разработка новых методов иммобилизации биоматериала на поверхности электрода» (2003-2004 гг.) получен индивидуальный грант Минобразования России.

Цель работы. Создание нового электрохимического иммуносенсора, использование которого позволило бы исключить применение в анализе антивидовых антител, ферментов, специально вводимых реагентов, снизить предел обнаружения. Достижение этой цели потребовало проведения исследований и выбора:

- материалов, способных служить трансдьюсером - сигналопередающим элементом иммуносенсора;

- биораспознающего материала и способов его иммобилизации на поверхности трансдьюсера;

- «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый отклик.

Научная новизна.

- в качестве носителей металлической метки в электрохимическом иммуноанализе использованы коньюгаты белка А с коллоидным металлом (золотом, серебром). Исследовано распределение серебра в коньюгатах с разной концентрацией белка А и взаимосвязь электрохимического отклика с концентрацией и распределением металла в коньюгате;

- исключена стадия извлечения металла из сандвич - структуры перед его детектированием, что позволило осуществить прямое электрохимическое определение количества металла - «метки», входящего в состав сэндвич -структуры;

- показана взаимосвязь электрохимического отклика с количеством металла - «метки», содержащегося в сэндвич - структуре и концентрацией искомых антител в растворе.

Практическая ценность работы. Создан новый электрохимический иммуносенсор для диагностики клещевого энцефалита. Использование этого сенсора позволяет исключить применение дорогих антивидовых антител, ферментов и введения специальных субстратов в анализируемый раствор.

Предложенный сенсор обеспечивает снижение предела обнаружения до 0,2 нг/мл в сыворотках крови инфицированных людей по сравнению со стандартным ИФА методом.

Простота и экономическая эффективность сенсора позволяет организовать иммуноанализ на месте в небольших клиниках.

Автор выносит на защиту следующие положения:

- результаты исследований различных способов иммобилизации биорецептора на поверхности различных графитсодержащих и нанокомпозиционных трансдьюсеров а также на поверхности трансдьюсеров, модифицированных формазанами: (адсорбции, сшивки, введение в мембраны. Выбор оптимального способа иммобилизации биораспознающего материала на поверхности трансдьюсера;

- обоснование использования в электрохимическом иммуноанализе в качестве носителя металлической метки белка А вместо антивидовых антител;

- обоснование использования коньюгата белка А - металл в качестве сигналообразующего компонента электрохимического иммуносенсора;

- сенсор для диагностики клещевого энцефалита, состоящего из трансдьюсера с иммобилизованным антигеном, на котором в процессе анализа возникает сэндвич - структура: антиген - антитело - белок А, меченый металлом;

- результаты анализа сывороток крови инфицированных людей, подтвержденные данными независимого стандартного ИФА метода;

- возможность расширения развитого подхода для создания иммуносенсоров.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на 5 Семинаре INCO - Copernicus "Производство лабораторных прототипов" (Отроковицы, Чехия, 1999 г.); на 5 Всероссийской конференции «Электрохимические методы анализа (ЭМА-99)» (Москва, 1999 г.); на 6 Семинаре INCO - Copernicus "Повышение производства и коммерциализации" (Лунд, Швеция, 2000 г.); на 4 Международном семинаре "Российские технологии для индустрии. Физические, химические и биологические сенсоры" (С-Петербург, Россия, 2000 г.); на научно -технической конференции с участием зарубежных специалистов "Датчик-2002" (Судак, Украина, 2002).

Выражаю искреннюю благодарность: научному руководителю д.х.н., профессору Брайниной Х.З.; главному врачу «Центра лабораторной диагностики здоровья матери и ребенка» г. Екатеринбурга, д.м.н. Бейкину Я.Б. за предоставление консультаций, биологических образцов, данных ИФА анализа; доценту кафедры энзимологии МГУ, к.х.н. Рубцовой М.Ю. за предоставление образцов коньюгата А, меченого серебром и электронно-микроскопические фотографии последних; зам. директору по научной работе НИЦ «ПМТ» ЦНИИ материалов (С-Петербург), д.т.н. Гордееву С.К. за предоставление нанокомпозиционных материалов; профессору кафедры органического синтеза УГТУ - УПИ (г. Екатеринбург), д.х.н. Липуновой Г.Н. за предоставление образцов формазанов.

ВЫВОДЫ

- Исследованы различные способы иммобилизации биорецептора (адсорбции, сшивки, введение в мембраны) на поверхности различных графитсодержащих и нанокомпозиционных трансдьюсерах, а также трансдьюсерах, модифицированных формазанами. Выбран оптимальный способ иммобилизации биорецептора (антигена вируса клещевого энцефалита) на поверхности трансдьюсера (толстопленочного графитового электрода), заключающийся в последовательном нанесении очищенных иммуноглобулинов и антигена клещевого энцефалита.

- Показано образование сэндвич-структуры: антиген - антитело - белок А («метка») непосредственно на рабочей поверхности трансдьюсера.

- Показана возможность применения белка А в качестве носителя металлической метки.

- Разработан вариант электрохимического анализа (анодная вольтамперометрия с линейной разверткой потенциалов) для определения антител против клещевого энцефалита с использованием белка А, меченого коллоидным золотом. Предел обнаружения составляет 5x10"6 мг/мл.

- Изучено распределение коллоидных частиц серебра в коньюгатах,содержащих белок А в концентрациях 10, 15, 50, 70, 100 мкг/мл. Показана взаимосвязь концентраций белка А и распределения частиц металла в коньюгате с электрохимическим откликом. Максимальный аналитический сигнал наблюдается при использовании 50 мкг/мл белка А.

- Разработан вариант электрохимического анализа (анодная вольтамперометрия с линейной разверткой потенциалов) для определения антител против клещевого энцефалита с использованием белка А, у меченого коллоидным серебром. Предел обнаружения составляет 2x10" мг/мл.

- Результаты анализа определения антител против вируса клещевого энцефалита в реальных объектах (сыворотках крови инфицированных людей) с использованием предложенного сенсора хорошо согласуются с результатами анализа стандартного ИФА метода.

- Показана возможность расширения применения развитого подхода для создания иммуносенсоров.

1. N.C. Bacon, Е.А.Н. Hall. A sandwich enzyme electrode giving electrochemical scavenging of interferents // Electroanalysis, 1999, 11, №.10-11, p.749-756.

2. M. Albarela-Sirvent, A. Merkoci, S. Alegret. Thick-film biosensors for pesticides produced by screen-printing of graphite-epoxy composite and biocomposite pastes // Sensors and Actuators B, 2001, № 79, p. 48-57.

3. J. Wang, L. Chen, J. Liu. Critical comparison of metallized and mediator-based carbon paste glucose biosensors // Electroanalysis, 1997, 9, № 4, p. 298-301.

4. C. Saby, F. Mizutani, S. Yabuki. Glucose sensor based on carbon paste electrode incorporating poly(ethylene glycol) modified glucose oxidase and various mediators // Analytica Chimica Acta, 1995, № 304, p. 33-39.

5. J. Wang, P.V.A. Pamidi, D.S. Park. Screen-printed sol-gel enzyme-containing carbon inks // Analytical Chemistry, 1996, 68, № 15, p. 2705-2706.

6. I.M. Christie, P. Vadgama. Modification of electrode surfaces with oxidized phenols to confer selectivity to amperometric biosensors for glucose determination // Analytica Chimica Acta, 1993, № 274, p. 191-199.

7. E.A. Cummings, S. Linquette-Mailley, P. Mailley, S. Cosnier, B.R. Eggins, E.T. McAdams. A comparison of amperometric screen-printed, carbon and theirapplication to the analysis of phenolic compounds present in beers // Talanta, 2001, №55, p. 1015-1027.

8. C. Loechel, G.-C. Chemnitius, M. Borchardt, K. Cammann. Amperometric bi-enzyme based biosensor for the determination of lactose with an extended linear range // Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und forschung A, 1998, 207,p. 381385.

9. A. Avramescu, T. Noguer, M. Avramescu, J-L Marty. Screen-printed biosensors for the control of wine quality based on lactate and acetaldehyde determination // Analytica Chimica Acta, 2002, № 458, p. 203-213.

10. C.G. Tsiafoulis, M.I. Prodromidis, M.I. Karayannis. Development of amperometric biosensors for the determination of glycolic acid in real samples // Anal. Chem., 2002, № 74, p. 132-139.

11. J. Niu, J.Y. Lee. Reagentless mediated biosensors based on polyelectrolyte and sol-gel derived // Sensors and Actuators B, 2002, № 82, p. 250-258.

12. I. Moser, G. Jobst, G.A. Urban. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine // Biosensors & Bioelectronics, 2002, № 17, p. 297-302.

13. N. Sato, K.Usui, H. Okuma. Development of bienzyme reactor sensor system for the determination of ornithine // Analytica Chimica Acta, 2002, № 456, p. 219-226.

14. M.D.P.T. Sotomayor, A. A. Tanaka, L.T. Kubota. Development of an enzymeless biosensor for the determination of phenolic compounds // Analytica Chimica Acta, 2002, №455, p. 215-223.

15. W.K. Ward, L.B. Jansen, E. Anderson, G. Reach, J.-C. Klein, G.S. Wilson. A new amperometric glucose microsensor: in vitro and short-trem in vivo evaluation // Biosensors & Bioelectronics, 2002, №17, p. 181-189.

16. X. Wei, J. Cruz, W. Gorski. Integration of enzymes and electrode: spectroscopic and electrochemical studies of chitosan-enzyme films // Anal. Chem, 2002, № 74, p. 5039-5046.

17. A.A. Karyakin, E.A. Karyakina, L. Gorton. Amperometric biosensor for glutamate using Prussian Blue-based "Artificial Peroxidase" as a transduser for hydrogen peroxide // Anal. Chem, 2000, № 72, p. 1720-1723.

18. A.A. Karyakin, M. Vuki, L.V. Lukachova, E.A. Karyakina, A.V. Orlov, G.P. Kasparova, J. Wang. Processible polyaniline as an advanced potentiometric pH transduser. Application to biosensors // Anal. Chem, 1999, № 71, p. 2534-2540.

19. M.I. Prodromidis, М. I. Karayannis. Enzyme based amperometric biosensors for food analysis // Electroanalysis, 2002, 14, № 4, p. 241-261.

20. T. Lenarczuk, D. Wencel, S. Glab, R. Koncki. Prussian blue-based optical glucose biosensor in flow-injection analysis // Anal Chim Acta 447 (2001) 23-32.

21. S. Cosnier, H. Perrot, R. Wessel. Biotinylated polypyrrole modified quartz crystal microbalance for the fast and reagentless determination of avidin concentration // Electroanalysis, 2001, 13, № 11, p. 971-974.

22. L. Gorton. Carbon paste electrodes modified with enzymes, tissues, and cells // Electroanalysis, 1995, 7, № 1, p. 23-45.

23. S. Uchiyama, M. Kobayashi, Y. Hasebe. Electrical control of urease activity immbilized to the conducting polymer on the carbon felt electrode // Electroanalysis, 2002, 14, №23, p. 1644-1647.

24. К. Catterall, К. Morris, С. Gladman, Н. Zhao, N. Pasco, R. John. The use of microorganisms with broad range substrate utilisation for the ferricyanide-mediated rapid determination of biochemical oxygen demand // Talanta 55 (2001) 1187-1194.

25. T. Petanen, M. Romantschuk. Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts // Anal. Chim. Acta 456(2002)55-61

26. J.I. Lee, I. Karube. Reactor type sensor for cyanide using an immobilized microorganism // Electroanalysis, 1996, 8, № 12, p. 1117-1120.

27. M. Koblizek, J. Masojidek, J. Komenda, T. Kucera, R. Pilloton, A.K. Mattoo, M.T. Giardi. A sensitive Photosystem II-based biosensor for detection of a class of herbicides // 1998 John Wiley & Sons, Inc. p. 664-669.

28. A. Warsinke, A. Benkert, F.W. Scheller. Electrochemical immunoassays // Fresenius J Anal. Chem (2000) 366:622-634.

29. Э.П. Медянцева, E.B. Халдеева, Г.К. Будников. Иммуносенсоры в биологии и медицине: аналитические возможности, проблемы и перспективы // Ж. Аналитической химии, 2001, т. 56, № 10, с. 1015-1031.

30. P. Skladal. Advances in electrochemical immunosensors // Electroanalysis,1997, 9, № 10, p. 737-745.

31. R.-I. Stefan, J.F. Ikoos) van Staden, H.Y. Aboul-Enein. Immunosensors in clinical analysis // Fresenius J Anal Chem (2000) 366: 659-668.

32. D.S. Hage. Immunoassays // Anal. Chem. 1999, 71, p. 294R-304R.

33. A.L. Ghindilis, P. Atanasov, M. Wilkins, E. Wilkins. Immunosensors: electrochemical sensing and other engineering approach // Biosens. Bioelectron.1998, 13, l,p. 113-131

34. C. Berggren, B. Bjarnason, G. Johansson. Capacitive biosensors // Electroanalysis, 2001, 13, № 3, p. 173-180.

35. Q. Li, G. Luo, J. Feng. Direct electron transfer for heme proteins on nanocrystalline Ti02 film // Electroanalysis, 2001, 13, № 5, p. 359-363.

36. P. Bataillard, F. Gardies, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet. Direct detection of immunospecies by capacitance measurements // Anal. Chem. 1988, 60, p. 2374-2379.

37. C. Berggren, G. Johansson. Capacitance measurements of antibody-antigen interactions in a flow system // Anal. Chem. 1997, 69, p. 3651-3657.

38. A.R. Varlan, J. Suls, W. Sansen, D. Veelaert, A. Deloof. Capacitance sensor for the allastostatin direct immunoassay // Sensors and Actuators В 44 (1997) p. 334340.

39. H. Berney, J. Alderman, W. Lane, J.K. Collins. A differential capacitance biosensor using polyethylene glycol to overlay the biolayer // Sensors and Actuators В 44 (1997) p. 578-584.

40. L. Tessier, F. Patat, H. Watier, V. Brumas, N. Scmitt. Potential of the thickness shear mode acoustic immunoensor biological analysis // Anal. Chim. Acta 347 (1997) p. 207-217.

41. P. Scladal. Piezoelectric biosensors // Chemicke Liste 1995, 89, p. 170-179.

42. B. Konlg, M. Gratzel. A novel immunosensor for Herpes viruses // Anal. Chem. 1994, 66, 3410344.

43. X. Su, F.T. Chew, S.F.Y. Li. Piezoelectric quartz crystal based label-free analysis for allergy disease //Biosensors & Bioelectronics 15 (2000) 629-639.

44. Y.S. Fung, Y.Y. Wong. Self-assembled monolayers as the coating quartz piezoelectric crystal immunosensor to detect Salmonella in aqueous solution // Anal. Chem. 2001, 73, p. 5302-5309.

45. G. Sakai, T. Saiki, T. Uda, N. Miura, N. Yamazoe. Evaluation of binding of human serum albumin (HAS) to mono polyclonal antibody by means of piezoelectric immunosensing // Sensors and Actuators В 42 (1997) p.89-94.

46. M. Masson, K.S. Yun, T. Haruyama, E. Kobatake, M. Aizawa. Quartz crystal microbalance bioaffinity sensor for biotin // Anal. Chem. 1995, 67, p. 2212-2215

47. I. Bendov, I. Willner, E. Zisman. Piezoelectric immunosensors for urine specimens of Chlamydia trachomatis employing quartz crystal microbalance microgravimetric analyses // Anal. Chem. 1997, 69, p. 3506- 3512

48. D.B. Parkovsky, T.C. Riordan, G.G. Guilbault. An immunosensor based on the glucose oxidase label and optikal oxygen detection // Anal. Chem. 1999, 71, p. 15681573.

49. I. Surugiu, B. Danielsson, L. Ye, K. Mosbach, K. Haupt. Chemiluminescence imaging ELIS A using an imprinted polymer as the recognition element instead of an antibody // Anal. Chem. 2001, 73, p. 487-491.

50. J.B. Delehanty, F. S. Ligher. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria // Anal. Chem. 2002, 74, p. 5681-5687.

51. К. E. Sapsford, P.T. Charles, C.H. Patterson, F.S. Lighler. Demonstration of four immunoassay formats using the array biosensor // Anal. Chem. 2002, 74, p. 10611068.

52. J. Penalva, R. Puchades, A. Maquieira. Analytical properties of immunosensors working in organic media // Anal. Chem. 1999, 71, p. 3862-3872.

53. P.S. Petrou, S.E. Kakabakos, I. Christofidis, P. Argitis, K. Misiakos. Multi-analyte capillary immunosensor for the determination hormones in human serum samples // Biosensors & bioelectronics 17 (2002) 261-268.

54. J. Yakovleva, R. Davidsson, A. Lobanova, M. Bengtsson, S. Eremi, T. Laurell, J. Emneus. Microfluidic enzyme immunoassay using silicon microchip with immobilized antibodies and chemiluminescence detection // Anal. Chem. 2002, 74, p. 2994-3004.

55. E. Turiel, P. Fernandez, C. Perez-Conde. Oriented antibody immobilization for atrazine determination by a flow-through fluoroimmunosensor // Fresenius J Anal Chem (1999) 365: 658-662.

56. С.С. Решетников. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека // Новости «Вектор-Бест», №6Б 1997.

57. Т. Scharnweber, М. Ficher, М. Suchanek, D. Knopp. Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzoa]pyrene immunogen // Fresenius J Anal Chem (2001) 471: 578-585.

58. I.A. Darwish, D.A. Blake. Development and validation of a one-step immunoassay for determination of cadmium in human serum // Anal. Chem. 2002, 74, p. 52-58.

59. R. Galve, M. Nichkova, F. Camps, F. Sanchez-Baeza, M.-P. Marco. Development and evaluation of an immunoassay for biological monitoring chlorophenols in urine as potential indicators of occupational exposure // Anal. Chem. 2002, 74, p. 468-478.

60. A.V. Eremenko, C.G. Bauer, A. Makower, В. Kanne, H. Baumgarten, F.W. Schelller. he development of a non-competitive immunoenzymometr cocaine // Anal.Chim. Acta. 1998, 358, 1, p.5-13

61. S. Dai, M.E. Meyerhoff. Nonseparation binding / immunoassay using polycation-sensetive membrane electrode detection // Electroanalysis 2001, 13, № 4, p. 276-283

62. C. Ercole, M.D. Gallo, M. Pantalone, S. Santucci, L. Mosiello, C. Laconi, A. Lepidi. A biosensor for Escherichia coli based on a potentiometric alternating biosensing (PAB) transduser // Sensors and Actuators В 83 (2002) 48-52.

63. D. Ivnitski, I. Abdel-Hamid, P. Atanasov, E. Wilkins, S. Strieker. Application of electrochemical biosensorsfor detection of food pathogenic bacteria // Electroanalysis 2000, 12, № 5, p. 317-332.

64. G.-D. Liu, J.-T. Yan, G.-L. Shen, R.-Q. Yu. Renewable amperometric immunosensor for complement 3 (C3) assay in human serum // Sensors and Actuators В 80 (2001) 95-100.

65. Т. Peng, Q. Cheng, R. Stevens. Amperometric detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by redox diacetylenic vesicles on a sol-gel thin-film electrode // Anal. Chem. 2000, 72, p. 1611-1617.

66. C. Fernandez-Sanchez, M.B. Gonzalez-Garcia, A. Costa-Garcia. AC voltammetric carbon paste-based enzyme immunosensors // Biosensors & Bioelectronics 14 (2000) 917-924.

67. I. Wilner, R. Blonder, A. Dagan. Application of photoisomerizable antigenic monolayer electrodes as reversible amperometric immunosensors // Amarican Chemical Society, 1994, 116. p. 9365-9370.

68. H. Ju, G. Yan, F. Chen, H. Chen. Enzyme-linked immunoassay of a-1-fetoprotein in serum by differential pulse voltammetry // Electroanalysis 1999, 11, № 2, p. 124-127.

69. R.M. Van Es, S.J. Setford, Y.U. Blankwater, D. Meijer. Detection of gentamicin in milk by immunoassay and flow injection analysis with electrochemical measurement // Anal. Chim. Acta 429 (2001) p. 37-47.

70. R.W. Keay, C.J. Mcneil. Separation-free electrochemical immunosensor for rapid determination of atrazine // Biosensors & Bioelectronics 13 (1998) p. 963-970.

71. M.D. Carlo, I. Lionti, M. Taccini, A. Cagnini, M. Mascini. Disposable screen-printed electrodes for the immunochemical detection of polychlorinated biphenyls // Anal. Chim. Acta 342 (1997) p. 189-197.

72. T.M. O,Regan, M. Pravda, C.K. O,Sullivan, G.C. Guilbaut. Development of disposable immunosensor for the detection of human heart fatty-acid binding protein in human whole blood using screen-printed carbon electrodes // Talanta 57 (2002) p. 501-510.

73. G.-D. Liu, Z.-y. Wu, S.-P. Wang, G.-L. Shen, R.-Q. Yu. Renewable amperometric immunosensor for Schistosoma japonium antibody assay // Anal. Chem. 2001, 73, p. 3219-3226.

74. C.-H. Liu, К.-Т. Liao, H.-J. Huang. Amperometric immunosensors based on protein A coupled polyaniline-perfluorosulfonated ionomer composite electrodes // Anal. Chem. 2000, 72, 2925-2929.

75. M. Pravda, C. 0,Meara, George G., G. Guilbaut. Polishing of screen-printed electrodes improves IgG adsorbtion // Talanta 54 (2001) p. 887-892.

76. R. Krishnan, A.L. Ghindilis, P. Atanasov, E. Wilkins, J. Montoya, F.T. Koster. Amperometric immunoassay for Hantavirus infection // Electroanalysis 1996, 8 № 12,p. 1131-1134.

77. C. Milligan, A. Ghindilis. Laccase based sandwich scheme immunosensor employing mediatorless electroanalysis // Electroanalysis 2002, 14 № 6, p. 415-419.

78. C.G. Bauer, A.V. Eremenko, A. Kuhn, K. Kurzinger, A. Makower, F.W. Scheller. Automated amplified flow immunoassay for cocaine // Anal. Chem. 1998, 70, 4624-4630.

79. Z. Yang, Y. Li, C. Balagtas, M. Slavik, D. Paul. Immunoelectrochemical assay in combination with homogeneous enzyme-labeled antibody conjugation for rapid detection Salmonella // Electroanalysis 1998, 10, № 13, p. 913-916.

80. M.R. Smyth, L. Bin, R. O,Kennedy, J. Moulds, T. Frame. Development of amperometric immunosensor based on flow analysis for the detection of red blood cells // Anal. Chim. Acta 340 (1997) p. 175-180.

81. H.C. Budnikov, E.P. Medyantseva, E.V. Khaldeeva, N.I. Glushko. Amperometric enzyme immunosensor for the determination of the pathogenic fungi Trichophyton rubrum // Anal. Chim. Acta 411 (2000) p. 13-18.

82. C. Fernandez-Sanchez, A. Costa-Garcia. Competitive enzyme immunosensor developed on a renewable carbon paste electrode support // Anal. Chim. Acta 402 (1999) p. 119-127.

83. K. Di Gleria, M.J. Green, H.A.O. Hill, C.J. McNeil. Homogeneous ferrocene-mediated amperometric immunoassay // Anal. Chem. 1988, 58, 1203-1205.

84. J. Janata. Immunoelectrode // Amer. Chem. Soc. 1975, 97, № 10, p. 2914.

85. Г.К. Будников, B.H. Майстренко, M.P. Вяселев. Основы современного электрохимического анализа // "Мир", 2003.

86. C.J. McNeil, R.W. Keay. Separation-free electrochemical immunosensor for rapid determination of atrazine // Biosensors & Bioelectronics 13 (1998) p. 963-970.

87. D. Ivnitski, J. Rishpon. A one-step, separation-free amperometric enzyme immunosensor // Biosensors & Bioelectronics 11 (1996) p. 409-417.

88. H. Kimura, S. Matsuzawa. Ultrasensitive heterogeneous immunoassay using photothermal deflection spectroscopy. 2. Quantitation of ultratrace Carcinoembryonic antigen in human sera // Anal. Chem. 1996, 68, p. 3063-3067.

89. K. Sato, M. Tokeshi, T. Odake, H. Kimura, T. Ooi, M. Nakao, T. Kitamori. Integration of an immunosorbent assay system: analysis of secretory human immunoglobulin A on polystyrene beads in a microchip // Anal. Chem. 2000, 72, p. 1144-1147.

90. L.A. Lyon, M.D. Musick, M.J. Natan. Colloidal Au-enhanced surfase plasmon resonance immunosensing // Anal. Chem. 1998, 70, p. 5177-5183.

91. J.J. Storhoff, R. Elghanian, R.C. Mucic, C.A. Mirkin, R.L. Letsinger. One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes // J. Am. Chem. 1998, 120, p. 1959-1964.

92. A. Perrin, A. Theretz, B. Mandrand. Thyroid stimulating hormone assaya based on the detection of gold conjugates by scanning force microccopy // Analytical Biochemistry 256, (1998) p. 200-206.

93. J. Ni, R.J. Lipert, G.B. Dawson, M.D. Porter. Immunoassay readout method using Raman labels adsorbed on immunogold colloids // Anal. Chem. 1999, 71, p. 4903-4908.

94. J. Wang, B. Tian, K.R. Rogers. Thick-film electrochemical immunosensor based on stripping potentiometric detection of a metal ion label // Anal. Chem. 1998, 70, p. 1682-1685.

95. W. Guo, J.-F. Song, M.-R. Zhao, J. Wang. Electrochemical immunoassay based on catalytic conversion of substrate by labeled metal ion and polarographic detection of the product generated // Analytical Biochemistry 259, (1998), p. 74-79.

96. S. Rapicault, B. Limoges, C. Degrant. Renewable perfluorosulfonated ionomer carbon paste electrode for competitive homogeneous electrochemical immunoassay using redox cationic labeled hapten // Ana. Chem. 1996, 68, p. 930-935.

97. M.B. Gonzales Garsia, A. Costa Garsia. Adsorptive stripping voltametric behavior of colloidal gold and immunogold on carbon paste electrode // Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38 (1995) p. 389-395.

98. M. Dequaire, Ch. Degrand, B. Limoges. An electrochemical metalloimmunoassay based on a colloidal gold label // Anal. Chem. 2000, 72, p. 5521-5528.

99. United States patent № 6,083,614 Method of producing a composite, moreprecisely a nanoporous body and a nanoporous body produced thereby. S.K.

100. Gordeev, S.G. Zhukov, P.I. Belobrov, A.N. Smolianinov, J.P. Dikov, prior.data2709.1995.

101. Б.И. Бузыкин, Г.Н. Ляпунова, Л.П. Сысоева, Л.И. Русинова. Химияформазанов. // Москва, "Наука", 1992.

102. Kh. Brainina, Е. Neyman. Electroanalytical Stripping Methods // J.1. Wiley&Sons, NY, 1993.

103. Основное содержание работы изложено в следующих работах:

104. Х.З. Брайнина, А.Н. Козицина, Я.Б. Бейкин. "Электрохимический иммуносенсор, на основе белка А, меченого коллоидным золотом" // Сенсор, 2002, № 4, стр. 22-26.

105. Kh. Brainina, A, Kozitsina, J. Beikin "Electrochemical immunosensor for forest-spring Encephalitis based on the protein A label with colloidal gold." // Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2003, 376, № 3, 481-485.

106. A.N. Kozitsina, Kh.Z. Brainina. Immunosensor for Diagnosis of Forest-Spring-Encephalitis. 5th Workshop "Manufacturing of laboratory Prototipes", Otrokovise, 7-10 October 1999, c. 15.

107. Козицина A.H., Брайнина X.3. Иммуносенсор для диагностики клещевого энцефалита. V Всероссийская конференция с участием стран СНГ «Электрохимические методы анализа», Москва, 6-8 декабря 1999, c.l 11.

108. A.N. Kozitsina, Kh.Z. Brainina. Amperometric Immunoassay for detection of Forest-Spring Encephalitis. 6th Workshop: "Scale-up Production and Commercialization", Lund, Sweden, 22-24 September, 2000, c.30.

109. Kozitsina A.N., Brainina Kh., Beikin Y.B. Amperometric Immunoassay for detection of Forest-Spring Encephalitis. International Workshop "Results of Fundamental Research for Investmen", St Petersburg, May 29-31, 2000, P. 70.

110. Kozitsina A.N., Brainina Kh. Amperometric . Immunosensor for Diagnosis of Forest-Spring-Encephalitis. XVI th International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Bratislava, Slovak Republic, June 1-6, 2001, p.147.

111. Х.З. Брайнина, А.Н. Козицина, А.В. Иванова, Е.Н. Шарафутдинова, М.Ю. Рубцова, С.М. Сергеев. Заявка на изобретение . Способ электрохимического иммуноанализа. Дата приоритета 18.06.2002

112. Х.З. Брайнина, А.В Иванова, Н.А. Малахова, С.Ю. Сараева, А.Н. Козицина, JI.B. Алешина, Ж.В. Шалыгина. Получено положительное решение. Способ изготовления электрода для электрохимического анализа. Дата приоритета 18.06.2002