Применение пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

/ Г

С'у7

Мелихова Елена Владимировна

ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж-2006

Работа выполнена в Липецком государственном техническом университете

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ермолаева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Шеховцова Татьяна Николаевна

Ведущая организация: Воронежская государственная технологическая академия, г.Воронеж.

Защита состоится « 16 » января 2006 г. в 15 ч. 00 мин. в аудитория 290 на заседании диссертационного совета Д 212.038.19 по химическим наукам при Воронежском государственном университете по адресу:

394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, химический факультет, (ауд. 290)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан _2_ декабря 200$ г.

доктор химических наук, доцент Рудаков Олег Борисович

Ученый секретарь диссертационного совета

Крысин М. Ю.

гтвв

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Последнее десятилетие характеризуется интенсивным развитием сенсорных технологий, ориентированных на создание аналитических устройств, позволяющих получать информацию о свойствах и составе различных сред в форме электрического сигнала. Пьезокварцевые химические сенсоры, широко применяющиеся для диагностики газовых (реже жидких) сред, характеризуются невысокой селективностью, поскольку аналитический сигнал формируется за счет приращения массы покрытия, нанесенного на электродах, вследствие сорбции определяемого компонента.

Применение в качестве рецепторных покрытий высокоспецифичных иммунореаген-тов позволяет проводить прямое, без введения дополнительных меток (ферментативные, флуоресцентные, радиоактивные), определение высоко- и низкомолекулярных соединений в жидких средах. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя при селективном определении следовых концентраций биологически активных соединений в водных растворах, пищевых продуктах и биологических средах, и поэтому исследованию таких сенсоров в настоящее время уделяется повышенное внимание.

Широкое использование противомикробных препаратов (сульфаниламиды, салицила-ты) для лечения и профилактики заболеваний людей и животных стимулирует разработку новых экспрессных, чувствительных методик их определения в различных объектах в присутствии большого количества сопутствующих соединений. Поэтому весьма перспективным является исследование возможностей иммуносенсоров, сочетающих принципы иммуноана-лиза с пьезокварцевьм методом преобразования аналитического сигнала, как детекторов в проточно-инжеюшонном анализе жидких сред при определении сульфаниламидов и салици-латов.

Цель работы. Разработка высокочувствительных и селективных пьезо кварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения следовых концентраций ряда биологически активных соединений в жидких средах.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

- исследование закономерностей иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности сенсоров, предназначенных для определения сульфопрепаратов и са-лицилатов в жидких средах;

- исследование способов иммобилизации галтен - белковых коньюгатов;

- кинетическое исследование гетерогенных имммтштшчилшк реакций; -

рос. национальная

- оценка специфичности применяемых иммунор<

агентовцБЛИОТЕКА СИ 09

I шт 4

- изучение влияния режима проточно-инжекциониого анализа на величину аналитического сигнала сенсора;

- разработка комплекса способов проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салицилатов с применением пьезоквариевых иммуносенсоров.

Научная новизна. Показана возможность конкурентного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах с применением пьезоквариевых иммуносенсоров с био-рецепторными покрытиями на основе гаптен-белковых конъюгатов. Впервые методом пьезо-кварцевого микровзвешивания изучены закономерности гетерогенной иммунохимической реакции между сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кислота)-белковым конъюгатом и специфичными антителами. Выявлены условия, способствующие наиболее полному протеканию реакции как в прямом, так и в обратном направлениях. Рассчитаны константы образования (Ко) гетерогенных иммунокомплексов, полученных при взаимодействии 4-аминосалициловой кислоты и сульфаметоксазола, конъюгированных с белковыми молекулами, с соответствующими поликлональными антителами. Показана взаимосвязь величины Ксв с пределом обнаружения сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносенсо-ра. Обоснованы требования к биорецепторным покрытиям (масса, толщина слоя, прочность закрепления иммунореагентов на металлической поверхности электродов), обеспечивающим многократное применение иммуносенсоров для определения сульфаметоксазола и салициловой кислоты в широком диапазоне концентраций. Оценена специфичность поликлональных антител по отношению к сульфопрепаратами и салицилатами, рассчитаны коэффициенты перекрестного взаимодействия. Изучено влияние режима проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора и определены оптимальные параметры (скорость потока, природа и рН раствора носителя, природа и концентрация регенерирующего раствора), обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ.

Практическая значимость. Предложены новые эффективные биорецепторные покрытия пьезоквариевых иммуносенсоров для определения микроколичеств сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах. Предложен алгоритм выполнения проточно-инжекционного анализа жидких сред, включающий регистрацию аналитического сигнала сенсора и регенерацию его биорецепторного покрытия.

Разработаны высокочувствительные и селективные методики проточно-инжекционного определения остаточных количеств сульфаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметазина гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных рас-

творах; сульфаметоксазола в объектах окружающей среды (почва, природные воды), пищевых продуктах (мясо, яйца, молоко), фармацевтических препаратах.

Методика определения сульфаметоксазола внедрена в лабораторный практикум спецкурса «Химические и биосенсоры». По материалам разработок подана заявка (№ 2004122302/28(023824)) на предполагаемое изобретение и получено положительное решение на выдачу патента.

На защиту выносятся:

- результаты сравнительного изучения способов иммобилизации гаптен-белковых конъю-гатов на поверхности металлических электродов пьезокварцевых резонаторов с учетом оптимального сочетания массы и толщины покрытия, стабильности сигнала, чувствительности определения биологически активных соединений;

- результаты изучения закономерностей иммунох имических реакций сульфопрепаратов или салицилатов со специфичными антителами;

- константы скорости образования и разрушения иммунокомплексов, величины констант связывания иммунореагентов;

- коэффициенты перекрестного взаимодействия антител к сульфаметоксазолу и 4-аминосалициловой кислоте с собственными иммуногенами и их структурными аналогами;

- оптимальные значения скорости потока, рН и природы раствора носителя, концентрации и природы регенерирующего раствора, обеспечивающие максимальную величину аналитического сигнала иммуносенсора;

- алгоритм выполнения проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов (суль-фаметоксазол, сульфаметазин, сульфаметазин гемисукцинат, белый стрептоцид) и салициловой кислоты в жидких средах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров;

- методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций сульфаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметазина гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных растворах; сульфаметоксазола в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и фармацевтических препаратах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); ХП научно - практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2003»

(Санкт - Петербург, 2003); I Региональной научной конференции «Химико-экологические проблемы Центрального региона России» (Орел, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004), XIV Областной научно-технической конференции (Липецк, 2005), П Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).

Публикапии. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 10 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена 125 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 15 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 256 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

Работа выполнялась при финансовой поддержке программ Минобрнауки РФ: «Развитие научного потенциала высшей школы» (тема № 01970006723 «Пьезокварцевые проточные иммуносенсоры: новые возможности для определения физиологически активных веществ»), темплана (тема «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ») и гранта для поддержки научно - исследовательской работы аспирантов вузов (тема A04-2.ll-935 «Исследование условий формирования аналитического сигнала проточного пьезокварцевого им-муносенсора при определении сульфопрепаратов в жидких средах»),

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Систематизированы литературные данные об особенностях применения пьезокварцевых иммуносенсоров для определения следовых концентраций биологически активных соединений в жидких средах методом проточно-инжекционного анализа. Проведен сравнительный анализ детекторов, применяемых в проточно-инжекционном анализе. Показана перспективность применения пьезокварцевых иммуносенсоров в качестве детекторов.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ИММУНОРЕАГЕНТЫ И АППАРАТУРА. Объекты исследования - салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота ("х.ч.", Россия), 4-аминосалициловая кислота, сульфаметоксазол, сульфаметазин, сульфаметазин гемисукци-нат, белый стрептоцид ("Signa", USA).

Иммунореагенты: гаптен-белковые конъюгаты - 4-аминосалициловая кислота, конъ-югированная с белковыми молекулами (бычий (И), яичный (КП) альбумины и соевый

трипсиновый ингибитор (Kill)); сульфаметоксазол, конъюгироваиный с бычьим сывороточным альбумином через диазокислоту (KTV), глутаровый альдегид (KV) и гемисукцинат (KVI); поликлональные антитела к 4-аминосалициловой кислоте (R1) и к сульфаметоксазолу (R2, R3, R4). Иммунореагенты были предоставлены д.х.н. С.А. Ереминым (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова) и проф. Ф. Ровелом (F. Rowell) (Школа медицины и фармации университета г. Сандерленд, Великобритания).

Для иммобилизаций гаптен-белковых конъюгатов использовали у-аминопропилтри-этоксисилан ("Reanal", Hungary), тетраэтоксисилан («х.ч.», Россия), конконавалин А и тиок-товую кислоту ("Sigma", USA). В качестве бифункциональных реагентов применяли глутаровый альдегид ("Reanal", Hungary), 1 - эпи - 3 - (3 - диметиламинопропил)карбодиимид, N,N' - дициклогексилкарбодиимид, N - гидроксисукцинимид ("Sigma", USA).

Буферные растворы - носители (рН 6,0 - 8,5): NaH2P04 - Na2HPO<i. КН2РО4 -Na2HP04; QHiO, - Na2HP04; NaOH - KH2PO„.

Регенерирующие растворы: (4-10"4 - 3) М растворы тиоционата калия, 8 М раствор тиомочевины; 0,1 М раствор и концентрированная соляная кислота (р =1,198 г/см3).

В качестве физических преобразователей применялись серийно выпускаемые пьезок-варцевые резонаторы АТ-среза с золотыми или серебряными электродами (диаметр 8 мм), собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц (ОАО "Квант", ЗАО "ЭТНА", Россия).

Исследования проводили на оригинальной установке для проточно-иижекционного анализа, включающей дозатор для ввода пробы, проточную ячейку детектирования (объем 15-20 мкл), в которой пьезокварцевый иммуносенсор контактировал только одной стороной с раствором, перистальтический насос, схему возбуждения пьезокварцевого сенсора, частотомер и персональный компьютер.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ПОВЕРХНОСТИ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ. Работа пьезокварцевого иммуносенсора базируется на обратимой иммунохимической реакции между антителами, находящимися в растворе, и коныогированными с белковыми молекулами низкомолекулярными соединениями, иммобилизованными на поверхности электродов:

Ат+АЛАт - Аг,

где Ат - антитело; Аг - антиген (гаптен-белковый конъюгат); Аг - Ат - иммунокомплекс.

Аналитический сигнал сенсора (Af) регистрируется при протекании прямой реакции гаптен-белковых конъюгатов с поликлональными антителами. После регистрации Af осуществляется разрушение поверхностного иммунокомплекса, что позволяет многократно использовать иммуносенсор в проточно-инжекционном анализе. Поэтому при изучении зако-

номерностей гетерогенных иммунохимических реакций были выявлены условия, способствующие наиболее полному протеканию как прямой, так и обратной реакций, а также установлены параметры, позволяющие проводить проточно-инжекционное определение биологически активных соединений с высокой чувствительностью и селективностью. Так как анализ проводился в потоке, то для обеспечения хорошей воспроизводимости результатов важным являлся выбор способа иммобилизации белковых молекул на поверхности электрода физического преобразователя.

Влияние способа иммобилизации на качество биорецепториого покрытия и оперативные характеристики иммуиоеенсора. К способам иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов предъявлялись следующие требования: удобство включения в состав биосенсора, стабилизация трехмерной структуры и активности, вариация специфичности связывания лигандов, многократное использование иммунореагентов.

Изучены следующие способы иммобилизации (табл. 1):

- непосредственное закрепление гаптен-белковых конъюгатов на металлической поверхности электрода пьезокварцевого иммуносенсора (1);

- сорбция биомолекул на подложке из конконавалина А (2), а также кросс-пришивка к ней с помощью 1 - этил - 3 - (3 - диметиламинопропил)карбодиимида (3), глутарового альдегида (4), КЬ)' - дициклогексилкарбодиимида (5);

- ковалентная иммобилизация с помощью глутарового альдегида на подложках, сформированных методом самособирающихся монослоев на основе тетраэтоксисилана (6); у-аминопропилтриэтоксисилана (7); а также с помощью 1 - этил - 3 - (3 - диметилами-нопропил)карбодиимида (8) и N - гидроксисукцинимида (9) на монослоях тиоктовой кислоты.

Качество полученного биорецепториого слоя оценивали по следующим параметрам (табл. 1): массе биорецепториого покрытия (ДШпл, мкг), толщине покрытия (ДЬ, нм), прочности связывания биомолекул с подложкой или металлической поверхностью электродов сенсора (Дт*); концентрационной чувствительности (А, Гц-мл мкг"1) определения антител к сульфаметоксазолу ИЗ (сАт= 0,4 мкг/мл); удельной чувствительности (Б, Гц-мл-мкг'2), равной А/Дт™; пределу обнаружения (ПрО) и стабильности покрытия (число циклов измерений (Ы) на данном биослое).

Наиболее перспективны методы иммобилизации, связанные с получением самособирающихся монослоев с регулируемой микроархитекгурой поверхности (7, 8). Последовательное нанесение слоев на носитель способствует регулярному послойному заполнению поверхности за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий. Достоинством таких наноструктурированных покрытий является снижение уровня неспецифической сорбции, по-

вышение чувствительности определения различных аналитов, а также гидролитической устойчивости, что позволяет осуществлять свыше 20 - электрод) или 35 (Аи - электрод) определений на одной пленке как сульфопрепаратов, так и салицилатов.

Таблица 1. Характериспгики покрытий пьезокварцевых иммуиосенсоров (п = 3; Р=0,95)

Номер способа Электрод 4т11Л;мкг ДЬпл, нм Дт\мкг Д £ Гц А, Гц-мл-мкг'1 в, Гц-мл-мкг'2 N

1 Аи 11,4 0,40 0,5 9±3 22,5 1,98 3

2 Аи 11,8 0,41 5,9 6±1 15,0 1,27 5

3 Аи 3,4 0,12 2,5 10±2 25,0 7,44 3

4 Аи 8,6 0,30 4,0 13±1 31,0 3,65 6

5 а8 22,7 0,79 6,9 44±15 110 4,85 10

Аи 12,4 0,43 3,5 36±13 90,0 7,25 16

6 А8 30,4 1,06 10,3 62±5 160 5,09 12

7 А8 20,2 0,71 10,5 87±4 220 10,77 21

11,9 0,42 6,0 65±3 160 13,62 18

Аи 6,5 0,23 0,5 110±5 275 42,24 36

8 А6 31,9 1,12 19,9 110±13 280 8,62 12

Аи 4,7 0,17 3,9 19±4 48,0 10,06 9

9 АЙ 15,9 0,56 12,2 12±2 30,0 1,88 3

Аи 7,5 0,26 4,3 - - - -

На покрытиях, полученных на основе у-аминопропилтрйэтоксисилана (7) и тиоктовой кислоты (8) с последующее закрепление сульфаметоксазол(4-аминосалициловая кислота)-белковых конъюгатов с помощью глутарового альдегида или Г- этил - 3 - (3 - диметилами-нопропил)карбодиимида, наблюдается оптимальное сочетание чувствительности, стабильности, воспроизводимости сигнала сенсора (рис. 1).

способ?

Я /ЖА

1 /51-СД

+глутчи»ый + «умфвмяммво»

шцпя -бшоийкотвпг

способе

\ +тиокт»«я ыяяог«

+1 -утп-3-(3-димвтип

\

«СНг)г О *

5-1

яминпирощцфирбо

+ суафмдтоксюоп

-Бышовый говмогег

Рис. 1. Схемы иммобилизации гаптен-белкового конъюгата на поверхности металлических электродов сенсоров.

Такой механизм иммобилизации позволяет сформировать на поверхности электрода биосенсора пространственно доступные активные центры, обеспечивающие высокую прочность связывания определяемого соединения с антителами без срывов частоты колебаний пьезокварцевого иммуносенсора. Качество биорецепторного покрытия также зависит от концентрации иммобилизуемого конъюгата. Наибольший аналитический сигнал сенсора отмечается при применении конъюгатов с концентрацией 0,5 м кг/мл, обеспечивающей высокую концентрацию стерически доступных активных центров на поверхности биослоя.

В последующих исследованиях применяли иммуносенсоры с биорецепторными покрытиями, полученными по методике (7) массой не более 20 - 25 мкп увеличение массы слоя свыше 35 - 45 мкг приводит к срыву частоты колебаний сенсора, а уменьшение до 10-15 мкг существенно сужает диапазон определяемых концентраций и сокращает число возможных циклов измерений. Иммуносенсоры могут сохраняться во влажной камере при + 4°С без снижения чувствительности свыше 3 месяцев.

Кинетические исследования. Величина аналитического сигнала сенсора во многом определяется степенью связывания антител с определяемым соединением. Аффинность взаимодействия иммунореагентов оценена по величинам констант связывания (К«), установленных на основе кинетических измерений.

Уравнение скорости обратимой иммунохимической реакции, выраженное через частотные характеристики с учетом уравнения Зауэрбрея (Д£=к-Дт, где к - коэффициент пропорциональности), имеет следующий вид: - АИИ = (к,,с+кр)Г - коС^, где с - концентрация антител в анализируемом растворе, а £п и Г - частоты колебаний сенсора до начала измерений и при образовании поверхностного иммунохомплекса соответственно.

Скорость взаимодействия иммобилизованных гаптен-белковых конъюгатов со специфичными антителами устанавливали методом начальных скоростей по тангенсу угла наклона на прямолинейном участке кинетической кривой (рис. 2а).

Графически, с учетом линейного характера зависимости скорости иммунохимической реакции (- «ПУЛ ) от частоты колебаний сенсора Г, по отрезку, отсекаемому на оси ординат, и значению углового кшффшиола (рис, 26) рассчитывали константы скорости образования (ко), разрушения (кр) иммунокомплекса и константу связывания К„ как отношение ко икр (таЕи. 2).

При разработке пьезокварцевых иммуносенсоров применяли комплементарные пары с наибольшими значениями констант связывания: для определения сульфопрепаратов - КГУ и КЗ (К« = 148-Ю7 М"1); для определения салицилатов - К1П и Н1 (Кс, = 501-Ю7 М"1). Установлена взаимосвязь между пределом обнаружения сульфопрепаратов и величиной К», на-

и

пример, для определения 0,2 нг/мл сульфопрепаратов должны применяться комплементарные пары с КсВ 108- 109М"' и выше.

Рис. 2. Определение констант связывания конъюгатов 4-аминосалициловой кислоты (КГ) с антителами Н1, концентрацией, нг/мл: 20 (1), 50 (2), 100 (3).

Таблица 2. Константы связывания (К„) *10"7 М~'

Антитела Конъюгят | К„ Антвтяа Коиъюгат | Ксв

R1 4-Амииосалициловая кислота R3 Сульфаметоксазол

Ы | 14,7 K1V 148,0

КП 24,8 KV 0,9

Kill 501-0 KV1 0,6

R2 Сульфаметоксазол R4 Сульфаметоксазол

KIV 3,9 KTV 3,7

KV 0,4 KV 0,1

KV1 0,1 KVI 0,5

Исследование специфичности иммуиоиеагентов. Поскольку поликлональные антитела обладают сродством не только к детерминантам собственного иммуногена, но и к детерминантам его структурных аналогов, проведены перекрестные иммунохимические реакции антител к сульфаметоксазолу (1*2, Ю, Н4) с родственными соединениями: сульфамета-зином, сульфаметазином гемисукцинатом, стрептоцидом; антител к 4-аминосалициловой кислоте (Ш) с салициловой и ацетилсалициловой кислотами. Рассчитаны коэффициенты перекрестного взаимодействия сульфопрепаратов и салицилатов ся,% [ся,% _ 1сзо(в)100/1с5о(а), где гс50 - концентрация, соответствующая 50 % - ому ингибированию связывания сульфаметоксазола или 4-аминосалициловой кислоты (а) и его аналога (в)].

Антитела к сульфаметоксазолу (рис. 3, а) проявляют максимальное сродство к собственному иммуногену (ся,% = 100%), следовательно, сульфаметоксазол можно определять в присутствии структурных аналогов с применением всех антител, кроме антител 114, прояв-

'' ляющих высокое сродство к сульфаметазину гемясукцинату (СЯ = 91%). Это объясняется использованием гемисукцината в качестве трейсера для получения гаптен-белкового конъю-гата, на которые затем вырабатывались антитела Я4. В тоже время, все исследованные антитела могут применяться для определения сульфаметазина гемисукцината, сульфаметазина и белого стрептоцида в отсутствии сульфаметоксазола.

Антитела к 4 - аминосалициловой кислоте (рис. 3, в) проявляют наибольшую активность не к собственному иммуногену - 4-аминосалициловой кислоте, а с салициловой кислоте (СИ. = 170 %), что, вероятно, связано с большей доступностью активных центров у незамещенной салициловой кислоты.

Рис. 3. Коэффициенты перекрестных взаимодействий а): антител 142, ИЗ, 1*4 с сульфаметок-сазолом (1), сульфаметазином (2), сульфаметазином гемисукцинатом (3), стрептоцидом (4); в): антител Ш с салициловой кислотой (1), 4-аминосалициловой кислотой (2), ацетилсалициловой кислотой (3).

Изучение влияний условий проточно-ннжекпионного анализа на величину аналитического сигнала сенсора. Поскольку лимитирующей стадией гетерогенной иммунохи-мической реакции является массоперенос реагирующих веществ в реакционную зону, изучено влияние скорости потока, природы и рН раствора носителя на величину аналитического сигнала, а также оптимизирован режим регенерации, позволяющий проводить многократные измерения на одном биорецепторном слое.

Максимальное и стабильное значение аналитического сигнала иммуносенсора наблюдалось при пропускании через ячейку детектирования со скоростью 60 мкл/мин (рис. 4) буферного раствора на основе ИаНгРОд - КааНРС^ (рН 6,1). Увеличение или снижение скорости потока раствора носителя сопровождалось сужением диапазона определяемых концентраций или удлинением времени анализа.

При использовании других изученных буферных систем [КН2РО4 - Ка2НР04, СбНвО? - №2НР04, ЫаОН - КН2РО4 с рН 6,0 - 8,5] наблюдается или меньшее значение А £ или непостоянное значение базового сигнала, что снижает воспроизводимость результатов определения в точность измерения аналитического сигнала.

Л£Гц 80

Рис. 4. Зависимость аналитического сигнала сенсора от скорости потока раствора-носителя (г) при взаимодействии сульфаметоксазол-беакового конъюгата со специфичными антителами (с = 40 нг/мл).

70

50

40

30

20 40 60 80 120 150

г, инн

Для возобновления числа активных центров покрытия после регистрации аналитического сигнала осуществляли разрушение поверхностного иммунокомплекса с помощью регенерирующего раствора. Экспериментально установлено, что применение в качестве регенерирующего 0,4 • 10"4 М раствора КБСИ обеспечивает достаточно быстрое разрушение иммунокомплекса и восстановление исходной частоты сенсора, не вызывая дополнительной деструкции подложки, что позволяет использовать одно и тоже покрытие свыше 30 раз.

Проведенные исследования позволили разработать алгоритм выполнения проточно-инжекционного анализа:

-пропускание через ячейку детектирования буферного раствора носителя для стабилизация частоты колебания сенсора (У;

- ввод анализируемой пробы в поток буферного раствора-носителя, сопровождающийся резким снижением частоты колебаний сенсора вследствие образования гетерогенного иммунокомплекса антиген-антитело;

- пропускание буферного раствора для стабилизации сигнала сенсора и регистрирование £

- пропускание регенерирующего раствора для разрушения гетерогенного иммунокомплекса и восстановления первоначальной активности биорецепторного слоя;

- пропускание через ячейку детектирования буферного раствора до возвращения частоты колебаний сенсора к исходному значению.

ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРШЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. Для определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах с помощью пьезокварцевых иммуносен-соров применяли конкурентный вид анализа. Фиксированную концентрацию специфичных антител вводили в пробу, которую затем пропускали через проточную ячейку детектирования, включающую пьезокварцевый иммуносенсор. Предварительно установленная концентрация специфичных антител к салициловой кислоте или к сульфаметоксазолу, необходимая для их 50%-ного связывания иммобилизованным аналитом (50 мкг/мл и 20 нг/мл соответст-

веняо), обеспечивала стехиометрическое соотношение между числом поверхностных активных центров биослоя и количеством несвязавпшхся в гомогенный иммунокомплекс антител. В момент образования гетерогенного иммунокомплекса регистрировали аналитический сигнал, обратно пропорциональный концентрации определяемого компонента в пробе.

Пьезокварцевые иммуносенсоры апробированы при анализе модельных растворов, содержащих сульфаметоксазол, стрептоцид, сульфаметазин, сульфаметазин гемисукцинат и салициловую кислоту (табл.3).

Таблица 3. Метрологические характеристики способов определения сульфопрепаратов и салициловой кислоты

Аналит Гаптен-белковый конъюгат Диапазон определяемых содержаний ПрО Параметры уравнения градуи ровочной функции

БА КIII 5,0- 25,0 мкг/мл 0,4 мкг/мл у = - 0,8х + 49,3 Я2 = 0,98

БМХ КIV 1,0- 220,0 нг/мл 0,2 нг/мл у = - 1,7х + 504 Я2 =0,99

ЭМ2 5,0-100,0 нг/мл 1.4 нг/мл у = - 1,4х+ 180 Я2 =0,99

вмг-ш 20,0-200,0 нг/мл 3,2 нг/мл у = - 0,7х + 186 Я2 =0,97

БА* 5,0- 130,0 нг/мл 3,0 нг/мл у = -0,6х + 210 Я2 =0,97

Правильность способов определения салициловой кислоты и сульфаметоксазола оценивали сопоставлением результатов, полученных разработанными способами, с содержанием салициловой кислоты в фармацевтическом препарате «Салициловый спирт» или с данными определения сульфаметоксазола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (табл. 4). Проверка результатов по критерию Стьюдента показала отсутствие систематической погрешности. Преимуществом предлагаемого способа анализа является возможность определения более низких (в 200 раз меньше по сравнению с методом ВЭЖХ) концентраций сульфопрепарата.

Разработаны методики проточно-инжекционного определения с помощью пьезокварце-вого иммуносенсора остаточных концентраций сульфаметоксазола в объектах окружающей среды (табл. 5), пищевых продуктах (табл. б), лекарственных формах (Бисептол, Ко-тримоксазол 1С>Г). Концентрацию сульфаметоксазола в образцах определяли методами гра-дуировочного графика или стандартных добавок. Установленное в лекарственных формах содержание сульфаметоксазола в пересчете на одну таблетку («Бисептол» -378±1 мг и «Ко-тримоксазол 1С№> - 374±2 мг) соответствовало паспортным данным.

Таблица 4. Проверка правильности определения сульфаметоксазола в водных растворах (п = 3, Р = 0,95)

\ метод вэжх Проточно-инжекционный способ

введено, найдено, в, введено, найдено, &

№ пробы \ нг/мл нг/мл нг/мл нг/мл

1 200 250 ±38 0,15 200" 170 ±23 0,14

2 500 470 ±23 0,05 500е 570 ±63 0,11

3 1000 970 ±19 0,02 1000" 980 ±19 0,02

Примечание: для анализа с применением пьезокварцевого иммуносенсора а - разбавление в 10 раз,®- в 50 раз,' - в 25 раз.

Таблица 5 Определение сульфаметоксазола в образцах почв и природных водах

Номер пробы сдоб, нг/мл Сх+лоб, нг/мл Сх> нг/мл »г

Почва (птицефабрика «Липецкая»)

1 10,0 24,4±2,8 14,4±2,8 0,18

2 10,0 22,3±2,9 12,3±2,9 0,22

3 10,0 17,2±0,3 7,2±0,3 0,02

4 10,0 6д±1,3 0,15

Природная вода г. Сандерленд (Англия)

5 5,0 7,3±0,5 2,3±0,5 0,20

6 250,0 329,0±15 79,0±15 0,20

7 500,0 644,0±14 144,0±14 0,10

р. Воронеж г. Липецк (Россия)

8 10,0 13,6±0,6 3,6±0,6 0,20

9 25,0 28,5±0,7 3,5±0,7 0,20

Таблица б. Результаты определения сульфаметоксазола в пищевых продуктах (Р=0^5; п=5)

Номер пробы Введено сульфаметоксазола, нг/мл Найдено сульфаметоксазола, нг/мл Рассчитано вг

Молоко

1 10,0 10,6±0,2 0,6±0,2 нг/мл 0,02

2 10,0 11,5±0,4 1,5±0,4нг/мл 0,04

3 10,0 14,8±0,9 4,8±0,9 нг/мл 0,06

Яйца

4 10,0 11,б±0,9 0,8±0,4 нг/г 0,10

5 10,0 12,3±0,9 1,2±0,5 нг/г 0,06

Мясо птицы

6 10,0 13,9±1,5 1,6±0,6нг/г 0,13

Образцы: молоко -1 - «Детское», 2 - коровье (некоммерческое), 3 - женское; яйца - 4 - некоммерческое, 5 - птицефабрика «Золотой петушок» (г. Липецк); мясо - 6 - птицефабрика «Золотой петушок» (г. Липецк).

Все разработанные методики проточно-инжекцнонного определения сульфаметоксазо-ла характеризуются простотой выполнения, высокой чувствительностью (ПрО = 0,15 нг/мл) и селективностью, не требуют сложного оборудования, поэтому могут быть рекомендованы для мониторинга объектов окружающей среды, контроля качества пищевых продуктов, сульфаниламидных лекарственных препаратов и выявления их фальсификаций.

Автор благодарит к. х. н., доцента E.H. Калмыкову за большую помощь при проведении эксперимента, к. т. н„ доцента В.Ю. Ширяева и к т. н. М.В. Милонова за техническое содействие в создании лабораторного комплекса для проточно-инжекционного анализа, д.х.н. С. А. Еремина за предоставленные иммунореагенты и обсуждение результатов, проф. Ф. Ровела за предоставленные иммунореагенты.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально изучены и теоретически обоснованы условия протекания обратимой иммунохимической реакции на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров на примере взаимодействия конъюгатов сульфаметоксазола и 4-аминосалициловой кислоты с соответствующими антителами. Установлены значения Кс„ позволяющие количественно оценить степень связывания сульфаниламидов и салицилатов со специфичными антителами. Показано, что при применении комплементарных пар иммунореагентов с константой связывания 108 - 109 М'1 и выше возможно обнаружение сульфопрепаратов на уровне ОД нг/мл.

2. Обоснованы способы формирования биорецепторных покрытий пьезокварцевых иммуно-

сенсоров на основе сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кислота)-белковых конъюгатов. Показано, что наилучшие оперативные характеристики сенсоров достигаются при иммобилизации иммунореагентов на предварительно полученной методом самособирающихся монослоев силоксаиовой или тиоктовой подложке с помощью глутарового альдегида или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Такие покрытия позволяют регистрировать максимально возможные значения аналитического сигнала пьезок-варцевого иммуносенсора и выполнять свыше 30 измерений на одном биослое.

3. Установлены коэффициенты перекрестных взаимодействий ряда поликлональных антител

с определяемыми соединениями, конъюгированными с белковыми молекулами и иммобилизованными на поверхности электрода сенсора. Осуществлен выбор комплементарных пар для селективного определения биологически активных соединений в присутствии их структурных аналогов: сульфаметоксазола в присутствии сульфаметазина, суль-

фаметазина гемнсукцината, белого стрептоцида; салициловой кислоты в присутствии 4-аминосалициловой кислоты, ацетилсалициловой кислоты.

4. Обоснованы режимы проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салици-

латов в жидких средах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров. Установлено, что проведение иммунохимических реакций сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кислота) - антитело в потоке (60 мкл/мин) буферного раствора носителя на основе №НгР04 - Na2HPÜ4 (pH 6,1) повышает чувствительность и стабильность работы сенсора, а использование в качестве регенерирующего реагента 0,4 • 10"4 М раствора тиоционата калия обеспечивает высокую воспроизводимость сигнала при многократном использовании пьезокварцевых иммуносенсоров.

5. Разработаны методики проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салициловой кислоты в водных средах, сульфаметоксазола в образцах пищевых продуктов (мясо, яйца, молоко), объектах окружающей среды (почва, природные воды) и фармацевтических препаратах (Бисептол, Ко-тримоксазол), характеризующиеся достаточно широким диапазоном определяемых содержаний, высокой селективностью и низким пределом обнаружения.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Мелихова Е.В. Кинетическое исследование аффинного взаимодействия антиген-антитело методом пьезо кварцевого микровзвешивания [Текст] / Е.В. Мелихова, М.В. Милонов // Актуальные проблемы современного естествознания: науч. конф. фестив. студентов, аспирантов и молодых ученых: тез. докл. - Иваново, 2003. - С. 35.

2. Мелихова Е.В. Оценка аффинности иммунохимического взаимодействия с помощью пье-зогравиметрического иммуносенсора [Текст] / Е.В. Мелихова // Наша общая окружающая среда: науч.-практич. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов Липецкой области: тез. докл. - Липецк, 2003. - С. 67.

3. Ермолаева Т.Н. Перспективы использования пьезокварцевых сенсоров для иммунохимического анализа [Текст] / Т.Н. Ермолаева, E.H. Калмыкова, Е.С. Дергунова, Е.В. Мелихова, С.А. Еремин // XIIV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: тез. докл. - Казань, 2003. - С. 17.

4. Калмыкова E.H. Определение сульфаниламидов в водных средах с применением иммуносенсоров [Текст] / E.H. Калмыкова, Е.В. Мелихова, Т.Н. Ермолаева // Экоаналитика-2003: V Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды: тез. докл. -СПб., 2003. -С.217.

5. Калмыкова E.H. Определение сульфаметоксазола с помощью пьеэокварцевого иммуно-сенсора [Текст] / E.H. Калмыкова, Е.В. Мелихова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т. 49. - № 1. - С. 8-13.

6. Калмыкова Е.Н! Применение пьезокварцевых иммуносенсоров для определения остаточного количества сульфаниламидов в молоке [Текст] / E.H. Калмыкова, Е.В. Мелихова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Химико-экологические проблемы центрального региона России: I Регион, науч. конф.: тез. докл. - Орел, 2003. - С. 81 - 84.

7. Калмыкова E.H. Кинетические исследования аффинного взаимодействия и их применение при разработке пьезокварцевых иммуносенсоров [Текст] / E.H. Калмыкова, Е.В. Мелихова, Е.С. Дергунова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2004. - № 5. - С. 597 - 602.

8. Калмыкова E.H. Пьезокварцевый иммуносенсор для проточного определения сульфопре-паратов в жидкостях [Текст] / E.H. Калмыкова, М.В. Милонов, Е.В. Мелихова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Сенсор. - 2005. - № 2. - С. 14 - 20.

9. Калмыкова E.H. Проточный пьезокварцевый иммуносенсор для определения фармацевтических препаратов в лекарственных формах и молоке [Текст] / E.H. Калмыкова, Е.В. Мелихова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Аналитика России: Всероссийская конф. по аналит. химии: тез. докл. - М., 2004. - С. 86 - 87.

10. Наквасина Е.В. Изучение условий формирования аналитического сигнала пьеэокварцевого иммуносенсора при проточно-инжекционном определении сульфаметоксазола [Текст] / Е.В. Наквасина, Е.В. Мелихова // Повышение эффективности металлургического производства: XIV Областная науч.-техн. конф.: тез. докл. - Липецк, 2005. - С, 8 - 9.

11. Мелихова Е.В. Особенности формирования рецепторного покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров для определения сульфопрепаратов [Текст] / Е.В. Мелихова, E.H. Калмыкова, С.А. Еремин, Т.Н. Ермолаева // Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии: П Междунар. симпозиум.: тез. докл. - Краснодар, 2005. - С. 215 - 216.

12. Мелихова Е.В. Экстракционная пробоподготовка при анализе пищевых продуктов на содержание сульфопрепаратов с помощью проточного пьеэокварцевого иммуносенсора [Текст] / Е.В. Мелихова, E.H. Калмыкова, Т.Н. Ермолаева // Экстракция органических соединений: III Междунар. конф.: тез. докл. - Воронеж, 2005. - С. 302.

13. Нартова Ю.В. Проточно-инжекционное определение сульфопрепаратов и пестицидов в органических концентратах [Текст] / Ю.В. Нартова, И.В. Неробеева, Е.В. Мелихова, E.H. Калмыкова, Т.Н. Ермолаева // Экстракция органических соединений: III Междунар. конф.: тез. докл. - Воронеж, 2005. - С. 308.

Подписано в печать 30. 11. 2005г. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Ризография. Печ. л 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 1110 Липецкий государственный технический университет. Типография ЛГТУ 398600 Липецк, ул Московская, 30

Р2544 5

РНБ Русский фонд

2006-4 28075

Ф ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

• I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ПРОТОЧНО

ИНЖЕКЦИОННОГО АНАЛИЗА.

I. 1. Характеристика детекторов, применяемых в проточно - инжекционном анализе.

I.2. Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных соединений в жидких средах. $ II. ЭКСЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

II. 1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, биополимеров и иммунореагентов.

II. 2. Установка для проточно - инжекционного анализа.

II. 3. Пробоподготовка образцов пищевых продуктов и объектов окружающей среды.

III. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ^ ПОВЕРХНОСТИ ПЬЕЗОКВ АРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ.

III. 1. Изучение взаимодействия антител с биорецепторным покрытием на основе иммунореагентов.

III. 1. 1. Влияние способа иммобилизации ® на качество биорецепторного покрытия и оперативные характеристики иммуносенсора.

III. 1. 2. Влияние массы биослоя на величину аналитического сигнала.

III. 2. Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело.

III. 3. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту ® протекания иммунохимических реакций.

III. 4. Исследование специфичности иммунореагентов.

III. 5. Изучение влияния условий проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора.

III. 5.1. Влияние скорости, природы и рН буферного раствора носителя на величину аналитического сигнала иммуносенс ора.

III. 5. 2. Влияние природы регенерирующего раствора на воспроизводимость аналитического сигнала.

IV. ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ ИММУНОСЕНСОРОВ № ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И

БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ.

IV. 1. Особенности применения пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах.

IV. 2. Методика определения сульфаметоксазола в объектах окружающей среды.

IV. 3. Методика определения сульфаметоксазола в пищевых продуктах.

IV. 4. Методика определения сульфаметоксазола в фармацевтических формах.

ВЫВОДЫ.

Актуальность. Последнее десятилетие характеризуется интенсивным развитием сенсорных технологий, ориентированных на создание аналитических устройств, позволяющих получать информацию о свойствах и составе различных сред в форме электрического сигнала. Пьезокварцевые химические сенсоры, широко применяющиеся для диагностики газовых (реже жидких) сред, характеризуются невысокой селективностью, поскольку аналитический сигнал формируется за счет приращения массы покрытия, нанесенного на электродах, вследствие сорбции определяемого компонента.

Применение в качестве рецепторных покрытий высокоспецифичных имму-нореагентов позволяет проводить прямое, без введения дополнительных меток (ферментативные, флуоресцентные, радиоактивные), определение высоко- и низкомолекулярных соединений в жидких средах. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя при селективном определении следовых концентраций биологически активных соединений в водных растворах, пищевых продуктах и биологических средах, поэтому исследованию таких сенсоров в настоящее время уделяется повышенное внимание.

Широкое использование противомикробных препаратов (сульфаниламиды, салицилаты) для лечения и профилактики заболеваний людей и животных стимулирует разработку новых, экспрессных, чувствительных методик их определения в различных объектах в присутствии большого количества сопутствующих соединений. Поэтому весьма перспективным является исследование возможностей иммуносенсоров, сочетающих принципы иммуноанализа с пьезокварцевым методом преобразования аналитического сигнала, как детекторов в проточно-инжекционном анализе жидких сред при определении сульфаниламидов и сали-цилатов.

Цель работы. Разработка высокочувствительных и селективных пьезоквар-цевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения следовых концентраций ряда биологически активных соединений в жидких средах.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

• исследование закономерностей иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности сенсоров, предназначенных для определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах;

• исследование способов иммобилизации гаптен - белковых конъюга-тов;

• кинетическое исследование гетерогенных иммунохимических реакций;

• оценка специфичности применяемых иммунореагентов;

• изучение влияния режима проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора;

• разработка комплекса способов проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салицилатов с применением пьезокварцевых иммуносенсоров.

Научная новизна. Показана возможность конкурентного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров с биорецепторными покрытиями на основе гаптен-белковых конъюгатов. Впервые методом пьезокварцевого микровзвешивания изучены закономерности гетерогенной иммунохимической реакции между сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кислота) - белковым конъюгатом и специфичными антителами. Выявлены условия, способствующие наиболее полному протеканию реакции как в прямом, так и в обратном направлениях. Рассчитаны константы образования (Ксв) гетерогенных иммунокомплексов, полученных при взаимодействии конъюгатов 4-аминосалициловой кислоты или сульфаметоксазола со специфичными поликлональными антителами. Показана взаимосвязь величины Ксв с пределом обнаружения сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносен-сора. Обоснованы требования к биорецепторным покрытиям (масса, толщина биослоя, прочность закрепления иммунореагентов на металлической поверхности электродов), обеспечивающим многократное применение иммуносенсоров для определения сульфаметоксазола и салициловой кислоты в широком диапазоне концентраций. Оценена специфичность поликлональных антител по отношению к сульфопрепаратами и салицилатами, рассчитаны коэффициенты перекрестного взаимодействия. Изучено влияние режима проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора и определены оптимальные параметры (скорость потока, природа и рН раствора носителя, природа и концентрация регенерирующего раствора), обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ.

Практическая значимость. Предложены новые эффективные биорецеп-торные покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров для определения микроколичеств сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах. Предложен алгоритм выполнения проточно-инжекционного анализа жидких сред, включающий регистрацию аналитического сигнала сенсора и регенерацию его биорецепторного покрытия.

Разработаны высокочувствительные и селективные методики проточно-инжекционного определения сульфаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметази-на гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных растворах, а также сульфаметоксазола в объектах окружающей среды (почва, природные воды), пищевых продуктах (мясо, яйцо, молоко), фармацевтических препаратах.

Методика определения сульфаметоксазола внедрена в лабораторный практикум спецкурса «Химические и биосенсоры». По материалам разработок подана заявка (№ 2004122302/28(023824)) на предполагаемое изобретение и получено положительное решение на выдачу патента.

На защиту выносятся:

- результаты сравнительного изучения способов иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов на поверхности металлических электродов пьезокварцевых резонаторов с учетом оптимального сочетания массы и толщины покрытия, стабильности сигнала, чувствительности определения биологически активных соединений; результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций сульфопрепаратов или салицилатов со специфичными антителами;

- константы скорости образования и разрушения иммунокомплексов, величины констант связывания иммунореагентов;

- коэффициенты перекрестного взаимодействия антител к сульфаметоксазлолу и 4-аминосалициловой кислоте с собственными иммуногенами и их структурными аналогами;

- оптимальные значения скорости потока, рН и природы раствора носителя, концентрации и природы регенерирующего раствора, обеспечивающие максимальное значение аналитического сигнала иммуносенсора;

- алгоритм выполнения проточно-инжекционного определения сульфопрепара-тов (сульфаметоксазол, сульфаметазин, сульфаметазин гемисукцинат, белый стрептоцид) и салициловой кислоты в жидких средах с применением пьезок-варцевых иммуносенсоров;

- методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций суль-фаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметазина гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных растворах; сульфаметоксазола в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и лекарственных препаратах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); XII научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2003» (Санкт-Петербург, 2003); I Региональной научной конференции «Химико-экологические проблемы Центрального региона России» (Орел, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004), XIV Областной научно-технической конференции (Липецк, 2005), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 10 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 15 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 269 ссылок на отечественные и зарубежные работы.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально изучены и теоретически обоснованы условия протекания обратимой иммунохимической реакции на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров на примере взаимодействия конъюгатов сульфаметоксазола и 4-аминосалициловой кислоты с соответствующими антителами. Установлены значения Ксв, позволяющие количественно оценить степень связывания сульфаниламидов и салицилатов со специфичными антителами. Показано, что при применении комплементарных пар иммунореагентов с константой связывания 108 - 109 М"1 и выше возможно обнаружение сульфопрепаратов на уровне 0,2 нг/мл.

2. Обоснованы способы формирования биорецепторных покрытий пьезокварце-вых иммуносенсоров на основе сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кисло-та)-белковых конъюгатов. Показано, что наилучшие оперативные характеристики сенсоров достигаются при иммобилизации иммунореагентов на предварительно полученной методом самособирающихся монослоев силоксановой или тиоктовой подложке с помощью глутарового альдегида или 1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Такие покрытия позволяют регистрировать максимально возможные значения аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора и выполнять свыше 30 измерений на одном биослое.

3. Установлены коэффициенты перекрестных взаимодействий ряда поликлональных антител с определяемыми соединениями, конъюгированными с белковыми молекулами и иммобилизованными на поверхности электрода сенсора. Осуществлен выбор комплементарных пар для селективного определения биологически активных соединений в присутствии их структурных аналогов: сульфаметоксазола в присутствии сульфаметазина, сульфаметазина гемисук-цината, белого стрептоцида; салициловой кислоты в присутствии 4-аминосалициловой и ацетилсалициловой кислот.

4. Обоснованы режимы проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров. Установлено, что проведение иммунохимических реакций сульфаметокса-зол (4-аминосалициловая кислота)-антитело в потоке (60 мкл/мин) буферного раствора носителя на основе NaH2P04 - Na2HP04 (рН 6,1) повышает чувствительность и стабильность работы сенсора, а использование в качестве регенерирующего реагента 0,4 • 10"4М раствора тиоционата калия обеспечивает высокую воспроизводимость сигнала при многократном использовании пьезокварцевых иммуносенсоров.

5. Разработаны методики проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салициловой кислоты в водных средах, сульфаметоксазола в образцах пищевых продуктов (мясо, яйца, молоко), объектах окружающей среды (почва, природные воды) и фармацевтических препаратах (Бисептол, Ко-тримоксазол), характеризующиеся достаточно широким диапазоном определяемых содержаний, высокой селективностью и низким пределом обнаружения.

93

1. Шпигун J1.K. Проточно - инжекционный анализ / JI. К. Шпигун, Ю. А. Золотов //1. М. ^Знание* 1990. 32 с.

2. Su X.D. Design and application of piezoelectric quartz crystal based immunoassay /

3. X.D. Su,F.T. Chew, S.F.Y. Li//Anal. Sci.-2000.-V. 16,P. 107- 111.

4. Susmel S. Human cytomegalovirus detection by a quartz crystal microbalance immunosensor / S. Susmel, C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault // Enzyme and Microb. Technol 2000. - V.27, P. 639.

5. Konig B. A piezoelectric immunosensor for hepatitis viruses/ B. Konig, M. Gratzel //

6. Anal. Chim. Acata. 1995. - V. 309, P. 19.

7. Zhou X.D. Detection of hepatitis В virus by piezoelectric biosensor / X.D. Zhou, L.J.1.u, M. Hu, L.L. Wang, J.M. Hu // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. - V. 27. № 12. - P. 341.

8. Skladal P. Piezoelectric biosensor for real-time monitoring of hybridization and detection of hepatitis С vims / P. Skladal, C.S. Riccardi, H. Yamanaka, P.L Costa // J. of Virolog. Meth. 2004. - V. 117, P. 145.

9. Murrey G. M.Sensors for chemical weapons detection / G. M. Murrey, G. E.

10. Southard // IEEE Instrum. And Meas. Mag. 2002. V. 5, № 4 - P. 12 - 21.

11. Мирошниченко И. В. Применение проточно-инжекционного анализа для контроля химического состава жидких радиоактивных отходов / И. В. Мирошниченко, О. Ю. Пыхтеев // Тез. докл. всеросс. конф. «Экоаналитика 2003» -Санкт-Петербург. 2003. - С. 244.

12. Евгеньев М. И. Проточно-инжекционный анализ лекарственных веществ / М. И.

13. Евгеньев, С. Ю. Гармонов // Тез. докл. всеросс. конф «Аналитические приборы» Санкт-Петербург. - 2002. - С. 283.

14. Будников Г. К. Основы современного электрохимического анализа / Г. К. Будников, В.Н Майстренко, М.Р Вяселев / М.: «Мир», 2003. 592 с.

15. Евгеньев М.И. Проточно инжекционный анализ лекарственных веществ / М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Л.Ш. Шакирова // Журн. аналит. химии. -2001.-Т. 56, №4.-С. 355-366.

16. Евтюгин Г. А. Биосенсоры для определения ингибиторов ферментов в окружающей среде / Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, Е. Б. Никольская // Russian Chem. Rew. 1999. Т. 68, № 12. - С. 1041 - 1064.

17. Шпигун Л. К. Проточно-инжекционный анализ / Л. К. Шпигун // Журн. аналит. химии. 1990. - Т. 45, № 6. - С. 1045.

18. Tzanavaras Paraskevas D. Novel flow injection spectrophotometric determination offosinopril using UV-assisted digestion and an orthophosphates calibration graph /

19. D. Tzanavaras Paraskevas, G. Themelis Demetrius // Anal. chim. acta. 2003. -V.481, № 2. - P. 321-326.

20. Altiokka G. FIA of sildenafil citrate using UV-detection / G. Altiokka, Z. Atkosar,

21. E. Sener, M. Tuncel // J. Pharm. And Biomed. Anal. 2001. - V. 25, № 2. - P. 339 - 342.

22. Sener E. Rapid determination of naproxen sodium in pharmaceutical formulations by flow injection analysis (FIA) using UV-detection / E. Sener, M. Tuncel, H. Y. Aboul-Enein // J. Liq. Chromatogr. And Relat. Technol. 2003. - V. 26, № 3. - P. 401-408.

23. Misiuk W. Flow injection spectrophotometric determination of perazine / W. Misiuk, P. Hataburda // J. Trace and Microprobe Techn. 2003. - T. 21, № 1. - P. 95-102.

24. Xu Hong-ping Application of uniform design in multivariable optimization of a new

25. FIA system for the determination of ruthenium / H.-p. Xu, Y.-l. Chen, X.-g. Chen, H.-t. Liu, Z.-d. Hu // J. Lanzhou Univ. Natur. Sci. -2003. T. 39, № 6. - P. 49 -53.

26. Kleszczewski T. Flow injection spectrophotometric determination of L-ascorbic acid in biological matters / T. Kleszczewski, E. Kleszczewska // J. Pharm. And Biomed. Anal. 2002. - T. 29, № 4. - P. 755 - 759.

27. Liawruangrath S. Flow injection spectrophotometric determination of europium using chlortetracycline / S. Liawruangrath, Sakulkhaemaruethai S. // Talanta. 2003. -T. 59, № 1. - P. 9- 18.

28. Shrivas K. Flow injection analysis spectrophotometric determination of palladium / K. Shrivas, Patel S. Khageshwar, P. Hoffinann // Anal. Lett. 2004. - T. 37, № 3. -P. 507-516.

29. Oms M. T. Sequential injection system for on-line analysis of total analysis of totalnitrogen with UV-mineralization / M. T. Oms, A. Cerda, V. Cerda // Talanta. -2003. T.59, № 2. - P. 319 - 326.

30. Liu R. Применение жидкой мембраны для концентрирования и on-line проточно-инжекционного спектрофотометрического определения для определения летучих фенолов в воде / R. Liu, J. Li // J. Anal. Chem. 2003. - Т. 31, № 5. - P. 594 - 597.

31. Евгеньев М. И. Проточно-инжекционные определения замещенных триптамина со спектрофотометрическим детектированием / М. И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, А. С. Брысаев // Тез. докл. 17 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Казань. - 2003. С. 298.

32. Li J. Спектрофотометрическое определение следов анилина в воде в системепроточной инжекции с обогащением на потоке с помощью жидкой мембраны на подложке / J. Li, R. Liu // Anal. Chem. 2002. - Т. 30, № 8. - P. 915 - 919.

33. Евгеньев M. И. Проточно-инжекционные определения токсичных ароматических аминов в лекарственных препаратах / М. И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, JI. Ш. Шакирова, А. С. Брысаев // Журн. аналит. химии. 2002. - Т. 57, № 12. -С. 1290-1295.

34. Cassella R. J. Flow injection spectrophotometric determination of copper in petroleum refinery wastewaters / R. J. Cassella // Microchem. J. 2002.-T. 72,№ l.-P. 17 -26.

35. Brabcova M. Determination of nitrites, nitrates and their mixtures using flow injection analysis with spectrophotometric detection / M. Brabcova, P. Rychlovsky, I. NSmcova // Anal. Lett. 2003. - T. 36, № Ю. - P. 2303 - 2316.

36. Costin J. W. Selective determination of amino acids using flow injection analysis coupled with chemiluminescence detection / J. W. Costin, P. S. Francis, S. W. Lewis // Anal. chim. acta. 2003. -T. 480, № 1. - P. 67 - 77.

37. Afsaneh S. Flow injection determination of isoniazid using N-bromosuccinimide-and N-chlorosuccinimideluminol chemiluminescence systems / S. Afsaneh, M. A. Karimi, M. R. H. Nezhad // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2003. - T. 30, № 5. - P. 1499-1506.

38. Afsaneh S. Flow injection chemiluminescence determination of sulfide by oxidationwith N-bromosuccinimide and N-chlorosuccinimide / S. Afsaneh, M. A. Karimi // Talanta. 2002. - T. 57, № 3. - P. 491 - 500.

39. Zhou M. Flow injection chemiluminescence determination of trace calf thymus DNA / M. Zhou, Y. J. Ma, X. Y. Jin, X. L. Teng, Z. Y. Zhang, H. Chen // Chin. Chem. Lett.-2003.-T. 14, № 10.-P. 1051- 1053.

40. Ma Y. Flow-injection chemiluminescence assay for ultra-trace determination of DNA using rhodamine B-Ce(IV)-DNA ternary system in sulfuric acid media / Y. Ma, M. Zhou, X. Jin, Z. Zhang, X. Teng, H. Chen // Anal. chim. acta. 2004. -T. 501, № i.p. 25-30.

41. Liangqia G. Flow injection chemiluminescent determination of tetracycline using atris(2,2/ bipyridine)ruthenium(II) - cerium(IV) sulphate system / G. Liangqia, X. Zenghong, L. Xucong, Z. Weilin, C. Guanan // Luminescence. -2004. - T. 19, № 2.-P. 64-68.

42. Nianbing L. Determination of procaine hydrochloride using flow injection ingibitory chemiluminescence / L. Nianbing, C. Yuwu, W. Jian, D. Jianping, C. Guonan // Luminescence. 2003. -T. 18, № 3. - P. 125 - 130.

43. Li Y. Flow injection chemiluminescence determination of thiol-sontaining drugs based on a quinine-sensitized permanganate reaction / Y. Li, A. Zhang, J. Du, J. Lu // Anal. Lett. 2003. - T. 36, № 4. - P. 871 - 879.

44. Li B. Flow injection chemiluminescence determination of 1 cysteine in amino acidmixture and human urine with the Br03-quinine system / B. Li, Z. Zhang, M. Liu,

45. С. Xu // Analyt. And Bioanalyt. Chem. 2003. - T. 377, № 7 - 8. - P. 1212 -1216.-X-'

46. Afsaneh S. Flow injection chemiluminescence determination of sulfide by oxidation ^ with chlorinated isocyanurates / S. Afsaneh, M. A. Karimi, M. R. H. Nezhad //

47. Anal. Lett. 2002. - T. 35, № 12. - P. 2023 - 2037.

48. Guerrero S. R. O. FIA-chemiluminescence determination of acridine yellow / S. R.

49. O. Guerrero, С. M. Icardo, G. C. Benito, M. J. Calatayud // Anal. Lett. 2003. - T. 36, №5.-P. 1039-1049.

50. Wu X.-P. Определение 5-метокситриптофола в системе проточно-инжекционного анализа с хемилюминесцентным детектированием / Х.-Р. Wu, J.-P. Duan, H.-Q. Chen, D-L.Chen, F.-X. Huang, G.-N. Chen // J. Spectrosc. Lab.2003.-T. 20, №5.-P. 781 -786.

51. Townshend A. Flow injection-chemiluminescence determination of propranolol in pharmaceutical preparations / A. Townshend, P. J. A. Murillo, M. T. A. Pardo // Anal. chem. acta. 2003. - T. 488, № 1. - P. 81 - 88.

52. Du J. Chemiluminescence flow injection analysis of amoxycilin by permanganatebased-reaction / J. Du, Y. Li, J. Lu // Anal. Lett. 2002. - T. 35, № 14. - P. 2295 -2304.

53. Townshend A. Flow-injection determination of cinnarizine using surfactant-enhanced permanganate chemiluminescence / A. Townshend, N. Youngvises, R. A. Wheatley, S. Liawruangrath // Anal. chim. acta. 2003. - T. 499, № 1 - 2. - P. 223-233.

54. Yakovleva J. Development of a polarization fluoroimmunoassay for linear alkyl-benzenesulfonates (LAS) / J. Yakovleva, A. Lobanov, I. Michura, A. For-manovsky, M. Franek, J. Zeravik, S. Eremin // Anal. Lett. 2002. - T. 35, № 14. -P. 2279 - 2294.

55. Sanz V. Design and characterization of a fluorescent biosensor for glucose determi-\ nation based on labeled glucose oxidase / V. Sanz, A. Yolanda, de Marcos S., J.

56. Galban, J. R. Castillo // Luminescence. 2002. - T.17, № 4. - P. 260 - 261.

57. Lima J. Enzymatic determination of choline in milk using a FIA system with potentiometric detection / J. Lima, C. Delerue Martos, C. Vaz // Analyst. - 2000. - V. 125.-P. 1281 - 1284.

58. Niu J. Reagentless mediated biosensors based on polyelectrolyte and sol — gel derived silica matrix / J. Niu, Lee J. Yang // Sensors and Actuators B. 2002. - V. Jt" 82.-P. 250-258.

59. Ravi Shankaran D. An amperometric sensor for hydrogen peroxide based on a (3mercaptopropyl)trimethoxysilane self-assembled layer containing hydrazine / D. Ravi Shankaran, Y. Bo. Shim //Electroanalysis. - 2002. - V. 14, № 10. - P. 704 -707.

60. Song J.-F. Flow-injection biamperometric direct determination of calcium dobesi-late in irreversible couple system / J.-F. Song, J.-Q. Chen // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2003. - V. 33, № 4. - P. 789 - 796.

61. Лунина В. Электрохимически модифицированные электроды для проточно-инжекционного определения олова (II, IV) и сурьмы (III, V) методами инверсионной вольтамперометрии / В. Лунина // Автореф. на соиск. уч. степ. канд. хим. наук. Москва. - 2004. - 27 с.

62. Айтикеева А.А. Синтез и исследование мебран ИСЭ для определения пенициллина / А.А. Айтикеева, Т. В. Щеглова, Н. В. Щеглова // Тез. докл. 6 все-росс. конф. «ЭМА 2004» - С. 203 - 204.

63. Guzman-Vazques de Prada A. Voltammetric behavior and determination by flow injection with amperometric detection of benzimidazoles / Guzman-Vazques de Prada A., M. L. Mena, A. J. Reviejo, J. M. Pingarron // Anal. Lett. 2004. - V. 37, № l.-P. 65-79.

64. Ipatov A. Determination of cyanide using flow-injection multisensor system / A. Ipatov, M. Ivanov, S. Makarychev-Mikhailov, V. Kolodnikov, A. Legin, Y. Vlasov // Talanta. -2002. V. 58, №6.-P. 1071 - 1076.

65. Халдеева Е. В. Определение гентамицина с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора / Е. В. Халдеева, Э. П. Медянцева, Н. А. Има-наева, Г. К. Будников // Журн. аналит. химии. 2002. - Т. 57, № 12. - С. 1284- 1289.

66. Imabayashi S. Amperometric biosensor for polyphenol based on horseradish peroxidase immobilized on gold electrodes / S. Imabayashi, Y.-T. Kong, M. Watanabe // Electroanalysis. 2001. - V. 13, № 5. - P. 408 - 412.

67. Couto С. M. С. M. Application of amperometric sol-gel biosensor to flow injectiondetermination of glucose / С. M. Couto, A. N. Araujo, M. Montenegro, J. Rohwed-der, Ivo. Raimundo, C. Pasquini // Talanta. 2002. - V. 56, № 6. - P. 997 - 1003.

68. Mitchell К. M. Acetylcholine and choline amperometric enzyme sensors characterized in vitro and in vivo / К. M. Mitchell // Anal. Chem. 2004. - V. 76, № 4. - P. 1098-1106.

69. Hasunuma T. Real-time quantification of methanol in plants using a hybrid alcoholoxidase-peroxidase biosensor / T. Hasunuma, S. Kuwabata, E. Fukusaki, A. Koba-yashi // Anal. Chem. 2004. -V. 76, № 5. - P. 1500 - 1506.

70. De Jesus D. S. Amperometric in sol-gel film for benzydamine determination in pharmaceuticals / D. S. De Jesus, С. M. Couto, A. N. Araujo, M. С. B. S. M. Montenegro // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2003. - V. 33, № 5. - P. 983 - 990.

71. Муртазина Н. Р. Амперометрический иммуноферментный сенсор в анализе сульфаниламидных антибиотиков / Н. Р. Муртазина, Э. П. Медянцева, Г. К.

72. Будников II тез. докл. 5 всеросс. конф. «Экоаналитика 2003» - 2003. - С. 328.

73. Campuzano S. Amperometric flow-injection determination of phenolic compounds at self-assembled monolayer based tyrosinase biosensors / S. Campuzano, P. J. M. Serra // Anal. chem. acta. 2003. - V. 494, № 1 - 2. - P. 187 - 197.

74. Hristov S. М. Tyrosinase sensor for amperometric detection of phenol / S. M. Hristov, R. I. Boukoureshtlieva, A. R. Kaisheva, I. D. Iliev // Bulg. Chem. Commun. -2004. V. 36, № 1. - p. 53 - 56.

75. Kim M. A. Amperometric phenol biosensor based on sol-gel silicate/Nafion composite film / M. A. Kim, W-Y. Lee // Anal. chim. acta. 2003. - V. 479. № 2. - P. 143-150.

76. Wang S-Z. Определение микроколичеств свинца в морской воде методом атомно-абсорбционной спектрометрии с генерацией гидридов в проточно-инжекционном варианте / S-Z. Wang, Y-C. Liu, Y-R. Song // J. Spectrosc. Lab. -2003. V. 20, № 4. - P. 513 - 516.

77. Shabani A. M. H. On-line preconcentraction and determination of cobalt by chelating microcolumns and flow injection atomic spectrometry / A. M. H. Shabani, S. Dadfarnia, K. Dehghan // Talanta. 2003. - V. 59, № 4. - P. 719 - 725.

78. Liu Y.-L. Определение следовых количеств ртути методом атомно-абсорбционной спектрометрии с генерацией гидридов в варианте ПИА / Y.-L. Liu // Spectrosc. and Spectral. Anal. 2003. - V. 23, № 5. - P. 987 - 989.

79. Ivanova P. Flow injection cold vapour generation electrothermal atomic absorbtionspectrometry determination of mercury in seawater after preconcentration with Chelex-100 / P. Ivanova, I. Havezov // Bulg. Chem. Commun. 2003. - V. 35, № 2.-P. 100- 103.

80. Lasztity A. Flow-injection preconcentration and graphite furnace atomic absorptionspectrometric determination of platinum / A. Lasztity, L. Kelko, K. Zih-Perenyi, I. Varga // Talanta. 2003. - V. 59, № 2. - P. 393 - 398.

81. Zhou f. Проточно-инжекционное on-line разделение и концентрирование приопределении платины в рудах методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии / F. Zhou, Y. L. Huang, S. Lon // J. Xiangtan Univ. -2003. V. 25, №2.-P. 38-40.

82. Yingxue Y. Cobalt determination with FI-FAAS after on-line sorbent preconcentration using l-nitroso-2-naphthol / Y. Yingxue, A. Akbar, Y. Xuefeng // Talanta. -2002. V. 57, № 5. p. 945 - 951.

83. Zhang Yan-Hong Определение ртути в биологических образцах методом атомно-абсорбционной спектрометрии с генерацией гидридов в варианте проточно-инжекционного анализа / Y.-H. Zhang, Z.-B. Xia // J. Spectrosc. Lab. 2002. -V. 19, №6. -P. 822-825.

84. Karousos N. G. Determination of 4-aminophenol using the quartz crystal microbalance sensor / N. G. Karousos, S. M. Reddy // Analyst. 2002. - V. 127, № 3. - P. 368-372.

85. Vaughan R. D. A quartz crystal microbalance (QCM) sensor for the detection of Bacillus cereus / R. D. Vaughan, R. M. Carter, С. К. О'Sullivan, G. G. Guilbault // Anal. Lett. 2003. - V. 36, № 4. - P. 731 - 747.

86. Karousos N. G. Quartz crystal microbalance determination of organophosphorous and carbamate pesticides / N. G. Karousos, S. Aouabdi, A. S. Way, S. M. Reddy // Anal. chim. acta. 2002. - V. 469, № 2. - P. 189 - 196.

87. Jinbin Y. A sulpha-drug sensitive sensor based on ion-pair complex modified PQC resonator / Y. Jinbin, Y. Shouzhuo // Talanta. 2002. - V. 58, № 4. - P. 641 - 648.

88. Mingxing Y. Self-assembled monolayer based quartz crystal biosensors for the detection of endotoxins / Y. Mingxing, C. Jianrong // Anal. Lett. 2002. - V. 35, № 11.-P. 1775-1784.

89. Bing-Sheng Y. Ion chromatographic determination of calcium and magnesium cations in human saliva and urine with a piezoelectric detector / Y. Bing-Sheng, Y. Qian-Gen, Y. Li-Hua // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2001. - V. 25, № 5 - 6. - P. 1027-1032.

90. Voinova M. V. Missing mass effect in biosensor's QCM applications / M. V. Voinova, M. Jonson, B. Kasemo // Biosens. And Bioelectron. 2002. - V. 17, № 10.-P. 835-841.

91. Babacan S. Evaluatin of antibody immobilization methods for piezoelectric biosensor application / S. Babacan, P. Pivarnik, S. Letcher, A. G. Rand / Biosensors & Bioelectronics. -2000. -B. 15. -P. 615 621.

92. Bjurling P. Biosensor assay of sulfadiazine and sulfamethazine residues in pork / P. Bjurling, G. Baxter, M. Caselunghe, C. Jonson, M. O'Connor, B. Persson, Т. C. Elliot // Analyst. 2000. - V. 125. - P. 1771 - 1774.

93. Brynda E. The detection of human (32 — microglobulin by grating coupler im-munosensor with three dimensional antibody networks / E. Brynda, M. Houska, A. Brandenburg, A. Wikerstal, J. Skvor // Biosensors & Bioelectronics. 1999. - V. 14.-P. 363 -368.

94. Cavie B. Acoustic waves and the study of biochemical macromolecules and cells at the sensor liquid interface / B. Cavie, G.L. Hay ward, M. Thompson // Analyst. -1999. - T. 124. - P. 1405 - 1420.

95. Crooks S. Immunosensor an alternative to enzyme immunoassay screening for residues of two sulfonamides in pigs / S. Crooks, A. Baxter, M. O'Conner, Т. C. Elliot // Analyst. - 1998. - B. 123. - P. 2755 - 2757.

96. Crooks S. Detection of levamisole residues in bovine liver and milk by immuno-biosensor / S. Crooks, B. McCarney, I. Traynor, C. Thompson, S. Floyd, Т. C. Elliott // Anal. Chimica Acta. 2003. - Y. 483. - P. 181 - 186.

97. Haasnoot W. Haasnoot W., Bienenmann Ploum M., Kohen F. Biosensor immunoassay for the detection of eight sulfonamides in chicken serum / W. Haasnoot, M. Bienenmann - Ploum, F. Kohen // Anal. Chimica Acta - 2003. - Y. 483. - P. 171-180.

98. Liu M. Flow injection immunosensing of polycyclic aromatic hydrocarbons with a quartz crystal microbalance / M. Liu, Q. X. Li, A. G. Rechnitz // Anal. Chimica Acta. 1999. - B. 387. - P. 29 - 38.

99. Liu Y. Quartz crystal biosensor for real time monitoring of molecular recognition between protein and small molecular medicinal agents / Y. Liu, X. Yu, R. Zhao, D.- H. Shangguan, Z. Bo, G. Liu // Biosensors & Bioelectronics. 2003. - V. 19. -P. 9-19.

100. Storri S. Surface modifications for the development of piezoimmunosensors / S. Storri, T. Santoni, M. Minunni, M. Mascini // Biosensors & Bioelectronics. 1998.- V. 13, № 3 4. - P. 357 - 362.

101. Su X. Piezoelectric quartz crystal based label free analysis for allergy disease / X. Su, Chew F. Tim, Sam F. Y. Li // Biosensors & Bioelectronics. - 2000. - V. 15. -P. 629-639.

102. Tang A. Immunosensor for ocadaic acid using quartz crystal microbalance / A. Tang, M. Pravda, G. G. Guilbault, S. Piletsky, A. Turner // Anal. Chimica Acta. -2002.-V. 471.-P. 33-40.

103. Ko(31inger C. Characterization of immobilization methods for African swine fever vims protein and antibodies with a piezoelectric immunosensor / C. Ko(31inger, S. Drost // Biosensors & Bioelectronics. 1998. - V. 13. - P. 1279 - 1286.

104. Uttenthaler E. Quartz crystal biosensor for detection of the African Swine Fever disease / E. Uttenthaler, C. Kopnger, S. Drost // Anal. Chim. Acta 1998. V. 362. -P. 91-100.

105. Evgen'ev M. I. Determination of hydrazine derivatives by flow-injection analysis with spectrophotometric detection / M. I. Evgen'ev, S. Yu. Garmonov, I. I. Evge'eva, G. К Budnicov // Talanta. 1995. - V.l 17, № Ю. - P. 1465.

106. Евгеньев М.И. Проточно-инжекцнонное определение ариламинов с фотометрическим детектированием / М. И. Евгеньев, И. И. Евгеньева, Евгеньева И.И., Ф.С. Левинсон // Заводск. лаборатория. 1996.-Т.62, №11. -С.715-718.

107. Евгеньев М.И. Избирательное проточно-инжекционное определение гидразина / М.И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, И.И. Евгеньева, В. В. Угричич Тре-бинский // Журн. аналит. химии. - 1998. - Т. 53, № 3. - С. 432.

108. Евгеньев М.И. Избирательное проточно-инжекционное определение амино-соединений в смесях / М.И. Евгеньев, И.И. Евгеньева, С.М. Горюнова, А. X. Васякина // Журн. аналит. химии. 1998. - Т. 53, № 4. - С. 432.

109. Garrigues J. М. Flow injection Fourier transform infrared determination of nicotine in tobacco / J. M. Garrigues, A. Perez Ponce, S. Garnigues, M. de la Guardia // Analyst. - 1999. - V. 124. - P. 783 - 786.

110. Евгеньев М.И. Избирательные проточно-инжекционные определения производных 4-аминобензойной и 4-аминосалициловой кислот в смесях / М.И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, Л.Ш. Шакирова // Журн. аналит. химии. 2000. - Т. 55, №7.-С. 775.

111. Аналитическая химия. Проблемы и подходы: В 2 т: Пер. с англ. / под ред. Р. Кельнера и др./М.: «Мир», 2004. 469 с.

112. Perez Ruiz Т. Flow injection fluorimetric determination of thiourea / T. Perez -Ruiz, C. Martinez - Lozano, V. Thomas, R. Casajus // Talanta. - 1995. - V. 42, № 3.-P. 391.

113. Calatayud J. M. / J. M. Calatayud, F. J. Blasco Matinez, S. Sagrado Vives. // Mi-crochim. Acta. 1992. - V. 1, № 3. - P. 319.

114. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа/ Ю.А.Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др./М.: «Мир», 2004. 503 с.

115. Manedero М. С. Flow-injection determination of sulphonamides with fluorimetric or photochemical-fluorimetric detection / M. C. Manedero, J.J. Aaron // Anal. Chim. Acta. 1992. - V. 269, № 2. - P. 193.

116. Chen X. Проточно-инжекционное хемилюминесцентное определение декса-метазона фосфата натрия с Mn (3+), электрогенерируемым в режиме on-line / X. Chen, S. Shen, С. Zhang, J. Lu // Anal. Chem. 2002. - V. 30, № 12. - P.l 501 - 1503.

117. Chen X. Проточно-инжекционное хемилюминесцентное определение цефра-дина с Mn (3+), электрогенерируемым в режиме on-line / X. Chen, С. Zhang // J. Shaanxi Norm. Univ. Natur. Sci. Ed. 2003. - V. 31, № 1. - P. 76 - 78.

118. Li X. Применение проточно-инжекционной хемилюминесцентной системы для определения куркулина / X. Li, Н. Qi, L. Zhu, С. Zhang // J. Shaanxi Norm. Univ. Natur. Sci. Ed. 2003. - V. 31, № 3. - P. 85 - 88.

119. Du J. Flow injection chemiluminescence determination of thiamine based on its enhancing effect on the luminal-hydrogen peroxide system / J. Du, Y. Li, J. Lu // Talanta. 2002. - V. 57, № 4. - P. 661 - 665.

120. Lang H. Определение урапидила хемилюминесцентным методом в проточно-инжекционной системе / Н. Lang, Y. Li, X. Zhang, Y. Shen // J. Chin. Univ. -2003. V. 24, № 4. - P. 618 - 620.

121. Wang Z. Sensitive flow-injection chemiluminescence determination of methformin based on N-bromosuccinimide-fluorescein system / Z. Wang, Z. Zhang, Z. Fu, W. Luo, X. Zhang // Anal. Lett. 2003. - V. 36, № 12. - P. 2683 - 2697.

122. Zhou G. Development of integrated chemiluminescence flow sensor for the determination of adrenaline and isoprenaline / G. Zhou, G. Zhang, H. Chen // Anal, chim. acta. 2002. - V. 463, № 2. - P. 257 - 263.

123. Xie С. Определение галловой кислоты в таблетках Jianmin Yanhou по усилению хемилюминесценции в системе проточно-инжекционного анализа / С. Xie, Н. Cui, X. Lin// Anal. Chem. -2002.-V.30,№ll.-P.1316-1318.

124. Легин А. В. Лабораторные и мобильные системы типа «Электронный язык» / А. В. Легин, А. М. Рудницкая, Ю. Г. Власов, Б. Л. Селезнев, А. Н. Халатов // Тез. докл. 1 всерос. конф. «Аналитические приборы». — Санкт-Петербург. -2002.-С. 77-78.

125. Qin W. Flow injection chemiluminescence-based chemical sensors / W. Qin // Anal. Lett. 2002. - V. 35, № 14. - P. 2207 - 2220.

126. Gong Z. Определение фенола в воде хемилюминесцентного анализа / Z. Gong, Y. Huang, Z. Zhang // J. Anal. Chem. 2002. - V. 30, № 9. - P. 1123 - 1125.

127. Wieck H. J. Chemically modified reticulated vitreous carbon electrode with immobilized enzyme as a detector in flow-injection determination of glucose / H. J. Wieck, G. N. Jn. Heider, A. Yacunych // Anal, Chim. Acta. 1984. - V. 158. - P. 137

128. Smolander M. Determination of xylose and glucose in a flow-injection system with PQQ-dependent aldose dehydrogenase / M. Smolander, J. Cooper, W. Schuhmann, M. Hammerle, H. Schmidt // Anal. Chim. Acta. 1993. - V. 280., № 1. - P. 119.

129. Pei R.J. A PZ immunosensor for complement C4 using protein A oriented biliza-tion of antibody / R.J. Pei, J.M. Hu, Y. Hu, Y.E. Zeng // J.Chem.Tech.Biotechnol. -1998. V.71, № l.-P. 59.

130. Davis K. Continuous liquid-phase piezoelectric biosensor for kinetic immunoassays / K. Davis, T. Leary. // Anal. Chem. 1989. - V. 61. - P. 1227.

131. Mahedero M.C. Determination of sulphamethoxazole by photochemically induced fluorescence in drugs and milk / M.C. Mahedero, Diaz T. Galeano., P. Galan // Ta-lanta. 2002. - V. 57, № 1. - P. 1-6.

132. Gobel A. Walter Occurrence and fate of selected macrolide and sulfonamide antibiotics in sewage treatment / A. Gobel, C. S. McArdell, A. C. Alder, W. Giger // Chimia. 2002. - V. 56, № 7-8. - P. 333.

133. Hirsch R. FIA analysis / R. Hirsch, T. Ternes, K. Haberer, K. Kratz // Sci. Total Environ. 1999. - V. 225. - P. 109.

134. Lopez E. C. Flow-injection fluorimetric analysis of sulfamethoxazole in pharmaceutical preparations and biological fluids/ E. C. Lopez, P. Vianas, С. M. Hernandez // Talanta. 1994. - V. 41, № 12. - P. 2159 - 2164.

135. Lucarelli F. Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of toxicants in water and wastewater samples / F. Lucarelli, I. Palchetti, G. Mar-razza, M. Mascini // Talanta. 2002. - V. 56, № 5. - P. 949 - 957.

136. Сафина Г. P. Иммуноферментный сенсор для определения стафилококка / Г. Р. Сафина, Е. В. Халдеева, Э. П. Медянцева, Г. К. Будников // тез. докл. 17 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 2003. - Т. 4. - С. 296.

137. Gong J. An amperometric immunosensor for the newcastle disease antibody assay / J. Gong, F. Gong, G. Zeng, G. Shen, R. Yu // Anal. Lett. 2003. - V. 36, № 3. -P. 287-302.

138. Yamanaka H. Amperomrtic immunosensor for atrazine / H. Yamanaka, P. Skladal // Anais da ABQ. 2001. - V. 50, № 1. - p. 25 - 28.

139. Jiang D. Новый емкостный иммуносенсор для непосредственного детектирования ламинина с потенциометрическим измерением / D. Jiang, J. Tang, В. Liu, X. Shen, S. Zhang, P. Yang, A. Li, Y. Huang, J. Kong // J. Chin. Univ. 2003. -V. 24, № l.-P. 46-48.

140. Sakai G. A surface plasmon resonance-based immunosensor for highly sensitive detection of morphine/ G. Sakai, K. Ogata, T. Uda, N. Miura, N. Yamazoe // Sens. Actuators B. 1998. - V. 49, № 1 - 2. - P. 5.

141. Sakai G. Highly selective and sensitive SPR immunosensor for detection of methamphetamine/ G. Sakai, S. Nakata, T. Uda, N. Miura, N. Yamazoe // Electro-chim. Acta. 1999. - V. 44, № 21 - 22. - P. 3849.

142. Sasaki S. Novel surface plasmon resonance sensor chip functionalized with organic silica compounds for antibody attachment/ S. Sasaki, R. E. Nagata, B. Hock, I. Ka-rube // Anal. Chim. Acta. 1998. - V. 368, № 1 - 2. - P. 71.

143. Gizeli E. Adsorption determination of ionic surfactants using an electrode-separated piezoelectric quartz crystal / E. Gizeli, M. Liley, C.R. Lowe, H. Vogel // Anal. Chem. 1997. - V. 349, № 23. - P. 4808.

144. Minunni M. The quartz crystal microbalance as biosensor / M. Minunni, M. Mas-cini, G.G. Guilbault, B. Hock. // Anal. Letters. 1995.- V. 28. - P. 749.

145. Ahmad A. Use of Optical Biosensor Technology to Study Immunological Cross -reactivity between Different Sulfonamide Drugs / A. Ahmad, A. Ramakrishnan, M.

146. A. Mc Lean, D. Li, M. T. Rock, A. Karim, A. P. Breau // Analytical Biochemistry. 2002. - V. 300. - P. 177 - 184.

147. Liley M.J. Surface plasmon resonance for the detection of DNA hybridization / M.J. Liley // PhD Thesis, University of Cambridge. 1990.

148. О'Sullivan С. K. Commercial quartz crystal microbalances theory and applications / С. К. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Biosensors & Bioelectronics. - 1999. -V. 14. - P. 663 - 670.

149. Skladal P. Piezoelectric Quartz Crystal Sensors Applied for Bioanalytical Assay and Characterization of Affinity Interactions / P. Skladal // J. Braz. Chem. Soc. -2003.-V. 14, №4.-P. 491-502.

150. Bunde R.L. Piezoelectric crystal biosensors / R.L. Bunde, E. J. Jarvi, J. J. Rosen-treter. // Talanta. 1998. - V. 46. - P. 1223.

151. Luppa P.B. Immunosensors principles and applications to clinical chemistry / P.

152. B. Luppa, L. J. Sokoll, D. W. Chain // Clinica Chimica Acta -2001. V. 1. - P. 314

153. Yokoyama K. Highly sensitive quartz crystal immunosensors for multisample detection of herbicides / K. Yokoyama, K. Ikebukuro, E. Tamiya, I. Karube, N. Ichiki, Y. Arikawa. // Anal. Chim. Acta. 1995. - V. 304. - P. 139.

154. Кривошеин Ю.С. Биологические датчики, их использование в медицине и биотехнологии / Ю. С. Кривошеин, JI. Ю. Бержанская, О. Н. Постникова // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т. 36, №3. - С. 51 - 54.

155. Sacti S. P. Disposable HAS QCM immunosensor for practical measurement in liquid / S. P. Sacti, P. Hauptmann, B. Zimmermann, F. Buhling, S. Ansorge // Sensors and Actuators B. - 2001. - V. 78. - P. 257 - 262.

156. Halamek J. Higly sensitive detection of cocaine using a piezoelectric immunosen-sor / J. Halamek, A. Makower, P. Skladal, F. W. Scheller // Biosensors and Bio-electronics. 2002. -V. 17. - P. 1045 - 1050.

157. Bizet K. Validation of antibody-based recognition by piezoelectric transducers through electroacoustic admittance analysis/ K. Bizet, C. Gabrielli, H. Perrot, J. Therasse // Biosens. and Bioelectr. 1998. V. 13. - P. 259.

158. Lin Z. Operation of an ultra sensitive 30 MHz quartz crystal microbalance in liquids/ Z. Lin, С. M. Yip, I. S. Joseph, M. D. Ward // Anal. Chem. 1993. - V. 65. -P. 1546.

159. Uttenthaler E. Ultra sensitive 39 to 70 quartz crystal microbalance sensors for detection of M13-phages in liquids / E. Uttenthaler, M. Schraml, S. Drost // The 6th World Congress on Biosensors. San Diego. - 2000. - Abstracts Book - P. 147.

160. Uttenthaler E. Ultrasensitive quartz crystal microbalance sensors for detection of ml3-phages in liquids/ E. Uttenthaler, M. Schraml, J. Mandel, S. Drost // Biosens. and Bioelectr. -2001. V. 16. - P. 735.

161. Lucarelli F. Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of toxicants in water and wastewater samples / F. Lucarelli, I. Palchetti, G. Mar-razza, M. Mascini // Talanta. 2002. - V. 56, № 5. - P. 949 - 957.

162. Wang K. Sensitively detecting recombinant hirudin variant-2 with capacitive immunoassay based on self-assembled monolayers / Ke Wang, Dechen Ziang, J. Kong, Si Zhang, B. Liu, T. Lu // Anal. Lett. 2003. - V. 36, № 12. - P. 2571 -2583.

163. Karousos N. G. Quartz crystal microbalance determination of organophosphorus and carbamate pesticides / N. G.Karousos, S. Aouabdi, A. S. Way, S. M. Reddy // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 469, № 2. - P. 189 - 196.

164. Yuan J. A sulpha-drug sensitive sensor based on ion-pair complex modified PQC resonator / Y. Jinbin, Y. Shouzhuo // Talanta. 2002. - V. 56, № 4. - P. 641 - 648.

165. Vaughan R.D. A quartz crystal microbalance (QCM) sensor for the detection of Bacillus cereus / R. D. Vaughan, R. M. Carter, С. К. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Anal. Lett. 2003. - V. 36, № 4. - P. 731 - 747.

166. Brogan K. Direct oriented immobilization of Fab antibody fragments on gold / K. Brogan, K. Wolfe, P. Jones, M. Schoenfisch // Anal. Chim. Acta. 2003. - V. 496, № 1-2.-P. 73-80.

167. Cavic B. A. Acoustic waves and the study of biochemical macromolecules and cells at the sensor liquid interface / B. A. Cavic, G. L. Hayward, M. Thompson // Analyst. - 1999. - V. 124. - P. 1405 - 1420.

168. Самуилов В.Д. Иммуноферментиый анализ / В. Д. Самуилов // Соросовс. образов. журн. 1999. - № 12. - С. 9 - 15.

169. Killard A.J. Antibodies: production, functions and applications in biosensors / A.J. Killard, B. Deasy, R. O'Kennedy, M. R. Smyth //Trends in analytical chemistry. -1995.-V. 14, №6.-P. 257-266.

170. Hock B. Antibodies for immunosensors / B. Hock // Analytica Chimica Acta. -1997.-V. 347.-P. 177-186.

171. Твердофазный иммуноферментиый анализ. Сб. науч. трудов. //Л.: Изд. Института им. Пастера, 1988. 160 с.

172. Калмыкова Е.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры в анализе водных сред / Е.Н. Калмыкова, М. В. Струкова, С. А. Еремин, Т. Н. Ермолаева // Вестник ЛГТУ-ЛЭГИ. 2000. - Т. 6, № 2. - С. 74-78.

173. Pribyl J. Development of piezoelectrc immunosensors for competitive and direct determination of atrazine / J. Pribyl, M. Hepel, J. Halamek, P. Skladal. // Sensors and Actuators. 2003. - В 91. P. 333.

174. Dupont-Filliard A. Comparison by QCM and photometric enzymatic test of the biotin-avidin recognition on a biotinylated polypyrrole / A. Dupont-Filliard, M. Billon, S. Guillerez, G. Bidan // Talanta. 2001. - V. 55. - P. 981 - 992.

175. Hengerer A. Dertermination of Phage Antibody Affinities to Antigen by a Micro-balance Sensor System / A. Hengerer, C. KoBlinger, J. Decker, S. Hauck, J. Queitsch, H. Wolf, S. Diibel // Bio Techniques. 1999. - V. 26, № 5. - P. 956 -964.

176. Kim N. Application of flow type antibody sensor to the detection of Escherichia coli in various foods / N. Kim, I. - S. Park // Biosensors and Bioelectronics - 2003. -V.18.-P. 1101-1107.

177. Skladal P. Kinetic studies of affinity interactions: comparison of piezoelectric and resonant mirror-based biosensors / P. Skladal, J. Horacek // Analytical Letters.1999.-V. 32, №8.-P. 1519- 1529.

178. Thompson M. Liquid-phase piezoelectric and acoustic transmission studies of in-terfacial immunochemistry/ M. Thompson, C. L. Arthur, G. K. Dhaliwal // Anal. Chem. 1986. V. 58. - P. 1206.

179. Shons F. An immunospecific microbalance / F. Shons, J. Dorman, Najarian // J. Biomed. Mater. Res. -1972. V. 6. - P. 565.

180. Chang H.-C. Detection of lipopolysaccharide binding peptides by the use of a lipopolysaccharide-coated piezoelectric crystal biosensor / H.-C. Chang, С. C. Yang, Т. M. Yeh // Anal. Chim. Acta. 1997. - V. 340. - P. 49 - 54.

181. Smith A. Nature of immobilized antibody linked to thioctic acid treated gold surfaces / A. Smith, M. W. Ducey, M. E. Meyerhoff // Biosensors & Bioelectronics.2000.-V. 15.-P. 183-192.

182. Hengerer A. Quartz crystal microbalance (QCM) as a device for the screening of phage libraries / A. Hengerer, J. Decker, E. Prohaska, S. Hauck, C. KoBlinger // Biosensors & Bioelectronics. 1999. - V. 14. - P. 139-144.

183. Horacek J. Improved direct PZ biosensors operating in liquid solution for the competitive label free immunoassay of 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid / J. Horacek, P. Skladal. // Anal. Chim. Acta. - 1997. - V. 347. - P. 43.

184. Halamek J. Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid / J. Halamek, M. Hepel, P. Skladal. // Biosens. Bioelec

185. Г tron. -2001. V. 16.-P. 253.

186. Liu Y. C. Comparison of different protein immobilization methods on quartz crystal microbalance surface in flow injection immunoassay / Y. - C. Liu, С. - M.

187. Wang, K. P. Hsiung // Anal. Biochem. - 2001. - V. 299. - P.130 - 135.1. V ■

188. Sauerbrey G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wagung dunner Schichtenund zur Microwagung / G. Sauerbrey // Zeitschrifit furjphysip^- 1959. -Bd. 155. P. 205-222. u V

189. Uttenthaler E. Characterization of immobilization methods for African swine fever % virus protein and antibodies with a piezoelectric immunosensor / E. Uttenthaler, C.

190. Koplinger, S. Drost // Biosensors & Bioelectronics. 1998. - B. 13. - P. 12791286.

191. Shriver-Lake L.C. Antibody immobilization using heterobifunctional crosslinkers / L.C. Shriver-Lake, B. Donner, R. Edelstein, K. Breslin, S. K. Bhatiat & F. S. Ligner//Biosensors & Bioelectronics.-1997.-V. 12, № 11.-P. 1101 1106.

192. Park J-W. Comparison of stabilizing effect of stabilizers for immobilized antibodies on QCM immunosensors / J-W. Park, S. Kurosowa, H. Aizawa, S-i. Wakida, S. Yamada, K. Ishihara // Sensors and Actuators B. 2003. - V. 91. - P. 158 - 162.

193. Abert F. HIV serology using piezoelectric immunosensors/ F. Abert, H. Wolf, C. Koplinger, S. Drost, P. Woias, S. Koch // Sensors & Actuators. 1994. - V. 18. -P. 271.

194. Konig B. Detection of human T-lymphocytes with a piezoelectric immunosensor/ B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim. Acta. 1993. - V. 281. - № 1. - p. 13.

195. Konig B. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of human erythrocytes / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim Acta. -1993. V. 276 - № 2.-P. 329-333.

196. Konig B. Long-term stability and improved reusability of a piezoelectric immunosensor for human erythrocytes / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim Acta. -1993.-V. 280.-№ l.-P. 37-41.V

197. Barnes С. A. concanavalin A coated piezoelectric crystal biosensor / C. Barnes, C. D'Silva, J.P. Jones, T.J. Lewis // Sens. Actuat. - 1991. - B. 3. - P. 295.

198. Pei R.J. Studies of the piezoelectric immunosensor for detction of fibrin using protein A oriented immobilization of antibody / R. J. Pei, J. M. Hu, Y. Hu, Y. E. Zeng. // Chem. J. Chim Univ. 1998. - V. 19. - P. 363.

199. Suri C.R. A new type of reusable piezoimmunosensor fabricated by a recombinant IgG binding protein / C. R. Suri, P. K. Jain, G. C. Mishra // J. Biotecnol. - 2000. - V. 39. P. 27.

200. Saha S. Sandwich microgravimetric immunoassay: sensitive and specific detection of low molecular weight analytes using piezoelectric quartz crystal/ S. Saha, M. Raje, C. R. Suri // Biotechnol. Lett. 2002. - V. 24. - P. 711.

201. Park I-S. Thiolated Salmonella antibody immobilization onto the gold surface of piezoelectric quartz crystal / I-S. Park, N. Kim // Biosensors & Bioelectronics. -1998.-V. 13.-P. 1091-1097.

202. Pribyl J. Quartz crystal biosensor for detection of sugars and glycated hemoglobin / J. Pribyl, P. Skladal // Analytica Chimica Acta. 2005. - V. 530. - P. 75 - 84.

203. Plomer M. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of en-terobacteria / M. Plomer, G. G. Guilbault, B. Hock //Enzyme and Microbiol Tech-nol. 1992. V. 14., № 3.-P. 230.

204. Konig B. A novel immunosensor for herpes vims / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chem. 1994. -V. 66, № 16. -P. 341.

205. Su X. Piezoelectric quartz crstal based screening test for porcine reproductive and respiratory syndrome vims infection in pigs / X. Su, F.Y. Li Sam, Liu Wei, J. Kwang. // Analyst. 2000. - V. 125. - P. 725.

206. Fung Y.S. Piezoelectric crystal for sensing bacteria by immobilizing antibodies on divinylsulphone activated poly-m-aminophenol film / Y.S. Fung, S. H. Si, D. R. Zhu // Talanta. 2000. - V. 51. -P. 151.

207. Muramatsu H. Piezoelectric crystal biosensor modified with protein A for determination of immunoglobulins/ H. Muramatsu, J. M. Dicks, E. Tamiya, I. Karube // Anal. Chem. 1987. - V. 59. - P. 2760.

208. Ren X. A new type of reusable piezoimmunosensor fabricated by a recombinant IgG-binding protein / X. Ren, E. Kobatake, M. Aizawa // Analyst. 2000. - V. 125.-P. 669.

209. Sury C.R. A new type of reusable piezoimmunosensor fabricated by a recombinant IgG-binding protein / C. R. Sury, P. K. Jain, G. C. Mishra // J. Biotecnol. 1995. -V. 39.-P. 27.

210. Chou S.-F. Development of an immunosensor for human ferritin, a nonspecific tumor marker, based on Quartz crystal microbalance / S.-F. Chou, W.-L. Hsu, J.-M. Hwang, C.-Y. Chen // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 453. - P. 181.

211. Калмыкова E.H. Разработка пьезокварцевого иммуносенсора для проточно -инжекционного анализа высоко и низкомолекулярных соединений / Е. Н. Калмыкова, Т. Н. Ермолаева, С. А. Еремин // Вест. Моск. университета, сер. 2. — 2002. - V. 43.-Р. 391.

212. Mannelli I. Quartz crystal microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection / I. Mannelli, M. Minunni, S. Tombelli, M. Mascini // Anal.Chem. 2003. - V. 18., № 2 - 3. P. 129 - 140.

213. Mariotti E. Surface plasmon resonance biosensor for genetically modified organisms detection / E. Mariotti, M. Minunni, M. Mascini // Anal. Chem. 2002. - V. 453., №2.-P. 165-172.

214. Attili B.S. A Piezoelectric Immunosensor for the Detection of Cocaine / B. S. At-tili, A. A. Suleiman // Microchem. J. 1996. - V. 54. - P. 174.

215. Mo Z.H. A New sandwich-type assay of estrogen using piezoelectric biosensor immobilized with estrogen response element/ Z. H. Mo, X. H. Long, W. L. Fu // Anal Commun. 1999. - V. 36. - P. 281.

216. Alfonta L. Biosensor for the toxine Cholera detection / L. Alfonta, I. Wilner //Anal. Chem. 2001. - V. 72. P. 5287.

217. Su X.D. Self-assembled monolayer based piezoelectric immunosensor for the total UgE quantification / X. D. Su, F. T. Chew, S. F. Y. Li // Anal. Biochem. 1999. -V. 73.-P. 66.

218. Hu J.M. Piezoelectric immunosensor for detection of complement C6 / J. M. Ни, L. J. Liu, B. Danielsson, X. D. Zhou, L. L. Wang // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 423. P. 215.

219. Harteveld J.L.N. Detection of Staphylococcal Enterotoxin В employing a piezoelectric crystal immunosensor / J. L. N. Harteveld, M. S. Nieuwenhuizen, E. R. J. Wils // Biosens. & Bioelectr. 1997. - V. 12. - P. 661.

220. Skladal P. Direct piezoelectric immunosensors for pesticides / P. Skladal, J. Horacek, M. Malina // Biosensors for DRECT Monitoring of Envimental Pollutants in Field.-1998.-P. 145-153.

221. Prusak-Sochaczewski E. Development of piezoelectric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium / E. Prusak-Sochaczewski, J. H. T. Loung, G. G. Guilbault // Enzyme Microbiol Technol. 1990. - V. 12. - P. 173.

222. Каркищенко H. H. Фармакокинетика / H. H. Каркищенко, В. В. Хоронько, С. А. Сергеева, В. Н. Каркищенко Ростов-на-Дону.: «Феникс», 2001. - 384 с.

223. Neu H. S. The crisis in antibiotic resistance / H. S. Neu // Science.-1992.-V. 257. -P. 1064- 1067.

224. Littlefield N.A. Chronic toxicity/carcinogenicity studies of sulfametothazine in Ficher 344/N rats: two generation exposure / N.A. Littlefield, W.G. Sheldon, R. Allen, D.W. Gaylor // Food Chem. Toxicol. 1990. - V. 28. - P. 157 - 161.

225. Haasnoot W. Biosensor immunoassay for the detection of eight sulfonamides in chicken serum / W. Haasnoot, M. Bienenmann-Ploum, F. Kohen // Anal. Chim. Acta -2003.-V. 483. -P. 171-180.

226. Commission Regulation (EC) no. 508/1999, Official Journal of the European Communities, L60, P. 16-52.

227. Bratton K.D. In: Liquid Chromatography / Mass Spectrometry, MS/MS and Time-of-Flight MS: Analysis of Emerging Contaminants, Ferrer, I., Thurman, E. M.,

228. Eds.; American Chemical Society / K. D. Bratton, A. S. Lillquist, T. D. Williams, С. E. Lunte Oxford University Press. New York. - 2003. -Chapter 12. - P. 188.

229. Досон P. Справочник биохимика. / P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс -М.: «Мир», 1991.-544 с.

230. Sauerbrey G.Z. Use a quartz vibration form weigh thin films on a microbalance / Sauerbrey G.Z. //Z. Phys. 1959. — B. 155.-P. 206-210.

231. Фадеев Ф.Ю. Жидкостной химически модифицированный кварцевый резонатор как иммуносенсор / Ф. Ю. Фадеев, А. А. Ельцов, Ю. К. Алешин, С. И. Малышенко, Г. В. Лисичкин / Ж. физич. химии 1994. - Т. 68., № 11. - С. 2071-2075.

232. Воробьева Л.А. Химический анализ почв / Л. А. Воробьева- М.: изд во МГУ,- 1998.-272 с.

233. Химия привитых поверхностных соединений / Под ред. Г. В. Лисичкина. -М.: «Мир», 2003.-592 с.

234. Первиков Ю. В. Иммунные комплексы при вирусных инфекциях / Ю. В. Пер-виков, Л. Б. Эльберт М.: «Мир», 1984. - 459 с.