Разработка метода оценки быстрых изменений уровня подвижных и прочносвязанных фосфолипидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

'3 М 9 2'

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ЬМЖЙ ШКОЛЫ

Тверской государственный университет

На правах рукописи

Л ШИНА НДДЕВДА ПЕГРОША

РАЗРАБОТКА МЕТОДА СЦЕНКИ БКСТРКХ ИЗМЕНЕНИЙ УРОШЯ ПОДЪШНЫХ И ПРОЧНХШЗАННЬ'Х ФОСФОЛЖЩОВ.

Специальность 02.00.04 - физическая химия

■ 02. 00.10-- биоорганическая тсимия,"

химия природных и фиэио- . логически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Тверь - 1992

Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Тверского Ордена Дружбы Народов государственного медицинского

института.

Научные руководители: доктор биологических наук,профессор

A.В.Каргаполов

доктор медицинских наук,профессор

B.В.Аникин

»

Официальные оппоненты: доктор химических наук,профессор

Э.М.Сульман кандидат биологических наук,доцент

C.В.Карцова

Ведущая организация: Московский государственный университет

Защита диссертации состоится ЛМХЭи 1992 г.в "/^часов на заседании специализированного совета К 063.97,05 в Тверском государственном университете по адресу: 170002,г.Тверь,Садовый . пер.,35.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ТГУ.

Отзывы направлять ло адресу: 170002,г.Тверь,Садовый пер.,35, университет,специализированный совет по защитам,ученому секретарю.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук, доцен Ю.Г.Паетушенков

ОЩАН ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем;. Фосфолипидн,являясь необходимым структурным компонентом биологических: меибран, играют важную роль в реализации фундаментальных функций клетки:транспортной, рецепторной,энергетической,пролифератишой. Однако, приводимые в литературе сведения о количественном содержании данных соединений в биологических мембранах, отличаются противоречивостью (<0сшт G , 1985; Швец В.И. и coaвт.,198?;Крепе Е.М., 1931 ). Это,вероятно,связано с тем,что фосфосодержащие липиды одновременно участвуют в большом количестве биохимических процессов,причем уровень их контролируется рядом ферментативных систем и существенно меняется в короткие промежутки времени в Процессе функционирования ( Дин Р., 1981; Мацуль В.М., 1У88 ). При этом следует отметить также,что фосфолипиды находятся в мембранах в ввде белково-липидных комплексов,из которых часть проч-носрязанных фосфоллпвдов (ФЛ) не извлекается традиционными методами экстракции (Кейтс М., 1У75; Олифсон JI.E. с соавт., I9ÖI),

Цель работы состояла в разработке метода выделения подвижных и прочноевязанных ФЛ и определении параметров динамики быстрых изменений этих липидов в биологических системах.

Научная новизна работы. Предложен метод,позволяющий оценить динамику быстрых изменений подвижны* и прочноевязанных ФЛ биологических мембран под действием внешних факторов. Выявлены различия в характере быстрых изменений фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилинозитов (ФИ) биологических систем в норме и при патологии, Впервые обнаружено в митохондриальных мембранах существование значительного количества прочносвяэанннх ФЛ, уровень которых зависит от физико-химических параметров среды инкубация и состава экстрагирующей смеси. Высказано предположение о существовании тесной взаимосвязи просносвяэанного и подвижного пулов липидов митохондрий.

• Практическая значимость работы. Разработанный метод впервые позволил исследовать динамику быстрых изменений уровня содержания ФХ и ФИ, что даёт возможность получить принципиально новую информации о функциональном состоянии биомембран. Предложенный метод может быть использован для аналитического выделения проч-носвязанных ФЛ. Новый методический приём особенно интересен

/

для исследования быстрых изменений крови при ишемической болезни сердца, так как позволяет получать новую информацию о специфике реакции этого липида на наличие инфаркта миокарда. Показано, что стадия заболевания отражается на характере быстрых изменений что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Внедрение результатов в практику. В Меж^акультетской ПНИЛ биоорганической химии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета используются результаты совместной работы по теме: "Лилидный обмен и окислительное ("[-осформирование митохондрий при ишемической болезни сердца" и внедрена методика определения одновременно с измерением других функциональных параметров митохондрий.

В терапевтическом отделении городской больниш № I г. Твери с 1990 года используется метод оценки состояния больных инфарктом миокарда по динамике быстрых изменений ФИ цельной крови, предложенный в диссертационной работе.

На каФедре общей и биоорганической химии Тверского государственного медицинского института используются результаты дис- : сертационной работы в лабораторной практике научных исследований кафедры, а также в теоретическом плане лекционного курса студентов.

В диссертации выносятся на защиту следующие положения:

1. Результаты влияния Физико-химических параметров среды инкубации и экстрагирующей смеси на эффективность выделения прочносвязанных ФосФюлипидов.

2. Существование в биомембранах быстрых, специфических колебаний уровня подвижных и прочносвязанных ^Х, возникающих под действием гипотонии, АТЛ, ионов калымя, ФгасФата.

3. Возможные механизмы, обеспечивающие динамику быстрых изменений уроькл содержания подвижных в биологических системах.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на Объединенной научной конференции молодых ученых и специалистов "Медицинская наука - практическому здравоохранению" (Махачкала, 1990), I научно-практической конференции молодых медиков Нечерноземья ( Тверь, 19ЭС). Диссертация апр<">- " бирована на межкаФедральном заседании с участием сотрудников ке^едр Физической химии, биохимии и биотехнологии Тверского

государственного университета, общей и биоорганической химии Тверского государственного медицинского института (Í992). По теме диссертации опубликованы: 5 научных статей, 2 тезиса докладов, получено положительное решение на изобретение ( 4851949/14 (079229) от 18.Сб.90 г), получены удостоверения на 7 раиионализаторских предложений.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав и выводов. Первая глава представляет собой обзор литературы. Во второй главе дано описание проведенных экспериментов. Третья глава содержит основные результаты собственных исследований и их обсуждение. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 28 рисунков. Список литературы вклэчает 197 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ PABOTH Материалы и метода исследований.

Аналитическое выделение различных Фракций ФосФолипидов из многокомпонентных смесей природных липидов осуществлялось с помощью усовершенствованного метода проточной тонкослойной хроматографии. В качестве адсорбента использовалась Фракция частиц (32-45 мгс), получаемая из силинагеля ¿/40 ("Chemapol ЧСТ ), способом седиментации. Количественное определение исследуемых ^Л проводилось денситометрическим способом по степени обугливания пятен после проявления хроматограмм хромовой смесьп и построения калибровочных кривых зависимости площади пиков денсито-гремм от количества Фосфора стандартных препаратов: ФосФатидил-инозитов (из растений, Фирма " Servo ", ^РГ), лизоФосФатидил-этаноламинов (Л'Т'ЭА), ФэсФатидилхолинов, фосфатидилсеринов (^С), кардиольлинов (Ю1), ФосФатидной кислоты (^К) (из яичного желтка, Фирма "Cocfi - Ligkt ", Англия), сФингомиелинов (СЭД) (из мозга быка, Фирла " Sigma "» ДНА). Содержание ФосФора в анализируемых пробах определялось по методу Багинскогэ. Быстрка изменения уровня содержания подвижных и прочносвязанных ФХ анализировались предложенным нами для этих цэлеК методом, отличающимся от известных тем, что количество этих ^Л контролировалось многократно - через 30 секунд в течении 3-х минут после воздействия на исследуемый обьект Физшсп-хкмичееких агентов. Митохондрии выделялись из печени белых крке по стандартной мето-

дяке (среда выделения: 0,3 М сахароза, 0,2 М трис-HCI, pH 7,4). функциональная-активность этих органелл оценивалась по степени набухания, которая определялась по изменению светорассеивания (спектрофотометр С?-26) каждые 30 секунд в течении 3 минут после внесения суспензии митохондрий в среду инкубации. Экстракция подвижных липидов из биологических структур проводилась по методу Блайя и Дайера. В отличие от имеющихся в литературе методов (Прохорова М.И., 1982; ОлиФсон Л.Е. с соавт., 1981), прочносвя-занные ,ТЛ извлекались поэтапно. При этом время экстракции и количество конц. HCl в экстрагирующей смеси было увеличено. Прочносвязанные липиды выделялись следующим образом: после первой обработки, оставшийся на Фильтрфатериал остатков фрагментов мембран митохондрий обрабатывала 2-3 мл смеси хлороформа и метанола (2:1) (смесь содержала U,5% конц. HCl по объему) в течение I часа (жесткая экстракция). После второй экстракции Фильтр с остатками мембран помещался в 2-3 мл смеси хлороформа и метанола 2:1, которая содержала 1% кони.HCl (по объему) , и оставлялась на сутки (ультражесткая экстракция). Полноту экстракции контролировали путем кипячения оставшегося биологического материала в метаноле, содержащем 1% H2SO4 в колбе с обрат- • ным холодильником в течение 4-6 часов, а также определением свободных жирных кислот после полного щелочного гидролиза. Полученные на каждом из этапов экстракты липидов фракционировались методом проточной горизонтальной хроматографии,. Концентрация. белка определялась биуретовым методом. Статистическая обработка полученных данных проводилась на персональной ЭШ "Робо-трон-СМ-19-IO" с применением стандартного пакета прикладных программ "Статан".

Результаты и их обсуждение.

I. Влияние Физико-химических факторов на эффективность экстракции подвижных и прочносвязанных фосАолипидов.

В первом разделе настоящей работы исследовано влияние Физико-химических параметров среды инкубации (присутствие ФосФата, pH и тоничности среды) и состава экстрагирующей смеси (содержание кони. HCl) на эффективность экстракции подвижных и прочносвязанных митохондриальных мембран.

Известно, что инкубация в различных средах и уменьшение тоничности среды влияют на осмотическое набухание митохондрий и их основные <*ункши - дыхание, окислительное (ТосгЬормированяе, транспорт ионов (Хиап Уи-Ппд et а?, 1989; гЬеН Веппс! А. е! а1, 1989). Показатель активности ионов водорода (рН) является одним из ключевых параметров среды инкубаши, который контролирует свойства митохондрий в различных Функциональных состояниях. С другой стороны э(Мективность экстракции >М1 в значительной степени зависит от химической природы лчпидного компонента и от вида комплексов, которые образуют эти соединения в биологических мембранах с белками. Прочносвяззнные липиды невозможно экстрагировать органическими растворителями, их можно выделить лишь разрушив комплекс кислотным или щелочным гидролизом. Однако при этом липидн подьергаются значительным химическим изменениям (Кейтс М., 1975; Оли^сон М.Е., с соавт., 1981; Блюгер А.Ф. с соавт., 1987 ).

В работе предлагается после извлечения липидов из митохондрий по методу Блайя и Дайера провести дальнейшую обработку биологического материала с помощью подкисленных смесей растворителей для выделения прочносвяэаньых с белками липидов. Кроме того, моделируя функциональное состояние митохондрий с помощью экзогенных добавок мы показали, что количество дополнительно экстрагируемых ^Л в значительной степени зависит от функционального состояния митохондрий.

1.1. Влияние степени подкисления растворителей на уровень подвижных и прочно связанных Аэс^чшшидов.

Для выделения прочносвязэнных <М1 из митохондриальных мембран нами были использованы растворители с разной степенью под-кисления (жесткая и ультражесткая экстракции после экстракции нейтральной смесью растворителей) (рис. I ). В отличие от используемых традиционных методом выделения прочносвязанных нами использовалась поэтапная экстракция липидов, при которой время экстракции и количество кони. ![С1 в экстрагирующей смеси было увеличено (Кейтс !;!., 1975; Е«еп&ег^ Н , 1976;

Прохорова М.й., 1982 ).

Анализ полученных результатов, свидетельствует о том, что после обычной экстракции смесью хлороформа и метанола из мито-

ИЗОТОНИЧЕСКАЯ СРЕДЛ

ГИПОТОНИЧЕСКАЯ СРЕДА Рис. I. Влияние типа экстракции на количество подвипшх> и прочносвязанных Лзсйолипидов (мкг/мг белка); т -мягкая, жесткая, ультражвсткая экст-

ракции, соответственно.

хондрий, в зависимости от среда инкубации, удаётся дополнительно извлечь от 8 до ЗО/S СЛ с помощью экстракции смесями растворителей, содержащих кислоту. Так, в изотонических условиях при Физиологических значениях рН общее количество ФЛ, экстрагируемых из мембран митохондрий с помощью обычной мягкой экстракции, составило 304,1 ± 10,1 í-кг/мг балка. С помощью последующих жесткой и ультраясесткой экстракций было доизвлечено 41,1 ± 0,8 и 4,4 + 0,2 мкг/мг белка, соответственно (14% ). В условиях гипотонии эти показатели были следующими: 249,8 ± 7,2 ; 27,0+ 1,0; 21,0 + 1,1 мкг/мг белка (.19% ). Следует отметить, что снижение тоничности среды существенно уменьшает количество слабосвязанных, а также жесткосвязанных в экстрактах митохондрий. Важно указать, что количество липидов в экстрактах, полученных в ультражестких условиях при гипотонии резко возрастает (до 7 раз ).

Поскольку эффективность экстракции зависит от химической природы нами было проведено исследование влияния типа экстракции на количество извлекаемых прочносвязанных ФосФолипидных Фракиий. Так, в изотонических условиях при Физиологических значениях рН с помощью жесткой экстракции было доиэвлочено дополнительно следующее количество ФосФолипидных фракций: (18% ), ФХ (6% ), (12% ), Ю1-+ Ш (33% ) (рис. 2 ). При инкубации в гипотонии количества прочносвязанных ФосФолипидных Фракций было следующим: ЛФЭА (6% ), ОТМ (2% ), Ш (3055 ), 5Х (8% ), ФЭА (7% ), КЛ + <*'К С23% ) (рис. 3). Наибольшее- количество прочносвязанных ФосФолипидов как в условиях изотонии, так и при гипотонии было выявлено во Фракциях ФИ и КЛ+ФК.

1.2. Влияние физико-химических параметров среды инкубации на эффективность экстракции подвижных и прочносвязанных ФосФолипидов.

В этой серии опытов исследовано влияние нескольких параметров среды инкубации: тоничности, концентрации ионов водорода и неорганического фосфата на ФосФолипидннА состав экстрактов из митохондрий, полученных в условиях обычной экстракции, а также при экстракции сильно подкисленными смесями растворителей.

•Так, снижение тоничности среды инкубации при любых комбинациях остальных параметров среда существенно уменьшает количество слабосвязанннх, а также жесткосвязанных Ш. Однако, ко-

Рис. 2. Влияние Физико-химических параметров среды инкубации на количество извлекаемых подвижных и прочно связанных ^осФолипидов, мхг/мг белка (изотонические растворы)

РН7.35 РН7.35*Р[ РН 6.8

РН 7.35 РН7.35*Р( РН6.6 РК6.6*Р[

РН 7.35 РН7.35*Р> РН6.6 РНб.б-Р;

I

0

1

Ряс. 3. Елияниз ^изкко-химнческих параметров среда инкубации на количество извлекаемых

подвижных и прочно связанных *ос#,олипидов, мкг/мг белгса (гипотокичесхиз растворы).

личество липидрв, извлеченных в ультражестких условиях в гипотонии, резко возрастает. Суммарное количество липидов, которое удаётся экстрагировать из суспензий митохондрий, находящихся в средах с низкой тоничностью, существенно ниже,чем в изотонических условиях. Очевидно, что часть ФД в гипотонических средах не попадает в экстракты.

Фосфат вызывает набухание митохондрий, меняет структуру , активирует системы ионного транспорта. Бнесение Р{ в среду, за одним исключением, снижает количество мягко связанных липидов. Б изотонических средах фосфат увеличивает количество жестко ~ и ультражесткосвязанных ФЛ. Б набухших митохондриях, в гипотонических средах фосфат вызывает обратный эффект.

Снижение рН уменьшает количество липидов в мягких экстрактах и увеличивает количество липидов в ультражестких экстрактах митохондрий в изотонических условиях, а в гипотонических средах снижение рН уменьшает количество ультражесткосвязанных липидов.

Следовательно, такие физико-химические параметры, как то-ничность, рН, присутствие фосфата по отдельности, а также па- . раллельное изменение двух или нескольких параметров приводят к изменению уровней подвижных и прочносвязэнных М экстрактов митохондрий.

2. Метод определения некоторых параметров динамики быстрых изменений фосфолипидов биомембран.

й результате проведенных исследований установлено, что в митохондриальных мембранах существуют быстрые обратимые изменения уровня содержания §Х.

Нами показано,что в сроки до л минут после воздействия экзогенных факторов, вызывающих переход биомембраны в новое функциональное состояние,уровень ФХ в них подвергается существенным колебаниям. Амплитуда колебаний, а также характер динамики изменений ФЛ в период перехода биомембраны в новое функциональное состояние являются принципиально новой динамической характеристикой.

о

Данный метод исследования биологических мембран отличаемся от известных тем, что определение ФД проводилось многократно в

течении 3-х минут после воздействия физико-химических агентов. Для этого на взвесь исследуемых.внутриклеточных мембрак,выделенных общепринятыми методами и находящихся в среде выделения в концентрации 20 мг/мл, действовали фактором, изменяющим их функциональное состояние. Через 20-J0 секунд в течении J-x минут после воздействия агента отбирали пробы, содержащие 0,1 мг белка в J-5 мкл, и наносили на хроматографическую пластинку с тонким слоем силикагеля непосредственно в среде выделения. При этом происходила стабилизация процессов, происходящих в исследуемом объекте. Для ускорения стабилизации в точку нанесения пробы предварительно помещели 1-2 мкл денатурирующего агента (5% раствор трихлоруксусной кислоты). Перед нанесением исследуемого материала слой адсорбента разделяли на узкие полосы (шириной 5 мм ), что обеспечивало проведение одновременного анализа 12-15 проб в стандартных условиях и качественную денситометрию. Полноту экстракции,которая происходила в процессе хроматографи-рования,контролировали путем анализа стартовых пятен на присутствие в них прочноевязанных ФЛ. Для этого проводилось их элюи-рование подкисленной хлороформ-метанольной смесью (хлороформ --метанол - 0,5$ HCl по объёму) и повторная хроматография. Количественная оценка уровня ФЛ проводилась денситометрическим способом.

Предлагаемым методом можно анализировать быстрые изменения ФЛ как при непосредственном нанесении на хроматографичес-кие пластинки гомогенатов митохондрий,тканей, а также экстракты подвижнвх и прочноевязанных ФЛ из биологических структур.

3. Специфика быстрых изменений количества подвижных и прочноевязанных фосфатц^илхолинов в биомембранах.

Используя предложенный метод определения параметров динамики быстрых изменений ФЛ нами была предпринята попытка описать характер и особенности изменений основного ФЛ митохондриальных мембран ФХ при воздействии на митохондрии неорганического фосфата и гипотонии,являющихся активными регуляторами биохимических процессов клетки.

Б результате проведенных экспериментов обнаружено, что через 30 секунд после добавления фосфата (5 мМ) и уменьшения то-

ночности среды выделения в 2 раза количество подвижных и прочное вязанных ФХ в мембранах митохондрий меняется. Характер этих изменений определяется природой действующего агента ( рис. 4). Как видно из этого рисунка, при воздействии неорганического фосфата уровень подвижных ФХ к ЛО-ой секунде увеличивается в 1,5 раза. В отличие от этого, изменение тоничности среды вызывает уменьшение содержания этих липидов в 1,4 раза. Уровень связанных ФХ, определенный путем анализа стартовых пятен через ЛО секунд в опытах с добавками фосфата достигал своего минимального значения, количество связанных - максимального, а при уменьшении тоничности среды уровень первых липидов продолжал уменьшаться, а вторых - возрастать.

К пятой минуте уровень подвижных ФХ стабилизируется,оставаясь заниженным по сравнению с исходным уровнем, а содержание связанных липидов возрастает во времени независимо от действующего агента.

Таким образом, приведенные донные свидетельствуют о том, что разнообразные факторы вызывают в биологических мембранах быстрые обратимые изменения недвижных и связанных ФХ, при этом амплитуда обнаруженных колебаний определяется действующим экэо-гепшм фактором.Это необходимо учитывать при экстракции фос-фолипидов.

4. Возможные механизмы,обеспечивающие динамику быстрых изменений уровня содержания подвижных фосфа-тидилхолинов в биологических мембранах.

В предыдущих опытах установлено,что под влиянием экзогенных факторов (гипотонии, неорганического фосфата) возникают быстрые изменения количества подвижных ФХ. Наиболее вероятными механизмами, объясняющими эти изменения могут быть: связывание ФХ с белком, гидролиз и синтез липеда и возможные превращения его в. другие Ш (фосфатидилэтаноламины, лизофосфатодилхолины, фосфатидилиноэиты, фосфатидилсерины).

Для проверки возможности гидролиза липида были проведены исследования с ингибитором фосфолипазы А^.Как оказалось, лидокаин не оказывает существенного влияния на динамику быстрых изменений подвижных ФХ.Следовательно, вклад процессов гидроли-

ПРОЧНОСВЯЗАННЫЕ ФХ

Рие. 4. Быстрые изменении иодтгаш. и прочпосвяагшных "X питохингфигхп.м.п: исмброи в период до 5 минут «осле ро.ччсПгтлнп неоргтшчоскопа (Pi) ¡: г.люго-

iiHii (Т\(м!'г/мг боль а). А/ - hojto^ihíí уро^зиь *Х.

за в динамику является незначительным.Синтез фосфатидилхолина de novo также мало вероятен, так как синтезируется он в микросомах, кроме того в опыте отсутствуют условия,необходимые для обеспечения синтеза л::п!-!дя (наличие АТФ и т.д.). Возможность изменения уровня этого липида за счет превращения его в другие классы липидов исключить трудно,так как состав ФЛ существенно меняется в процессе динамики быстрых изменений.Для учёта действия этого механизма необходимы дополнительные исследования по определению активности рцца ферментных систем.Наиболее вероятным механизмом,на наш взгляд,является связывание ФХ с белком. Это подтверждается тем,что с помощью подкисленных смесей растворителей удаётся дополнительно извлекать некоторое количество этого липида.Для проверки данного предположения в работе была . проанализирована динамика быстрых изменений прочносвязанных ФХ. Анализ этих изменений показал,что по времени при взаимодействии различных агентов количество прочносвязанных липцдов увеличивается.Следовательно, возрастает прочность связи липида с белками митохондрий.Это хорошо согласуется с тем,что в опытах по определению количества жирных кислот после полного щелочного . гидролиза в исследуемые временные интервалы после воздействия неорганического фосфата эти значения приблизительно одинаковые. При этом общий фонд ФЛ, в том числе ФХ, остаётся неизменным. Поэтому динамика быстрых изменений подвижных ФХ в митохондриаль-ных мембранах,по-видимому,объясняется связыванием ФЛ с белками.

5. Использование показателей динамики быстрых изменений фосфатидилинозитов цельной крови для диагностики инфаркта миокарда.

Известно,что динамика быстрых изменений ФЛ коррелирует с некоторыми видами патологий.Поэтому представляло интерес исследовать специфику быстр,« изменений уровня содержания самого лабильного липида-фосфатидилинозита при таком тяжёлом состоянии организма,каким является инфарктмиокарда.

Обнаруженная специфика динамики быстрых обратимых изменений уровня содержания ФИ в цельной крови у больных инфарктом, миокарда на .различны:: стадиях заболевания,а также в группе контроля (рис. 5),может быть использована при диагностике больных

Рис. 5. Шстрые изменения уровня фосфатидилинозитов цельной крови здоровых лиц и больных с нео-слошенным инфарктом миокарда в различные периоды заболевания, мкмоль фосфора ФИ/л крови. ИБС О, ИБС 15, ИБС ¿0 - острый период, 15 и "сутки заболевания,норма - группа контроля.

инфарктом миокарда.

шьода

1. Разработан метод оценки димамики быстрых изменений подвижных и связанных фосфолипидов в биологических мембранах.

2. Показано, что различные физико-химические параметры среды инкубации оказывают влияние на эффективность экстракции проч-носвязанных с белками фосфолипидов.При этом найдены условия, при которых из митохондрий удается дополнительно извлечь до о02 фосфолипидов (от общего количества) с помощью поэтапной экстракции подкисленными смесями растворителей.

Л. Установлено, что под влиянием экзогенных факторов (гипотония, АТФ, ионы кальция, фосфата) происходят быстрые специфические

- It> -

изменения подвижных и прочноевязэнных фосфатидилхолинов.

4. Определены параметры этих изменений:амплитуда колебаний уровня подвижных и прочноевязанных фосфатицилхолинов;время выявления максимальных отклонений в уровнях подвижных и проч-посеяэйнных фосфатидилхолинов;время,необходимое для стаби-

. лизации уровня фосфатидилхолино в при ВО^ДёиС 4 St»«« различных экзогенных факторов.

5. Показано,что ингибитор митохондриальных фосфолипаз лидокаин не оказывает существенного влияния на динамику быстрых изменений фосфатидилхолинов.

6. Установлено,что изменения уровня содержания фосфатидилхолино в в короткие промежутки времени обусловлены тем,что происходит прочное связывание липида с белком,что подтверждается близкими значениями уровня жирных кислот,определенных в эти

, временные интервалы после полного щелочного гидролиза. При этом общий фонд фосфолилвдов не изменяется.

7. Определены достоверные различия в динамике быстрых изменений фосфатидилинозигов цельной крови здоровых людей и больных крупноочаговым неосложненным инфарктом миокарда. Показано, что стадия заболевание отражается на характере быстрых изменений фосфатидилинозитов. На этом основании предложен метод диагностики и прогнозирования протекания болезни.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Нопина H.H., Смирнова Т,И., Пастуненкова М.А.»Парамонова И. В., Каргаполов A.B., Ягужинский JI.C. Изменение уровня содержания прочноевязанных фосфолипвдов митохондрий под влиянием экзогенных факторов // Биохимия, 1990.-Т.55,вып.8-е. 1J5Z-IJ66.

2. Лопина Н.П., Быковская Н.Г., Каргаполов А.Б., Аникун Б.В., Ястребов Г.Н. Динамика содержания в крови фосфатидилинозита у больных инфарктом миокарда //Лаб.дело, I99I.-JM -с.22-24.

J. Лопина Н.П., Каргаполов A.B., Смирнова Т.И., Пастушенкова М.А. Исследование белково-липедных комплексов //В еб.:"Ком-плексоны и комллексонаты? Тверь, 1990. - С. 57-59.

4. Лопина Н.Л., Быковская Н.Г., Мацуль В.М. Специфика фосфоино-зитолыгого ответа больных с острым периодом инфаркта миокарда// Тезисы докладов I научно-практической конференции молодых медиков Нечерноземья. - Тверь,1990. - C.Ö5-66.

5. Слюсарь H.H., Лопина H.H., Дмитриева Б.Г. Динамика быстрых изменений фосфатидилинозитов эритроцитов и тромбоцитов у больных злокачественными опухолями // Тезисы докладов Объединенной научной конференции молодых ученых,специалистов и студентов "Медицинская наука - практическому здравоохранению" - Махачкала, 1990. - С. ¿4I-J42.

6. Максютова Е.П., Каргаполов A.B., Лопина Я.П. Значение показателей уровня содержания фосфатидилинозитов в диагностике хронического рецидивирующего афтозного стоматита// В сб.: Диагностика и лечение врожденных и приобретенных заболеваний челюстно-лицевой области".-Москва, 1990.- С.65-70.

7. Лопина Н.П., Аникин Б.Б., Каргаполов A.B., Мацуль В.М..Ястребов Г.Н., Быковская Н.Г. Динамика изменения уровня содержания общих липидов у больных инфарктом миокарда //Тер.архив, 1991, - № 12 - с. 74-75.

8. Способ диагностики инфаркта миокарда / Слюсарь H.H., Лопина Н.П., Быковская Н.Г., Каргаполов A.B., Ястребов Г.Н., Аникин Б.В., Зубарева Г.М. Положительное решение по заявке № 4851949/14 ( 079229), заявлено 18.07.90 г.

Ьгинй.