Реакция гидроксиэтилирования как метод химической модификации крахмала тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ПАНОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

РЕАКЦИЯ ГИДРОКСИЭТИЛИРОВАНИЯ КАК МЕТОД ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ КРАХМАЛА

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003482754

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И. Менделеева в УНЦ «Биоматериалы»

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор Штильман Михаил Исаакович

Официальные оппоненты:

член-корреспоядент РАН, доктор химических наук, профессор Зезин Александр Борисович

член-корреспондент РАМН, доктор технических наук, профессор Береговых Валерий Васильевич

Ведущая организация: Институт элементорганических соединений им. А.Н.

Несмеянова РАН

Защита состоится " 26 " ноября 2009 г. в 16-30 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.04 в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д.86, корп. Т, ауд.Т-410

Отзывы на автореферат направлять по адресу:

119571, г. Москва, пр. Вернадского, д.86, МИТХТ, им. М.В. Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru и в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова

Автореферат размещен на сайге « 26 » октября 2009 г. и разослан «26 »октября 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.120.04, доктор химических наук, профессор

И.А. Грицкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Макромолекулярные системы занимают важное место среди

современных лекарственных препаратов. В том числе, это относится к полимерным компонентам кровезаменителей различного типа, в частности, производным полисахаридов, сочетающим высокую эффективность и безвредность за счет постепенного распада в организме с последующим выведением образовавшихся фрагментов.

К таким полимерам относится гидроксиэтилированный крахмал, составляющий основу плазмозамещающих кровезаменителей, широко применяемых в медицине катастроф, хирургии, акушерстве и гинекологии, а также в качестве кршшротекторггых составов, используемых при хранении трансплантируемых органов.

В . настоящее время в Российской Федерации отсутствует производство гидроксиэтилированного крахмала. В связи с этим, работы, направленные на изучение реакции гидроксиэтилирования крахмала различного происхождения с целью создания отечественной фармацевтической субстанции являются актуальными.

Цель работы: изучение закономерностей реакции гидроксиэтилирования

амилопектиповего крахмала для получения фармацевтической субстанции

ч

гидроксиэтилированного крахмала из доступного отечественного сырья.

Научная новизна - определены оптимальные условия реакции гидроксиэтилирования крахмала различного происхождения: концентрация крахмала, температура процесса, концентрация и природа катализатора, мольное соотношение крахмал : алкилирующий агигг.

Для прогнозирования свойств субстанции разработан математический аппарат конформациониого анализа макромолекул олиго- и полисахаридов.

Предложен новый подход к количественной оценке степени превращения реагентов и их селективности в реакции гидроксиэтилирования крахмала на основе ЯМР 13С спектроскопии.

Разработан комплексный метод анализа тонкой структуры амилопектипа в его гидроксиэтильных производных, пригодный для стандартизации лекарственных препаратов на основе гидроксиэтнлировалного крахмала.

Практическан значимость работы.

Разработана оригинальная технология получения фармацевтической субстанции гидроксиэтилированного крахмала из доступного отечественного сырья. Разработан метод оперативного производственного контроля, а также комплексный метод анализа структуры

\\

\

амилопектина и его гидроксиэтильных производных, пригодный для стандартизации лекарственных препаратов на основе гидроксиэтилировашюго храхмала.

Автор защищает:

1. Результаты оптимизации условий реакции гидроксиэтилироваиия крахмала.

2. Метод контроля за протеканием реакции гидроксиэтилироваиия полисахаридов на основе ЯМР 13С спектроскопии.

3 Новый метод исследования тонкой структуры молекул гидроксиэтилированного крахмала.

4. Метод конформационного анализа макромолекул олиго- и полисахаридов.

5. Технологию получения субстанции гидроксиэтилированного крахмала.

Личное участие состояло в создании лабораторной установки гидроксиэтилирования,

непосредственном анализе химического строения полисахаридов и продуктов их модификации методом 13С ЯМР, подготовке проб для анализа строения гидроксиэтилированного крахмала методом ГЖХ, оптимизации условий гидроксиэтилирования крахмала, разработке математического аппарата конформационного анализа полисахаридов, интерпретации результатов исследований, подготовке докладов и публикаций.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах:

- V Съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии. (Минск, 2003);

- Съезд международной инженерной академии (Париж, 2004);

- Международная конференция "Биотехнология и Медицина" Москва, 2006);

- Международная конференция "Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности " (Санкт-Петербург, 2006);

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованном ВАК, 1 патент РФ, а также 4 тезиса докладов, представленных на отечественных и международных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы (173 наименования). Работа изложена на 152 страницах, включая 46 рисунков и 36 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении сформулированы цель работы, актуальность проблемы, основные

положения, выносимые на защиту, научная новизна в практическая значимость работы.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

В первой главе дан подробный анализ публикаций, посвященных химической модификации крахмала, изучению строеппя полисахаридов и их применению в медицине.

ГЛАВА 2. В Экспериментальной части охарактеризованы объекты исследования, приведены методики синтеза и анализа исследуемых полисахаридов, дано описание экспериментальной установки.

ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Осповные стадии синтеза гидроксиэтнлированного крахмала (ГЭК)

Поскольку в качестве сырья для получения ГЭК медицинского назначения принято использовать только крахмал с высоким (не менее 95%) содержанием амилопектина, в диссертации был разработан метод очистки пищевого крахмала с низким содержанием амилопектина (ГОСТ 7699-78), который предусматривает его кислотный гидролиз и последующее отделение амилозы. Разработанный метод позволяет получать крахмалы с требуемым содержанием амилопектина и необходимой величиной молекулярной массы. Также был разработан метод кислотного гидролиза сортов крахмала с высоким содержанием амилопектина («Магаса 340IX»,произв. РепГогй, Австралия; «1по\га1ех 100», произв. АуеЬе, Голландия), которые обычно применяются для получения субстанции ГЭК.

Из известных способов проведения реакции гидроксиэтшшрования полисахаридов нами выбран процесс, предусматривающий проведение реакции в водном растворе в присутствии хлорида или гидрокевда натрия. В качестве алкилирующих агентов (АА) были использованы этиленоксид (ЭО) и этиленхлоргидрин (ЭХГ).

, где АА-апкилирующий агент. или

^-Н.ЧСНгОуЭ^Н

I*,: -Н, -(СНгСН,0)„Н, -а-О-аи. -НБ«-[>-аи

3.2. Изучение реакции гидрокспэтолирования крахмала

3.2.1. Метод количественной оценки параметров реакции гидрокенэтилировапия крахмала в характеристик полученныл продуктов на основе спектроскопии ЯМР13С

Для контроля за ходом протекания процесса гидроксиэтшшрования был разработан комплексный метод анализа на основе спектроскопии ЯМР 13С. Данный метод позволяет с

достаточной точностью получать информацию как о качественном и количественном составе реакционной массы, так и о строении образующихся продуктов.

На рисунке 1 представлен типичный спектр ЯМР 13С реакционной смеси,

зарегистрированный с помощью процедуры Inverse Gate .

1 ........ I ц .......... I I I и I . . I | . I ■ ■ t. I I .! • I ................I I I 1....................................I ....................

100 85 ВО 85 ВО 75 70 65 60 55 50 45 40

Chemical Shift (ppm)

Рис.1. Типичный спектр ЯМР 13С реакционной смеси.

Таблица 1

Отнесение сигналов в типичном спектре ЯМР 13С реакционной смеси

№ Отнесение сигнала или группы сигналов Обозначение Химический сдвиг, м.д.

1 Сигнал ядер углерода этиленоксида (ЭО) S1 44,34

2 Сигнал С2 атома углерода (С-С1) этиленхлоршдрина (ЭХГ) S2 48,85

3 Сигнал С6 атома углерода у замещенных и незамещенных остатков глюкопиранозы S3 62,92; 63,50

4 Сигнал терминального атома углерода (СНг-ОН) гкдроксиэтильной группы S4 63,24

5 Сигнал С1 атома углерода этиленхлоргидрина (С-ОН) S5 64,50

6 Сигнал ядер углерода этиленгликоля S6 65,08

7 Группа сигналов атомов углерода С2-С5 замещенных и незамещенных остатков глюкопиранозы Сигнал атома углерода (С-ОСНг) гидроксиэтильной группы S7 68,00-85,00

8 Сигнал атома углерода С1 глюкопиранозного остатка в случае его замещения при С2 атоме S8 99,31

9 Сигнал атома углерода С1 глюкопиранозного остатка в случае его замещения при СЗ и/или С6 атомах S9 100,86

10 Сигнал атома углерода С1 в незамещенном остатке глюкопиранозы S10 102,05

Основные характеристики полученных продуктов (СЗ и молярное замещение (МЗ)) и параметры реакции гидроксиэтилирования полисахаридов (селективность (Ф"А) и степень превращения (,ХМ) алкилирукмцего агента) определяли по формулам 1-6:

1+1 /.. (2)

С3= — МЗ--

У/-/^ (3) (4)

■51/ 4. 56/ 4.Та.! I л-1 -и 56/

/2 /2 58 58 59 /2

х = ^ + + (5) =-(6)

где 151 - интегральная интенсивность сигнала (см. таблицу 1).

Следует отметить, что важным показателем ГЭК, используемого в качестве фармацевтической субстанции, является цветность. Как известно, в процессе тидроксиэтилирования образуются окрашенные побочные продукты. Несмотря на дальнейшую обработку реакционной массы в процессе ультрафильтрации и кипячения с активированным углем, не удается полностью избавиться от окраски раствора ГЭК. Данный факт дает основания для предположения, что в процессе гидроксиэтилирования кроме образования кизкомолекулярных окрашенных продуктов, также происходит частичная модификация самого крахмала. В виду невозможности полной очистки ГЭК от окрашенных продуктов, при проведении процесса гидроксиэтилирования наряду с вышеуказанными характеристиками реакции необходимо оценивать степень окрашивания реакционной массы. В качестве критерия для количественной оценки величины цветности ГЭК можно использовать величину удельной оптической плотности:

__________Аюо- оптическая плотность

А400 '100%

Ауд = -, (7) нейтрализованной реакционной массы,

^ к измеренная при длине волны 400 нм;

Скг - концентрация крахмала, масс. %.

3.2.2. Влияние отдельных факторов на реакцию гидроксиэтилирования крахмала 3.2.2.1. Гидроксиэтилироваиие крахмала этиленоксидом (ЭО) в присутствии №С1

Для определения оптимальной концентрации крахмала была проведена серия экспериментов с различным его содержанием в растворе: 15, 21 и 27%. Методом

спектрофотометрии и ЯМР 13С спектроскопии проводили анализ полученных образцов. Как видно из рис.2, рост СЗ сопровождается значительным ростом Ауд. С другой стороны, при концентрации крахмала 15% наблюдается низкая селективность этиленоксида по основному продукту, а тахже остаточное количество этиленоксида (5%) в реакционной массе. Для дальнейших исследований выбрана концентрация крахмала-21%.

Рис.2. Зависимость СЗ и удельной оптической плотности от концентрации крахмала.

Наиболее доступным, безопасным и мягким катализатором является хлорид натрия. С целью определения оптимальной концентрации катализатора была проведена серия экспериментов по пвдроксиэтилированию крахмала избытком ЭО при оптимальной концентрации крахмала (21 %).

Рис.3. Зависимость СЗ, степени превращения этиленоксида и удельной оптической плотности от концентрации хлорида натрия

При концентрации катализатора 2%, наблюдается очень низкая степень превращения, как исходного соединения, так и этиленоксида (рис.3). При концентрациях хлорида натрия 10 и 20% степени превращения имеют близкие значения, но Ау1 в последнем случае более интенсивна. По этой причине, оптимальное значение концентрации хлорида натрия 10%.

Для определения оптимального значения температуры, при которой необходимо проводить реакцию гидроксиэтшшровапия крахмала этиленоксидом была проведена серия экспериментов с различными температурами (30, 40, 50 и 70°С) при оптимальной концентрации крахмала 21% (рис.4).

СЗ;1'2 Хэо

/ —1

/ и

г

Ауд.

-•-Степень заменит*)

-•-Степень грввраидания этпемжада -*-Удел.ная оптическая пготяостъ

О 5 10 15 33 25 Комдолрамия хлореда натрии. Ч от массы фахмапа

Рис.4. Зависимость СЗ и удельной оптической плотности от

температуры.

Значительный рост СЗ наблюдается вплоть до 40°С, который постепенно замедляется. В тоже время, выше 40°С происходит сильное увеличение Ауд. Таким образом, при гидроксиэтилировании крахмала этиленоксидом в присутствии хлорида натрия, 40°С является оптимальной температурой для проведения реакции.

Таблица 2

Характеристики процесса и продуктов реахдии при различных соотношениях храхмал/ЭО

№ Шифр образца Температура реакции Т,°С Соотношение реагентов Иис : N30 Время с начала подачи ЭО, ч С3 = Хис мз Хэо ф зд Ауд

1 Образец 9.1 2 0,18 0.20 0,32 0,94 0,003

2 Образец 9.2 4 0,30 0,34 0,63 0,88 0,014

3 Образец 9.3 1 :0,70 8 0,39 0,45 0,86 0,81 0,058

4 Образец 9.4 16 0,42 0,50 0,98 0,77 0,071

5 Образец 9.5 24 0,43 0,52 1,00 0.76 0,146

6 Образец 10.1 2 0,24 0,27 0,33 0,92 0,016

7 Образец 10.2 4 0,37 0,43 0,49 0,90 0,064

8 Образец 10.3 1: 1,00 8 0,46 0,55 0,71 0,82 0,108

9 Образец 10.4 40 16 0,51 0,61 0,91 0,72 0,155

10 Образец 10.5 24 0,53 0,64 1,00 0,71 0,218

11 Образец 11.1 2 0,32 0,37 0,27 0,90 0,035

12 Образец 11.2 4 0,51 0,61 0,50 0,82 0,098

13 Образец И З 1 : 1,60 8 0,65 0,78 0.73 0,72 0,167

14 Образец 11.4 16 0,71 0,89 0,92 0,64 0,236

15 Образец 11.5 24 0,73 0,92 0,99 0,64 0,301

16 Образец 12.1 2 0,38 0,45 0,30 0,74 0,047

17 Образец 12.2 4 0,64 0,78 0,62 0,64 0,102

18 Образец 12.3 1 :2Д0 8 0,79 1,02 0,79 0,62 0,214

19 Образец 12.4 16 0,85 1,15 0,90 0,61 0,338

20 Образец 12.5 24 0,87 1,21 0,97 0,60 0,479

Не менее существенное влияние на характеристики процесса гидроксиэтштарования

оказывает соотношение реагентов - крахмал / ЭО. Для получения требуемых величин СЗ была проведена серия экспериментов при постоянных оптимальных условиях: концентрации крахмала 21%, концентрации ЫаС1 10%, и варьируемых количествах этиленоксида. Результаты представлены в таблице 2.

По данным таблицы 2 были построены графические зависимости величины СЗ от времени для различных соотношений крахмал/ЭО, при которых определены эффективные константы скоростей в предположении первого порядка реакции по крахмалу.

Рис.5. Зависимость СЗ от времени реакции при мольных соотношениях крахмал - этиленоксид: 1/0,7; 1/1,0; 1/1,6 и 1/2,2.

Полученные данные (рис.5) позволяют легко определить при каких условиях проведения процесса гидроксиэтилирования крахмала можно получить требуемую величину СЗ в диапазоне от 0,3 до 0,9. Воспроизводимые результаты при значительных изменениях времени отмечаются в области «плато» на графиках, которые целесообразно отбирать для величин СЗ (0.4,0.5,0.7), присущих фармацевтическим субстанциям.

Таким образом, для получения вышеуказанных степеней замещения ГЭК необходимо проводить процесс в условиях, описанных в таблице 3.

Таблица 3

Оптимальные условия получения ГЭК со СЗ 0.4,0.5 и 0,7

№ Степень Температура Концен- Концен- Соотно- Время с

замещения реакции трация трация №С1, шение начала

Т, °С крахмала, % масс. % масс. реагентов Лис: N30 подачи ЭО, ч

1 0,4 1:0,7 9,0

2 0,5 40 21 10 1:1,0 13,0

3 0,7 1 ■. 1,6 15,0

3.2.2.2. Гидроксиэтилирование крахмала этнленоксидом в присутствии 1ЧаОН

Для производства продукта фармацевтического назначения наиболее приемлемым является гидроксид натрия, поскольку образующийся при нейтрализации хлорид натрия в случае неполной очистки продукта не представляет серьезной опасности.

Для определения оптимальных условий реакции гидроксиэтилирования крахмала в присутствие гидроксида натрия был использован описанный ранее подход. Гидроксиэтилированию этилелоксидом при температуре 40°С подвергался щелочной раствор с концентрацией крахмала 21%, соотношением крахмал/ЭО 1:1, при различных концентрациях щелочи (рис.6).

Рис. 6. Зависимость СЗ, степени превращения этиленоксида и удельной оптической плотности от концентрации гидроксида натрия.

При концентрации катализатора 0,1 М наблюдаются низкие значения основных показателей реакции. В диапазоне концентраций 0,3-0,5М при незначительном росте СЗ и степени превращения этиленоксида наблюдается рост удельной оптической плотности. На основании этих данных, для дальнейших экспериментов с этиленоксидом использована наиболее пригодная для получения ГЭК концентрация гидроксида натрия в щелочном растворе, равная 0,3 М.

Имеющиеся данные свидетельствуют, что при использовании в качестве катализатора гидроксида натрия наблюдается более интенсивное протекание реакции по сравнению с процессом гидрокекггшшроваяия в присутствии хлорида натрия. Ввиду этого, была проведена серия экспериментов при более низких температурах. Как видно из графиков, представленных на рис. 7, несмотря на невысокие значения Ауд после гадроксиэтилироваиия при температуре 20°С, реакция характеризуется низкими степенями превращения. В диапазоне температур после 30°С не наблюдается существенного изменения степени конверсии как по крахмалу, так и по этиленоксиду. Однако, при температуре 30°С значительно ниже А»д, чем при 40°С.

Рис. 7. Зависимость СЗ и удельной оптической плотности от температуры реакции гидроксиэтили-рования

Последнее обстоятельство стало решающим для выбора условий реакции гидроксиэтилирования крахмала этиленоксидом при щелочном катализе. Таким образом, оптимальная температура в этих условиях составляет 30°С.

Концентрация гидроксида натрия, когь/п

Для получения ГЭК с заданной СЗ была проведена серия экспериментов при фиксированных значениях оптимальных показателей: температуры, концентрации катализатора и крахмала, и варьируемых соотношениях крахмал/ЭО.

Рис.8. Зависимость степени замещения от соотношения крахмал/этиленоксид.

Таблица 4

Характеристики процесса и продуктов реакции при различных соотношениях крахмал/ЭО

№ Шифр образца Температура реакции Т,°С Соотношение реагентов NHC : N30 Время с начала подачи ЭО, ч С3 = Хис МЗ Хэо ф эо Ауд

1 Образец 18.1 2 0,08 0,10 0,24 0,98 0,038

2 Образец 18.2 4 0,15 0,18 0,44 0,96 0,061

3 Образец 18.3 1 :0,45 8 0,22 0,30 0,72 0,95 0,099

4 Образец 18.4 16 0,29 0,40 0,99 0,94 0,120

5 Образец 18.5 24 0,31 0,42 1,00 0,94 0,145

6 Образец 19.1 2 0,14 0,18 0,32 0,98 0,051

7 Образец 19.2 4 0,22 0,29 0,53 0,96 0,089

8 Образец 19.3 1 :0,60 8 0,31 0,42 0,76 0,95 0,123

9 Образец 19.4 16 0,38 0,52 0,97 0,94 0,158

10 Образец 19.5 30 24 0,40 0,55 1,00 0,94 0,192

11 Образец 20.1 2 0,22 0,28 0,42 0,98 0,065

12 Образец 20.2 4 0,33 0,40 0,60 0,97 0,143

13 Образец 20.3 1:0,70 8 0,44 0,54 0,83 0,96 0,174

14 Образец 20.4 16 0,52 0,64 0,97 0,95 0,202

15 Образец 20.5 24 0,54 0,66 1,00 0,95 0,223

16 Образец 21.1 2 0,28 0,37 0,41 0,97 0,078

17 Образец 21.2 4 0,45 0,53 0,58 0,95 0,196

18 Образец 21.3 1 :1,00 8 0,60 0,71 0,80 0,92 0,220

19 Образец 21.4 16 0,68 0,82 0,95 0,90 0,242

20 Образец 21.5 24 0,71 0,85 1,00 0,90 0,264

Таблица 5

Оптимальные условия реакции получения ГЭК со СЗ 0.4,0.5 и 0-7_

J6 Степень Температура Концен- Концен- Соотно- Время с

замещения реакции трация трация шение начала

Т, °С крахмала, % масс. ЫаОН, моль/л реагентов Иис: N30 подачи ЭО, ч

1 0,4 1 :0,6 20,0

2 0,5 30 21 0,3 1:0,7 13,0

3 0,7 1:1,0 21,0

На основании данных таблицы 4 и рис. 8 были определены оптимальные условия реакций синтеза ГЭК (СЗ 0.4, 0.5 и 0.7) (таблица 5), при которых получены эффективные константы скоростей в предположении первого порядка реакции по крахмалу.

3.2.2.3. Гидрокспэтилвроваппе крахмала этнлекхлоргидрином в присутствии NaOII

Использование в качестве алкилирующего агента (АА) этилсноксида сопряжено с рядом недостатков, которые отсутствуют при использовании этилеихлоргидрипа (ЭХГ). Следует отметить, что в водном растворе в присутствие щелочного агента наблюдается равновесие между этиленхлоргидрином и этиленоксидом.

NaOH .

✓-ч. -ОН с Я + Н.О + NaCl

ci ZA

В этом случае ЭО образуется в реакторе in situ. В качестве щелочного агента выбран гидроксид натрия, как наиболее доступный и позволяющий создать необходимые условия для протекания реакции. С учетом расхода щелочного агента в реакции, возможно два способа проведения процесса. Прямой способ - дозирование ЭХГ в щелочной растЕор крахмала. Обратный - дозирование раствора щелочи к смеси ЭХГ с крахмалом.

Для изучения процесса гидроксиэтилирования крахмала ЭХГ были воспроизведены условия, аналогичные реакции с ЭО в щелочной среде (разд.3.2.2.2): температура 30°С, концентрация крахмального клейстера 21% при прямом способе и 24% при обратном (таблица 6).

№ таблицы 6 видно, что степень замещения ГЭК в первую очередь зависит от количества щелочи в реакционной массе. При увеличении количества щелочного агента больше, чем указано в таблице, наблюдается значительный рост Ауд, при которой продует, уже не может быть использован в качестве фармацевтической субстанции.

На основании данных таблицы 6 и рис.9 были определены условия реакций получения ГЭК со степенями замещения 0,4 и 0,5.

Рис. 9. Рост степени замещения во времени при прямом способе дозировки ЭХГ

Таблица 6

Характеристики процесса и продуктов реакции при различных соотношениях _ крахмад'ЭХГ/ЫаОН при прямом способе загрузки

№ Шифр образца Температура реакции Т, "С Соотношение реагентов ^с^эхгНлюн Время с начала подачи ЭХГ, ч С3 = Хис МЗ Хэхг ф ЭХГ Ауд

1 Образец 22.1 2 0,06 0,10 0,16 0,73 0,035

2 Образец 22.2 4 0,15 0,21 0,32 0,71 0,081

3 Образец 22.3 1 : 1,0: 0,8 8 0,24 0,30 0,48 0,69 0,116

4 Образец 22.4 16 0,32 0,38 0,69 0,63 0,145

5 Образец 22.5 24 0,34 0,41 0,70 0,65 0,164

6 Образец 23.1 2 0,12 0,18 0,23 0,78 0,065

7 Образец 23.2 30 4 0,22 0,29 0,36 0,75 0,127

8 Образец 23.3 1 : 1,2 : 1,0 8 0,32 0,42 0,53 0,73 0,173

9 Образец 23.4 16 0,39 0,54 0,71 0,69 0,198

10 Образец 23.5 24 0,41 0,55 0,73 0,69 0,212

11 Образец 24.1 2 0,16 0,22 0,26 0,82 0,081

12 Образец 24.2 4 0,28 0,35 0,42 0,78 0,156

13 Образец 24.3 1 : 1,2:1,4 8 0,41 0,48 0,62 0,75 0,217

14 Образец 24.4 16 0,49 0,61 0,77 0,73 0,231

15 Образец 24.5 24 0,50 0,63 0,81 0,73 0,243

Таблица 7

Оптимальные условия получения ГЭК со СЗ 0.4 и 0.5 при гидроксиэтилировании _крахмала этиленхлоргидрином прямым способом.__

№ Степень Температура Концентрация Соотношение Время с

замещения реакции клейстера, реагентов начала

Т,°С % масс. ^С^ЭХиИкаОН подачи

ЭХГ, ч

1 0,4 30 21 1:1,2: 1,0 20,0

2 0,5 1 : 1,2 : 1,4 18,0

Для обратного способа загрузки результаты представлены ниже.

Рис. 10. Рост степени замещения во времени при обратном способе дозировки ЭХГ

На основании данных таблицы 8 и рис.10 были определены оптимальные условия реакции для получения ГЭК со СЗ 0,4: соотношение реагентов Мис^эхг^.он" 1:1,2:1,4; 20 часов, 30°С.

Таблица 8

Характеристики процесса и продуктов реакции при различных соотношениях __крахмал/ЭХГ/ЫаОН при обратном способе загрузки_

№ Шифр образца Температура реакции Т,°С Соотношение реагентов ИиС^зхГ^аОН Время с начала подачи ЭХГ, ч С3 = Хис МЗ Хэхг Ф ЭХГ Ауд

1 Образец 25.1 2 0,03 0,03 0,10 0,55 0,032

2 Образец 25.2 4 0,07 0,09 0,23 0,55 0,045

3 Образец 25.3 1 : 1,0 : 0,8 8 0,12 0,15 0,33 0,53 0,053

4 Образец 25.4 16 0,16 0,20 0,48 0,51 0,065

5 Образец 25.5 24 0,18 0,22 0,50 0,52 0,082

6 Образец 26.1 2 0,03 0,04 0,10 0,66 0,035

7 Образец 26.2 30 4 0,08 0,12 0,19 0,64 0,057

8 Образец 26.3 1 : 1,2 : 1,0 8 0,16 0,21 0,33 0,62 0,082

9 Образец 26.4 16 0,26 0,32 0,50 0,61 0,115

10 Образец 26.5 24 0,28 0,35 0,56 0,61 0,132

11 Образец 27.1 2 0,04 0,06 0,11 0,73 0,038

12 Образец 27.2 4 0,11 0,14 0,20 0,71 0,106

13 Образец 27.3 1: 1Д : 1,4 8 0,25 0,30 0,42 0,69 0,148

14 Образец 27.4 16 0,38 0,44 0,65 0,67 0,173

15 Образец 27.5 24 0,41 0,48 0,69 0,68 0,182

3.2.2.4. Сравнительный анализ методов синтеза ГЭК.

Наибольший иптерес, с позиции производства фармацевтических субстанций, представляют ГЭК со СЗ 0,4, 0,5 и 0,7. Ниже приведены сравнительные характеристики образцов ГЭК с одинаковой степенью замещения, полученные разными способами. Наиболее перспективным является ГЭК со СЗ 0,4 (таблица 9).

Таблица 9

Сравнительные характеристики образцов ГЭК со СЗ 0.4

№ Шифр образца Тип АА Катализатор Температура, °С Время реакции, ч Хм Ауд

1 Образец 9 ЭО КаС1 40 9 0,87 0,80 0,060

2 Образец 19 ЭО №ОН 30 20 0,98 0,94 0,175

3 Образец 23 ЭХГ прямой №ОН 30 20 0,72 0,69 0,205

4 Образец 27 ЭХГ обратный ЫаОН 30 20 0,67 0,67 0,178

Как видно из данных таблицы 9, наименьшее время для достижения требуемого

значения СЗ затрачивается в процессе гидроксиэтилирования этиленоксидом в присутствие ЫаС1 (обр.9), что связано, по всей вероятности, с более высокой температурой процесса. В этом же процессе, несмотря на более высокую температуру, имеет место наименьшая Ауд, что объясняется наиболее низким значением рН среды, по сравнению с другими процессами. Наибольшая селективность по ГЭК и степень превращения алкилирующего агента

наблюдается в случае реакции гвдроксиэтилировапия ЭО с щелочным катализатором. Оба способа с применением ЭХГ значительно уступают по основным показателям способам, связанным с применением ЭО. Вместе с тем, при использовании ЭХГ имеются преимущества, прежде всего, технологического характера. При этом, процесс с обратным способом дозирования ЭХГ даже при близких значениях Ф™ и Хм характеризуется значительно меньшей Ауд.

Наиболее широко используется ГЭК со СЗ 0,5, характеристики образцов такого ГЭК, полученного нами, представлены в таблице 10.

Таблица 10

Сравнительные характеристики образцов ГЭК со СЗ 0.5

№ Шифр Тип АА Катали- Температура, Время Ф?/ Ауд

образца затор °С реакции,ч

1 Образец 10 ЭО NaCl - 40 13 0,82 0,76 0,135

2 Образец 20 ЭО NaOH 30 13 0,92 0,95 0,192

3 Образец 24 ЭХГ прямой NaOH 30 18 0,78 0,73 0,235

Наиболее оптимальным по селективности Ф™ и степени превращения Хи является способ гидроксиэтилирования ЭО в присутствие NaOH. Использование в качестве катализатора NaCl может быть предпочтительно только с позиции Ауд. Образцы, полученные с применением ЭХГ уступают по всем характеристикам образцам, синтезированным с помощью ЭО. Однако, для ГЭК со СЗ 0,5, как и для СЗ 0,4, использование ЭХГ может бьгть оправдано с точки зрения безопасности технологического процесса.

С целью получения фармацевтической субстанции ГЭК со СЗ 0,7 наиболее перспективна реакция в присутствии NaOH (таблица 11) из-за более высоких значений Ф™и А'^,, а также ввиду близких величии Aya-

Таблица 11

Сравнительные характеристики образцов ГЭК со СЗ 0.7

№ Шифр Тип АА Катали- Темпе- Время хм Ауд

образца затор ратура, "С реакции, ч

1 Образец 11 ЭО NaCl 40 15 0,91 0,65 0,224

2 Образец 21 ЭО NaOH 30 21 0,98 0,90 0,257

3.3. Метод определения тонкой структуры продуктов гидроксиэтилирования полисахаридов

Положение гидроксиэтильной группы в гшокопиранозном остатке существенно влияет на резистентность глюкозидной связи к амилолютческим ферментам. В этой связи, тонкая структура ГЭК напрямую определяет его устойчивость к расщеплению, тем самым,

обеспечивая его хровезамещающие свойства. Для установления тонкой структуры ГЭК нами был разработан комплексный метод. Согласно этому методу, ГЭК или другой полисахарид подвергался избыточному двух стадийному метилированию по свободным гидроксильным группам, последующему исчерпывающему кислотному гидролизу до соответствующих моносахаридов и ацетилированию гидроксильных групп, образующихся после гидролиза гликозидных связей. Полученную смесь модифицированных моносахаридов анализировали методом хромато-масс спектрометрии. Количественное соотношение полученных продуктов позволяло определить структуру исходного полимера.

Известные для полисахаридов способы метилирования не позволили получить полностью метилированный ГЭК. Поэтому избыточного метилирования удалось достичь лишь в случае двух стадийного процесса: на первой стадии проводили метилирование водного раствора ГЭК до С3~2 в присутствии КаОН, на второй - в растворе ДМФА в присутствии ЫаН, АА на обоих стадиях являлся СЩ. После каждой стадии проводили диализ реакционной массы для удаления низкомолекулярных примесей.

Последовательность модификации ГЭК и его расщепления до моносахаридов представлена на схеме:

л+науэуэу* 15,: -сн,, -(СН,СН,0).СН, И2: .СН,, ЧС^СН^СН, ^ -сн, -{сн^садсн,

Н,:-М. -<СНгСН30)„Н. ^-СН^СНгСНДОН, я,- -И, -СН, ЧСЬЦС^О^СН, Я,: -Ас, -СН,. ЧСНзС^О.СН,

-а-ШЗ!и, -НЕ-а-О-аи -Ме-а-СМЗи, -МЕ-НЕ-а-СН3111

Газовая хроматограмма смеси модифицированных моносахаридов приведена на рисунке 11.

Рис.11. Типичная газовая хроматограмма смеси модифицированных полисахаридов.

Отнесение пиков проводили с помощью масс-спекгроыетрии по характерным осколочным пикам при регистрации спектров в режиме электронного удара (70 эВ). На рисунке 12 приведен типичный масс-среетр одного из моносахаридов.

режиме электронного удара.

В таблице 12 представлены данные по расшифровке пиков газовой хроматограммы

смеси модифицированных полисахаридов.

Таблица 12

Расшифровка пиков газовой хроматограммы смеси модифицированных полисахаридов

Формула соединения Время удерживания мин Обозначение Формула соединения Время удерживания мин Обозначение

оси, 4,28 4,34 М1 ОСИ, 5,54 5,59 Мб

4,80 4,85 М2 5,84 5,91 М7

5,05 5,13 МЗ А 6,05 6,13 М8

5,19 5,24 М4 осн, 6,15 6,22 М9

5,50 5,58 М5 6,16 6,25 М10

С помощью данных таблицы 12, нами были выведены следующие формулы для расчета основных показателей характера распределения гидроксиэтильных групп в макромолекуле полисахарида:

Общая степень замещения - СЗ =

I

Степень замещения по С-2 - С32 Степень замещения по С-3 - СЗ, Степень замещения по С-6 Степень полизамещения -Степень разветвления -

(8)

2Л

Л»

СЗ = -

6 У;

/ . 'А/Г

1 (9) (Ю) (И)

где - интегральная интенсивность пиков Ш (см. таблицу 12)

II*

ГР

I'*

' 1'м

(12) (13)

По вышеуказанным формулам были определены показатели характера распределения гидроксиэтильных групп в макромолекулах ГЭК со СЗ 0,4 и 0,5, для образцов, полученных при оптимальных условиях, а также для образцов зарубежных аналогов. Все образцы, за исключением, ГЭК 130/0,4 характеризуются величиной молекулярной массы 200 кДа. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13

Характер распределения гидроксиэтильных групп в макромолекулах ГЭК со СЗ 0,4 и 0,5

Шифр образца СЗ С32 С33 С36 СЗподя СР

Обр. 9 (ЭО + ЫаС!) 0,409 0,310 0,023 0,029 0,047 0,051

Обр. 19 (ЭО +№ОН) 0,406 0,326 0,022 0,022 0,036 0,050

Обр. 23 (ЭХГ прямой способ) 0,409 0,315 0,023 0,024 0,047 0,051

ГЭК 130/0,4 «Серум Верк» (Германия) 0,404 0,305 0,023 0,029 0,047 0,051

Обр. 10 (ЭО +КаС1) 0,504 0,396 0,010 0,029 0,069 0,052

Обр. 20 (ЭО + КаОН) 0,506 0,414 0,021 0,027 0,044 0,050

Обр. 24 (ЭХГ прямой способ) 0,503 0,397 0,024 0,029 0,054 0,049

ГЭК 200/0,5 «Аджиномотофарм» (Япония) 0,509 0,404 0,024 0,028 0,053 0,048

На основании данных таблицы 13 можно сделать заключение о схожем характере распределения гидроксиэтильных групп в макромолекулах ГЭК между образцами с близкими СЗ. Однако, для образцов 19 и 20, полученных гидроксиэтилированием крахмала

этяленоксидом в присутствии NaOH, наблюдается наибольшая степень замещения по С-2, по сравнению с другими образцами, при этом доля полизамещенных остатков ниже. Такое распределение, вероятно, связано с высокой активностью катализатора и алкшгирующего агента.

Следует отметить, что в качестве исходного сырья для получения образцов ГЭК использовали обычный пищевой крахмал из кукурузы, который подвергали кислотному гидролизу с последующей очисткой от амилозы (см. раздел 3.1). Образцы зарубежных производителей по данным сопроводительной документации были изготовлены из кукурузного (ГЭК 200/0,5) и картофельного (ГЭК 130/0,4) крахмалов специальных сортов с высоким (не менее 95%) содержанием амилопектина. По данным таблицы 13, видно, что все образцы имеют близкие величины CP, что говорит о схожем строении исходного амилопектина, а также о возможности их использования для получения субстанции ГЭК.

3.4. Конформационный анализ макромолекул ГЭК

Уникальные свойства амилопектина, этого разветвленного неоднородного по структуре полисахарида, вызваны исключительно большим числом лабильных конформационных состояний, меняющихся за очень короткий промежуток времени из-за низких барьеров вращения глюкопиранозных остатков вокруг глюкозидных связей и связей С-О в гидроксильных группах, а также влиянием водородного связывания в межмолекулярном взаимодействии их цепей с окружающими молекулами воды. Указанное свойство амилопектина затрудняет распознавание его структуры антителами, обеспечивая его длительное пребывание в кровяном русле. Известно, что в случае мвогоэкстремальных молекул полисахаридов существенный вклад в относительную устойчивость конформеров вносит энтропийный фактор. Для оценки его влияния при введении гидроксиэтильных групп в молекулу амилопектина нами был проведен конформационный анализ фрагментов цепей ГЭК разного состава и строения в рамках аддитивной модели атом-атомных потенциальных функций (ААПФ).

Строгий расчет конформационной энтропии многоэкстремальных молекул моносахаридов с учетом статистического вклада каждого конформационного состояния — задача исключительно трудоемкая, а в случае олиго- и полисахаридов она сопряжена с практически непреодолимыми вычислительными трудностями. В рамках модели ААПФ нами были исследованы информационные состояния moho-, ди-, три-OMe-a-D-ппокопиранозидов и moho-, ди-, три-ОМе-О-гидроксиэтил-а-О-глюкопиранозидов при любых возможных способах замещения, которые являются наиболее простыми модельными соединениями, на которых можно проследить основные пространственные эффекты и

закономерности, связанные с замещением атомов водорода ОН-групп при построении макромолекул ГЭК. Для каждой модели было рассчитано число разрешенных конформационных состояний Ир (таблица 14).

Таблица 14

Число разрешенных конформационных состояний (Np) в moho-, ди-, три-OMe-a-D-глюкопиранозидах (I) и moho-, ди-, три-ОМе-О-гидроксиэтил-а-О-глюкопиранозидах (II)

Модель Тип фрагмента Np

l-OMe-a-D-глю Концевой незамещенный фрагмент 320

4-OMe-a-D-r.mo Первый незамещенный фрагмент 240

1,4-Ди-ОМе-а-О-глю Центральный незамещенный фрагмент 200

1,4,6-Три-ОМе-а-1>глю Центральный разветвленный незамещенный фрагмент 147

1,4-Ди-0Ме-2-ГЭ-а-0-глю Центральный замещенный фрагмент при С2 3528

1,4-Ди-ОМе-З-ГЭ-а-О-глю Центральный замещенный фрагмент при СЗ 3528

1,4-Ди-ОМе-б-ГЭ-а-О-глю Центральный замещенный фрагмент при С6 3150

1,4,6-Три-ОМе -2-ГЭ-а-О-глю Центральный разветвленный замещенный фрагмент при С2 2998

1 -ОМе-2-ГЭ-а-О-глю Концевой замещенный фрагмент при С2 5830

1-ОМе-3-ГЭ-а-Э-глю Концевой замещенный фрагмент при СЗ 4096

1 -ОМе-б-ГЭ-а-О-глю Концевой замещенный фрагмент при С6 4888

Рассматривая ротационные состояния соседних звеньев амилозы, амвлодекгинового крахмала и семейства ГЭК как независимые, исходя из адекватности ротационных запретов в указанных полисахаридах и в модельных соединениях - молекулах типа I и И, можно предсказать максимально возможное число конформеров в этих полисахаридах (Ы). Исходя из типа и степени разветвления, а также степени и характера замещения нами была выведена формула для расчета числа разрешенных конформационных состояний макромолекул амилозы, амилопеюгинового крахмала, его гидроксиэтильных производных:

*=ГКГ;2^ • • ГК^ • ^мГ' • дат • ^ (н)

, где: р - СР, q - СЗ, и - доля монозамещенных звеньев с разветвлениями, (1 - и) - доля незамещенных звеньев с разветвлениями, I - доля монозамещенных ¡-концевых звеньев, (1 - 0 - доля незамещенных ¡-концевых звеньев, п - общее число звеньев.

Поскольку подавляющая часть разрешенных конформеров имеет избыток энергии менее 1 ккал/моль, их можно считать равновероятными и с удовлетворительной точностью оценить энтропию смешения то формуле:

Я = Я-1пЛг (14)

По формулам 13 и 14 в пересчете на одно звено определены числа разрешенных конформационных состояний, удельные конформационные энтропии (п=1) амилозы и амилопектива с различными молекулярными массами (рис.13), а также ГЭК (рис.14) с различными величинами СЗ с учетом характера распределения групп, полученного с помощью данных метода хроматомасс-спектрометрии (раздел 3.3).

Рис.13 Влияние молекулярной массы амилозы и амилопектина на удельную величину конформационной энтропии

Из рис.13 видно, что при значении ММ крахмальных полисахаридов более 100 кДа (lgM=5) ее изменение практически не влияет на величину ¡>уД.

Рис.14 Влияние СЗ на удельную величину конформационной энтропии ГЭК

Рис.14 иллюстрирует тот факт, что при введении в молекулу амилопектина одной гидроксиэтильной группы на 2 остатка глюкозы имеет место увеличение удельной конформационной энтропии на 27%, что качественно характеризует улучшение объемозамещающих свойств ГЭК.

ГЛАВА 6. ПРИЛОЖЕНИЯ

6.1. Схема лабораторной установки для гидроксиэтвлирования крахмала в водном растворе

Представлены схема разработанной нами лабораторной установки для гидроксиэтилирования крахмала в водном растворе и описание технологического процесса получения ГЭК.

6.2. Отчет о доклинических испытаниях субстанции ГЭК 200/0,5

Представлен отчет о проведении доклинических испытаний образцов субстанции ГЭК

200/0,5, синтезированных на ОПУ по разработанной нами технологии.

изменение практически не влияет на величину ¡>уД.

35

30 --------

О 0.1 0,2 0.3 0.4 0.5 0,6 СЗ

Глава 4. ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные условия проведения реакции гидроксиэтилирования крахмала этиленоксидом и этиленхлоргидрином (мольное соотношение крахмал : алкилирующий агент, температура, природа и концентрация катализатора). Сформулированы условия реакции для получения гидроксиэтилированного крахмала с требуемой степенью замещения.

2. Предложен новый подход к количественной оценке степени превращения реагентов и их селективности в реакции гидроксиэтилирования крахмала на основе ЯМР 13С спектроскопии. Определены условия анализа молекулярно-массовых характеристик полученного полимера.

3. Показано, что для стандартизации гидроксиэтилированного крахмала, как основы лекарственных препаратов, может быть использован хромато-массспектрометрический метод исследования структуры продуктов полного кислотного гидролиза метилированного гидроксиэтил крахмала.

4. Для прогнозирования свойств субстанции разработан математический аппарат конформационяого анализа макромолекул олиго- и полисахаридов. Проведено сравнение значений конформационной энтропии для полисахаридов с различными величинами молекулярных масс и степеней превращения. Установлено, что увеличение степени гидроксиэтилирования приводит к росту конформационной энтропии.

5. Разработан технологический регламент получения субстанции гидроксиэтилированного крахмала и создана опытно-промышленная установка для получения субстанции гидроксиэтилированного крахмала. По данным доклинических испытаний, проведенных в Гематологическом научном центре РАМН, синтезированные продукты не уступают импортным аналогам и могут быть рекомендованы для создания отечественных кровезаменителей объемозамещающего действия и консервирующих растворов для органов и тканей.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Панов A.B., Травень В.Ф., Панов В.П. Конформационный анализ макромолекул гидроксиэтилировашюго крахмала // Хим.-фарм. журнал. - 2004. - Nal2. - С. 32-38.

2. Травепь В.Ф., Панов A.B., Долотов С.М. и др. Сравнительный анализ продуктов гидроксиэтклирования картофельного и кукурузного крахмалов, методами газожидкостной хроматографии и ЯМР 13С спектроскопии // Хим. растит, сырья,- 2009.- №3,- С. 57-61.

3. Панов A.B., Мотовилов Д.В., Дубровин В.И. Определение состава препаратов для парентерального и энтерального питания методом ЯМР 13С // Научная конференция «Современные проблемы энтерального и парен-терального питания»: Тез. докл. - Гомель ,

2002.-С. 77-78.

4. Панов A.B., Кирьянов H.A., Панов В.П. Плазмозаменители на оспове гидроксиэгшшрованого крахмала // V Съезд гематологов и трансфузиологов республики Беларусь «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии»: Тез. докл. — Мипск,

2003,- С. 387.

5. Panov А. V., Traven V.F., Modern technologies of production of highly effective biologically degradative blood substitutes // Aims for future of engineering science: Тез.докл. - Париж, 2004-C.l-2.

6. Панов A.B., Травень В.Ф., Долотов С.М., Еексаев С.Г. Получение субстанции гидроксиэтилированнош крахмала 200/0,5// Московская международная конференция "Биотехнология и Медицина»: Тез.докл. - Москва, 2006.- С. 235.

7. Панов В.П., Панов A.B., Коротаев Г.К., Кирьянов H.A. Долотов С.М. Лекарственное средство волемического действия и способ его получения // Патент РФ № 2245714,2005.

Подписано в печать:

26.10.2009

Заказ № 2840 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.ru

Введение

1. Литературный обзор.

1.1. Гидроксиэтилирование крахмала

1.2. Применение гидроксиэтилированных крахмалов

1.3. Способы получения гидроксиэтилированных крахмалов

1.4. Гидролиз гидроксиэтилированного крахмала

1.5. Определение величины молекулярной массы (ММ) и 23 молекулярно-массового распределения (ММР)

1.6. Анализ молярного замещения (МЗ) и степени замещения 28 (СЗ)

1.7. Анализ характера замещения

1.8. Синтез модельных соединений

2. Экспериментальная часть

2.1. Гидролиз крахмала

2.1.1. Определение степени гидролиза крахмала

2.1.2. Гидролиз крахмала различного происхождения в 47 водной суспензии

2.1.2.1. Определение зависимости ММ от времени 47 гидролиза в водной суспензии

2.1.2.2. Гидролиз крахмала до требуемой величины ММ в 48 водной суспензии

2.1.3. Гидролиз крахмала различного происхождения в 49 изопропаноле

2.1.3.1. Определение зависимости ММ от времени 49 гидролиза в изопропанольной суспензии

2.1.3.2. Гидролиз крахмала до требуемой величины ММ в 50 изопропанольной суспензии

2.2. Фракционирование обычного сорта пищевого крахмала с 50 целью очистки от амилозы

2.3. Гидроксиэтилирование крахмала различного 51 происхождения

2.3.1. Анализ реакционной смеси методом ЯМР 13С

2.3.2. Анализ интенсивности поглощения реакционной 53 массы

2.3.3. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в 53 присутствии №С

2.3.4. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в 54 присутствии ИаОН

2.3.5. Гидроксиэтилирование крахмала 55 этиленхлоргидрином в присутствии ИаОН прямым способом

2.3.6. Гидроксиэтилирование крахмала 56 этиленхлоргидрином в присутствии №ОН обратным способом

2.4. Анализ тонкой структуры продуктов гидроксиэтилирования полисахаридов

2.4.1. Условия проведения хроматографического анализа

2.4.2. Подготовка образцов к хроматографическому 58 анализу

2.4.2.1. Частичное метилирование ГЭК в воде

2.4.2.2. Исчерпывающее метилирование частично 58 метилированного ГЭК в диметилацетамиде

2.4.2.3. Полный гидролиз избыточно метилированного 59 ГЭК

2.4.2.4. Ацетилирование частично метилированных 59 производных глюкозы

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Основные стадии синтеза гидроксиэтилированного 60 крахмала

3.2. Изучение реакции гидроксиэтилирования крахмала

3.2.1. Метод количественной оценки параметров реакции 62 гидроксиэтилирования крахмала и характеристик полученных продуктов на основе спектроскопии ЯМР

3.2.1.1. Обоснование выбора критериев для оценки свойств 62 ГЭК и оптимальных условий проведения реакции гидроксиэтилирования

3.2.1.2. Обоснование выбора метода анализа для изучения 63 реакции гидроксиэтилирования крахмала

3.2.1.3. Анализ методом ЯМР 13С спектроскопии основных 66 характеристик ГЭК и параметров реакций его получения

3.2.1.4. Спектрофотометрический анализ реакционной массы 72 после гидроксиэтилирования крахмала

3.2.2. Влияние отдельных факторов на реакцию 73 гидроксиэтилирования крахмала

3.2.2.1. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в 73 присутствии хлорида натрия

3.2.2.1.1 Концентрация раствора крахмала

3.2.2.1.2 Концентрации катализатора хлорида натрия

3.2.2.1.3 Температура реакции

3.2.2.1.4 Соотношение реагентов - крахмал / этиленоксид

3.2.2.2. Гидроксиэтилирование крахмала этиленоксидом в 81 присутствии гидроксида натрия

3.2.2.2.1 Концентрация катализатора гидроксида натрия

3.2.2.2.2 Температура реакции

3.2.2.2.3 Определение оптимального соотношения реагентов 84 — крахмал / этиленоксид при щелочном катализе

3.2.2.3. Гидроксиэтилирование крахмала этиленхлоргид- 87 рином в присутствии гидроксида натрия

3.2.2.3.1 Прямой способ гидроксиэтилирования крахмала 89 этиленхлоргидрином

3.2.2.3.2 Обратный способ гидроксиэтилирования крахмала 92 этиленхлоргидрином

3.2.2.4. Сравнительный анализ методов синтеза ГЭК

3.2.2.4.1 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,

3.2.2.4.2 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,

3.2.2.4.3 Гидроксиэтилированный крахмал со СЗ = 0,

3.3. Метод определения тонкой структуры продуктов 99 гидроксиэтилирования полисахаридов

3.4. Конформационный анализ макромолекул ГЭК

3.4.1. Описание метода расчета числа конформационных 125 состояний

3.4.2. Результаты конформационного анализа

4. Выводы

История инфузионной терапии насчитывает уже более полутора веков. Возникновение данного метода связано с именем Лаудерера, который 10 июля 1881 г. впервые осуществил внутривенное введение физиологического раствора поваренной соли при лечении больного холерой.

В последствии, глобальные военные конфликты XX века стимулировали развитие инфузионно-трансфузионной терапии. Так, в годы Первой мировой войны Д.Хоган впервые описал использование синтетических коллоидных растворов на основе желатина (I поколение). Во время Второй мировой войны в клиническую практику были введены декстраны (II поколение). Несколько позже, в 1960-е годы были синтезированы плазмозаменители на основе гидроксиэтилированных крахмалов - ГЭК (III поколение)[1].

Следует отметить, что искусственные плазмозаменители различных типов имели как характерные преимущества, так и недостатки.

Представители первого поколения синтетических коллоидов отличались достаточно высокой гемодинамической эффективностью, однако данный эффект весьма кратковременен. Растворы на основе желатина быстро выводятся из циркулирующей внутрисосудистой жидкости через почки. Их применение ограничивается случаями дефицита объема циркулирующей крови (ОЦК) и при необходимости создания непродолжительного замещения объема [1,2].

Выраженность волемического действия низкомолекулярных декстранов превышает данный показатель всех используемых в клинике коллоидных растворов. Однако ряд недостатков делают их пользование в медицинской практике мало перспективным. Основная проблема при использовании в качестве объемозамещающих препаратов растворов на основе декстрана, кроме сравнительно высокой реактогенности, заключается в узком терапевтическом окне. Применение больших объемов растворов на 5 основе высокомолекулярного декстрана способствует нарушениям свертывающей системы крови (гипокоагуляции), приводит к возникновению «декстринового ожога почки». Любая передозировка растворами на основе декстрана чревата тяжелыми осложнениями, грозящими необратимыми последствиями: легочными проблемами, дегидратацией тканей, отказом почек вследствие повышения вязкости мочи, кровотечениями и повышением свертываемости крови в малых сосудах вследствие кумуляции высокомолекулярных фракций препарата в кровеносном русле и возрастания вязкости крови [1-3].

По спектру терапевтического действия и фармакологической активности растворы ГЭК перекрывают область применения «традиционных» плазмозамещающих растворов и лишены недостатков растворов на основе желатина и декстрана. Это привело к широкому внедрению в мировую медицинскую практику, особенно в области медицины катастроф плазмозамещающих растворов на основе ГЭК [2, 4].

В РФ повсеместному внедрению плазмозаменителей третьего поколения препятствует отсутствие отечественно производства субстанции ГЭК и растворов на ее основе. В связи с этим, работы, направленные на изучение реакции гидроксиэтилирования крахмала различного происхождения с целью создания отечественной фармацевтической субстанции являются актуальными.

Целью данной работы является изучение закономерностей реакции гидроксиэтилирования амилопектинового крахмала для получения фармацевтической субстанции гидроксиэтилированного крахмала из доступного отечественного сырья.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение эмбриотоксичности и тератогенности препарата «ГЭК 200/0,5, раствор для инфузий 6%» показало, что он в испытанной дозе 50 мл/кг при внутривенном введении беременным крысам с 1 по 19 день беременности не влияет на динамику массы тела подопытных животных, продолжительность беременности, количество живых эмбрионов, их массу и кранио-каудальный размер тела. В испытанной дозе препарат не вызывает каких-либо уродств или пороков развития и не влияет на развитие костного скелета эмбрионов и постнатальное развитие потомства. Следовательно, препарат не обладает эмбриотоксическими и тератогенными свойствами.

При ежедневном внутрижелудочном введении ГЭК 200/0,5 в дозе 50 мл/кг крысам-самцам в течение 10 недель и крысам-самкам в течение 2 недель не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию.

В испытанных дозах 2,5, 12,5 и 50 мл/кг и схемах введения ГЭК 200/0,5 не влияет на массу и клеточность лимфоидных органов мышей, на первичный иммунный ответ у мышей при иммунизации эритроцитами барана и на фагоцитарную активность нейтрофилов, следовательно, препарат не обладает иммунотоксическим действием.

Таким образом, при токсикологическом изучении препарата «Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5, раствор для инфузий 6 %» не установлено противопоказаний для проведения клинических испытаний препарата в рекомендуемых дозах 20-40 мл/кг.