Рентгеновская фокусирующая оптика в исследованиях строения биологических объектов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

А

На правах рукописи УДК 621.386

КОРНЕВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

РЕНТГЕНОВСКАЯ ФОКУСИРУЮЩАЯ ОПТИКА В ИССЛЕДОВАНИЯХ СТРОЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

01.04.01 - Техника физического эксперимента, физика приборов, автоматизация физических исследований

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

АВТОРЕФЕРАТ

ПУЩИНО - 1997

Работа выполнена в Институте биофизики клетки Российской Академии наук

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Брытов И.А. доктор технических наук Галль Р.Н. доктор технических наук Корнеев В.Н.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе РАН

Защита состоится " " Ы /0(1-Я 1997 г. в час.

на заседании диссертационного совета Д 003.53.02

при ИАП РАН (198103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д.26)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИАП РАН.

Автореферат разослан

/У » 1997 г.

Ученый секретарь

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Развитие молекулярной и клеточной биологии, а затем и биотехнологии базируется на познании структурных и структурно-функциональных взаимосвязей все более сложных биологических объектов (мышц, мембран, вирусов, ДНК, белков).

Среди широкого спектра прямых методов определения пространственного строения биообъектов выделяется метод рентгеноструктурного анализа, как один из наиболее информативных и высокоразрешающих.

Особенности биологических объектов (низкая рентгенорассеивающая способность, большие периоды идентичности, короткое время жизни под рентгеновским пучком) и необходимость выявления структурно-функциональных взаимосвязей в сложных, в том числе живых биосистемах, требуют разработки и применения техники рентгеновского эксперимента нового поколения.

Качественно новый уровень рентгеноструктурных исследований в настоящее время связывают с уникальными источниками рентгеновского излучения - синхротронами, оснащенными рентгенофокусирующими системами и высокочувствительными рентгеновскими детекторами. Однако чрезвычайно актуальной на этом фоне представляется разработка и применение подобного оснащения для широко распространенных лабораторных источников рентгеновского излучения. Это связано с тем, что решение огромного количество задач биологии как в науке, так и в промышленности происходит с использованием рентгеновских источников в лабораторных условиях, в том числе при осуществлении комплексных подходов с одновременным привлечением специалистов различных областей науки со всем арсеналом их методов и аппаратуры (биологов, физиков, биохимиков, физиологов и т.д.).

Разработке и созданию новых рентгенооптических фокусирующих систем для лабораторных источников рентгеновского излучения в применении к исследованию структуры и структурно-функциональных взаимосвязей конкретных биологических объектов посвящена данная работа.

Цель работы.

Целью настоящей работы было создание нового поколения рентгенооптических фокусирующих систем на основе зеркальной и дифракционной оптики для изучения широкого набора биологических объектов различного уровня структурной организации. Обеспечить их внедрение в практику изучения в лабораторных условиях структуры и структурно-функциональных взаимосвязей биологических объектов с различной структурной организацией, в частности: протяженных квазикристаллических объектов с большими периодами идентичности (мышца, пленки ДНК, биологические мембраны т.п.) и биологических кристаллов с большими периодами идентичности отличающихся как правило высокой мозаичностью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить оптимальные параметры рентгенофокусирующих систем (сходимость рентгеновского пучка, его удельную интенсивность, расстояние образец-детектор), предусматривая их" максимальную универсальность в применении к решению структурных задач;

определить основные принципы конструирования, материалы и оптимальные способы фокусировки рентгеновских лучей при создании рентгенофокусирующих систем необходимых качеств;

- разработать и систематизировать методики расчета конструктивных параметров, создаваемых на основе зеркальной и дифракционной оптики;

разработать (на основе зеркальной оптики) рентгенофокусирующие системы с переменным фокусным расстоянием, формирующие рентгеновский пучок высокой удельной интенсивности со сходимостью порядка 2-5 угловых минут с минимальными размерами фокального пятна, способными работать в автономном режиме и совместимыми с кинематическими устройствами типа камер Бюргера и Арнцта-Воннакота;

разработать (на основе дифракционной оптики) универсальные рентгенофокусирующие системы с переменным фокусным расстоянием, формирующие рентгеновский пучок высокой удельной интенсивности со сходимостью порядка 1-3°, с точечным фокальным пятном, совместимыми с кинематическими камерами;

опробировать разработанные рентгенофокусирующие системы, с их помощью исследовать ряд функционально значимых параметров сложных биологических объектов: -поперечно-полосатой мышцы в нативном состоянии, пленок ДНК, препаратов биологических мембран, биологических кристаллов высокой мозаичности при больших периодах идентичности.

Научная новизна.

В ходе работы:

обоснованы способы фокусировки рентгеновского излучения и подобраны необходимые материалы, применимые при создании рентгенофокусирующих систем для исследования сложных биологических объектов, позволившие оптимизировать технические характеристики разрабатываемых

ренттенооптических фокусирующих систем;

- разработаны и систематизированы методики расчета конструктивных параметров рентгенофокусирующих систем, создаваемых на основе зеркальной и дифракционной оптики, в том числе:

а) зеркальных рентгенофокусирующих систем, построенных на основе поверхностей второго порядка:

- эллипсоида вращения;

- коаксиально расположенных гиперболоида и эллипсоида;

- двух коаксиально расположенных параболоидов.

б) на основе двух и четырех упругодеформируемых цилиндрических зеркал;

в) на основе дифракционной оптики, содержащей упругодеформированные кристаллы-монохроматоры с переменным сечением;

- разработаны алгоритмы расчета хода действительных лучей для каждого варианта применения рентгенофокусирующей оптики. Создано соответствующее программное обеспечение для ЭВМ, позволяющее рассчитать ход множества действительных лучей с индивидуальными коэффициентами отражения от фокусирующей поверхности и на этой основе сделать сравнительные оценки качеств фокусирующих систем;

- впервые создано и испытано семейство систем точечной фокусировки рентгеновского пучка, построенных. на основе четырех попарно взаимно перпендикулярных зеркал, формирующих сходящийся рентгеновский пучок высокой удельной интенсивности при минимальных аберрациях и

размерах в фокальной плоскости. Системы могут перестраиваться на любое расстояние образец-детектор, обеспечивая при этом сходимость сфокусированного пучка в пределах 2-10 угловых минут,

- впервые построена и применена в эксперименте ренттенофокусирующая система на основе двух последовательно расположенных взаимно перпендикулярных монохроматоров, позволяющая обеспечивать оптимальное направление сфокусированного пучка и плавно менять фокусное расстояние, обеспечивая сходимость сфокусированного пучка 1-4°,

- с применением рентгенофокусирующих систем получены рентгенограммы высокого разрешения от образцов нативной мышцы в различных физиологических состояниях, позволившие обнаружить не регистрируемые ранее меридиональные рефлексы. Анализ рентгенограмм высокого разрешения позволил предложить и обосновать модель, описывающую упаковку белков миозиновой и немиозиновой природы толстых нитей скелетных мышц.

Практическая ценность.

Практическая ценность работы состоит в следующем: -разработаны и систематизированы методики расчета различных типов рентгеновских фокусирующих систем, для работы с биологическими объектами;

- создан пакет программ, позволяющий рассчитывать ход действительных лучей в рентгенофокусирующей системе и на основе расчетов делать сравнительные оценки качества фокусировки;

- предложена рентгеноопти ческая схема четырехзеркальной фокусирующей системы, позволяющая сочетать достоинства тороидально-эллиптической и двухзеркальной рентгенофокусирующих систем;

разработаны достаточно простые в изготовлении конструкции рентгенофокусирующих систем, с четырьмя попарно взаимно перпендикулярными упругодеформированными зеркалами. В конструкциях применялись два способа изгиба зеркал: традиционный - с симметричной схемой нагружения зеркал и с помощью консольного закрепления зеркал, нагруженных сосредоточенной нагрузкой в крайнем сечении;

разработана конструкция и изготовлена рентгенофокусирующая система с двумя последовательными взаимно перпендикулярными кристаллами-монохроматорами.

Система позволяет использовать различные кристаллы-монохроматоры и обеспечивать оптимальное направление сфокусированного рентгеновского пучка;

- создан комплекс рентгеновского анализа, в котором рентгеновская фокусирующая система монохроматор-монохроматор сопряжена с камерой рентгеновской универсальной. Комплекс позволяет получать трехмерный дифракционный набор от кристаллов биологических объектов с большими периодами идентичности в сходящемся пучке как по схеме Бюргера, так и по схеме Арндта-Воннакота без переюстировки кристалла;

- С применением разработанных рентгенофокусирующих систем нами получены рентгенограммы высокого разрешения от поперечно-полосатых мышц в различных физиологических состояниях. На рентгенограммах впервые определены положения целого ряда рефлексов. Полученный экспериментальный материал послужил основой создания модели распределения белков миозиновой и немиозиновой природы в толстых нитях поперечно-полосатой мышцы.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, четырех разделов, заключения, списка литературы и приложения. Она изложена на 254 страницах, содержит 81 рисунок и 13 таблиц, список цитируемой литературы состоит из 149 наименований.

Апробация работы.

Основные результаты работы докладывались на: VII International Biophysics congress & PAN-American Biochemistry congress, Mexico, 1981; 1-м Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982 г.; Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия мышечного сокращения", Тбилиси, 1983 г.; IUPAC 14th International Simposium on the chemistiy of natural products. Posnan, Poland, 1984; V Всесоюзной конференции по биохимии мышц, Телави, 1985 г.; VIII Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, 1987 г.; Twelfth European Ciystallographic Meeting, Moscow, 1989; International Union of Crystallography XVII Congress & General Assembly, Seattle Washington, USA, 1996.

Благодарности.

Автор признателен сотрудникам лаборатории биофизики мышечного сокращения Института биофизики АН СССР за большую помощь в работе и биофизики нервной клетки

Института биофизики клетки РАН за поддержку и доброжелательную атмосферу. Особенная признательность ведущему научному сотруднику Института кристаллографии РАН Михайлову Альберту Михайловичу, к полезным консультациям которого автор прибегал на всем протяжении выполнения данной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи работы, приводится научная новизна, практическая ценность работы. Определено место данной диссертации в области применения рентгеновского анализа для определения структур и структурно-функциональных взаимосвязей сложных биологических систем.

Первые раздел посвящен литературно-аналитическому обзору, состоящему из двух частей. В первой части рассмотрены, физические основы рентгеновской фокусирующей оптики, свойства материалов зеркал и монохроматоров, особенности отражения рентгеновских лучей зеркальными поверхностями и монокристаллами, спектральное разрешение, роль качества отражающей поверхности, методы получения

рентгенооптических поверхностей, способы фокусировки рентгеновского пучка, аберрации рентгенофокусирующих систем, конструктивные особенности существующих рентгенофокусирующих систем, сферы и способы их применения, достоинства и недостатки отдельных рентгенофокусирующих систем. Вторая часть посвящена описанию структурно-функциональной организации поперечнополосатой мышцы как основного объекта исследований.

Рентгенофокусирующие системы (по признаку физических явлений лежащих в их основе) делятся на два направления: зеркальной и дифракционной рентгеновской оптики. Первое основано на эффекте полного внешнего отражения рентгеновских лучей от зеркальной поверхности под очень острыми углами. Характер взаимодействия ренттеновского излучения с зеркальной поверхностью описывается величиной показателя преломления п ,которая может быть представлена через параметры материала отражающей поверхности в виде:

п=1-5-ф, здесь (1-5) - действительная компонента показателя преломления. Она характеризует изменение фазы рентгеновского

луча при прохождении его через вещество. Параметр 8 обычно называют параметром уменьшения показателя преломления и представляют следующим соотношением:

Я

е2Я2

о -

2 лт с

и + Е * н

я н

я и

1

где е - заряд электрона, т - масса электрона, с - скорость света в вакууме, X - длина волны излучения, N - электронная плотность, ).ц - и - длина волны и электронная плотность, соответствующие краю полосы поглощения материала зеркала. Абсолютное значение величины § очень мало и равно ~10~5.

(3 -мнимая компонента п. Она отображает степень поглощения излучения веществом и может быть представлена в виде:

л

(3 = -— , где - линейный коэффициент поглощения. При

4 к

работе вне края полосы поглощения, с использованием обычного для биологических объектов набора длин волн рентгеновского излучения и материалов зеркал (линейный коэффициент поглощения мал), мнимая компонента принимается равной нулю ((5=0). При падении рентгеновских лучей на поверхность зеркала (Рзеркала > Рвоздуха) при определенных условиях падения должен наблюдаться эффект полного внешнего отражения. Для каждого материала существует критический (предельный) угол скользящего падения 0К, когда рентгеновские лучи падающие на поверхность зеркала под углами 6 < 6К, претерпевают полное внешнее отражение. Величину критического угла скользящего падения можно определить из выражения:

ъ\ъ6 к « вк = >/21 * 1.6 • 1 О"3

Обычно в структурном анализе величина 8К составляет не более 50 угловых минут.

Дифракционная рентгеновская оптика основана на том, что большинство монокристаллов имеют межатомные расстояния собственной кристаллической структуры одного порядка с длиной волны рентгеновского излучения, поэтому они служат хорошими дифракционными решетками для рентгеновских лучей.

Направление монохроматического пучка согласуется с длиной волны ренттеновского излучения уравнением Вульфа-Брэгга

2d sin 9 = nX, где X - длина волны рентгеновского излучения, 8 - угол падения на поверхность кристалла-монохроматора, d -межплоскостное расстояние кристалла. Фокусировка определяется формой, придаваемой поверхности кристалла-монохроматора'.

В практике рентгеновского анализа биологических объектов, как правило, применяются два типа фокусирующих систем, использующих рентгеновскую зеркальную оптику: фокусирующая система с отражающей зеркальной поверхностью в виде эллипсоидального "тороида" и система с двумя взаимно перпендикулярными зеркалами, изогнутыми по цилиндрической поверхности.

Эллиот разработал технологию и изготовил полое тороидальное эллиптическое зеркало с золотым покрытием для С и ка - излучения (1=1.54 А, вК - 30', Rj=20 м, R2=1.5 мм;

расстояние источник-фокус 34.6 см). Однако, эти системы имеют большие геометрические аберрации из-за несовершенства своей реальной формы. Для ослабления влияния аберраций на качество дифракционной картины при формировании сфокусированного рентгеновского пучка используют набор диафрагм и экранов (стопоров).

Взаимное расположение всех элементов, формирующих рентгеновский пучок, строго фиксированное, поскольку тороидально-эллиптическое зеркало изготавливается для строго определенного межфокального расстояния, в одном фокусе которого размещается источник рентгеновского излучения, а в другом - рентгеновская пленка или детектор. Параметры фокусирующего зеркала и характеристики источника рентгеновского излучения определяют форму, размеры и положение пучок формирующих элементов (дшфрагм, экранов-стопоров).

Альтернативную систему с фокусирующей зеркальной оптикой предложил Франке. В ней используются два взаимно перпендикулярных зеркала, изогнутых по эллиптической поверхности каждое из которых фокусирует рентгеновские лучи в линию. Последовательное отражение от двух взаимно перпендикулярных изогнутых зеркал фокусирует рентгеновский пучок в точку.

Каждая из этих рентгенофокусирующих систем имеет свои достоинства и недостатки. Система с тороидально-

эллиптическим зеркалом формирует рентгеновский пучок большей удельной интенсивности за счет большей угловой апертуры. Угловая апертура полутороида длиной 10 см с золотой отражающей поверхностью составляет при межфокальном

расстоянии 34.6 см, 1.4x10"4 стерадиан для С -излучения, в

то время как для системы из двух взаимно перпендикулярных позолоченных зеркал длиной 6 см каждое и межфокальным расстоянием 40 см она составляет - 7.5х10"6 стерадиан. Однако, имея большую удельную интенсивность сфокусированного рентгеновского пучка, система с эллиптическим зеркалом проигрывает в качестве фокуса, позволяя добиться разрешения по периоду лишь 300 А, тогда как система с двумя взаимно перпендикулярными зеркалами - 1000 А. Последняя обладает еще одним преимуществом - она позволяет довольно просто перестраивать фокусирующую систему на различные межфокальные расстояния за счет изгиба плоских рентгеновских зеркал по цилиндрической поверхности разного радиуса кривизны, в то время как тороидально-эллиптическое зеркало не обладает мобильностью настройки и для каждого межфокального расстояния требуется изготовление такого отдельного зеркала.

Далее описаны два вида рентгенофокусируюгцих систем, использующих дифракционную оптику: "дважды изошутый" монохроматор и схема монохроматор-монохроматор, состоящая из двух последовательных взаимно перпендикулярных монохроматоров.

Геометрия "дважды изогнутого" рентгеновского монохроматора с точечной фокусировкой идеальна, когда отражающие плоскости кристалла изогнуты так, чтобы получались кофокальные эллипсоиды вращения с источником рентгеновских лучей и его изображением в фокусе. Соотношение радиусов кривизны отражающей поверхности монохроматора в двух взаимно перпендикулярных направлениях должно удовлетворять выражению: = Л] апФ. Наилучшая

интенсивность и монохроматичность достигается при равноплечной схеме фокусировки, когда расстояния источник-монохроматор и монохроматор-фокус равны между собой и равны Л] бцА).

Применение "дважды изогнутого" рентгенофокусирующего монохроматора для исследования биологических объектов ограничено техническими возможностями вышлифовывания

радиуса К] (порядка 3-5 метров при длине изделия 60-80 мм). Сложности применения схемы с последовательным отражением от двух взаимно перпендикулярных кристаллов-монохроматоров заключается в том, что после каждого отражения от кристалла рентгеновский луч поворачивается на угол 29 в плоскости перпендикулярной поверхности изгиба кристалла-монохроматора. Таким образом сфокусированный пучок последовательно повернется на угол 20 в двух взаимно перпендикулярных направлениях, причем угол 29- составляет обычно несколько десятков градусов. Это создает трудности пространственного размещения образца, регистрирующего устройства и вакуумирования пути рентгеновских лучей при работе в лабораторных условиях с применением генераторов с вращающимся анодом, когда расстояние образец-детектор порядка 1 метр и более.

В качестве основного модельного объекта исследований была избрала поперечно-полосатая мышца, являющаяся одним из наиболее ярких представителей биологических систем, как с точки зрения функциональной значимости, так и с точки зрения сложного иерархического построения пространственного ансамбля, составленного целым рядом структур.

Myofibril

и

j

.О.О.А мое

• NK-рм ООО

ф—w* J ® ©

е

о • с

Рис.1. А - уровни структурной организации типичной поперечно-полосатой скелетной мышцы позвоночных; Б -схематическое изображение общего представления о структурах и их взаимном расположении в саркомере поперечно-полосатых мышц позвоночных (Squire, 1982).

На рис. 1 показано иерархическое построение целой скелетной мышцы позвоночных, состоящей из большого числа клеток или волокон часто в пределах 20-100 мкм в поперечнике. Каждое из волокон образовано пучком цилиндрических миофибрилл около 1-2 мкм в диаметре. Волокна в мышце соединены вместе при помощи коллагеновой соединительной ткани, которая также образует сухожилия на концах мышцы, присоединяющие ее к скелету. На световом микроскопе миофибриллы выглядят как чередующиеся светлые и темные полосы. Темные полосы называют А-диском (полосой) (Анизотропный диск), светлые полосы I-диском (полосой) (Изотропный диск). В центре 1-диска можно видеть темную линию, называемую Z-полосой (Zwischenscheibe). Саркомер определяется как повторяющаяся ячейка между соседними Z-полосами вдоль миофибриллы, его длина в пределах 2-3 мкм в зависимости от степени сокращения скелетной мышцы. Другой характерной особенностью миофибриллы считается менее темная область в центре А-диска, называемая Н-зоной.

Центральная область саркомера (рис. 16) состоит из миозинсодержащих нитей, упакованных бок о бок и

формирующих А-диск. Эти нити механически соединены в их центрах через структуры, называемые М-полосой. Каждый конец толстых нитей отделен от другого промежутками, которые заполнены упорядочений упакованными тонкими актинсодержащими нитями. Тонкие нити проходят сквозь Z-диск, шарнирно соединяясь с его структурами, и образуют регулярную упаковку (построение) тонких нитей в последующем саркомере, подобную построению в предыдущем.

Следующий уровень структурной организации мышцы соотносится непосредственно со структурой толстых и тонких нитей на уровне взаимодействия которых и происходит единичный акт мышечного сокращения. Основная структурная составляющая тонкой или актиновой нити - двухтяжевая спираль Б-актина, построенная из глобул О-актина. Внутри желобка двухтяжевой актиновой спирали проходит тропомиозиновый тяж на всю длину тонкой нити. На актиновой спирали с периодически располагаются комплексы из трех регуляторных глобулярных белков тропонинов (С, I, Т-тропонины). Толстая нить построена из "длиннохвостых" молекул и представляет собой спиралеобразную структуру в виде цилиндра, выполненную легким меромиозином. Другая часть миозиновых молекул - тяжелый меромиозин выступает за пределы цилиндрического тела толстой нити и образует регулярно расположенные мостики, которые, взаимодействуя с тонкими нитями, осуществляют единичные акты мышечного сокращения. На теле толстых нитей в районе Н-зоны периодически расположены минорные белки, точная природа и локализация которых не до конца ясна. Из-за широкого диапазона периодичности структур составляющих мышцу (от микрон до ангстрем), она представляет собой и классический пример с точки зрения взаимодействия различных методов при изучении ее структуры - светорассеяние, электронная микроскопия, трехмерная реконструкция, рентгеноструктурный анализ, исследующий мышечные структуры как в кристаллическом, так и в нативном состоянии, где чрезвычайно продуктивно применение решгенофокусирующей оптики.

Биологические объекты весьма разнообразны по своим качествам, размерам и форме, поэтому по результатам обзора определены необходимые сочетания материалов и способов фокусировки для создания набора решгенофокусирующей аппаратуры оптимизирующей рентгеновский эксперимент п и

решении структурных задач в применении к различным биологическим объектам.

Второй раздел посвящен разработке методов расчета конструктивных параметров рентгенофокусирующих систем.

В рамках создания единого подхода к разработке рентгенофокусирующих устройств для работы с биологическими объектами разработаны основы теории их расчета, включающие в себя методики расчета конструктивных параметров зеркальных фокусирующих устройств, на основе поверхностей второго порядка (эллипсоида вращения, коаксиально расположенных гиперболоида и эллипсоида, двух коаксиально расположенных параболоидов) (рис.2), а также методики математического моделирования фокусирующих систем, состоящих из двух и четырех упругодеформированных цилиндрических зеркал и упругодеформированного монохроматора с переменным поперечным сечением.

а. Эллиптический тороид

б. Гиперболический и эллиптический тороиды

в. Два параболических тороида

Рис.2. Схематическое представление фокусирующих систем на основе зеркальной оптики.

Цилиндрическое зеркало с внутренней эллиптической поверхностью

Источник Б, имеющий размеры Н3хВ8, и приемник II рентгеновского излучения расположены в оптически сопряженных фокальных точках эллипсоида. Линейное увеличение системы £> для этой пары точек равно 1. Сферическая аберрация отсутствует, однако кома может достигать значительных величин. После определения расстояния между источником и приемником рентгеновского излучения, задавшись длиной волны X рентгеновского излучения и плотностью р материала отражающей поверхности зеркала, определяем критический угол полного внешнего отражения 8К. Одиночные осесимметричные зеркала обладают значительными аберрациями и практически не могут быть использованы для получения изображения, однако обеспечивают большую по сравнению с двух и четырехзеркальными системами апертуру и полностью свободны от астигматизма. В то же время весьма существенны аберрации децентрировки, связанные с большим расстоянием точек отражения от оптической оси. Зависимость линейного увеличения £ от аппликаты г\ точки отражения приводит к возникновению комы первого порядка

Р>

аЕ

Кому первого порядка характеризуем величиной ДГ = Гтах -1'тш, где 1'к = 1 |}к

Максимальное увеличение |}тах соответствует точкам с аппликатами ги а минимальное ¡Ь^ - точкам с аппликатами таким образом величину АГ для конкретного зеркала можно определить по формуле:

АГ = /:

• Ь5_я +аЕ + /и)• ¿¿.я + (г, + 1т)2 + яй

4в

Обычный для оптики нормального падения расчет аберрации методом производных от функции оптического пути в применении к рентгенофокусирующим зеркалам может давать большую погрешность, поскольку они имеют большое отличие в величинах геометрической и эффективной апертуры из-за резкой зависимости коэффициента отражения Л от угла скольжения 6. Поэтому целесообразнее использовать более точный расчет на

ЭВМ хода множества лучей с учетом реальных коэффициентов отражения для каждого луча при прохождении его через систему. Оценка качества фокусировки в методе хода лучей основана на построении двумерного распределения интенсивности в фокальной плоскости системы, которое дает расчет большого количества лучей заполняющих апертуру системы.

Распределение энергии в изображении внеосевой точки имеет вид кольца, радиус которого зависит от аппликаты ъ^ точки падения луча. Возникновение аберраций краевой зоны связано с тем, что лучи, падающие на поверхность эллиптического зеркала в разных точках окружности, появляющейся в сечении эллипсоида плоскостью перпендикулярной оптической оси, образуют с касательными к поверхности в этих точках различные углы падения е^. Расчеты показывают оптимальность (с точки зрения минимизации аберраций) симметричной схемы расположения зеркала.

Фокусирующая система, состоящая из гиперболоида и эллипсоида

Рентгенофокусирующая система, состоящая из двух коаксиальных отражающих поверхностей второго порядка (1-ая поверхность гиперболоид, 2-ая-эллипсоид), в сопряженных фокусах которых находятся центры источника Б и приемника Л и конструктивно выполнена в виде двух отдельных полых цилиндрических зеркал, установленных с возможностью взаимного перемещения друг относительно друга на одном основании, что облегчает его изготовление и последующую юстировку (рис.3).

Первое зеркало представляет собой часть положительной полости двуполостного гиперболоида. Второе зеркало - часть эллипсоида, ограниченного двумя плоскостями. В фокальной точке Сн гиперболоида находится центр фокального пятна источника 8 рентгеновского излучения, в фокусе С'н строится мнимое увеличенное изображение источника, фокус С'н гиперболоида и фокус Се эллипсоида совпадают, центр приемника II совпадает со второй фокальной точкой С'е эллипсоида, в которой строится действительное изображение источника. Для обеспечения максимальной апертуры при расчете параметров зеркал, зеркало устанавливается на минимально возможное расстояние Б] от источника. Наибольший угол 0 между касательной и падающим на первое зеркало лучом

образуется в точке Мщ. После отражения от первого зеркала луч падает на второе зеркало в точке Мег. Для достижения максимальной отражающей способности по всей длине зеркал в точках Мщ и Ми- соответствующие углы скольжения б не должны превышать критический угол ек.

ис

№

МНГМБ=М1

ИЭлтчения

Вид I

Масштаб

по оси У 40:1 по оси 2 1:2

Рис.3. Фокусирующая система, состоящая из гиперболоида и эллипсоида.

Расчет хода лучей через такую фокусирующую систему показывает, что она имеет значительно меньшие аберрации, чем одиночное эллиптическое зеркало. Система гиперболоид-эллипсоид позволяет получить большую апертуру и более равномерное распределение энергии в изображении источника при неравноплечной схеме, то есть минимизации расстояния источник-зеркало и увеличении расстояния зеркало-приемник. Необходимо отметить сложности юстировки такой системы из-за высоких требований к соосности зеркал.

Фокусирующая система из двух коаксиальных параболоидов В фокусе первого из них находится центр источника Б, а в фокусе другого - центр приемника излучения II. Определяем расстояние от выходного торца второго параболического зеркала до центра приемника рентгеновского излучения

~ ^с-я + > где ^с-я И А'т2-с соответственно

расстояния от исследуемого объекта до приемника и от второго параболоида до объекта и по эмпирической формуле определяем расстояние между центрами источника и приемника рентгеновского излучения Ьв_я = 2А-Ьт2_к,

Расчеты показали, что оптимальный с точки зрения аберраций вариант расположения зеркал тогда, когда граница пересечения двух профилей должна пересекать оптическую ось системы в точке, совпадающей с центром симметрии системы, то есть при симметричном расположении зеркал между источником и приемником рентгеновского излучения.

Определение параметров параболоидов осуществляется следующим образом. По разности величин Ьт2-11 и определяем сумму длин зеркал: 1т1 + 1т2 = Ьд-я - Задаемся

в первом приближении длиной первого зеркала 1т1. Определяем расстояние = 0.5 - 1аХ .

Связь между фокальным параметром Р1 первого параболоида и расстоянием выражается уравнением:

ап^рр^+ 0.5 = агс^/рр^ + 0.5 • />,)) + 0к

После определения р1 рассчитываем величину фокального параметра р2 второго параболоида:

Т _ _ /

После определения параметров обоих параболоидов и их взаимного расположения определяем углы <аи, со а в меридиональной плоскости, образуемые соответственно верхним и нижним полевыми лучами с оптической осью системы. Определяем

наружный ОрЕй и внутренний Е)р|П[ диаметры входного зрачка системы:

Орш = 2 (в, + вр) 1ё <ои

0Р1п1 = 2(81 + 8р)18©<1

Расчет хода лучей через систему параболоид-параболоид показывает, что такая система позволяет получить большую апертуру и более равномерное распределение энергии в изображении источника только при симметричной установке зеркал. Принимая во внимание сложность изготовления и юстировки такой системы ее применение можно рекомендовать только тогда, когда исследуются структуры с очень большими

периодами идентичности (несколько тысяч ангстрем), то есть когда предъявляются особенно жесткие требования к качеству сформированного пучка.

Таким образом, анализ возможностей рассмотренных рентгенофокусирующих систем показывает оптимальность применения системы гиперболоид-эллипсоид в случае необходимости получения качественной рентгенограммы от объекта с большими (более 1000 А) периодами идентичности и системы с одиночным эллипсоидальным зеркалом для хорошо структурированных объектов с периодом идентичности до 300 А.

Рентгенофокусирующая система из двух взаимно перпендикулярных упругоизогнутых зеркал

Достоинства этой системы заложены в требованиях к схеме нагружения зеркал, которые можно сформулировать так:

- простота конструкции, реализующей схему нагружения;

- возможность перенастраивать фокусирующую систему на различные расстояния между источником и приемником излучения Ь$-к;

- минимизация у зеркал сечений, в которых концентрируются внутренние напряжения;

- наличие в схеме независимо действующих устройств, позволяющих изменять форму зеркала.

а) Симметричная

схема нагружения

6) Асиннетричкал

схема нагружения

19 Y

M(z)

в) Консольная схема нагружения

Рис.4. Схемы нагружения фокусирующих элементов.

Для определения оптических свойств упругодеформированных зеркал необходимо получить уравнения их упругой линии у = y(z) и уравнения для определения угла поворота поперечного сечения 0 = 9(z). Искомые уравнения получаются из известного дифференциального уравнения упругой линии.

«••'(O^f = «(х).

где Е - модуль упругости материала, из которого изготовлено зеркало (н/м2); J(z) - момент инерции поперечного сечения (м4); M(z) - результирующий изгибающий момент всех сил в сечении z (нм).

Оценку качества сопряжения профиля деформированного зеркала с поверхностью эллиптического цилиндра можно осуществлять методом наименьших квадратов. Могут быть выбраны и другие критерии оптимизации, например, минимум суммы аберраций (с учетом того, что эллиптическая поверхность не оптимальна в отношении геометрических аберраций). Независимо от выбранного критерия необходимо определить исходные значения независимых переменных, от которых зависит профиль деформированных зеркал.

Расчеты показали, что наиболее точное сопряжение профиля деформированного зеркала с поверхностью эллиптического цилиндра возможно в случае нагружения зеркала двумя различными по величине сосредоточенными нагрузками. То есть, наиболее часто применяемая в практике рентгеноструктурного анализа симметричная схема нагружения зеркал не оптимальна с точки зрения возможности инструментальной коррекции

аберраций путем управления профилем деформированного зеркала. Оптимальной в плане простоты конструкции и чувствительности к управляющим воздействиям представляется схема консольного закрепления зеркала, нагруженного сосредоточенной нагрузкой в крайнем сечении.

Четырехзеркальная рентгенофокусирующая система Предложенная нами система содержит четыре -упруго изогнутых зеркала, попарно расположенных во взаимно перпендикулярных плоскостях (рис.5).

Рис.5. Схематическое представление четырехзеркальной ренттенофокусирующей системы.

Расчеты параметров такой системы осуществляются практически аналогично расчету двухзеркальной системы. Они показали необходимость разворота второй пары зеркал относительно друг друга, что привело бы к значительному усложнению конструкций системы. Для оценки важности разворота зеркал были проведены расчеты двух четырехзеркальных систем. В первой системе зеркала второй пары были развернуты относительно друг друга на необходимые углы, а во второй - нет. Аберрации в обеих системах практически не отличаются в пределах предельного критического угла 1°-Предельный критический угол для всех возможных материалов покрытий зеркал и для длин волн рентгеновского излучения, используемых в исследованиях биологических объектов, не превышает обычно 1°. Таким образом при конструировании четырехзеркальных систем можно совмещать продольные оси

Приемвих

двух эллипсов без ухудшения аберрационных характеристик системы.

Упругодеформированный рентгенофокусирующий элемент с переменным моментом инерции сечения

Каждый рентгенофокусирующий элемент может быть выполнен в виде плоскопараллельной пластинки толщиной 11, имеющей переменную ширину Ь=Ь(2щ)- Зависимость ширины Ь от аппликаты гт выражается системой уравнений, получаемых из условий оптической фокусировки. Рассмотрен случай изгиба кристалла-монохроматора по логарифмической спирали. Составлена программа на ЭВМ для проверки сопряжения профиля деформированного кристалла-монохроматора с боковой поверхностью цилиндра, в основании которого лежит логарифмическая спираль. Было проведено сравнение погрешности сопряжения для монохроматора де Вольфа имеющего постоянную ширину и нагруженного двумя независимыми сосредоточенными нагрузками и монохроматора с переменной шириной. Монохроматор, имеющий переменный момент инерции 1(г) сечения, дает возможность добиться лучшей фокусировки излучения.

Третий раздел посвящен описанию разработанных оригинальных конструкций рентгенофокусирующих систем.

На основе зеркальной оптики впервые разработана система, объединяющая достоинства рентгенофокусирующих систем с тороидальным и с двумя взаимно перпендикулярными зеркалами. Величина фокального пятна остается практически такой же как и в случае двух взаимно перпендикулярных зеркал, а интенсивность сфокусированного пучка приближается к интенсивности пучка, сформированного эллипсоидально-тороидальным зеркалом" (рис.6).

Сочетание вышеуказанных свойств фокусирующей системы обеспечивается применением четырех, попарно взаимно перпендикулярных зеркал. Конструктивно система представляет собой набор функциональных блоков, расположенных на общей оптической скамье.

Первым элементом системы, формирующим пучок, служит блок горизонтальных щелей, зазор между которыми и определяет апертуру входящего в фокусирующую систему первичного пучка.

"О

к

Рис.6. Вид денсито-грамм характерного для пера серебристой чайки рефлекса (23.4 А), а -при одинаковой экспозиции при использовании в качестве рентге-нофокусирующего устройства торроидального зеркала с золотым покрытием, б - четырех-зеркальной системы с никелевым покрытием, в - двухзеркальной системы с никелевым покрытием. Значения интенсивности здесь относятся как 1а:1б:1в=3.4:3:1, а полуширины пиков - аа:аб:ав=2.46:1.23:1.

V

Далее на скамье располагается блок горизонтальных зеркал, который выполнен в виде двух симметричных частей, каждая из которых снабжена микрометрическим винтом и подвижными опорами для изгиба зеркал (рис.7).

Рис.7. Схематическое представление четырехзеркальной фокусирующей системы с симметричным нагружением зеркал.

Блок смонтирован на платформе, регулирующей его перемещения в трех взаимно перпендикулярных направлениях относительно направления распространения первичного пучка. Вслед за блоком горизонтальных зеркал располагается блок зеркал вертикальных, конструктивно выполненный так же как предыдущий. Окончательное формирование сфокусированного рентгеновского пучка осуществляется набором горизонтальных и вертикальных щелей, размещенном на оптической скамье за блоком горизонтальных зеркал.

шя

12"

о IДI 0

& 11 0

Рис.8. Схематическое представление четырехзеркальной фокусирующей системы с консольным закреплением зеркал.

Положительный опыт использования четырехзеркальных систем создал предпосылки для дальнейшего развития этого

направления. Нами была разработана четырехзеркальная фокусирующая система с консольным закреплением зеркал (рис.8), позволившая еще на 20% увеличить концентрацию энергии в изображении источника по сравнению с предыдущей системой.

Таким образом, рентгенофокусирующие системы, созданные нами на основе семейств комбинированной тороидальной зеркальной оптики и четырехзеркальных конструкций, практически перекрывают все возможности зеркальной оптики пригодные к использованию в комбинации с лабораторными рентгеновскими источниками для исследования биологических объектов.

Рис.9. Схема фокусирующей системы с двумя последовательными взаимно перпендикулярными

монохроматорами: 1 - входное окно системы; 2 - поворотная платформа; 3 - "вертикальный" кристалл-монохроматор; 4 -"горизонтальный" кристалл-монохроматор; 5 - образец; 6 -фокальная плоскость системы.

На основе дифракционной оптики разработана рентгенофокусирующая система точечной фокусировки ("монохроматор-монохроматор") с последовательным отражением от двух взаимно перпендикулярных кристаллов-монохроматоров, снимающая практические ограничения на расстояние образец-детектор. Она состоит из двух конструктивно идентичных блоков вертикального и горизонтального монохроматоров, расположенных на платформе - основании, которое может вращаться вокруг направления первичного пучка (рис.9).

Поворот этой платформы на угол ср может переводить направление распространения дважды отраженного и сфокусированного рентгеновского пучка в горизонтальную плоскость, позволяя тем самым все узлы камеры размещать на столе генератора рентгеновского излучения.

Подбор дифракционнооптических элементов фокусирующей системы, использующей схему последовательного отражения пучка от двух взаимно перпендикулярных кристаллов-монохроматоров, основывается на свойствах косых плоскостей кристалла -монохроматора. Угол 9 - определяется природой кристалла-монохроматора и длиной волны рентгеновского излучения в соответствии с уравнением Вульфа-Брэгга. Используя графики, подобные представленному на рис.10, можно подобрать углы среза о и радиусы изгиба Л вертикального и горизонтального кристаллов-монохроматоров так, чтобы они имели общий фокус при их последовательном расположении друг за другом, то есть должно выполняться соотношение: БА) +АР] ^ А2+Ар2, где: 8А]-расстояние источник-монохроматор для первого монохроматора, а Ар1-расстояние монохроматор-фокус для первого монохроматора; БАг и АРг-соответственно для второго монохроматора.

На основе этой рентгенофокусирующей системы "монохроматор-монохроматор" и разработанной- с нашим участием "Камеры Рентгеновской Универсальной" - КРУ создан комплекс, позволяющий получать трехмерный дифракционный набор от биологических кристаллов с большими периодами идентичности как по схеме Бюргера, так и по схеме Арндта-Воннакота. Данный комплекс оказался чрезвычайно полезным при расшифровке кристаллической структуры вируса СМ1У, вируса экзантемы свиней-8 72, токсина МЬ 1, иммунотоксина -агглютинина рицина.

а = 10" 9е 8* 7° 6°

43

8

>

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Радиус изгиба кристалла И, мм

Рис.10. Диаграмма взаимосвязей между соотношением "плеч" фокусирующего кристалла-монохроматора с И - радиусом изгиба и о - углом среза плоскости отражения (1011) кварца для С и к -излучения.

Четвертый раздел посвящен структурным исследованиям сложных биологических объектов с применением различных рентгенофокусирующих систем.

Наиболее продуктивно рентгеновские фокусирующие системы были применены в структурно-функциональных исследованиях поперечно-полосатой мышцы биологического объекта со сложной иерархической организацией.

Применение созданных рентгенофокусирующих систем позволило получить рентгенограммы высокого разрешения от портняжной мышцы лягушки в состоянии покоя и ригора. Координаты большинства рефлексов совпадают с классическими данными Хасельгрова, однако положения ряда рефлексов определены нами впервые на рентгенограммах высокого

разрешения, полученных при больших временах экспозиции при расстоянии образец-пленка порядка 130 см (рис.11).

состоянии покоя, (б) - спинной мышцы кролика в состоянии ригора, время экспозиции 48 ч (а) и 40 ч (б).

Так, например, мы фиксируем триплет: 111.7-109.8-106.7 А; вместо дуплета 110.7 - 107.2 А, фиксируемого Хасельгровом; хорошо разрешаемые дуплеты: 90.9- 89.7 А; 85.7- 85.1 А; 71.7 -71.2 А вместо одиночных рефлексов 91 А, 85.9 А, 71.6 А соответственно. Ранее не были описаны вообще полученные нами на рентгенограммах скелетных мышц кролика в состоянии ригора рефлексы: 217; 225; 144.1; 147.4; 424; 442 А.

Возможность получения рентгенограмм более высокого разрешения от мышц в различных физиологических состояниях послужила основой:

проведения ряда работ по уточнению структур, составляющих мышцу;

- определения вклада отдельных структурных составляющих мышцы в формирование суммарной рентгенодифракционной картины;

- организации, на основе определения этого вклада, мониторинга за поведением наиболее характерных рефлексов при изучении влияния различных физико-химических факторов на отдельные структурные составляющие мышцы с целью определения структурно-функциональных взаимосвязей в этом живом объекте.

Уточнение регулярного распределения минорных белков вдоль толстой нити базировалось на информации рентгенограмм высокого разрешения, полученных от мышц в состояниях покоя и ригора (рис.11). Дифракционная картина минорных белков целой толстой нити определяется произведением двух функций, одна из которых соответствует трансформу линейной решетки, состоящей из рассеивающих центров (минорных белков), а вторая (интерференционная функция) учитывает интерференцию излучения, рассеянного от двух соседних половинок данной толстой нити. Проведено : сравнение расчетных и экспериментальных данных для ряда моделей распределения минорных белков разной природы вдоль толстой нити. Наиболее состоятельна одиннадцатицентровая модель, причем семь первых полос с белками одинаковой рассеивающей способности (С-белок), последующие четыре полосы с отличающейся как от предыдущих (семи), так и между собой рассеивающей способностью (рис.12).

430 А

С-зона

Центр 445 А

/ /

С-зона

1 3

,5 7 9 П'П 9 7 5

3 1

7090 А

Рис.12. Схема распределения минорных белков по длине толстой нити.

Учет интерференции излучения, дифрагирующего на минорных белках и мостиках смежных половинок данной толстой нити, позволяет объяснить положение не менее тридцати

меридиональных рефлексов на рентгенограммах покоящихся поперечно-полосатых мышц позвоночных.

Хаксли и Браун, а затем Хасельгров отметили, что координаты рефлексов 143 и 72 А увеличиваются примерно на 1% как в ригоризованной, так и в тетанически сокращающейся мышце по сравнению с покоящейся.

Хасельгров предположил наличие . структурного преобразования толстых нитей, при котором происходит небольшое раскручивание спиралей, соединяющих точки выхода мостиков на поверхности миозиновых нитей: изменение наклона спирали по отношению к оси толстой нити приводит к увеличению расстояния между соседними ярусами мостиков, то есть увеличению периода "143 А". Эти авторы полагают, что в состояниях покоя, сокращения и ригора рефлекс "143 А" обусловлен одними и теми же структурными элементами толстой нити, а именно миозиновыми мостиками и легким меромиозином, формирующим ствол толстой нити.

На основании анализа рентгенограмм более высокого разрешения, полученных нами от скелетных мышц в состояниях покоя и ригора и интерференционных функций мостиков и минорных белков мы предложили другую интерпретацию. Нам представляется, что основной вклад в интенсивность рефлексов в области 143 и 72 А на рентгенограммах ригорной и сокращающейся мышцы может давать компонента минорных белков толстых нитей, тогда как на рентгенограмме покоящейся мышцы-мостики и легкий меромиозин. Иначе говоря, рефлексы в области 143 и 72 А на рентгенограммах покоящейся мышцы, с одной стороны, и ригоризованной и сокращающейся - с другой, обусловлены различными структурными элементами толстых нитей, и, следовательно, изменение положения этих рефлексов при ригоризации и активации мышцы не является основанием для заключения о наточил соответствующих изменений в осевом период^повторения структуры толстых нитей. Вместе с тем показано, что при ригоризации мышцы происходит изменение положений ряда рефлексов, в основном обусловленных минорными белками толстых нитей. Эти изменения свидетельствуют о том, что ригоризация и активация мышцы сопровождается структурными изменениями в стволе толстой нити приводящими к истинному удлинению толстых нитей или изменениями электронной плотности толстых нитей в проекции на их продольную ось, что тоже может приводить к изменению

периода интерференционной функции. Представление об удлинении ствола более вероятно.

Сочетание возможностей рентгенодифракционного анализа высокого разрешения (с применением рентгеновской фокусирующей оптики) с методами избирательной экстракции отдельных структурных составляющих мышцы позволили провести прямые эксперименты по определению вклада минорных белков Н-зоны в дифракционную картину.

212А ,144А

Рис. 13а. Денси-тограммы распределения интенсивности меридиональных рефлексов на рентгенограммах демембранизиро-ванных пучков мышечных волокон спинной мышцы кролика, введенных в ригор в растворах с различными значениями рН при Т = 4°С: а - рН 7.0; б - рН 8.0; в - рН 6.О..

а

Полученные данные однозначно показывают, что минорные белки, локализованные в центральной зоне толстых нитей (в области, заключенной между двумя соседними С-зонами) вносят основной вклад в интенсивность меридиональных рефлексов

"442 А" и "223 А". Это противоречит распространенному ранее представлению, согласно которому рефлекс "442 А" обусловлен главным образом дифракцией на С-белке толстых нитей.

Рис.136. Распределение интенсивности меридиональных рефлексов на рентгенограммах демембранизиро-ванных пучков волокон спинной мышцы кролика, введенных в ригор в растворах при различных значениях ионной силы ¡х (рН=7.0, 12°С): а -0.125; б - 0.34; в -0.04.

Рентгенодифракционное изучение влияния пирофосфата, рН-, ионной силы ригоризующего раствора на изменение сократительного аппарата мышцы в состоянии ригора показало наличие перераспределения интенсивностей меридиональных рефлексов "223 А" и "212 А" при воздействии этих факторов (рис.13).

7.0, Т твору

32

Рис.13в. Влияние пиро-фосфата и его смеси с этилен-гликолем на соотношение ин-тенсивностей меридиональных рефлексов на рентгенограммах демембранизи-рованных пучков ригорных волокон спинной мышцы кролика. ' Приведены ден-ситограммы распределения интенсивности вдоль меридионального направления на рентгенограммах одного и того же пучка волокон, находившегося в следующих растворах: а - ри-горный раствор, содержавший (в мМ): 5 Mg-(ацетат)2, 5

ЭГТА, 75 К-аце-тат, 15 трис-HCl-буфер, рН

= 4°С; б - к раствору (а) добавлено 2 мМ Na-PP; в - к рас-(а) добавлено 2 мМ Na-PP и 40% этиленгликоля.

Эти изменения трактуются следующим образом: отклонение рН или ионной силы от физиологических значений (в любую сторону) приводит к ослаблению электростатических сил взаимодействия С-2-сегментов со стволом толстой нити и к их отходу от поверхности ствола. При этом структура "отошедшего" С-2-сегмента будет определяться физико-химическими

Рис.1 Зг. Распределение интенсивности вдоль меридиана рентгенограмм глице-ринизированного пучка из ш-рБоав кролика: а - контроль; б - после экстракции М-ли-нии.

параметрами омывающего раствора. Соответственно изменения в соотношении интенсивностей меридиональных рефлексов, наблюдаемые при воздействии псевдорелаксантов, могут быть объяснены как результат возврата С-2-сегментов миозина к поверхности толстых нитей.

Приведены примеры использования рентгенооптических фокусирующих систем для определения ряда важных параметров в биологических мембранах, пленках ДНК, биологических кристаллах и т.п.

ВЫВОДЫ

1. Сформулированы теоретические и экспериментальные положения по созданию техники рентгеновского эксперимента нового поколения, неотъемлемой частью которого является рентгенофокусируюшая оптика. Рассмотрены и систематизированы данные по свойствам материалов зеркал и монохроматоров, особенностям отражения рентгеновских лучей зеркальными поверхностями, роли качества поверхности и методов ее обработки, способам фокусировки рентгеновского пучка, аберрациям рентгенофокусирующих устройств.

2. Разработаны теоретические подходы для расчета конструктивных параметров рентгенофокусирующих систем, создаваемых на основе зеркальной и дифракционной оптики для рентгеноструктурного анализа биологических объектов, в том числе:

а) зеркальных систем на основе поверхностей второго порядка:

- эллипсоида вращения;

- коаксиально расположенных гиперболоида и эллипсоида;

- двух коаксиально расположенных параболоидов.

б) на основе двух и четырех упругодеформированных цилиндрических зеркал.

в) систем на основе дифракционной оптики, содержащих упругодеформированные кристаллы-монохроматоры с переменным сечением.

3. Разработаны алгоритмы расчета хода действительных лучей для каждого варианта применения рентгенофокусирующей оптики. Создано программное обеспечение для ЭВМ, позволяющее рассчитать ход множества действительных лучей с индивидуальными коэффициентами отражения от фокусирующей поверхности для каждого луча. Это позволяет оценить качество фокусировки и получить сравнительные характеристики для различных рентгенофокусирующих систем.

4. Впервые предложена рентгенооптическая схема четырехзеркальной фокусирующей системы с точечной

фокусировкой рентгеновского пучка. Разработаны, изготовлены и опробованы регатенофокусирующие системы с четырьмя попарно взаимно перпендикулярными упруго

деформированными зеркалами. В конструкциях применены два способа изгиба зеркал: - с симметричной схемой нагружения и с помощью консольного закрепления зеркал, нагруженных сосредоточенной нагрузкой.

5. Впервые разработана и изготовлена рентгенофокусирующая система с точечным фокусом на основе двух взаимно перпендикулярных кристаллов-монохроматоров (монохроматор-монохроматор), позволяющая обеспечивать оптимальное направление сфокусированного рентгеновского пучка. Конструкция системы позволяет использовать различные кристаллы-монохроматоры.

6. На основе предложенных в диссертации концепций и теоретических расчетов созданы комплексы для рентгеновского анализа, не имеющие аналогов в отечественном приборостроении и по основным параметрам не уступающие лучшим зарубежным системам данного класса. Комплексы нашли широкое применение при проведении фундаментальных исследований в Институте биофизики АН СССР, Институте белка РАН, Институте биофизики клетки РАН, Институте кристаллографии РАН.

7. Разработанные и созданные методы и аппаратура на основе рентгенофокусирующей оптики позволили:

- получить рентгенограммы высокого разрешения от поперечно-полосатых мышц в различных физиологических состояниях и впервые определить положения ряда рефлексов на рентгенограммах;

- на этой основе создать модель, описывающую упаковку белков миозиновой и немиозиновой природы толстых нитей скелетных мышц;

- исследовать большой набор биологических объектов, имеющих кристаллическое и квазикристаллическое строение. Определить ряд существенных параметров изучаемых объектов -размер мембранных кластеров, параметры фазовых переходов ДНК, провести рентгенодифракционное исследование закристаллизованных вирусов: СМ^У и штамма Б-72; иммунотоксина агглютина рицина и токсина МЬ 1.

Список основных публикаций, отражающих содержание диссертационной работы

1. Баркас Б.В., Месянжинов В.В., Поглазов Б.Ф., Корнев А.Н., Туркин А.И., Хромов А.С. Использование электрофореза в полиакрил амидном геле для получения ориентированных препаратов вирусных частиц. - ДАН СССР, 1979, т.245, № 3, стр.736-739.

2. Леднев В.В., Сребницкая JI.K., Корнев А.Н., Хромов А.С., Малинчик С.Б. Локализация минорных белков и структурные изменения в миозиновых нитях поперечно-полосатых мышц позвоночных. - Биофизика, 1981, т.26, вып.4, стр. 739-748.

3. Леднев В.В., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К., Малинчик С.Б. Доказательство существования Са-индуцированного структурного перехода в стволах миозинсодержащих нитей скелетных мышц позвоночных. - Биофизика, 1982, 1.21, вып.З, стр.493-497.

4. Lednev V.V., Kornev A.N., Srebnitskaya L.K., Chromov A.S., Malinchik S.В. The origin of meridional reflektions in the X-ray diffraction patterns of vertebrate sceletal muscles. - YII International Biophysics congress & PAN-American Biochemistry congress Mexico, 1981, Abstr.

5. Леднев B.B., Корнев A.H., Сребницкая Л.К., Хромов А.С. Влияние пирофосфата на структурные характеристики миозинсодержащих нитей скелетных мышц позвоночных. - 1 Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1982, тез.докл., т.2, стр.43.

6. Леднев В.В., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К. Рентгенодифракционное изучение рН-зависимости структуры толстых нитей в демембранизированных волокнах скелетных мышц позвоночных. - 1 Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1982, тез.докл., т,2, стр.45.

7. Леднев В.В., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К., Малинчик С.Б., Хромов А.С. Интерпретация картин меридиональной дифракции на рентгенограммах демембранизированной спинной мышцы кролика в состоянии ригора и их зависимости от физико-химимческих параметров ригоризующего раствора. -Биофизика, 1982, т.27, вып 1, стр.1027-1040.

8. Леднев В.В., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К. Рентгенографическое изучение зависимости от рН структуры толстых нитей в демембранизированных пучках волокон

скелетных мышц позвоночных. - Биофизика, 1983, т.28, вьт.1, стр.96-99.

9. Леднев В.В., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К., Хромов A.C. Рентгенографическое исследование влияния пирофосфата на структуру толстых нитей в демембранизированных пупсах волокон спинной мышцы кролика. - Биофизика, 1983, т.28, вып.2, стр.302-305.

10. Леднев В.В., Корнев А.Н., Хромов A.C., Сребницкая Л.К., Четверикова Е.П., Рождественская З.Е., Орлова A.A. Рентгенографическое исследование спинных мышц кролика с экстрагированной Н-зоной. - Биофизика, 1983, т.28, вып.З, стр.457-462.

11. Леднев В.В., Корнев АН., Сребницкая Л.К. Рентгенографическое изучение молекулярной природы зависимости ригорного напряжения, развиваемого демембранизированными пучками волокон спинной мышцы кролика, от ионной силы раствора. - Биофизика, 1983, т.28, вып.4, стр.705-707.

12. Корнев А.Н., Сребницкая Л.К., Леднев В.В. Зависимость структуры толстых нитей в ригорных пучках демембранизированных волокон спинной мышцы кролика от температуры. - Биофизика и биохимия мышечного сокращения, тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1983, стр.97-98.

13. Леднев В.В., Корнев А.Н., Малинчик С.Б., Сребницкая Л. К. Природа меридиональных рефлексов на рентгенограммах мышц позвоночных и структура миозиновой нити. - Биофизика и биохимия мышечного сокращения, тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1983, стр.99.

14. Хромов A.C., Корнев А.Н., Сребницкая Л.К., Леднев В.В. Существование конформеров миозиновых мостиков в составе толстых нитей спинной мышцы кролика. - Биофизика и биохимия мышечного сокращения, тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1983, стр.113.

15. Ивков В.Г., Казаков В.А., Корнев А.Н. Кластеры в жидкокристаллическом бислое. - Биофизика, 1984, т.29, вып.З, стр.410-414.

16. Montrel М.М., Sukhorukov B.I., Kornev A.N. X-ray diffractions stady of the effect of salt ellimination on DNA secondary structure. - Studia biophysica, 1984, v. 103, N 1, pp.41-44.

17. Montrel M.M., Sukhorukov B.I., Kornev A.N. X-ray diffraction stady of protonated DNA. - IUPAC 14-th Int. Symp. on

the chemistry of natural products., Posnan, Poland, 1984, Abstr. pp.443.

18. Сребницкая JI. К., Корнев А.Н., Хромов A.C. Модификация тонких нитей демембранизированных поперечнополосатых мышц глутаральдегидом. - V Всес. конф. по биохимии мышц, тез. докл., Телави, 1985, стр.96-97.

19. Моргунова Е.Ю., Корнев А.Н., Михайлов А.М. Строение икосаэдрических вирусов растений в свете данных рентгеноструктурного анализа. Препринт, 1986, Пущино, ОНТИ НЦБИ, стр. 1-39.

20. Корнев А.Н. Фокусирующие рентгеновские камеры для исследования структуры биологических объектов. - Сб. "Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований". 1986, Пущино, ОНТИ НЦБИ, стр. 17-22.

21. Корнев А.Н., Голуб Ю.В., Михайлов А.М. Рентгеновская зеркальная оптика в исследованиях биологических объектов. -Деп. ВИНИТИ, 1986, № 6674-В86, стр. 1-24.

22. Корнев А.Н., Михайлов А.М. Рентгеновская дифракционная оптика в исследованиях биологических объектов. - Деп. ВИНИТИ, 1986, № 7636-В86, стр.1-42.

23. Корнев А.Н., Голуб Ю.В., Циглер И.Н., Михайлов А.М. Устройство для фокусировки рентгеновского излучения. A.C. 1324072, Б.И. № 26 (1987).

24. Корнев А.Н., Михайлов А.М. Принципы создания рентгеновских фокусирующих систем для исследования структуры биологических объектов. - Деп. ВИНИТИ, 1987, № 4263-В87, стр.1-29.

25. Михайлов А.М., Кафтанова A.C., Корнев А.Н., Беляева H.H. О строении бактериальных вирусов. - Препринт, 1987, Пущино, ОНТИ НЦБИ, стр. 1-49.

26. Леднев В.В., Корнев А.Н. Изменение осевого периода повторения структуры толстых нитей скелетных мышц при переходах типа "покой-ригор" и "покой-сокращение". Биофизика и биохимия биологической подвижности. - тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1987, стр.86.

27. Леднев В.В., Корнев А.Н., Удальцов С.Н., Сребницкая Л. К. Рентгенодифракционное исследование демембранизированных волокон спинной мышцы кролика в состоянии ригора, меченных экзогенными субфрашентами I-миозина. - Биофизика и биохимия биологической подвижности. - тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1987, стр.87.

28. Леднев В.В., Корнев А.Н., Фрейдина Н.А., Сребницкая JI.K. Рентгенодифракционное исследование демембранизированных волокон спинной мышцы кролика, меченных экзогенным F-белком (фосфофруктокиназой). - тез. докл. симп., Тбилиси, "Мецниереба", 1987, стр.88.

29. Корнев А.Н., Голуб Ю.В., Михайлов А.М. Система монохроматизации рентгеновского дифрактометра. А. С. № 1402874, Б.И. № 22 (1988).

30. Моргунова Е.Ю., Михайлов А.М., Дембо А.Т., Кафтанова А.С., Корнев А.Н., Попов А.Н. Четвертичная структура белковой молекулы CARNATION MOTTLE VIRUS (CMtV) и ее упаковка в капсиде. - Studia biophysica, 1987, v. 122, N 1-3, pp.71-76.

31. Корнев A.H., Ганин В.Ю., Михайлов А.М. Рентгеновская фокусирующая оптика для исследования строения биологических макромолекул. - Методические рекомендации. 1988, Пущино, ОНТИ НЦБИ, 74 стр.

32. Mikhailov А.М., Komev A.N. X-ray focusing devices for studing the structure of biosistems. - Twelfth European Crystallographic Meeting, Moscow, 1989, Abstr., v.3, p.378.

33. Корнев A.H., Михайлов A.M. Четырехзеркальная рештенофокусирующая система для исследования строения биологических объектов. - Кристаллография, 1990, т.35, вып.1, стр.190-196.

34. Корнев А.Н., Михайлов А.М. Способы настройки камер с точечной фокусировкой рентгеновского пучка, применяемых в исследованиях структуры биологических объектов. - Сб. "Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии", 1991, Пущино, ОНТИ НЦБИ, стр.74-83.

35. Корнев А.Н., Никонов С.В., Михайлов А.М. Система для получения трехмерного набора диффракционных картин. Патент РФ № 2025720, Б.И. № 24 (1994).

36. Michailov А.М., Perevozchikov V.A., Perevozchikova N.A., Gusev A.A., Komev A.N. Production of Highly Homogeneous Preparations, Crystallization and Preliminary X-ray Structure Investigation of the Porcine Visicular Exanthema Virus (S- 72 Strain). - Cristallography Reports v.40, N 5, pp.794-797.

37. Michailov A.M., Tonevitskii A.G., Konareva N.V., Agapov I.I., Popov A.N., Bartunik H.D., Komev A.N., Vainstein B.K. Crystallographic Stady of the Viscum Album ML1 Toxin in Its Native State. - Cristallography Reports, 1995, v.40, N 6, pp.955-958.

38. Корнев А.Н., Голуб Ю.В., Михайлов А.М. Устройство для фокусировки рентгеновского излучения - Решение о выдаче Патента на изобретение № 94015765/25 от 16 января 1996 г. Приоритет от 27.04.94.

39. Michailov A.M., Perevozchikov V.A., Kornev A.N. Cristallization and Preliminary X-ray Structure Investigation of the Porcine Vesicular Exanthema Virus (S-72 Strain). - International Union of Crystallography, XVII Congress and General Assembly. Seattle Washington, USA, 1996, Abst. PS 04.09.15.

40. Тоневицкий А.Г., Темяков Д.Е., Суиней И.К., Конарева Н.В., Корнев А.Н., Палмер Р.А., Михайлов А.М. Особенности структуры агглютинина рицина из Ricinus communis. Кристаллография, 1996, т.41, № 6, стр. 1018-1023.

Научное издание Автореферат Корнева А.Н.

Налоговая льгота — общероссийский классификатор продукции ОК-005—93, том 2; 953000 - книги, брошюры. 5.05.97 г. За*. 7535Р. Тир. 125 заз. Усл. печ. л. 2,5.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН.