Синтез дейтеромеченных липидов с простой и сложной эфирной связью и изучение их свойств в составе мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Чудиков, Михаил Васильевич
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1992
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАШШ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕШЛОГНИ ем. П.В.Ломоносова
Сават Д 063.41.01 .
Но правах рукописи
. Чулапоа 1£яезл Вэсяльегач
СШ1ЕЗ ДВ&ШШЧЗШП ЛЗППДОВ С ПРОСТОЙ П СЛ0Ш10Й ЭГ^ПЮЯ СЕЯ2Ш Я ГЗУ-ЖЗ ПХ СВОЙСТВ В СОСХАВЗ Ш25ВШ1
№
02.00.10.,- Бгооргшшческпя лзята .гатих пртрадгаа ц фютояогпчвски ектиешх вепузотв,.
АВТОРЕФЕРАТ
дпосортоцш ЛО СОИСГОИШЭ ЗПЗОЯОЙ СТОЛШЛ кагтдядато хютггостсях наук
Цосква
1992 г.
Робота выполнена на кафедре химии и технологии. тонких орга^ нических соединений Московского ордена Трудового Красного Знааэнп института тонкой химической технологии сл. Ы.В. Ломоносова.
Научный руководитель: кандидат пашескнх наук, доцент
Чуташ В.В.
Стадиальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Василенко И.А.
кандидат Оиологическпх наук, старсгаЗ научный сотрудник, Литвинов И.О.
Ведущая организация:
Научно-исследовательская лаборатория биологически-активных веществ гидробионтов. -
Защита диссертации состоится '_" ' 1ЭЭЗ г. в
час. шт. на заседании специализированного Совота д-063.41.01 при Московском институте гопкоа химической технологии им. М.В.Ломоносова (117571, г. Коскво, пр. Вернадского, 86.).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ ш. М.В. Ломоносова. (119631, г. Москва, ул. М. Пироговская, 1.).
■ Автореферат разослан "_" __1332 г.
Учений секретарь специализированного Совота, кандидат хишчоеккх наук,
старший научный сотрудник . Лютик А .11.
'»'''Лч» ; !
I'»- • Л- ■ , . I Л-> ■,< ■.Ц.Н' '
-------—!
Актуальность пробдэкш.
Исследования структурной организации и принципов фугациони-■ ровэния Окологпчоскях ыем<5рал - актуальная задачэ современной молекулярной слологпл. Для изучают структуры п динамики мембран п
последнее время широко используются методы дифракции нейтронов и р
ьН-ЯМР-спвктросксп::п, дзп^ле непосредственную информацию о по-дшгаюстп г'одэкуляршсс фрагмантов, кх взоимораспологонии. ориентации. Пря пспользовошш данных методов необходимо наличие в мембране дейтеромеченшс компонентов, то есть, возникает задача •. сзнтеза аналогов природных ляпвдов, содержащих дейтериевую метку.
Нетодо 31Р- л ^Н-ШР-спекгроскоюст применяются в ряде лабораторий г-ира для разрешения вопроса о ыэханизме биологического . действия так пазываемиг лнпадов с простой эфирной связью (еШзг 11р1Лз). Соединения этой группы отичавдсн от оОН'пшх ацнлышх ли. - лядов сяосозом присоединения гвдрсфсОяах цепей и гядрсфкльнсй часта молекулы: гёростая зфяриая сишь (алкнльниз лшшдн) или . ад-взасиплосС^ртгая связь <ш1апкакгл»1ш) вместо слояюэфйрной сзп-
ЗН.
■ Проблотло пгяскенля Сголс^поскпх фушшяй лгатидов о простой гфярпой спязъв считается восьма актуальной в дтщдояогяи- на про-тятяпш! нескольких десятилетий. Способность соединений этого тала-в сорву» очередь олкильшп лишдов-^вкзавать множество физиологических Аффектов и пдвнпфскеция таких бнсокосктиенцх липи-ДОВ ХЕК фтстор активации тромбоцитоз (1 -0-аЕЖ1Л~2-£:ЦОТ1М-аП-ГЛЩО-ро-З-фосОохолпп), (шлящяйся медиатором воспалительных и аллврга-чоскпх реакций, мощные мутагены лташдной природа-фекапвнтаены, обладающие противоопухолевой и иммуномодулкрущей активности
аналога алкиллизофосфолипидов, в значительной степени определяют необходимость разрешения этой проблема.
Механизм биологического действия липидов. с простой эфирной • -связью кокет реализоваться на двух различит уровнях: в структурной организации мембраны т. в спвцифичвском взаимодействии с раз- ■ - '' личными ферментами и рецепторами, например, фосфолипазой HJal ['
рецепторами липидного фактора активации, тромбоцитов. . .
? ■ !>
Мокно огидать, что применение методов Н-ЯМР- в . < 31 Р-ЯМР-сшктроскогош для изучения структуры модальных мембран в - j их взаимодействия с • лжолитаческимя ферментами, в частности ■ ; фосфолипазой. Ag, . приведет г решению ряда теоретических п ^ практических проблем молекулярной биологии. • .- •
Данная работа выполнена в соответствия с планом научныг ис- - Í следований кафедры ХТТОС ММ1ТГ ш.М.В.Ломоносова по теш .'Я 1 -865 , Í "Выделение и синтез отдельных молекулярных типов лшздов, исполь-зоваш:э их для изучения клеточных взаимодействий и создашэ на их основе диагностически, и лечебных препаратов" (номер государственной регистрации 0186.0132597;. - ..
Цель работы.Настоящая работа .посвящена синтезу фосфатвдалхо- . линов алкилыгаго и вцшшюго типов, содоргазшс селективные дайто-риевые метки в гидрофильной и гидрофобной частях молекула, с насыщенными и венасшцанными гидрофобными замэспггеляшш и изучена» мембран, сформированных из этих лктадоз, штода-з 2Н-ЯМР-спекгроскопип и 31Р-ЯМ?-спектроскошш. • .
Научная новизна а практическая ценность работы.
Синтезирован ряд селективно моченых дейтерием фосфатидалхс$вшов: 1-(2-2Н2)-хшльшгош1-2-па^што1М-гас-глзд9ро-Зм1осфо-(3'--2Н3)-хаЕВН
(2Н5-ДПВХ). 1 - (2-2Н2)-паль»!11Т01и1-2-0-гвксад8ШЛ-гас-глицеро-3-фос-фо-(Г-2Нз)-хопш (2Н5-ПГФХ). 1 -О- (2-2Й2)-гексадецил-2-пальмитоид-пзс-глпд9ро-3-фосфо-(7-2Нд)-10лш (2Н5-ГГЮХ) и 1-0-(2-2Н2)-гекса-дацзл-2-О-гвксад91Д1я-гас-гл:г40ро-3-фосфс>- (г-2Н3)-хотя (2Я5-ДГ'ФХ).
Дагашо соединения представляют все возможные комбинации присоединения алифатических заместителей к глицериновому фра тенту ыолэкула за счет простой или слогэтой эфирной связи.
Дейторомочоние липида были использоваш для сравнительного
изучения образуемое ими мембранных структур методом р
Н-ЯМР-сяоктроскоппи. Получено информация о коиформационно-•" дапамачоскпг свойствах ашьлышх лтидов и структуре образуемых t2.1t ШИбрПП.
Стштоспровпл ряд ивпасшцопниг фосфатидилхсшшов пцильпого д олкильпого , лзляицихся потонциалышми ингибиторами фосфолп-паси А,^. Для лзучэнля ззигаодэйствпя фосфолипази с Фосфолипид-" тгсс. ¡тодекулкги ~ ссставэ липнзногс олслоя был использован новый подход, ос^звавгшЯ пэ использовании спектроскопии Р-Я!/?, гозво-ляггзтй реглстщ-'озать струк'/урм.'о езмоиэняя в мембране в ироноссз гидролиза лшщдоз.
На зг""1ту заносятся сяэдуэдяэ основные положения: исследова ния ю срасштельпсму поучопи» кснфоризикошо-динемичвасю: свойств
• фосЗатядалходлюз с простоя и слоиюгфгопоЯ связью в составе мо-•. дэльгах ыэмбрзз! 'методом 2Н-ЯМР спектроскопии. Метода введения дей-
• торяэгоя котки в гидрсфальнув и гядрсфобнуо части молекулы фосфо-ялмда, сиптоз дэАтвромэчешх, фосфатидилхолинов. Исследования взсзгадойстаня фосфэлипази Л2 с модельным липядными мембранами катодом 31Р-гаР спектроскопии. Синтез пеиасшетшх фофатидилхоли-
нов алкильного и ацильного типа - ингибиторов фэсфолипазы Ag. ■
Апробация: Результата, изложенные в диссертации, доложены на международном семинаре "Investigation of tlio biological and lipid' membranes, amphlphlls by neana of neutron scattering" (Дубна, 1921.05.92) и конференции '"^алогически ектившв соединения, синтез и использование" (Пенза. 28-29.09.92).
Публикации: По материалам диссертации опубликовало 3 статьи и тезисы конференции.
Содержание работа: Диссертащклшая работе изложена на страницах мааююписного теиста и состоит из слодуизих разделов: вводэ-ние, литературный обзор, поев:' ;ешшЯ методам введения селективных лзототшх меток, обсуздашю результатов, екснериментальная часть, вывода и список использованной литературы.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ЮС ОБСУВДЕНШ.
I.Синтез фосфатидшиолштов различных типов. Известно, что поездошю насшзднгшх фосфатидилхоганов алкиль-ного типа в составе липидног: Сислоя в некоторых случаях суцест-венно отличаотся от поведения их диацилыих аналогов. Так, г.;э годом дифракции рентгеновских лучей было установлено, что 1,2-дигоксадецил-ад-гл!щоро-3-<£ссфэзсолин и 1-гвксадецил-2-паяь-кштоил-ап-и;що]ю-3-фосфохолш в избитко вода Форагруют голевую Оислойную фазу со взакшшм проникновением цепей (lnterdlgltated phase), нохаракторпую для 1 .г-далальштоил-агс-глщеро-З-фэсфохо-лина.
' Для изучения влияния молекулярной структуры алкильннх лилидов
о
на их конфзрмациои'о-дшгагдгчэскхэ свойства мэтодами Н-ЯЛР спек-
троскошш и лфракции нейтронов нами были получены дейтеромеченые фосфатидалхолзпш со всеми возмогамот комбинациями присоединения гидрофобных целой за счет простой и слоеной эфирной связи, содер-дейтериэЕые гэпш в структурно эквивалентных частях молекулу.
Для синтеза фосфатидилхолишв бил Еыбран удобный в препара-•лвлом отпопения гетод, основанный на фосфорилировании 1 ,2-дпз£^."9СЭ1Шых глицеринов хлороксидом фосфора и взаимодействии образующегося дихлорфосфата с растворимым в хлороформе п-толуолсульСопатом холила. Необходимым этапом в реализации данного ме^рдз пютсп синтез дейтерсмоченых 1,2-дизамещегашх глицери-гсог? п п-трлуодс ульфонат а (г-2Н3)-холкна.
I. Получегсга дзйтеромечешх синтопов . <?. л-Голуолсульфонат (г-2Нд)-хо,шт
Покгрусязго дейтеромечепого п-толуолсулъфопата холина осуща-... р от^дядэрь исходя вз кс-пдэрчэстш доступного гН3)-метанола.
По способу , раме описанному в литературе для получения ие-
' о
дс-^твр'.^рхгяого трэилага хо.'г.гпа, взаимодействие (сНд)-метанола с
р
п-ролуоллул-фохлоридом дает (.Н^)-метиловый офир п-толуолсульфо-гшслот (1). Алкилируя им Я.Л-дкметилЕмшоэтаиол, получали тозилаг (Г-2!^)-холила (2) (схоыв 1).
б.^-Мечаше гидрофобные заместители
Построение 2П2-моченых гидрофобных сштонов осуществляли исходя га (2-2Н-> )-пальг.мтиновоЛ кислоты (4), лолучешюй реакцией изотопного обмет та метилового эфира паамитгловоа кислоты и (2Я)-метилового спирта, согласно схеме 1.
Этот способ удобен в препаративном отловекии я позволяет яс-
пользовать в качестве исходного продукта пальмитиновую кислоту. Прямой изотопный обмен а-матиленовых протонов пальмитиновой кислоты протекает в довольно метких условиях' (КаС^Н/^О, 200°С). Ккс-лотность протонов а-катиленового сегмента, находящегося при слоа-ноаХгфноЯ группе, выло, поэтому для проведения дейтериесого обмена
пальмитиновую юхелоту переводили в мэткловыЯ ефф (3).
р
Кипячение мэтилпалыотата (3) в гН)-катаноле в течение ко-скольких часов в присутствия 102 иэталота натрия дао? (2-2Н2)-пальш1тшювую ка&яоту с изотопной частотой, определяешь равновесными условиям;:, т.е. соотноаением (^И)-ыатшюла и кэтал-пальмитата (3) в реакционной лчеси. Для оптимального использовгшш (2Н)-метанола процедуру обмена осуцествляли и два стадия, контролируя ход реакции по исчезновению в спектрах 1Н-ШР трпплзта
• а-метиленовых протонов (в около 2 м.д.). При обработка роокцконпоЗ
?
массы происходит ошлвнио (2 - Н^ )-иоталпвлькитато в соответствующую кислоту со, которую пероводали действием хлористого тсопила с хлорангидрвд (5) или мэгаловий ефир (6).
Восстановлением кэтнлог-то »фиря (2-гН2)-паяьштшюво2 кяо-лоты (6) алшогвдршш лития бал получоп (г-2!^ 5 -гбисадащу.0Ей спирт (7), которой-проврадали в (г-^ЬгоксадецидОроизд (в) действием РВг3.
Контроль за изотопной чистотой получонша соединенна осувд-ствляли методом 'н-ЯМР, измеряя остаточную интегральную ютепсив-ность триплета а-гаталоношх протонов в 1Н-ЯЦР-споктро соединения. По этим данным, степень изотопного зтэцзши в промокуточвдх соединениях провдаала 95%, а в конотах продуктах-903.
Схема 1
Получеипо даПТ9ро;.:9Ч01шх спи токов
|с»Иа«<
сн9^Ко3с»на (1 )
jnOCHjCWalHCM,),,
nocMaaijM-CH, (а<э), -аЧэ-^^со; (2) CHjû'H
снa (си3 ) t4cccQ<3-► о (сн, ) 10с*н,ссоя
(3) (4)
COCI э
(4) -» ем3{сня>13с~насос!
(5)
СЧ3СН LÍAIH»
(4) —2-, см.,(см,,).,.г.сгн5ссссн, --
(6)
РЭгл
СМЭ (CH3)t3C3U;,Ö)aCH--► • CHa(CíJa)1.aC;>»aO(,Dr
(7) (9)
: 2. Получение 1 .г-даеиэдвпгох. глацортов
(йштез t ,2-д;:зя:.!ацешшх глицеринов осуществляли исходя из азонролллядоетлпцеряна (9) в случае соединений (16) и (13а,б) или та 1.3-бенэтшдагтггцерлпч (17) для соединения (19). содержащего алкилыпй оп:,:еститоль во 2-и пологеша глицеринового фрагмента (схема 2).
Алкшшроваше (ацилироввние) Езопропилидэнглпцорина (9) соединениями (5) ш (8) с последующим удалением зеднтной грушшроти приводит к монозамещэтшм глицеринам (10а,б). -*
Использование на следующем втапо синтеза различных заздтшхх группировок: дкфеиилмотш-гшушюй для даацилького и алкилациль-ного диэфироп или тритильной для диалкильпого производного связано с меньшей СТббИЛЬНОСТЫ) слокноэфирнсй связи. При удалении тритильной защитной группа возможна оцалъная миграция. Б то гэ врошз. высокая лабильность дафолилметилсилнловш вффов по позволяет использовать зту зешитнуп группу в условиях реакции алкилировшшя.
После введения дафонзым талсилильнсй эаднти производите (11а,б) Сзз выделегая подвергали ацшироваякл кзбигком хлорап-гидрида пальмитиновой кислота, зотэм задитную группировку удаляли • в присутствии фторида вшсиия, Первэтиув гидро-сшапуа группу
о
1-(2- ^Э-гзксэддцилглицерхша (10а) блокировали тритильпо5 зсдаой к поело алкилироваиия соедштопия (14) гексадецилброг.идои и удала-шя защитной группы получали диэфир (16).
Для получения сцилалюш''.ого производгюго (19) 1,3-Оонзшд-: . деш1лицерин (17) алкидировшш гексадоцилброг,гидом и удалял:: задатку» группу в кислой•сродо. 2-Гвксадвцилглнцврул (18) иодировали с условиях недостатка хлорапгидрвда (2-^Н2)-палы.штшювоа 121 слота
(5), ЧТО ПРИВОДИЛО К ЗаЧОЦОШЮ ТОЛЬКО ОДНОГО ИЗ СВОбОДШЙ. П0Л01Л-
ний глицеринового фрагмэнта.
Ненасщошщв дазакзщлишо глицерины (?3а,б) получали, адкшшруя или ацилируя тригилглицорпн (20) соответственно .тозялатом олеинового спирта (21) и ыкюшвдорцяом (22). Поело удаления тритильяоЯ зашита создкаонмя (23а,б) о\тд,ага хроиатогрсфиоскя.
Схома 2
см,см I
Инн. ен, I ^ ^ си
Псуогчвгав 1,2-дтаЕ;*ог:э1а1Ы1 гллцорпшв 1. (5) аа (8)
(9)
? .ToeCtH, ClUß»
trci
. Ру {"
см.ол I
снсн »
СИ,см
(10а.б)
tW»*3C.Ct
ataOaisC^lla^CHa >апС1<э
СНСН
I
OyJTi-
(14)
CHS<CJ»I
сн,сс»,с*и, <a le ) taau¡
aî0(c?ta)lteHs
OI3OTf i
(16)
tt»„8ICI
at, оси, с "м, (см,)1асм,
ао(ац),0а(э
а»,cu
(16)
сн,сл
сном I
сн,оз1 twPba (На.б)
СНа(СМ,),.*С0С1
aire? t
ato-co(CH,,)14eMa CH,031ÍM4>} -<12а. б)
I
снаоя
сно-со(сма)4Чсн,
СИ,он
(13а,б)
сн,о HOCH Cl CH30
(IV)
1. a<a(cn3)t jDr
2. н*
ích¿ki il
XHO(CHa),taÇHa CH30H
(18)
Схема 2 (iiposojcaiiiíQ )
(5)
СН2ОСОС»Н,(CH,)laCU3
CHOCCHaJ^.CHa
chjoh
(19)
сн, он
№ Г H,
1 .TrCI ,'Py 2.Toaûh
(9)
i- - . , Il H ,1 .
R= -CpÇ3H3(CHj,)iaCH, -CHaCaha(CHa)i3CH,
CHaCil сном
Л. .
CHîOTr
(20;
1 .KCl ИЛИ íiOToe
H
:+
си~ся I .
■СНОП i
ch¿ún
(23ü,ö)
■r» -cûcî(a í¿t 12')б¿t-í=ct/fcna')vch3
3. Синтез'фосфатвдшхолинов
Получение фосфптидилхолинов (24а-о) промдик, 00ра<3ативал 1,2-дизамещетше глицоршш (16), (13а,(5) к (19) 'хлороксидЬ'м-фосфора и n-TajiyojicyjiHiOHaTOM "(г-^ц^-хо&ша боз'ваделешш ' пршеауточ-1011 продуктов (схема 3). Поело экстракции "и хрокатогр£ф!Чоской очистки липидц кристаллизовали'из ацогона.
Аналогично Ошэ тлучош'фосфатзд^аоляш ' (24д,о ) ,'"по с "применением немеченого то&яаать холила. Роцошческув таюсь '1,2- ■•■к 3,2-диолоокл-оп-глицорэйосфохо."5шоь (о ) гвдроя:оЬв0Ля:,фоёфоллпазЬй
А2, содержащейся в цельном яда »Си. Благодаря стереоспецифнчноста фэр.'.опта гидролизу ется только фосфатидилхолот природной конфигурации 1,2-сл. Из образовавшейся смоси продуктов выделяли 3,2-Д1»леоил-а7г-глиц9ро-1-фосфат:1ДНлхолнн (24я).
Получение фэсфатвдшшшотов
Схема 3
сн.-о-гг1
I
сн-о-пя I
а),си
(2)
РОС1.
СН,-0-1Т»
см-о-п» I
сн
,-о^ра
1аснам(снэ)ас»на
(1б;13а,б;19;23а,б)
(16.24а) П*я-СНаС3!\л (СНа ) » аС"з Гя—СНаСНя (СИа)13СИ;,
(24 а-е)
(13а,246) ГС1«—СНаСН, (СНа)13СНа П2в-с(о)СНа(сна)1асна
(19.24а) П*"-СНяСНг'(СН2 )1,аСНа
(136.24г)
(о)С,На(СН2)АЗС!!^
ггг»-с (о)сиа (сна)»Зсц,
сна-о-п
С!ЬО-П
I
сиаон
ТееСо!.
РОС1,
С!1а-0-П
акт
I
сня-а ' (снл) а
Л-
п»-осиа (сн,) 7а*=сн (сиа) Тснэ (23а. 24д)
п»-с(о)сия(сна),сн=си(снэ)тсна (230,240) То«Со1= тозилат холила
Схема 3 . (продолзэщгэ)
см,оа
«осфолшвзо Ао |
(246) -кк»
I
сна-^^ссмвсн,« (сн8),
\ /
\Фоофолшшза А2 " ° (25)
СИ.ОЙ
I
ис-ог» I
СИ^-ООСЬиСН^СН,,),
(248)
II.Исследование структура к дкиакжп шдвлышх из»3рш штодоа 2Н-ЯМР-спзктроскокй1. Селективно кичешо дэйториеи фосфатадалхолаки {24 а-г) били ио-пользоваш для кзучвття струксургшх пароходов н конформацпошю«-
динамичеасих свойств липидшх ыолэкул в состава блслоя ютодоа
р
Н-ЯМР-спектроскогам. Наличие и цолскулз коток доух гепоз-о катальной груттло холпиоеого остатка (Я-С^Н^) и во второй штилеповоЁ группе заместителя прл С-1 глицерина (г-С2!^) - шзеоляло одноврэ-мошго получать информацию о состояашз гидрофильной и гвдрофобкоЗ частой бислол.
Спектрц 2Н-РДР коцбрви ссак сссяодоваЕзчхся фосфатпдэлхолшюв оказались качаствзшга одпиакоьг&г.: с продсгавлош но рис. 1 па примере гПь-ШШ (24а). Пр; тешоратурад тс мира тури фазового
порохода голь-гидкнЯ кряоталл (Тс) и спектрах наблюдаются два типа сигналов, значительно отдгсаюялхся по величине квадрунольного рас^оплегам (Ду^). Вэлячйиа Ау^ зависит от природы связи, которой атся дойтерпя прпсоэдашои и молекула, от наличия усрэдняющих двиганий, соЕорзае>гдх двйтеропом и составе молекулы пли ее фрагмента, а от орпонтсщп! содорггл.с>го нотку тлэкулярпого фрагмента п липид-гом спслоэ:
3 е?яа
1у--(-)3 (1)
0 4
гдэ о^чО/Ъ- статическая константа квадруполыюго расщепления, рав-пся для связи С-2Н 170 КГц; Б«<1/2(Зсов2в-1 )>-молекулярный пара-' !*этр порядка, раипнА отновогош наблюдаемого и максимально возмок-пого гшадруполъпого расцепления; »-угол »¿езду £-Я осью динамичео-кого усредаэггал и направление» связи С-^Н; углошо скобки означают усрэдалаэ по I дтконияк. Потсэшю молекулярного порядка за счот . появления косах двпгэппЯ, Оистрих со временной шкало 2И-Ш.(Р, присолят « угянкззппэ псблвдаотего квадруполыюго расцепления. Таким образе;!, ггг:.!эпстаю сэлгпши Ау^ отраяаог длшотчвеки усредпегаше структур:из а кепфоргшегагамо перестройка а кеморапв.
В спектрах ^Н-ЯУР фосфзтпднлхалииоЕих >.:вкОран сигнал о конь-епз гпшярупольггш расцеплением (ряс. 1а,<5) соотватствует метко, рвстологояноЗ в облядогг.зм болыгоа кетформациопной свободой холи-ковоп Фрагменте. Бастрио тлэкуляршю даитаппя, а тагазэ внутримолекулярные предания С2группы вокруг С-И, С-0, С-0 п Р-0 связей приводят к значительному уерэдпоизю сэличилн'ду^, Сигнал с большим квадруполышм расцеплением (ряс. 1о,о) отвочаот 2-С2Н2-сегмэнту, для которого число степеней свободи суг,оств<эгаю меньпэ по сравне-
MiO). ?Т;Г^тПС"Х ifi ffamx. (fr,,tj) j¡ r состава... голтого.
n^CNiWsnOT^parï^jn^àxXqjfipiflcopOj .pçïçjijia. ^Горьпэд .ппгюпая^шггеп -япгпость рбус^р^лопа зпптатвлшоЯ пирпной
i того '.цалтлтл. оРтдог'пр^э „¡¿щрррплыртх ^пптопсяспостой сигналов ï-C^IIg-H.î'ijU-C^flIg-pp^^pnnno 2;3. 'что соотсотствует коотчоству • т?кТ;ОРСТОЗ п ,состпг:э дшшх груш в г.олзкулэ 2Пс-ДГОХ (24а).
Срйп'эпта спрктроп голэвях п гпдаоЛртстаяЕиогаип нэм-
0.0 ) 11 I I I I I I 11 I I м I I I I I I I м I I ч I I 11 I I I 11 26 30 35 40 4Ь ЬО 66 00 Температэра, С
(
Рис.3-Гргфвш тошюратуркоа »акзох^ости вэлзгшш квадруполь-ного расцошюняя и-Сри^-грунш ^-ЯШ! (£»).'^-ГПЭХ <)0. .2%-ПГМ: (□) в г1%-ДГ£аС (О).
бран нэ.^Ид-ДПИС (2<г). 2115-ГП®С (24а), 2Н5-1ТОХ (246) в 2Нб-Д!Ш (24а), отвачащио сигналам Н-С^Нд-груш приведены ка рас. 2. При тэыпературах шяе Т0 о споктрах цсбяодаатся тшшчшо для случая аксиальпоЯ шг^этреа сигналы, ш которых ваязчано ¿Уд оорода^шгсь непосредственно как честотиоа расстояилэ швду исксшуиша. Дна опредолоипя квадруполъного рассэплзыня в сигналах гола сих шиброа проводилась кокпьюториаа сшулядая сгссперсяштшаЕЦх спектров» Вояичшш Лу^ в шчисхшетдо на &х основа паргьатрц порядка (Б)
возростают а ряду 2Н5-ДГИХ < %5-ГПЭХ ~ 2Н5~ГПЖ < 2Н5-Д,"гс как для Г0Л9Е1П, тая я для етдпкфясггадлпчэскцх моибрая. Таким образом, по езрэ угэньпшпя содержания в ляпидннх молекулах карбоппль-' • пах групп копфор-мцпспноя спободз холлповых остатков несколько
ОГрГ.ТГГ'^^ТСЯ. .
■ Пароход Спслсл ггз гпдкогфлстодлгггасгсого состояния в состояние
■ голя сопропо-^сэтсл етк.гзгошяом ютэлруполыгого расщепления и упиро-р
1л:зм с:!птгов ü-C IIg-групп. Опродолоппэ TQ осуществлялось из тем- , порптурпоЛ зорлсгмостя волячкпп сигналов Н-С2^-групп (рпс. -3). Опрэдэлэшшо твкям образом значения Тс сказались в хороием со— отезтсткп! с пгагг^пся в лпторатурз данншл для дипалылитс л-, . ОТсксэдэцил- п гексадощшгалы.ятопл-гас-глнцерофосфохолша, ...
Для опрэдолпппл дппсячэскпх характеристик лгатдгаи молекул в состппэ Скатал "лс'.гл Con пропздзпя пс::орзпил ■ времени сшш- . ропототпоП ролгпсссцпл Т(. -
Из рзлахсецггопгах пзмзрошй! прл разшх тошорзтурах Сило опро- . дэлэпо, что скорость сшт-рзЕзточпоП -ролаксацпи умопьпаотся с рос- ■* тсч тшятзрзтуру, то ость то г;оро уволятолпя тгодвгояюстп молоку л S П-С^-^рзп.-энтоц. Это озиачсот, что доЯторопн а1 составе дштнх . .
"окуляр:их ípan.tonTOB. двпзутся с пастотсп, ирэшпювзжн лар.:о- .. pony частоту (oQ =• £я<30,1 МГц для дашшх.. .сгсспоржептов), п для . опрэдэ лппл врокопл корреляции Хц. попользовать ураппепиэ:
1 . Зл2 • e2qü 2 3 1 5
— » — (-) (1--S + — S )í_ (2)
Tj 2 h 2 2 0
Как ппдпо яп этого уразпогахя, скорость релаксации пряг.:о про-
порцпопалыга хс.
о
Подвппюстг. lí-C Hg-групп одяшкойп для ссох нзучешшх ^осфлтт!-
^líg-UTCX (В) И(Г) O COGELO £ВДи>2фИОГШШЛОИ:ЭГО (Д-И.47°С) бпслоя.
дилхоланов кш: в голэеш, гак е в иикокрзсташзгеэсзэа; üouSpffliftX. Воличпш квадрупалыгого расцешшвш тшжэ Олишсп, что создзгольст-Буот об отсутствии суцаствешшх раашгшй в кокфортада фооХохолз-иового фрггаоыта отшс фэсСоЕШлдов.
Споктры ^ll-fiUP щдаэкрестйлгачоскЕХ кзыбраз ез (24г),
ги5- ПГОХ (24В), 2И5-Гпгх (240) п гН5-ДГФХ (24а), СООТБОТСТСУВДВД 2-С^Но-группам, правэдоки на p:ic.4. Hex явдно сз сродотсидо!2sx
сшктроа, в случае фосфэтидилхолппоа 2Н5-ДПВХ (24г) а ПГФХ
(24В) сигнал 2-0%,-группы является двухкошонентиш«, что свидетельствует о пээквивалептпоста доЯтеропов в соствм второго метд-гэпогого фрагаапта угловодородпоЯ цзга в пологэша С-1 глицерина. Тэроход йлслоя из пздкскрясталлического состояния в состояние голя гопргсстдаотсл ппатггольшп yirapoinrcu сигналов 2-С?}^, что но посолило спрздоллть величины. ivQ длл дапшх сигналов прз тсшорату-■)0Х ста Т0:
11а оспсвслет сэлячшш avq спгпагз Z-C^^-rpynmi «orno оценить toirjoptisuni) углеводородных цепей в пологяния С-1 глицерина. ■ Воггозы ЛУд длл 2-С2Й2-гру1Ш фосфатпдилюлятов ают весьма Instete сличения порядка 25 кГц. Из этого следует, что данные ме-ялопоеуо группы находятся в составе углеводородных цепей перпен--[икулярпо плоскости Спелол. В случае липндов дяацлльного 2Я5-ДП"Х) а вцлглжаяьиого (2Н5-ПГФХ) тстоз длл г-С2!^-группы в кзгстргх присутствовала два езгпола, разлячажцпеся величиной «злтегэ в гзлтгпяга газадрупольгого расцепления для вткх сигналов оск.'.з позпачитолъпо.
IÍ3 рэлакссцпоплых • ■ гзмэротй! еядпо, что подвижности -С^-грушм d состагэ ^-ДПЭХ (24г) и 2Пб-ПГИС (24в) значигель-о ежэ по ерзвногяпэ с гИб-ЛШ'Х (24а) и ^-ГШХ (24<f).'
D целом, по дагата! 2Н-Я?ГР попфорлацпоппо-дгшамичосжю свойст-. а фосфэтпдплхолптш с простоя я слогпой эфзрпоЯ связь» в составе адгсогсрпсталл:г:зского Cv.or.on суцоствеипо пэ отличаются. Принимая э ппжаштз тот факт, что лпппдпыЯ С:тсло.1. алолоптчоских иаийран. ¡л Ф^зюлоппостспх услопзлх находятся" з згедкокрисгалличоском" со-голгтгт, место прэдполо^тгь, что биологическая 'активность липлдов
с простой эфирной связью реализуется кз на уровно структурной организация липвдного бислоя, а за счет специфических взаимодействий липидных молэкул с различными форгэнткл я рецептора«.
ООразцы фосХападвлхолиюв (24а-г) переданы в Обьэданешшй Институт ядерных исследований (г.Дубна) для нейтронографпоских ео-следований.
III,Исследование взаимодействия ыодельшх момЗрап - с фосфолппазой Один га .еозиииых шханпзков рэаллзециа биологических. £ую:~ ций фосфолипддов алкпльиого юта связал со спецгаТпчесюш взеиыэ-действием лгошдов этого 1слосса с фэсфоллпазой
Фосфолютаза является липолетичоскш форионто«, катагдзп-рущим гидролиз слоЕПОэфирлой связи в полоеэнкп оп-2 глзвдрофосфо-лотг.дав. К настоящему времени установлено, что ю/утржемтотеив сфолипазц л^ участвуют в тшеих ваших бдоимтч&ских процессах, как. образование лизоОосфатидашшша алклшюго тппа - исходного ср-одшгшшя в биосянгозе липидаого фактора щетнвоци! хромблщтов, ваг ппобоэдошо ерахидоповой кислоги - првдаестоаето'ка оШюзшювд(?в%, •
Полагает1, что вэцэства, отгабирувдие фоаЗолщиазу А2, обладать подоенный фармакож>гичосквми свойствами. Гю-кщ;^^!/» наиболее пэредактевшаи являются-вещества,' способные шгпбьрзтгь фосфолшюзу т нарушал при этом структурную организацию кеыб-ршш, в частности, липнда с простоя афирной связью.
Ршшо в напей лаборатории било показало, что насицэнше фосфатидалхолина даалюшшого • тело являются афЕоктиЕЯша ингибиторами фосфолипаза а 13 ингпбиторная активность коррелирует с противовосяалителыша свойгтвшя.
0 Ч
2 «I
29 .4
rrn
рги
ГРН
Гко.Б-Кглгопяя и спэктрзх 31P-ffiP лпгосом :тз ста си яичного Фсс^лгщто.'гша с 1,3-эт-;с:одэо1Ш\га1зро-3--фосфоход1тсм (а), 3,2-CT-^o^3onjTJEruDpo-3-isc5oîCbTn:cri (б) п 1,2-ля-0-(9,10-окта-ДОЦЭ1Ш)-гаэ-ГЛЩЭрО-3-фОСфОХОЛППСЫ (В) • пря ЕЗаПМОДЭЛСТВЯП о ОооЗолгпгзсЯ Ag. • •
В состав бпологичосхих нсмбрап, как прошло, входят фосфоли-ппдц с пэпасип;вппа£1 гадрофобпша остаткизи.' В связи с отим, представлялось необходаод! изучить злияпиэ па активность фосфолипази А2 П0ГПДРОЛГПЗУ01ЛХХ деешп! фЭр.'знгс'л фосфатаДИЛХОЛПЛОВ (24д,з), со-дор2п.тзх остатка ronccu^éinnzx спиртов и кислот. .
Для ПЗУЧЭШЛ ПЗППМОДЭЙСТВИЛ'фОСфОЛИПССи Á2 0 фОСфОЛППВДПШИ
кохэхулкя в состава лшадпого бпслоя использопаппо тачоиых дей-
терием лшшдов является нецелесообразным из-за высокой стоимости синтеза, при небольшой информатпвнобти катода в данном случае. По-,
этому нами был применен новый подход, основанный на использовании
31 '
спектроскопия Р-ШР, позволявший регистрировать структурные из- . менения в мембране в процесса гидролиза лппидов.
Цультилаыеллярные липосош, построенные из ляпидов (24д,к) в их
31
смесей с яичным фосфатидплхолшюм, дфст в спектро ^'Р-ЯМР шфокий - анизотропный сигнал с пиком в сильном поло и плечом, направлошшу . » в слабое поле (рис.5).
■ При добавлошш к лшосомам, построенным кз. пр;гродиых фосфа- . тидплхолшгав, препаратов фосфолипази А^пР311010^11, гядродна фоофэ- '
липидов и образующиеся продукты гидролиза вызиваат разрушение ли>
" ппдного биспоя лппосои. Разруизнио ляпосш сопровоадсэтся. обраго- . ■ вашем ыицеллярных структур. В сроках ^Р-ШР сто еэтодпт отро- ■ кзшо в появлении узкого оззол^^Щ^уч) сигнала, цнтоьскг'юсть то- • торого уволачивоэтся в точецпй вроюнз 'пЕкувещш Лштосо:.: о пропс-ратами фосфолипази (рлс.5а). Елодоегй г ссствз 1 ,?-ди-0-(9,10-октодецоша)-г>см-гетцоро-3-^&сфэ101;1:;э 'или 3,?.-де-олеоил-ая-глицоро-1-фос4отолшха приводят к рсзкоглу сашдпещо итого процесса (рпс.50,8).
Образцы фосфатпдалхолгаюв (24о,п) поредели в Центральна Кз-ститут трсвмайыюгии и ортоподип ЦЗ РО для проведения испытаний па противовоспалительное дойствпэ. ••
вывода
1 .Разрабстаны удобные в препаративном отноиенин метода регио-т ВЛ9КТИВНОГО введения дейтерзевой метки в состав фосфолипидаой мо-. эгсулы.
2.Синтезированы меченые дейтерием фосфатпдалхолиш, содоркащио дкилышо и ацильшо заместители и -несуцие дейтериевую метку в труктурло оквивалзптпых частях молекулы. Полученные фосфолипиды редставляиг все возможные комбинации присоединения гидрофобных о'яюкрптов за счет простой и слояюй эфирной связи.
3.Методом 1I-ЮТ-споктроскопии изучат модельные мембраны, по-троенпие па основе этих фосфолкпидов. Показано, что конформациок-о-дапс.'ячэскиэ свойства фосфолшгадов с простой и сложной эфирной вязыо супоствонио пе различается.
4.Синтезировали пепаскцешшо фосфатидилхолшш даалкилыюго и пацплыгого тппоп, пагидролязусше фосфолзпозой А2> Методом 1 Р-Я^Р-споктроскопти изучено пзся.годейстше их с фосфолипазой А2
составе 1юдэдъпих изибрш п шдтЕзрздено, что дагаше фоофатидил-ОЛЯШ ПВЛГПЗТСЯ СЭЗгООТПВ 12ВЛ ППгеОПТОрСЗ.П фосфолппози Äg.
Оспогпоэ содэргзппэ дпссэртацга излогого в следующих аботах:
1.Чудппов Ii.В., Чуппа D.B. 3,Р—ПИР исследование взаимодействия зофолипазы Ag с мемОранпкя, содорзкззля диалкпльпцй фосфатидил-олпн.// Бпологпчо.скп активные соодшюнип, синтез и использование, эзпсы докладов (28-29.09.92). Под ред. Н.В.Клюова. Пенза.- 1992, 3.83-84.
2.Чулан В.Б., Аникин A.B., Чудпнов М.В., Ооребретшковв Г.А., встагпзова Р.П. Изучение взаимодействия фосфоляпезн Л2 с поли-
мерными лшгосомош.// Доклада PAH.-1992.-T.326.-JU.-C.73Ch-T34,.
З.Чудиноп М.В., Аникш Ц.В., Ашосш A.B.., Bpammv,Д.А., Чупш В.В., Серебренникова Г.А. Синтез фосфатидалтолиттоп,..салшгагса кь-чвиых дейтерием.// 'Биосрганическая хп,'£Ш.-1993.-ТИ9.-С.
4.Чупип В.В., Аникин U.B., Чудщюв И.В., СороОропншэва Г.А. Исследование каыбран из фосфатидалхолинов даацшгыюго, чшааиаетэи ного, вцилалкильного и даалкнлыюго типов катодом спактросаюшя
о '
'■Н-ЯМР.// Биологические иокбраш, в почета. '
\ .
г
Зак.605 тир.80 экз.Ротапринт ШГШ ии.Доионосова