Синтез дейтеромеченных липидов с простой и сложной эфирной связью и изучение их свойств в составе мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Чудиков, Михаил Васильевич АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1992 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Автореферат по химии на тему «Синтез дейтеромеченных липидов с простой и сложной эфирной связью и изучение их свойств в составе мембран»
 
Автореферат диссертации на тему "Синтез дейтеромеченных липидов с простой и сложной эфирной связью и изучение их свойств в составе мембран"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАШШ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕШЛОГНИ ем. П.В.Ломоносова

Сават Д 063.41.01 .

Но правах рукописи

. Чулапоа 1£яезл Вэсяльегач

СШ1ЕЗ ДВ&ШШЧЗШП ЛЗППДОВ С ПРОСТОЙ П СЛ0Ш10Й ЭГ^ПЮЯ СЕЯ2Ш Я ГЗУ-ЖЗ ПХ СВОЙСТВ В СОСХАВЗ Ш25ВШ1

02.00.10.,- Бгооргшшческпя лзята .гатих пртрадгаа ц фютояогпчвски ектиешх вепузотв,.

АВТОРЕФЕРАТ

дпосортоцш ЛО СОИСГОИШЭ ЗПЗОЯОЙ СТОЛШЛ кагтдядато хютггостсях наук

Цосква

1992 г.

Робота выполнена на кафедре химии и технологии. тонких орга^ нических соединений Московского ордена Трудового Красного Знааэнп института тонкой химической технологии сл. Ы.В. Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат пашескнх наук, доцент

Чуташ В.В.

Стадиальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Василенко И.А.

кандидат Оиологическпх наук, старсгаЗ научный сотрудник, Литвинов И.О.

Ведущая организация:

Научно-исследовательская лаборатория биологически-активных веществ гидробионтов. -

Защита диссертации состоится '_" ' 1ЭЭЗ г. в

час. шт. на заседании специализированного Совота д-063.41.01 при Московском институте гопкоа химической технологии им. М.В.Ломоносова (117571, г. Коскво, пр. Вернадского, 86.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ ш. М.В. Ломоносова. (119631, г. Москва, ул. М. Пироговская, 1.).

■ Автореферат разослан "_" __1332 г.

Учений секретарь специализированного Совота, кандидат хишчоеккх наук,

старший научный сотрудник . Лютик А .11.

'»'''Лч» ; !

I'»- • Л- ■ , . I Л-> ■,< ■.Ц.Н' '

-------—!

Актуальность пробдэкш.

Исследования структурной организации и принципов фугациони-■ ровэния Окологпчоскях ыем<5рал - актуальная задачэ современной молекулярной слологпл. Для изучают структуры п динамики мембран п

последнее время широко используются методы дифракции нейтронов и р

ьН-ЯМР-спвктросксп::п, дзп^ле непосредственную информацию о по-дшгаюстп г'одэкуляршсс фрагмантов, кх взоимораспологонии. ориентации. Пря пспользовошш данных методов необходимо наличие в мембране дейтеромеченшс компонентов, то есть, возникает задача •. сзнтеза аналогов природных ляпвдов, содержащих дейтериевую метку.

Нетодо 31Р- л ^Н-ШР-спекгроскоюст применяются в ряде лабораторий г-ира для разрешения вопроса о ыэханизме биологического . действия так пазываемиг лнпадов с простой эфирной связью (еШзг 11р1Лз). Соединения этой группы отичавдсн от оОН'пшх ацнлышх ли. - лядов сяосозом присоединения гвдрсфсОяах цепей и гядрсфкльнсй часта молекулы: гёростая зфяриая сишь (алкнльниз лшшдн) или . ад-взасиплосС^ртгая связь <ш1апкакгл»1ш) вместо слояюэфйрной сзп-

ЗН.

■ Проблотло пгяскенля Сголс^поскпх фушшяй лгатидов о простой гфярпой спязъв считается восьма актуальной в дтщдояогяи- на про-тятяпш! нескольких десятилетий. Способность соединений этого тала-в сорву» очередь олкильшп лишдов-^вкзавать множество физиологических Аффектов и пдвнпфскеция таких бнсокосктиенцх липи-ДОВ ХЕК фтстор активации тромбоцитоз (1 -0-аЕЖ1Л~2-£:ЦОТ1М-аП-ГЛЩО-ро-З-фосОохолпп), (шлящяйся медиатором воспалительных и аллврга-чоскпх реакций, мощные мутагены лташдной природа-фекапвнтаены, обладающие противоопухолевой и иммуномодулкрущей активности

аналога алкиллизофосфолипидов, в значительной степени определяют необходимость разрешения этой проблема.

Механизм биологического действия липидов. с простой эфирной • -связью кокет реализоваться на двух различит уровнях: в структурной организации мембраны т. в спвцифичвском взаимодействии с раз- ■ - '' личными ферментами и рецепторами, например, фосфолипазой HJal ['

рецепторами липидного фактора активации, тромбоцитов. . .

? ■ !>

Мокно огидать, что применение методов Н-ЯМР- в . < 31 Р-ЯМР-сшктроскогош для изучения структуры модальных мембран в - j их взаимодействия с • лжолитаческимя ферментами, в частности ■ ; фосфолипазой. Ag, . приведет г решению ряда теоретических п ^ практических проблем молекулярной биологии. • .- •

Данная работа выполнена в соответствия с планом научныг ис- - Í следований кафедры ХТТОС ММ1ТГ ш.М.В.Ломоносова по теш .'Я 1 -865 , Í "Выделение и синтез отдельных молекулярных типов лшздов, исполь-зоваш:э их для изучения клеточных взаимодействий и создашэ на их основе диагностически, и лечебных препаратов" (номер государственной регистрации 0186.0132597;. - ..

Цель работы.Настоящая работа .посвящена синтезу фосфатвдалхо- . линов алкилыгаго и вцшшюго типов, содоргазшс селективные дайто-риевые метки в гидрофильной и гидрофобной частях молекула, с насыщенными и венасшцанными гидрофобными замэспггеляшш и изучена» мембран, сформированных из этих лктадоз, штода-з 2Н-ЯМР-спекгроскопип и 31Р-ЯМ?-спектроскошш. • .

Научная новизна а практическая ценность работы.

Синтезирован ряд селективно моченых дейтерием фосфатидалхс$вшов: 1-(2-2Н2)-хшльшгош1-2-па^што1М-гас-глзд9ро-Зм1осфо-(3'--2Н3)-хаЕВН

(2Н5-ДПВХ). 1 - (2-2Н2)-паль»!11Т01и1-2-0-гвксад8ШЛ-гас-глицеро-3-фос-фо-(Г-2Нз)-хопш (2Н5-ПГФХ). 1 -О- (2-2Й2)-гексадецил-2-пальмитоид-пзс-глпд9ро-3-фосфо-(7-2Нд)-10лш (2Н5-ГГЮХ) и 1-0-(2-2Н2)-гекса-дацзл-2-О-гвксад91Д1я-гас-гл:г40ро-3-фосфс>- (г-2Н3)-хотя (2Я5-ДГ'ФХ).

Дагашо соединения представляют все возможные комбинации присоединения алифатических заместителей к глицериновому фра тенту ыолэкула за счет простой или слогэтой эфирной связи.

Дейторомочоние липида были использоваш для сравнительного

изучения образуемое ими мембранных структур методом р

Н-ЯМР-сяоктроскоппи. Получено информация о коиформационно-•" дапамачоскпг свойствах ашьлышх лтидов и структуре образуемых t2.1t ШИбрПП.

Стштоспровпл ряд ивпасшцопниг фосфатидилхсшшов пцильпого д олкильпого , лзляицихся потонциалышми ингибиторами фосфолп-паси А,^. Для лзучэнля ззигаодэйствпя фосфолипази с Фосфолипид-" тгсс. ¡тодекулкги ~ ссставэ липнзногс олслоя был использован новый подход, ос^звавгшЯ пэ использовании спектроскопии Р-Я!/?, гозво-ляггзтй реглстщ-'озать струк'/урм.'о езмоиэняя в мембране в ироноссз гидролиза лшщдоз.

На зг""1ту заносятся сяэдуэдяэ основные положения: исследова ния ю срасштельпсму поучопи» кснфоризикошо-динемичвасю: свойств

• фосЗатядалходлюз с простоя и слоиюгфгопоЯ связью в составе мо-•. дэльгах ыэмбрзз! 'методом 2Н-ЯМР спектроскопии. Метода введения дей-

• торяэгоя котки в гидрсфальнув и гядрсфобнуо части молекулы фосфо-ялмда, сиптоз дэАтвромэчешх, фосфатидилхолинов. Исследования взсзгадойстаня фосфэлипази Л2 с модельным липядными мембранами катодом 31Р-гаР спектроскопии. Синтез пеиасшетшх фофатидилхоли-

нов алкильного и ацильного типа - ингибиторов фэсфолипазы Ag. ■

Апробация: Результата, изложенные в диссертации, доложены на международном семинаре "Investigation of tlio biological and lipid' membranes, amphlphlls by neana of neutron scattering" (Дубна, 1921.05.92) и конференции '"^алогически ектившв соединения, синтез и использование" (Пенза. 28-29.09.92).

Публикации: По материалам диссертации опубликовало 3 статьи и тезисы конференции.

Содержание работа: Диссертащклшая работе изложена на страницах мааююписного теиста и состоит из слодуизих разделов: вводэ-ние, литературный обзор, поев:' ;ешшЯ методам введения селективных лзототшх меток, обсуздашю результатов, екснериментальная часть, вывода и список использованной литературы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ЮС ОБСУВДЕНШ.

I.Синтез фосфатидшиолштов различных типов. Известно, что поездошю насшзднгшх фосфатидилхоганов алкиль-ного типа в составе липидног: Сислоя в некоторых случаях суцест-венно отличаотся от поведения их диацилыих аналогов. Так, г.;э годом дифракции рентгеновских лучей было установлено, что 1,2-дигоксадецил-ад-гл!щоро-3-<£ссфэзсолин и 1-гвксадецил-2-паяь-кштоил-ап-и;що]ю-3-фосфохолш в избитко вода Форагруют голевую Оислойную фазу со взакшшм проникновением цепей (lnterdlgltated phase), нохаракторпую для 1 .г-далальштоил-агс-глщеро-З-фэсфохо-лина.

' Для изучения влияния молекулярной структуры алкильннх лилидов

о

на их конфзрмациои'о-дшгагдгчэскхэ свойства мэтодами Н-ЯЛР спек-

троскошш и лфракции нейтронов нами были получены дейтеромеченые фосфатидалхолзпш со всеми возмогамот комбинациями присоединения гидрофобных целой за счет простой и слоеной эфирной связи, содер-дейтериэЕые гэпш в структурно эквивалентных частях молекулу.

Для синтеза фосфатидилхолишв бил Еыбран удобный в препара-•лвлом отпопения гетод, основанный на фосфорилировании 1 ,2-дпз£^."9СЭ1Шых глицеринов хлороксидом фосфора и взаимодействии образующегося дихлорфосфата с растворимым в хлороформе п-толуолсульСопатом холила. Необходимым этапом в реализации данного ме^рдз пютсп синтез дейтерсмоченых 1,2-дизамещегашх глицери-гсог? п п-трлуодс ульфонат а (г-2Н3)-холкна.

I. Получегсга дзйтеромечешх синтопов . <?. л-Голуолсульфонат (г-2Нд)-хо,шт

Покгрусязго дейтеромечепого п-толуолсулъфопата холина осуща-... р от^дядэрь исходя вз кс-пдэрчэстш доступного гН3)-метанола.

По способу , раме описанному в литературе для получения ие-

' о

дс-^твр'.^рхгяого трэилага хо.'г.гпа, взаимодействие (сНд)-метанола с

р

п-ролуоллул-фохлоридом дает (.Н^)-метиловый офир п-толуолсульфо-гшслот (1). Алкилируя им Я.Л-дкметилЕмшоэтаиол, получали тозилаг (Г-2!^)-холила (2) (схоыв 1).

б.^-Мечаше гидрофобные заместители

Построение 2П2-моченых гидрофобных сштонов осуществляли исходя га (2-2Н-> )-пальг.мтиновоЛ кислоты (4), лолучешюй реакцией изотопного обмет та метилового эфира паамитгловоа кислоты и (2Я)-метилового спирта, согласно схеме 1.

Этот способ удобен в препаративном отловекии я позволяет яс-

пользовать в качестве исходного продукта пальмитиновую кислоту. Прямой изотопный обмен а-матиленовых протонов пальмитиновой кислоты протекает в довольно метких условиях' (КаС^Н/^О, 200°С). Ккс-лотность протонов а-катиленового сегмента, находящегося при слоа-ноаХгфноЯ группе, выло, поэтому для проведения дейтериесого обмена

пальмитиновую юхелоту переводили в мэткловыЯ ефф (3).

р

Кипячение мэтилпалыотата (3) в гН)-катаноле в течение ко-скольких часов в присутствия 102 иэталота натрия дао? (2-2Н2)-пальш1тшювую ка&яоту с изотопной частотой, определяешь равновесными условиям;:, т.е. соотноаением (^И)-ыатшюла и кэтал-пальмитата (3) в реакционной лчеси. Для оптимального использовгшш (2Н)-метанола процедуру обмена осуцествляли и два стадия, контролируя ход реакции по исчезновению в спектрах 1Н-ШР трпплзта

• а-метиленовых протонов (в около 2 м.д.). При обработка роокцконпоЗ

?

массы происходит ошлвнио (2 - Н^ )-иоталпвлькитато в соответствующую кислоту со, которую пероводали действием хлористого тсопила с хлорангидрвд (5) или мэгаловий ефир (6).

Восстановлением кэтнлог-то »фиря (2-гН2)-паяьштшюво2 кяо-лоты (6) алшогвдршш лития бал получоп (г-2!^ 5 -гбисадащу.0Ей спирт (7), которой-проврадали в (г-^ЬгоксадецидОроизд (в) действием РВг3.

Контроль за изотопной чистотой получонша соединенна осувд-ствляли методом 'н-ЯМР, измеряя остаточную интегральную ютепсив-ность триплета а-гаталоношх протонов в 1Н-ЯЦР-споктро соединения. По этим данным, степень изотопного зтэцзши в промокуточвдх соединениях провдаала 95%, а в конотах продуктах-903.

Схема 1

Получеипо даПТ9ро;.:9Ч01шх спи токов

|с»Иа«<

сн9^Ко3с»на (1 )

jnOCHjCWalHCM,),,

nocMaaijM-CH, (а<э), -аЧэ-^^со; (2) CHjû'H

снa (си3 ) t4cccQ<3-► о (сн, ) 10с*н,ссоя

(3) (4)

COCI э

(4) -» ем3{сня>13с~насос!

(5)

СЧ3СН LÍAIH»

(4) —2-, см.,(см,,).,.г.сгн5ссссн, --

(6)

РЭгл

СМЭ (CH3)t3C3U;,Ö)aCH--► • CHa(CíJa)1.aC;>»aO(,Dr

(7) (9)

: 2. Получение 1 .г-даеиэдвпгох. глацортов

(йштез t ,2-д;:зя:.!ацешшх глицеринов осуществляли исходя из азонролллядоетлпцеряна (9) в случае соединений (16) и (13а,б) или та 1.3-бенэтшдагтггцерлпч (17) для соединения (19). содержащего алкилыпй оп:,:еститоль во 2-и пологеша глицеринового фрагмента (схема 2).

Алкшшроваше (ацилироввние) Езопропилидэнглпцорина (9) соединениями (5) ш (8) с последующим удалением зеднтной грушшроти приводит к монозамещэтшм глицеринам (10а,б). -*

Использование на следующем втапо синтеза различных заздтшхх группировок: дкфеиилмотш-гшушюй для даацилького и алкилациль-ного диэфироп или тритильной для диалкильпого производного связано с меньшей СТббИЛЬНОСТЫ) слокноэфирнсй связи. При удалении тритильной защитной группа возможна оцалъная миграция. Б то гэ врошз. высокая лабильность дафолилметилсилнловш вффов по позволяет использовать зту зешитнуп группу в условиях реакции алкилировшшя.

После введения дафонзым талсилильнсй эаднти производите (11а,б) Сзз выделегая подвергали ацшироваякл кзбигком хлорап-гидрида пальмитиновой кислота, зотэм задитную группировку удаляли • в присутствии фторида вшсиия, Первэтиув гидро-сшапуа группу

о

1-(2- ^Э-гзксэддцилглицерхша (10а) блокировали тритильпо5 зсдаой к поело алкилироваиия соедштопия (14) гексадецилброг.идои и удала-шя защитной группы получали диэфир (16).

Для получения сцилалюш''.ого производгюго (19) 1,3-Оонзшд-: . деш1лицерин (17) алкидировшш гексадоцилброг,гидом и удалял:: задатку» группу в кислой•сродо. 2-Гвксадвцилглнцврул (18) иодировали с условиях недостатка хлорапгидрвда (2-^Н2)-палы.штшювоа 121 слота

(5), ЧТО ПРИВОДИЛО К ЗаЧОЦОШЮ ТОЛЬКО ОДНОГО ИЗ СВОбОДШЙ. П0Л01Л-

ний глицеринового фрагмэнта.

Ненасщошщв дазакзщлишо глицерины (?3а,б) получали, адкшшруя или ацилируя тригилглицорпн (20) соответственно .тозялатом олеинового спирта (21) и ыкюшвдорцяом (22). Поело удаления тритильяоЯ зашита создкаонмя (23а,б) о\тд,ага хроиатогрсфиоскя.

Схома 2

см,см I

Инн. ен, I ^ ^ си

Псуогчвгав 1,2-дтаЕ;*ог:э1а1Ы1 гллцорпшв 1. (5) аа (8)

(9)

? .ToeCtH, ClUß»

trci

. Ру {"

см.ол I

снсн »

СИ,см

(10а.б)

tW»*3C.Ct

ataOaisC^lla^CHa >апС1<э

СНСН

I

OyJTi-

(14)

CHS<CJ»I

сн,сс»,с*и, <a le ) taau¡

aî0(c?ta)lteHs

OI3OTf i

(16)

tt»„8ICI

at, оси, с "м, (см,)1асм,

ао(ац),0а(э

а»,cu

(16)

сн,сл

сном I

сн,оз1 twPba (На.б)

СНа(СМ,),.*С0С1

aire? t

ato-co(CH,,)14eMa CH,031ÍM4>} -<12а. б)

I

снаоя

сно-со(сма)4Чсн,

СИ,он

(13а,б)

сн,о HOCH Cl CH30

(IV)

1. a<a(cn3)t jDr

2. н*

ích¿ki il

XHO(CHa),taÇHa CH30H

(18)

Схема 2 (iiposojcaiiiíQ )

(5)

СН2ОСОС»Н,(CH,)laCU3

CHOCCHaJ^.CHa

chjoh

(19)

сн, он

№ Г H,

1 .TrCI ,'Py 2.Toaûh

(9)

i- - . , Il H ,1 .

R= -CpÇ3H3(CHj,)iaCH, -CHaCaha(CHa)i3CH,

CHaCil сном

Л. .

CHîOTr

(20;

1 .KCl ИЛИ íiOToe

H

:+

си~ся I .

■СНОП i

ch¿ún

(23ü,ö)

■r» -cûcî(a í¿t 12')б¿t-í=ct/fcna')vch3

3. Синтез'фосфатвдшхолинов

Получение фосфптидилхолинов (24а-о) промдик, 00ра<3ативал 1,2-дизамещетше глицоршш (16), (13а,(5) к (19) 'хлороксидЬ'м-фосфора и n-TajiyojicyjiHiOHaTOM "(г-^ц^-хо&ша боз'ваделешш ' пршеауточ-1011 продуктов (схема 3). Поело экстракции "и хрокатогр£ф!Чоской очистки липидц кристаллизовали'из ацогона.

Аналогично Ошэ тлучош'фосфатзд^аоляш ' (24д,о ) ,'"по с "применением немеченого то&яаать холила. Роцошческув таюсь '1,2- ■•■к 3,2-диолоокл-оп-глицорэйосфохо."5шоь (о ) гвдроя:оЬв0Ля:,фоёфоллпазЬй

А2, содержащейся в цельном яда »Си. Благодаря стереоспецифнчноста фэр.'.опта гидролизу ется только фосфатидилхолот природной конфигурации 1,2-сл. Из образовавшейся смоси продуктов выделяли 3,2-Д1»леоил-а7г-глиц9ро-1-фосфат:1ДНлхолнн (24я).

Получение фэсфатвдшшшотов

Схема 3

сн.-о-гг1

I

сн-о-пя I

а),си

(2)

РОС1.

СН,-0-1Т»

см-о-п» I

сн

,-о^ра

1аснам(снэ)ас»на

(1б;13а,б;19;23а,б)

(16.24а) П*я-СНаС3!\л (СНа ) » аС"з Гя—СНаСНя (СИа)13СИ;,

(24 а-е)

(13а,246) ГС1«—СНаСН, (СНа)13СНа П2в-с(о)СНа(сна)1асна

(19.24а) П*"-СНяСНг'(СН2 )1,аСНа

(136.24г)

(о)С,На(СН2)АЗС!!^

ггг»-с (о)сиа (сна)»Зсц,

сна-о-п

С!ЬО-П

I

сиаон

ТееСо!.

РОС1,

С!1а-0-П

акт

I

сня-а ' (снл) а

Л-

п»-осиа (сн,) 7а*=сн (сиа) Тснэ (23а. 24д)

п»-с(о)сия(сна),сн=си(снэ)тсна (230,240) То«Со1= тозилат холила

Схема 3 . (продолзэщгэ)

см,оа

«осфолшвзо Ао |

(246) -кк»

I

сна-^^ссмвсн,« (сн8),

\ /

\Фоофолшшза А2 " ° (25)

СИ.ОЙ

I

ис-ог» I

СИ^-ООСЬиСН^СН,,),

(248)

II.Исследование структура к дкиакжп шдвлышх из»3рш штодоа 2Н-ЯМР-спзктроскокй1. Селективно кичешо дэйториеи фосфатадалхолаки {24 а-г) били ио-пользоваш для кзучвття струксургшх пароходов н конформацпошю«-

динамичеасих свойств липидшх ыолэкул в состава блслоя ютодоа

р

Н-ЯМР-спектроскогам. Наличие и цолскулз коток доух гепоз-о катальной груттло холпиоеого остатка (Я-С^Н^) и во второй штилеповоЁ группе заместителя прл С-1 глицерина (г-С2!^) - шзеоляло одноврэ-мошго получать информацию о состояашз гидрофильной и гвдрофобкоЗ частой бислол.

Спектрц 2Н-РДР коцбрви ссак сссяодоваЕзчхся фосфатпдэлхолшюв оказались качаствзшга одпиакоьг&г.: с продсгавлош но рис. 1 па примере гПь-ШШ (24а). Пр; тешоратурад тс мира тури фазового

порохода голь-гидкнЯ кряоталл (Тс) и спектрах наблюдаются два типа сигналов, значительно отдгсаюялхся по величине квадрунольного рас^оплегам (Ду^). Вэлячйиа Ау^ зависит от природы связи, которой атся дойтерпя прпсоэдашои и молекула, от наличия усрэдняющих двиганий, соЕорзае>гдх двйтеропом и составе молекулы пли ее фрагмента, а от орпонтсщп! содорггл.с>го нотку тлэкулярпого фрагмента п липид-гом спслоэ:

3 е?яа

1у--(-)3 (1)

0 4

гдэ о^чО/Ъ- статическая константа квадруполыюго расщепления, рав-пся для связи С-2Н 170 КГц; Б«<1/2(Зсов2в-1 )>-молекулярный пара-' !*этр порядка, раипнА отновогош наблюдаемого и максимально возмок-пого гшадруполъпого расцепления; »-угол »¿езду £-Я осью динамичео-кого усредаэггал и направление» связи С-^Н; углошо скобки означают усрэдалаэ по I дтконияк. Потсэшю молекулярного порядка за счот . появления косах двпгэппЯ, Оистрих со временной шкало 2И-Ш.(Р, присолят « угянкззппэ псблвдаотего квадруполыюго расцепления. Таким образе;!, ггг:.!эпстаю сэлгпши Ау^ отраяаог длшотчвеки усредпегаше структур:из а кепфоргшегагамо перестройка а кеморапв.

В спектрах ^Н-ЯУР фосфзтпднлхалииоЕих >.:вкОран сигнал о конь-епз гпшярупольггш расцеплением (ряс. 1а,<5) соотватствует метко, рвстологояноЗ в облядогг.зм болыгоа кетформациопной свободой холи-ковоп Фрагменте. Бастрио тлэкуляршю даитаппя, а тагазэ внутримолекулярные предания С2группы вокруг С-И, С-0, С-0 п Р-0 связей приводят к значительному уерэдпоизю сэличилн'ду^, Сигнал с большим квадруполышм расцеплением (ряс. 1о,о) отвочаот 2-С2Н2-сегмэнту, для которого число степеней свободи суг,оств<эгаю меньпэ по сравне-

MiO). ?Т;Г^тПС"Х ifi ffamx. (fr,,tj) j¡ r состава... голтого.

n^CNiWsnOT^parï^jn^àxXqjfipiflcopOj .pçïçjijia. ^Горьпэд .ппгюпая^шггеп -япгпость рбус^р^лопа зпптатвлшоЯ пирпной

i того '.цалтлтл. оРтдог'пр^э „¡¿щрррплыртх ^пптопсяспостой сигналов ï-C^IIg-H.î'ijU-C^flIg-pp^^pnnno 2;3. 'что соотсотствует коотчоству • т?кТ;ОРСТОЗ п ,состпг:э дшшх груш в г.олзкулэ 2Пс-ДГОХ (24а).

Срйп'эпта спрктроп голэвях п гпдаоЛртстаяЕиогаип нэм-

0.0 ) 11 I I I I I I 11 I I м I I I I I I I м I I ч I I 11 I I I 11 26 30 35 40 4Ь ЬО 66 00 Температэра, С

(

Рис.3-Гргфвш тошюратуркоа »акзох^ости вэлзгшш квадруполь-ного расцошюняя и-Сри^-грунш ^-ЯШ! (£»).'^-ГПЭХ <)0. .2%-ПГМ: (□) в г1%-ДГ£аС (О).

бран нэ.^Ид-ДПИС (2<г). 2115-ГП®С (24а), 2Н5-1ТОХ (246) в 2Нб-Д!Ш (24а), отвачащио сигналам Н-С^Нд-груш приведены ка рас. 2. При тэыпературах шяе Т0 о споктрах цсбяодаатся тшшчшо для случая аксиальпоЯ шг^этреа сигналы, ш которых ваязчано ¿Уд оорода^шгсь непосредственно как честотиоа расстояилэ швду исксшуиша. Дна опредолоипя квадруполъного рассэплзыня в сигналах гола сих шиброа проводилась кокпьюториаа сшулядая сгссперсяштшаЕЦх спектров» Вояичшш Лу^ в шчисхшетдо на &х основа паргьатрц порядка (Б)

возростают а ряду 2Н5-ДГИХ < %5-ГПЭХ ~ 2Н5~ГПЖ < 2Н5-Д,"гс как для Г0Л9Е1П, тая я для етдпкфясггадлпчэскцх моибрая. Таким образом, по езрэ угэньпшпя содержания в ляпидннх молекулах карбоппль-' • пах групп копфор-мцпспноя спободз холлповых остатков несколько

ОГрГ.ТГГ'^^ТСЯ. .

■ Пароход Спслсл ггз гпдкогфлстодлгггасгсого состояния в состояние

■ голя сопропо-^сэтсл етк.гзгошяом ютэлруполыгого расщепления и упиро-р

1л:зм с:!птгов ü-C IIg-групп. Опродолоппэ TQ осуществлялось из тем- , порптурпоЛ зорлсгмостя волячкпп сигналов Н-С2^-групп (рпс. -3). Опрэдэлэшшо твкям образом значения Тс сказались в хороием со— отезтсткп! с пгагг^пся в лпторатурз данншл для дипалылитс л-, . ОТсксэдэцил- п гексадощшгалы.ятопл-гас-глнцерофосфохолша, ...

Для опрэдолпппл дппсячэскпх характеристик лгатдгаи молекул в состппэ Скатал "лс'.гл Con пропздзпя пс::орзпил ■ времени сшш- . ропототпоП ролгпсссцпл Т(. -

Из рзлахсецггопгах пзмзрошй! прл разшх тошорзтурах Сило опро- . дэлэпо, что скорость сшт-рзЕзточпоП -ролаксацпи умопьпаотся с рос- ■* тсч тшятзрзтуру, то ость то г;оро уволятолпя тгодвгояюстп молоку л S П-С^-^рзп.-энтоц. Это озиачсот, что доЯторопн а1 составе дштнх . .

"окуляр:их ípan.tonTOB. двпзутся с пастотсп, ирэшпювзжн лар.:о- .. pony частоту (oQ =• £я<30,1 МГц для дашшх.. .сгсспоржептов), п для . опрэдэ лппл врокопл корреляции Хц. попользовать ураппепиэ:

1 . Зл2 • e2qü 2 3 1 5

— » — (-) (1--S + — S )í_ (2)

Tj 2 h 2 2 0

Как ппдпо яп этого уразпогахя, скорость релаксации пряг.:о про-

порцпопалыга хс.

о

Подвппюстг. lí-C Hg-групп одяшкойп для ссох нзучешшх ^осфлтт!-

^líg-UTCX (В) И(Г) O COGELO £ВДи>2фИОГШШЛОИ:ЭГО (Д-И.47°С) бпслоя.

дилхоланов кш: в голэеш, гак е в иикокрзсташзгеэсзэа; üouSpffliftX. Воличпш квадрупалыгого расцешшвш тшжэ Олишсп, что создзгольст-Буот об отсутствии суцаствешшх раашгшй в кокфортада фооХохолз-иового фрггаоыта отшс фэсСоЕШлдов.

Споктры ^ll-fiUP щдаэкрестйлгачоскЕХ кзыбраз ез (24г),

ги5- ПГОХ (24В), 2И5-Гпгх (240) п гН5-ДГФХ (24а), СООТБОТСТСУВДВД 2-С^Но-группам, правэдоки на p:ic.4. Hex явдно сз сродотсидо!2sx

сшктроа, в случае фосфэтидилхолппоа 2Н5-ДПВХ (24г) а ПГФХ

(24В) сигнал 2-0%,-группы является двухкошонентиш«, что свидетельствует о пээквивалептпоста доЯтеропов в соствм второго метд-гэпогого фрагаапта угловодородпоЯ цзга в пологэша С-1 глицерина. Тэроход йлслоя из пздкскрясталлического состояния в состояние голя гопргсстдаотсл ппатггольшп yirapoinrcu сигналов 2-С?}^, что но посолило спрздоллть величины. ivQ длл дапшх сигналов прз тсшорату-■)0Х ста Т0:

11а оспсвслет сэлячшш avq спгпагз Z-C^^-rpynmi «orno оценить toirjoptisuni) углеводородных цепей в пологяния С-1 глицерина. ■ Воггозы ЛУд длл 2-С2Й2-гру1Ш фосфатпдилюлятов ают весьма Instete сличения порядка 25 кГц. Из этого следует, что данные ме-ялопоеуо группы находятся в составе углеводородных цепей перпен--[икулярпо плоскости Спелол. В случае липндов дяацлльного 2Я5-ДП"Х) а вцлглжаяьиого (2Н5-ПГФХ) тстоз длл г-С2!^-группы в кзгстргх присутствовала два езгпола, разлячажцпеся величиной «злтегэ в гзлтгпяга газадрупольгого расцепления для вткх сигналов оск.'.з позпачитолъпо.

IÍ3 рэлакссцпоплых • ■ гзмэротй! еядпо, что подвижности -С^-грушм d состагэ ^-ДПЭХ (24г) и 2Пб-ПГИС (24в) значигель-о ежэ по ерзвногяпэ с гИб-ЛШ'Х (24а) и ^-ГШХ (24<f).'

D целом, по дагата! 2Н-Я?ГР попфорлацпоппо-дгшамичосжю свойст-. а фосфэтпдплхолптш с простоя я слогпой эфзрпоЯ связь» в составе адгсогсрпсталл:г:зского Cv.or.on суцоствеипо пэ отличаются. Принимая э ппжаштз тот факт, что лпппдпыЯ С:тсло.1. алолоптчоских иаийран. ¡л Ф^зюлоппостспх услопзлх находятся" з згедкокрисгалличоском" со-голгтгт, место прэдполо^тгь, что биологическая 'активность липлдов

с простой эфирной связью реализуется кз на уровно структурной организация липвдного бислоя, а за счет специфических взаимодействий липидных молэкул с различными форгэнткл я рецептора«.

ООразцы фосХападвлхолиюв (24а-г) переданы в Обьэданешшй Институт ядерных исследований (г.Дубна) для нейтронографпоских ео-следований.

III,Исследование взаимодействия ыодельшх момЗрап - с фосфолппазой Один га .еозиииых шханпзков рэаллзециа биологических. £ую:~ ций фосфолипддов алкпльиого юта связал со спецгаТпчесюш взеиыэ-действием лгошдов этого 1слосса с фэсфоллпазой

Фосфолютаза является липолетичоскш форионто«, катагдзп-рущим гидролиз слоЕПОэфирлой связи в полоеэнкп оп-2 глзвдрофосфо-лотг.дав. К настоящему времени установлено, что ю/утржемтотеив сфолипазц л^ участвуют в тшеих ваших бдоимтч&ских процессах, как. образование лизоОосфатидашшша алклшюго тппа - исходного ср-одшгшшя в биосянгозе липидаого фактора щетнвоци! хромблщтов, ваг ппобоэдошо ерахидоповой кислоги - првдаестоаето'ка оШюзшювд(?в%, •

Полагает1, что вэцэства, отгабирувдие фоаЗолщиазу А2, обладать подоенный фармакож>гичосквми свойствами. Гю-кщ;^^!/» наиболее пэредактевшаи являются-вещества,' способные шгпбьрзтгь фосфолшюзу т нарушал при этом структурную организацию кеыб-ршш, в частности, липнда с простоя афирной связью.

Ршшо в напей лаборатории било показало, что насицэнше фосфатидалхолина даалюшшого • тело являются афЕоктиЕЯша ингибиторами фосфолипаза а 13 ингпбиторная активность коррелирует с противовосяалителыша свойгтвшя.

0 Ч

2 «I

29 .4

rrn

рги

ГРН

Гко.Б-Кглгопяя и спэктрзх 31P-ffiP лпгосом :тз ста си яичного Фсс^лгщто.'гша с 1,3-эт-;с:одэо1Ш\га1зро-3--фосфоход1тсм (а), 3,2-CT-^o^3onjTJEruDpo-3-isc5oîCbTn:cri (б) п 1,2-ля-0-(9,10-окта-ДОЦЭ1Ш)-гаэ-ГЛЩЭрО-3-фОСфОХОЛППСЫ (В) • пря ЕЗаПМОДЭЛСТВЯП о ОооЗолгпгзсЯ Ag. • •

В состав бпологичосхих нсмбрап, как прошло, входят фосфоли-ппдц с пэпасип;вппа£1 гадрофобпша остаткизи.' В связи с отим, представлялось необходаод! изучить злияпиэ па активность фосфолипази А2 П0ГПДРОЛГПЗУ01ЛХХ деешп! фЭр.'знгс'л фосфатаДИЛХОЛПЛОВ (24д,з), со-дор2п.тзх остатка ronccu^éinnzx спиртов и кислот. .

Для ПЗУЧЭШЛ ПЗППМОДЭЙСТВИЛ'фОСфОЛИПССи Á2 0 фОСфОЛППВДПШИ

кохэхулкя в состава лшадпого бпслоя использопаппо тачоиых дей-

терием лшшдов является нецелесообразным из-за высокой стоимости синтеза, при небольшой информатпвнобти катода в данном случае. По-,

этому нами был применен новый подход, основанный на использовании

31 '

спектроскопия Р-ШР, позволявший регистрировать структурные из- . менения в мембране в процесса гидролиза лппидов.

Цультилаыеллярные липосош, построенные из ляпидов (24д,к) в их

31

смесей с яичным фосфатидплхолшюм, дфст в спектро ^'Р-ЯМР шфокий - анизотропный сигнал с пиком в сильном поло и плечом, направлошшу . » в слабое поле (рис.5).

■ При добавлошш к лшосомам, построенным кз. пр;гродиых фосфа- . тидплхолшгав, препаратов фосфолипази А^пР311010^11, гядродна фоофэ- '

липидов и образующиеся продукты гидролиза вызиваат разрушение ли>

" ппдного биспоя лппосои. Разруизнио ляпосш сопровоадсэтся. обраго- . ■ вашем ыицеллярных структур. В сроках ^Р-ШР сто еэтодпт отро- ■ кзшо в появлении узкого оззол^^Щ^уч) сигнала, цнтоьскг'юсть то- • торого уволачивоэтся в точецпй вроюнз 'пЕкувещш Лштосо:.: о пропс-ратами фосфолипази (рлс.5а). Елодоегй г ссствз 1 ,?-ди-0-(9,10-октодецоша)-г>см-гетцоро-3-^&сфэ101;1:;э 'или 3,?.-де-олеоил-ая-глицоро-1-фос4отолшха приводят к рсзкоглу сашдпещо итого процесса (рпс.50,8).

Образцы фосфатпдалхолгаюв (24о,п) поредели в Центральна Кз-ститут трсвмайыюгии и ортоподип ЦЗ РО для проведения испытаний па противовоспалительное дойствпэ. ••

вывода

1 .Разрабстаны удобные в препаративном отноиенин метода регио-т ВЛ9КТИВНОГО введения дейтерзевой метки в состав фосфолипидаой мо-. эгсулы.

2.Синтезированы меченые дейтерием фосфатпдалхолиш, содоркащио дкилышо и ацильшо заместители и -несуцие дейтериевую метку в труктурло оквивалзптпых частях молекулы. Полученные фосфолипиды редставляиг все возможные комбинации присоединения гидрофобных о'яюкрптов за счет простой и слояюй эфирной связи.

3.Методом 1I-ЮТ-споктроскопии изучат модельные мембраны, по-троенпие па основе этих фосфолкпидов. Показано, что конформациок-о-дапс.'ячэскиэ свойства фосфолшгадов с простой и сложной эфирной вязыо супоствонио пе различается.

4.Синтезировали пепаскцешшо фосфатидилхолшш даалкилыюго и пацплыгого тппоп, пагидролязусше фосфолзпозой А2> Методом 1 Р-Я^Р-споктроскопти изучено пзся.годейстше их с фосфолипазой А2

составе 1юдэдъпих изибрш п шдтЕзрздено, что дагаше фоофатидил-ОЛЯШ ПВЛГПЗТСЯ СЭЗгООТПВ 12ВЛ ППгеОПТОрСЗ.П фосфолппози Äg.

Оспогпоэ содэргзппэ дпссэртацга излогого в следующих аботах:

1.Чудппов Ii.В., Чуппа D.B. 3,Р—ПИР исследование взаимодействия зофолипазы Ag с мемОранпкя, содорзкззля диалкпльпцй фосфатидил-олпн.// Бпологпчо.скп активные соодшюнип, синтез и использование, эзпсы докладов (28-29.09.92). Под ред. Н.В.Клюова. Пенза.- 1992, 3.83-84.

2.Чулан В.Б., Аникин A.B., Чудпнов М.В., Ооребретшковв Г.А., встагпзова Р.П. Изучение взаимодействия фосфоляпезн Л2 с поли-

мерными лшгосомош.// Доклада PAH.-1992.-T.326.-JU.-C.73Ch-T34,.

З.Чудиноп М.В., Аникш Ц.В., Ашосш A.B.., Bpammv,Д.А., Чупш В.В., Серебренникова Г.А. Синтез фосфатидалтолиттоп,..салшгагса кь-чвиых дейтерием.// 'Биосрганическая хп,'£Ш.-1993.-ТИ9.-С.

4.Чупип В.В., Аникин U.B., Чудщюв И.В., СороОропншэва Г.А. Исследование каыбран из фосфатидалхолинов даацшгыюго, чшааиаетэи ного, вцилалкильного и даалкнлыюго типов катодом спактросаюшя

о '

'■Н-ЯМР.// Биологические иокбраш, в почета. '

\ .

г

Зак.605 тир.80 экз.Ротапринт ШГШ ии.Доионосова