Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе α-аминокислот

Баянова, Надежда Витальевна

Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе α-аминокислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Баянова, Надежда Витальевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

2007 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе α-аминокислот»

Автореферат диссертации на тему "Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе α-аминокислот"

На правах рукописи

003053077

БАЯНОВА НАДЕЖДА ВИТАЛЬЕВНА

СИНТЕЗ ГОМО- И ГЕТЕРОДЕНДРИМЕРОВ НА ОСНОВЕ а-

АМИНОКИСЛОТ

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2007

003053077

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

Г.П. Власов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, старший научный сотрудник М.В. Соловский

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Н.И. Колодкин

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

университет, химический факультет, кафедра высокомолекулярных

соединений

Зашита состоится «22» февраля 2007 года в 10 часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.229.01 в Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук по адресу:

199004, Санкт-Петербург, В.О., Большой пр., 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан « _» января 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

к.ф.-м.н. Н.А. Долотова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Водорастворимые поликатионяые системы привлекают все возрастающее внимание исследователей, что обусловлено перспективами их использования в качестве полимеров-носителей биологически активных веществ (БАВ), таких как противовирусных, противобактериальных и противораковых препаратов, а также при целевом транспорте генетического материала в новых биомедицинских технологиях, связанных с генной терапией. Основной задачей генной терапии является поиск оптимальных носителей для целевого транспорта ДНК в клетки определенного вида. Ограничения, связанные с применением вирусных носителей как транспортных средств для доставки ДНК, такие как сильный иммунный ответ при многократном применении или токсический эффект, вызванный продуктами их распада, явились главной причиной активного поиска новых систем доставки ДНК с использованием синтетических носителей: так называемый невирусный способ доставки. К настоящему времени выявлены наиболее перспективные в этом плане поликатионные носители, такие как катионные липосомы, разветвленные полиэтиленимины или сверхразветвленные полиамидоаминные (ЛАМАМ) молекулы - дендримеры. Носители на их основе более всего отвечают требованиям, предъявляемым к носителям ДНК, они компактизуют ее, обеспечивают эффективную защиту от расщепления нуклеазами крови, способствуют эффективному выходу комплексов ДНК из эндосом. Вместе с тем был отмечен токсический эффект, проявляемый данными носителями. В связи с этим представляется перспективным синтез и исследование дендримеров на основе природной а-аминокислоты - лизина. Данные макромолекулы, имея все преимущества выше отмеченных носителей, являются действительно биосовместимыми и биодеградируемыми. Несмотря на большое количество публикаций по синтезу и применению дендримерных макромолекул для целевого транспорта БАВ, число работ по изучению закономерностей их синтеза, физико-химических свойств и особенностей их строения весьма невелико. Актуальной остается проблема получения монодисперсных дендримерных макромолекул с высоким числом генераций и/или сложным химическим строением. Известно, что при создании каждой последующей генерации дендримера возрастают трудности достижения полной конверсии функциональных групп, что, в свою очередь, усложняет получение дендримеров без дефектов в структуре. В связи с вышесказанным разработка методов синтеза гомо- и гетеродендримеров на основе Ь-лизина, изучение их структурной организации и физико-химических свойств, а также исследование особенностей формирования интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) с участием дендримеров является актуальной задачей.

влияния структуры дендримеров на ход их синтеза, исследовании структуры и свойств дендримеров, а также их комплексов с ДНК или синтетическим полианионом - полиметакриловой кислотой (ГГМАК), с использованием различных методов.

Научная новизна. Впервые с использованием полимерных носителей получен ряд монодисперсных водорастворимых гомолюиновых дендримеров различных генераций; впервые осуществлен синтез регулярных гетеролизиновых дендримеров, в структуру которых между точками «ветвления» - остатками диацилированных лизинов - введены фрагменты различных аминокислот: гистидина, глутаминовой кислоты, аланина и дипептида глицил-глицина, несущие дополнительные боковые группы; определены условия синтеза данных дендримеров на твердой фазе, что позволило установить влияние структуры синтезируемого соединения на ход синтеза; показана применимость таких методов анализа как масс-спектрометрия, спектроскопия ЯМР и КД для исследования структурных и физико-химических характеристик лизиновых дендримеров; впервые применен динамический метод поляризованной люминесценции (IIJI) для изучения структурно-динамических характеристик синтезированных дендримеров, для этого впервые синтезированы люминесцентно меченые дендримеры, имеющие ковалентно связанную люминесцирующую метку (JIM) на внешнем или внутреннем слое дендримерной макромолекулы. Применение метода ПЛ позволило впервые изучить влияние номера генерации и химического строения дендримера на его способность к формированию супрамолекулярньтх структур в растворе - образование ассоциатов, особенности формирования интерполимерных комплексов и комплексов с низкомолекулярными соединениями в качестве моделей широкого круга БАВ. Впервые исследовано влияние химического строения дендримеров на свойства их комплексов с ДНК.

Практическая ценность. Методом твердофазного синтеза пептидов получен ряд гомо- и гетеродендримеров на основе природных а-аминокислот различных генераций. Показана перспективность их использования в качестве носителей генетического материала в клетку. Определены пути оптимизации свойств дендримеров с целью повышения трансфекционной активности комплексов дендример/ДНК. Использование техники твердофазного синтеза потенциально позволяет автоматизировать и масштабировать процесс синтеза данного класса макромолекул.

Основные положения, выносимые на защиту:

• усовершенствованный метод синтеза дендримеров различных генераций и различного химического строения на основе L-лизина на твердой фазе;

• результаты по исследованию влияния номера генерации гомодендримеров и химического строения развязки в гетеродендримерах на ход синтеза, особенности структурной организации дендримеров и их физико-химические свойства;

• метод модификации дендримеров JIM по внешним и внутренним слоям;

• исследование структурно-динамических характеристик дендримеров и механизмов формирования супрамолекулярных систем с участием дендримсров в растворе;

• взаимодействие дендримеров с молекулами ДНК.

Достоверность результатов подтверждается строгим контролем синтеза дендримеров, использованием разнообразных современных методов анализа структуры макромолекул и воспроизводимостью полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на 9th Annual meeting of ESGT (Turkey, Antalya, 2001), 27th European Peptide Symposium (Sorento, Italy, 2002), 7th World Conference on Biodegradable Polymer and Plastics (Pisa, Italia, 2002), 4th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems" (St. Peterburg, 2002), X Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Казань, Москва 2003), 10th Gemany-Russian Peptide Symposium (Gemany, Fridrichroda, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 1 Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2004), а также неоднократно на конкурсе молодых ученых ИБС РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 14 тезисов докладов на международных и всероссийских симпозиумах и конференциях.

Личный вклад автора состоял в участии в постановке задач исследования, в разработке методов синтеза, очистке дендримеров, в изучении их свойств с использованием ряда физических методов, в анализе и обсуждении результатов.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, списка сокращений и приложения. Работа изложена на 185 страницах, содержит 15 таблиц и 65 рисунков и библиографию из 167 источников.

Работа выполнена как часть исследований, проводимых в ИВС РАН по темам: «Гидрофильные синтетические и природные полимерные биологически активные соединения и материалы на их основе» и «Биологически активные полимерные системы. Синтез, структура, свойства».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснован выбор темы исследования и ее актуальность, сформулированы цели работы и основные положения, выносимые на защиту. Глава 1. литературный обзор содержит сведения по методам синтеза, изучению структурной организации и свойств дендримеров и их применению в качестве носителей БАВ.

Глава 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Синтез полилизиновых гомо- и гетеродендримеров на полимерном

носителе

Синтез мо но дисперсных дендримеров проводили дивергентным методом, что позволило осуществить четкий пошаговый контроль конверсии реагирующих групп и провести модификацию дендримерной структуры как введением дополнительных аминокислот между точками «ветвления» (гетеролшиновые дендримеры), так и ЛМ по внутренним слоям или по концевым аминогруппам (ЛМ дендримеры). В частности, были получены два гомологических ряда дендримеров на основе L-лизина; \ ряд -гомодендримеры на основе лизина (К) (рис. 1. структура слева) с первой по шестую генерации (табл. 1). На С-ко ней дендримеров (Y) данного ряда был введен остаток аланина (Ala) для того, чтобы можно было с помощью аминокислотного анализа синтезируемых дендримеров достаточно четко контролировать их структуру; 2-ой ряд гетеродендримеры на основе лизина па той генерации (рис. 1, структура справа), (табл. 2), содержащие между точками «ветвления» - лизиновыми фрагментами (К) - остатки гисгилина (Н).

глутаминовой кислоты (Е), ачанина (А), дипептида глицил-глицина (GG):

он .- • ОН "/^ои иЛ ' ОН ^ hn-

Н*IP h2n о h2n о h2n о h0h

( он он он НГ> СИ f

hzn ; сн v

Он °

Lys (К) Glu (Е) Ala (A) His (Н) Clv-Glv (CG)

На С-конец данных макромолекул дополнительно был введен фрагмент N5-хлорацетиллизина (Lys(ClAc)) с целью его последующего использования для конденсации с пептидами, «нацеленными» на клеточные рецепторы, что должно было бы обеспечить целевую доставку комплекса дендример/ДНК.

6 ^ If

4 рсъ г -

. Л ч / \ лЬ f О -4

Ьб»

? "V- ' V Г" 4 а -a- I VQ- ~ ^а

V \v с V ' * k 1 ф V

Рис. 1. Схематичное представление i омолизинового дендримера пятой генерации (слева) и гетсролизиновото деидримера пятой генерации (справа), где - лизнн, О -аланин, глугаминовая кислота, гистщшн hi и диглицкл, y- аминокислоты (аланин или V -хлорацетклдизин) или олигапептиды, находящиеся на карбоксильном конце дендримера.

Таблица 1

Сокращенные обозначения и структурные формулы полшшзшшвых гомодендримеров 1-го ряда

Обозн Структурная формула Г nlys nh2 ЭД^геор

D1 (NH2)4(Lys)2Lys-Ala-NH2 1 3 4 473

D2 (NH2)g(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2 2 7 8 985

D3 (NH2)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2 3 15 16 2011

D4 (NH2)32(Lys)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-NH2 4 31 32 4061

D5 (NH2)64(Lys)32(Lys)16(Lys)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala- nh2 5 63 64 8162

D6 (NH2)i28(Lys)64(Lys)32(Lys)i6(Lys)8(Lys)4(Lys)2 Lys-Ala-NH2 6 127 128 16364

Таблица 2

Сокращенные обозначения и структурные формулы полилизиновых гетеродендримеров 2-го ряда

Обозн Структурная формула Г N,vs NH2 Мтеор

D5H (NH2)64(Lys-His)32(Lys-I Iis), 6(Lys-His)8(Lys-His)4(Lys-His)2Lys-Ala-Ala-Lys(ClAc)-Ala- nh2 5 64 64 17004

D5E (NH2)64(Lys-Glu)32(Lys-Glu)]6(Lys- Glu)s(Lys-Glu)4(Lys-Glu)2Lys-Ala-Ala- Lys(ClAc)-Ala-NH2 5 64 64 16506

D5A (NH2)6i(Lys-Ala)32(Lys-Ala)i6(Lys-Ala)8(Lys-Ala)4(Lys-Ala)2Lys-Ala-Lys(ClAc)-Ala-Ala-NH2 5 64 64 12962

D5GG (NH2)64(Tys-Gly-Gly)32(Lys-Gly-Gly)16(Lys-Gly-Gly)8(Lys-Gly-Gly)4(Lys-Gly-Gly)2Lys-Gly-Gly-Lys(ClAc)-Ala-Ala-NH2 5 64 64 15626

Г - генерация, N1.« - число лизиновых остатков, КН2 - число терминальных аминогрупп, Мтюр - расчетная молекулярная масса.

Синтез дендримеров проводился на бензгидриламинном полимерном носителе с применением В0С/Вг1 - стратегии и БЮ/НОВЬсмеси на стадии ацилирования, используя в качестве карбоксильного компонента №,Мс-ди-(трет-бутилоксикарбонил)-лизин. Избьггок реагента, вводимого в реакцию, в общем случае составлял 3-4 эквивалента на одну аминогруппу в расчете на исходную емкость полимерного носителя. Полноту реакции ацилирования контролировали по наличию свободных аминогрупп с помощью теста Кайзера (нингидриновый тест). Защитную ВОС-группу в ходе синтеза удаляли

действием трифторуксусной кислоты (ТФУК). Конечной стадией синтеза было отщепление целевой молекулы дендримера от полимерного носителя с одновременным полным снятием защитных групп при действии системы трифторметансульфокислота/трифторуксусная кислота (ТФМСК/ТФУК) в присутствие скавенжеров.

Выделение и очистку целевых молекул осуществляли с помощью хроматографических методов, а доказательство структуры дендримеров проводили с помощью аминокислотного анализа, МА1ЛЭ1 ТОР масс-спектрометрии и метода 'Н ЯМР спектроскопии.

В ходе ситеза было изучено влияние химической структуры получаемых дендримеров на ход их синтеза на полимерном носителе (рис. 2). Так, в ходе синтеза гомодендримеров на стадии создания пятой генерации для достижения полной конверсии аминогрупп время ацилирования приходилось увеличивать до 20 часов против обычного 10-часового. При синтезе дендримера, содержащего остатки глутаминовой кислоты, принципиальных сложностей не наблюдалось. При синтезе гетеродендримеров, в структуру которых вводились остатки аланина или диглицина, при создании четвертой и пятой генераций потребовалось увеличение времени ацилирования до 50 ч. В случае дендримера, содержащего гистидин, на стадии создания четвертой генерации -присоединения лизина - потребовалось увеличить время ацилирования до 60 ч, а в случае формирования пятой генерации присоединение лизина практически не проходило даже после добавления в реакционную смесь в качестве катализатора 4-Н,"М-диметиламинопиридина. Это свидетельствовало о возникновения дефектов в структуре, что и было подтверждено методом МАЬЭ! ТОБ масс-спектрометрии (табл. 3).

Рис. 2. Сравнительный анализ ситеза полшшзиновых гомо- и гетеродендримеров 5-ой генерации на полимерном носителе на примере формирования слоев из остатков лизина, где т - суммарное время ацилирования, N - номер I енерации.

Таким образом, в ходе работы была показана принципиальная возможность контролируемого синтеза на твердой фазе монодисперсных дендримерных макромолекул высоких генераций гомогенного состава и макромолекул регулируемого гетерогенного состава и было изучено влияние химического строения дендримеров на ход их синтеза на твердой фазе.

2. Гидродинамические свойства дендримеров на основе лизина

Из литературных данных известно, что наиболее чувствительными к изменению ММ дендримера являются седиментационно-диффузионные методы анализа, а не характеристическая вязкость. Полученные гомо- и гетеродендримеры на основе лизина были исследованы методами молекулярной гидродинамики (табл. 3). В качестве основных гидродинамических характеристик были определены коэффициенты поступательной диффузии (О0) и скоростной седиментации (во). По уравнению Сведберга был произведен расчет молекулярных масс синтезированных дендримеров. Сопоставление гидродинамических характеристик (во и ГЗП) с молекулярной массой позволило оценить скейлинговые индексы для гомодендримеров 03, 04 и 05. Было найдено, что 50~М(№а1), а Оо-М*0,38^. Подобные скейлинговые индексы свидетельствуют о высокой симметрии этого ряда макромолекул и близки к значениям, получаемым для сферических гомологов и глобулярных протеинов, а также для дендримеров иного, не аминокислотного, химического строения, Полученные оценки плотности в несколько раз превышают величину, характерную для линейных макромолекул, и близки к оценкам плотности, полученным для глобулярных белков.

Таблица 3

Коэффициенты поступательной диффузии (О0) и скоростной седиментации (з0), __молекулярные массы (М^еоп М5р) дендримеров на основе лизина

Денд-ример Макет, г-моль" м*ж„, г-моль"1 О0Ю', см2/с зо-Ю13, с М5о-10"3, г-моль"1 Яь Ю8, см Р. г-см"3

473 - 28 2 - - 7.3 -

БЗ 2011 2011 156 0 65 2.7 134 0 49

И4 4061 4062 11 2 08 5.0 187 031

05 8162 8163 8.4 1 55 13 0 24.9 0 34

05Е 16506 15226 7.1 2.45 24.5 29.5 0.38

Б5Н 17004 11540" 63 1.35 15.2 33.2 0 17

1)5А 12962 12915 6.5 1.7 18 32.2 0.22

1)5(;с; 15626 15166 7.3 1.7 16 28.7 0.28

* МА1,131 ТОР масс-спектрометрия, ** мольное отношение Л1а:11«:1.\5 по данным аминокислотного анализа 3.62 64 (рассчитано) и 3:52:32 (найдено).

Используя соотношение Стокса (Яь^кТ/бл^гД)), была произведена оценка гидродинамических радиусов изученных генераций дендримеров (табл. 3). Как и для дендримеров, построенных на основе симметричных ветвящих единиц, для дендримеров, построенных на основе несимметричного лизина, наблюдается линейная зависимость роста гидродинамического радиуса от номера генерации.

3. Исследование гомолизиновых дендримеров различных генераций методом ЯМР спектроскопии

Для исследования структуры полученных дендримеров был применен метод 'Н ЯМР спектроскопии. Детальный анализ полученных спектров позволил строго отнести все сигналы к соответствующим атомам. По химическим сдвигам удалось различить атомы, находящиеся на наружной или во внутренней сферах дендримера. Кроме этого, для терминальных атомов удалось различить, с какой аминогруппой - а или с - они связаны. На основе сравнения значений интегралов сигналов протонов, соответствующих атомам внутренних и внешних остатков лизина, была подтверждена структура исследованных дендримеров.

При сравнительном анализе спектров ПМР лизиновых дендримеров с 2 по 6 генерацию было обнаружено значительное изменение положения сигналов протонов внешних метановых групп лизина при переходе от генерации к генерации, в то время как положения сигналов остальных протонов практически не меняются (рис. 3). Изменение положения сигналов протонов внешних метановых групп лизина для БЗ, Б4, Б5, Об, при переходе от одной генерации к другой, свидетельствует об изменении химического окружения соответствующего атома, которое вызвано структурными изменениями, а именно, вынужденным сближением МН3+ групп, что, в свою очередь, приводит к смещению равновесия:

сн-нмн3

сн-

-ын2

в сторону образования свободной аминогруппы. При этом наибольший сдвиг в сильные поля наблюдается для 02 и 136, что свидетельствует о более сильном эффекте, вызванном сближением аминогрупп.

3 4,2

-с

4,03,83,63,43,2

внутр

Я-С, СО-1Ч'Н-Я

5 6

генерация

Рис 3. Зависимость значений химических Рис. 4. Зависимость локальной

сдвигов (8) внутренних и внешних протонов плотности внешнего слоя лизинового

метановых групп лизина от номера операции дендримера от номера генерации,

дендримера где р - плотность.

В случае 02, который условно относится к дендримерам и является низкомолекулярным соединением, близость аминогрупп задана геометрией молекулы и аминогруппы не могут удалиться друг от друга, в то время как для Б6 данный эффект обусловлен повышением плотности упаковки лизиновых звеньев во внешнем слое макромолекулы по сравнению с ОЗ, Э4 и 05.

Для выявления закономерностей распределения локальной плотности звеньев лизина в единице поверхности дендримерной молекулы (р) в зависимости от номера генерации был произведен расчет величины р для дендримеров со второй по шестую генерации на основе экспериментально полученных гидродинамических радиусов (рис. 4) по уравнению: р = N^2 / 4пЯ2, где Ых,-Н2- число аминогрупп на внешнем слое, 4яЯ2 - площадь сферы.

Сравнение зависимостей, представленных на рис. 3 и рис. 4, показывает, что изменение положения химических сдвигов терминальных метиловых протонов хорошо коррелирует с изменением теоретически расчитанной локальной плотности структурных звеньев на поверхности дендримера, а именно, в обоих случаях плотность проходит через минимум на четвертой генерации, а максимальные значения плотности наблюдаются для дендримера 2-ой и 6-ой генераций.

Таким образом, в ходе исследования выявлена закономерность распределения локальной плотности звеньев лизина на внешнем слое дендримерной макромолекулы в зависимости от номера генерации.

4. Синтез люминесцентно меченых гомо- и гетеродендримеров на

основе лизина

Для изучения таких сложных полимерных систем, как дендримеры, наиболее информативными являются методы, основанные на «меточном» подходе. Действительно, поочередное присоединение метки к тому или иному фрагменту сложной полимерной системы дает возможность получать информацию о структуре и свойствах выделенного меткой структурного фрагмента. К числу высокочувствительных методов относятся люминесцентные методы, в частности, метод поляризованной люминесценции (ПЛ), позволяющий изучать наносекундную динамику макромолекул в растворе. Кроме того, наносекундная подвижность полимерных цепей макромолекул очень чувствительна к любым изменениям межмолекулярных взаимодействий и к вращательной подвижности полимерного образования как целого, и, соответственно, может служить индикатором образования супрамолекулярных систем в растворе с участием дендримеров. С целью изучения структурно-динамических и функциональных свойств синтезированных дендримеров с помощью метода ПЛ получены дендримеры с антраценовыми метками, присоединенными к звеньям внешних или внутренних слоев дендримеров. В качестве реагента для присоединения ЛМ был выбран 9-ангрилметштизоцианат (АМИЦ), способный реагировать с аминогруппами макромолекул в отсутствие катализаторов при комнатной температуре:

В ходе экспериментов были подобраны условия реакции, при которых к одной молекуле дендримера присоединялось не более одной метки, что позволило исключить вероятность электронных взаимодействий между присоединенными JIM, способных повлиять на величины измеряемых фотофизических характеристик. Количество присоединенных к молекуле дендримера JIM составило одну JIM на 400 аминогрупп. На основе люминесцентно меченого дендримера пятой генерации D5* был синтезирован дендример шестой генерации D65*. Реакцию формирования внешнего шестого слоя проводили в растворе, используя на стадии ацилирования №,1\'г'-ди-(трет-бугилоксикарбопил)-лизин в качестве карбоксильного компонента. Была предложена оригинальная методика высокой степени очистки JIM дендримеров от низкомолекулярных люминесцирующих примесей, также способных повлиять на результаты измерений. Все это позволило применить для исследования полилизиновых дендримеров высокочувствительный динамический метод IIJI.

5. Изучение особенностей структурной организации гомо- и

гетеродендримеров на основе лизина методом поляризованной люминесценции

Методом ПЛ определены времена релаксации т, характеризующие наносекундную подвижность макромолекул дендримеров в растворе, и на их основе рассчитаны молекулярные массы (табл. 5). Зависимость т(М) указывает на то, что движение частицы дендримера как целого является определяющим наносекундным релаксационным процессом, и эта зависимость такая же, как и для белковых глобул. Сопоставление молекулярных масс показало, что молекулы дендримеров третьей и пятой генераций при хранении в водных растворах даже с заряженными NH3' группами объединяются в ассоциаты. Формирование ассоциатов приводит к тому, что определяющим наносекундным релаксационным процессом становится подвижность ассоциата как целого. Определенные молекулярные массы дендримеров хорошо совпадают с Мтеор Для индивидуальных макромолекул или превышают М1еор и характеризуют размер ассоциата. Из данных табл. 5 видно, что по мере хранения раствора в случае D3 образующийся ассоциат состоит, в среднем, из 4 молекул дендримера, для D5 состоит из двух молекул. В то же время D6 не проявляет тенденции к ассоциации.

Времена релаксации, значения Мпл и параметры 1/Р0\

Таблица 5

Время

Дендример мтеор Ms,l> Mai хранения ^иет 1ЯУ

раствора

D3* 2010 5 2700 2300 Свежий 3,1 25

2400 30 дней 3,1 25

9600 1 год 3,6 9

D5* 8160 13000 17900 23 17

D5*E 16513 24500 22500 29 10.2

D5*H 17011 15200 29700 38 8,1

I)65* 16300 20000 26 5,7

18000 23 5,7

D6* 16364 16300 21 8,5

* люминесцентно меченый дендример.

Сопоставление молекулярных масс, определенных для гетеродендримеров, также показывает склонность данных макромолекул образовывать ассоциаты в растворе. Ассоциация дендримеров в растворе может быть объяснена встречным проникновением подвижных боковых тетраметиленовых фрагментов лизинов, находящихся на внешних слоях макромолекул, и возникновением гидрофобных контактов, которые начинают превалировать над электростатическим отталкиванием №1з+ групп. Из этого следует, что с уменьшением номера генерации или при переходе к гетероструктуре дендримеры имеют более рыхлую упаковку структурных звеньев. Действительно, анализ значений параметра 1/Р0' (табл. 5) показал, что с увеличением номера генерации плотность упаковки лизиновых фрагментов в макромолекуле дендримера возрастает, изменяясь от плотности, близкой к плотности клубка линейного полиэлектролита для ЮЗ (1/Р0' = 25), до плотности макромолекулярной глобулы для Б6 (1/Р0' = 5,7). Такая особенность структурной организации должна оказывать существенное влияние на способность дендримеров к формированию в растворах не только ассоциатов, но и супрамолекулярных структур гетерогенного состава - интерполимерных комплексов и комплексов с низкомолекулярными соединениями.

6. Исследование комплексообразующей способности полилизиновых дендримеров при взаимодействии с низкомолекулярным органическим анионом как моделью БАВ

Методом IUI была исследована комплексообразующая способность макромолекул лизиновых дендримеров при взаимодействии с низкомолекулярным органическим анионом 8-анилинонафталин-1-сульфонатом (АНС). Связанный с дендримерной молекулой, АНС люминесцирует при наличии в ней участков с высоким (или повышенным) содержанием метиленовых групп лизиновых фрагментов, т.е. интенсивность люминесценции АНС зависит от плотности упаковки таких групп. Связывание аниона с дендримерной макромолекулой обеспечивается наличием у

дендримера положительно заряженных ]\ТН3\ Долю №134 групп в дендримере задавали путем добавления к исследуемому раствору НС1.

Анализ изменений интенсивности люминесценции АНС в растворах гомо- и гетеродендримеров (рис. 5) показывает, что молекулы дендримеров на основе лизина с ионизованными аминогруппами сохраняют повышенную комплексообразующую способность при взаимодействии с АНС по сравнению с комплексообразующей способностью линейного полилизина. При этом высокие значения 1ЛЮМ АНС в молекулах Б5 с ионизованными группами (рис. 5а) указывают на высокую плотность метиленовых групп, существенно превышающую плотность метиленовых групп в рыхлом макромолекулярном клубке линейного полилизина с заряженными аминогруппами, а низкие значения 1шом АНС для 04 по сравнению с Г) 5 при одинаковой доле ХН3+ групп свидетельствуют о более рыхлой упаковке метиленовых групп остатков лизина в молекуле 134.

и. ад

0.0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

а №3

Рис. 5. Зависимости интенсивности люминесценции (11ЮМ) от содержания ионизованных аминогрупп в системах: а) АНС - линейный полилизин (роЬ1,у.ч) и АНС - 04,1)5 и б) АНС -линейный полилизин (ро1уЬу5) и АНС - 1)5Е, 0500, ША.

Изменение интенсивности люминесценции 1шом АНС для гетеродендримеров с различными аминокислотами между точками ветвления (рис. 56) отражает влияние строения расставки на комплексообразующую способность молекул гетеродендримеров при близком количественном содержании в молекуле гетеродендримера >Ш2- и N11/ групп.

Таким образом, в ходе исследования показано, что дендримеры в сравнении с линейными поликатионами могут быть более оптимальными носителями низкомолекулярных БАВ, а также показана возможность оптимизации их комплексообразующей способности при изменении химического строения.

7. Изучение взаимодействия полилизиновых дендримеров с

полиметакрилрвой кислотой в водных растворах и стабильность образующихся комплексов

Изучение формирования супрамолекулярных структур с участием дендримеров и ДНК на первом этапе проводили на примере взаимодействия

дендримеров с макромолекулами ионизованнои полимстакриловой кислоты (ПМАК). Изучались зависимости изменения наносекундной подвижности люминесцентно меченых молекул ПМАК при добавлении «темповых» (без меток) молекул лизиновых дендримеров и люминесцентно меченых молекул дендримеров при добавлении «темновых» молекул ПМАК. Значения времен релаксации (т), характеризующих наносекундную подвижность молекул JIM дендримеров разных генераций и макромолекул полиметакриловой кислоты (ПМАК), были определены методом ПЛ. При формировании комплексов ПМАК - дендример использовали ПМАК с ММ = 9-104 при степени ионизации ПМАК а = 0,84.

В ходе эксперимента обнаружена определенная корреляция между структурной организацией образующегося интерполимерного комплекса (ИГ1К) и склонностью того или иного дендримера к ассоциации. Из данных рис. 7а видно, что т для ПМАК имеет низкое значение (т = 90 не) при значительном содержании D3 по сравнению с т для D3 (т ■= 250 не). Из этого следует, что в комплексе D3 - ПМАК имеются подвижные участки цепей ПМАК, свободные от D3, и участки ПМАК, несущие ассоциированные молекулы D3. То есть при формировании ИПК для D3 ассоциаты дендримеров возникают не только в растворе, но и на комплементарном полимере, играющем роль матрицы. В системе D6 - ПМАК (рис. 76) высокие значения т для ПМАК указывают на равномерное распределение молекул D6 вдоль цепи ПМАК. Для дендримерных

ОД 0 6 0 9

ß = [DJ/[ПМАК] (1) или р- = [ПМАК] /[dj (2)

0,6 0,9

Р = tOe] [ПМАК-] (1) или

р'= [ПМАК1 [Dg] (2)

Рис. 7(а,б) Изменение времени релаксации х, характеризующего наносекундную подвижность меченой молекулы, при формировании интерполимерного комплекса, т.е. при добавлении второго компонента к раствору люминесцентно меченого полимера. ОЗ и ПМАК* (1а), ПМАК и 1)3* (2а): Б6 и ПМАК* (16), ПМАК и 1)6* (26). Люминесцентно меченый компонент выделен *. Величина Р(Р'), определяется количеством добавлялемого немеченого компаненга.

макромолекул шестой генерации Э6, не проявляющих склонности к ассоциации в растворе, исходные низкие значения т приближаются к значениям т для

ПМАК в комплексе с D6 по мере увеличения содержания ПМАК в растворе и переходе молекул D6 на ПМАК, что также свидетельствует о равномерном распределении молекул D6 на цепях ПМАК.

Известно, что при создании полимерных носителей ДНК важную роль играет стабильность ИПК носитель - ДНК в условиях высокой концентрации хлористого натрия и белков гошмы крови, способных вытеснять ДНК из комплекса с поликатионом. При исследовании стабильности ИПК Г1МАК -дендример в водно-солевых растворах были определены зависимости доли связанного (включенного в комплекс) компонента 6СЯ„ от содержания NaCl в водном растворе и сопоставлены со стабильностью ИПК ПМАК - линейный полилизин. Было обнаружено, что комплексы ПМАК - дендример проявляют повышенную стабильность в сравнении с комплексом ПМАК - линейный полилизин. Установлено, что стабильность комплексов ПМАК с дендримерами 3—ей и 6-ой генераций при переходе от водных растворов к водно-солевым связана с различной структурной организацией исследуемых интерполимерных комплексов. Наиболее стабильным является комплекс D6 - ПМАК, это можно объяснять отсутствием ассоциатов D6 - D6 на цепях ПМАК в отличие от D3 и множественностью контактов ионизованных карбоксильных групп ПМАК с NHi" группами одной и той же макромолекулы D6, а также гидрофобными взаимодействиями обращенных наружу неполярных групп ПМАК друг с другом.

Сопоставление изменений времен релаксации т, характеризующих изменение внутримолекулярной наносекундной подвижности ПМАК* при взаимодействии с линейным полилизином или дендримерами D3 и D5 (рис. 8), показало более высокую заторможенность цепей ПМАК* в комплексах с дендримерами по сравнению с внутримолекулярной подвижностью ПМАК*, взаимодействующих с линейным полилизином, и наличие подвижных участков ПМАК* в комплексе с ассоциатами D3, образующимися на цепях ПМАК*, или их отсутствие в комплексе ПМАК* - D5.

Рис. 8 Зависимость тгтмак(Р), влияние линейного полияизипа или деццримеров на основе лизина на внутримолекулярную подвижность ПМАК* (а = 0,84) в воде, Спмак = 0,2 м1/мл, р = [О].[ПМАК*].

Таким образом, в ходе исследований было показано, что дендримеры на основе лизина обладают повышенной комплексообразующей способностью по сравнению с линейным аналогом не только в отношении низкомолекулярных

веществ, но и высокомолекулярных соединений. Обнаружено, что разная плотность упаковки структурных фрагментов в макромолекулах лизиновых гомо- и гетеродендримеров проявляется не только в формировании в растворах супрамолекулярных ассоциатов, но и в механизмах образования макромолекулярных комплексов, возникающих при взаимодействии дендримеров с комплементарными соединениями иного химического строения, и оказывает влияние на стабильность образующихся комлексов, играющую принципиальное значение для «выживания» комплекса в экспериментах in vivo.

8. Исследование образования комплекса дендример/ДНК методом спектроскопии кругового дихроизма

Для изучения структурных особенностей дендримеров и их способности взаимодействовать с молекулами ДНК был применен метод спектроскопии кругового дихроизма (КД). В ходе экспериментов было показано, что дендримеры не проявляют способности к регулярной укладке аминокислот ( а-спираль или р-структура). Более того, введение в структуру дендримера дополнительных аминокислот различного химического строения также не оказывает влияния на форму спектров КД дендримеров независимо от рН раствора и полярности растворителя. Эти факты еще раз подтверждают данные о том, что дендримеры является жесткими структурами.

Исследование взаимодействия гомодендримера пятой генерации D5 и гетеродендримеров D5H, D5E, D5A, D5GG с молекулами ДНК показало, что изменение вторичной структуры ДНК происходит во всех исследованных системах и зависит от весового соотношения компонентов в растворе (г). Способность дендримеров связывать молекулы ДНК изучалась по изменению амплитуды положительной и отрицательной полос спектров КД, а также по изменению их формы в области 230-290 нм (рис. 9).

Рис. 9. Спектры кругового дихроизма, полученные для системы Ю5/ДНК в зависимости от концентрации П5 в растворе 0,15мМ N:\C1.

Для каждой системы было определено значение г, при котором начинается взаимодействие ДНК с дендримером. Обнаружено, что спектры КД

в исследованных системах неидентичны, что может свидетельствовать о различной структуре образующихся комплексов.

Параллельно был проведен анализ агрегативной устойчивости комплексов дендример/ДНК с помощью исследования зависимости характеристической «мутности» раствора, выраженной отношением оптической плотности раствора при 320 нм (обусловленной рассеянием света на частицах) и оптической плотности при 260 нм (определяемой концентрацией ДНК), от доли дендримера г в исследуемой системе. Было обнаружено, что в системах ДНКЛ}5А и ДНК/0500 наблюдается критическое значение концентрации дендримера (гкри1 - 0,5), при котором характеристическая «мутность» имеет максимальное значение и свидетельствует об образовании агрегатов комплексов, при этом в спектрах КД происходит исчезновение полосы поглощения ДНК. После полной нейтрализации зарядов ДНК дендримерами Б5А и 0500 и агрегации комплексов, при дальнейшем увеличении содержания дендримера в системе (г > гкр(ГГ) происходит восстановление типичных для комплексов ДНК/дендример полос КД, что может свидетельствовать о диссоциации первоначально образовавшихся крупных ассоциатов. В системе ДНК/Е)5Е определено пороговое значение гпор -2,0, при котором комплексы теряют агрегативную устойчивость, и далее, с ростом концентрации дендримера в растворе (г > гпор), диссоциации агрегировавших комплексов не происходит, полосы ДНК в спектрах КД исчезают и не восстанавливаются. Особым образом проходят процессы комплексообразования в системе ДНК/Е)5Н. Было определено ггрит = 1, однако, при увеличении концентрации дендримера (г > гкрит) характеристическая мутность раствора растет пропорционально росту концентрации дендримера, но полосы ДНК в спектрах КД сохраняются. Это может свидетельствовать о продолжении процесса комплексообразования в растворе и о формировании комплексов большего размера.

Из полученных данных можно сделать вывод, что строение дендримера влияет на строение и свойства его комплексов с ДНК, а изменение химического строения расставки между остатками лизина в структуре дендримера определяет пути направленного регулирования свойств комплексов ДНК/дендример, в частности, их агрегативной устойчивости, которая имеет принципиальное значение для эффективного генного переноса.

9. Исследование ДНК-компактизующей способности дендримеров на основе лизина методом гель-электрофореза

ДНК-компактизующая способность гомодендримеров третьей и пятой операций была исследована методом агарозного гель-электрофореза. Известно, что при образовании комплексов происходит изменение электрофоре гической подвижности молекул ДНК - при оптимальном соотношении реагентов комплекс остается на старте (рис. 10).

Было установлено, что полная задержка ДНК в случае гомодендримеров БЗ и Б5 наблюдается при одинаковом зарядовом соотношении ДНК/носитель равном 1:1. Однако, при увеличении концентрации Б5 (рис. 106, дорожка 5,6)

:вечекие комплекса в лунках уменьшается, что, видимо, означает увеличение их плотности, которое затрудняет проникновение в комплексен тер калирующс! о красителя бромистого этидия. который используется для обнаружения ДНК в экспериментах. Комплексы же ДНК/ОЗ остаются в достаточной степени «рыхлыми» для его проникновения, и затухание флуоресценции комплекса не происходит.

а б

'ис. 1 0. Электрофорез н 0,8% агарозном геле смеси плазмидноЙ ДНК рСМУ-пЫ,ас/ с 1)3 (а) 105 (б)при зарядовых соотношениях: ДНКТО - 1:0.1 (2), 1:0.5(3), 1:1(4), 1:2(5), 1:4(6), 1:6 7), 1:8 (8), 1:10 (9), ДНКЯ)5 - 1:0.5 (2), 1:1 (3), 1:2 (4), 1 4(5), !:6 (6). Контроль свободная «несвязанная») плазмидная ДНК (1).

10. Исследование эффективности трансфекции комплексами ДНК/дендример и анализ эндосомолитических свойств гомодендримеров третьей и пятой генераций

Эффективность трансфекции, т.е. экспрессии бактериальной р-галактозы, ;омплексами ДНК.'03 и ДНК/05 была определена па примере клеточной линии ЧеЬас маркерным геном рСМУ-пЬЬас/.

При подборе соотношения ДНК/дендример в серии экспериментов было токазано, что максимальная эффективность трансфекции комплексом ДНК/ОЗ >ез добавления эндосомолитических агентов (например, хлорокина) юстигалась при зарядовом соотношении ДНК/ОЗ равном 1:2 и составляла 0,86 0,41% от общего числа трансфе пируем ых клеток. Эффективность трансфекции при использовании комплекса ДНЮ'05 в целом была сравнима с грансфекционной активностью комплекса с 03 и составила 0,94 ± 0,05% от )бщего числа клеток. Однако добавление в систему хлорокина обнаруживает >езкое отличие 05 от 03 - присутствие хлорокина увеличивает эффективность трансфекции комплексом ДНК/05 почти на порядок - от 0.94 ± 0,05% до 7,9 ± 1,0% от общего числа клеток. На эффективность проникновения в клетки комплекса ДНК/ОЗ хлорокин, напротив, действия не оказал.

Таким образом, изучение эффективности трансфекции клеток линии НсЬа комплексами ДНК'03 и ДНК/05 в отсутствие лизосоморазрушающих ;оедииеннй показало, что уровни трансфекпии сопоставимы между собой. Однако, добавление к фансфецирующей системе сильного »ндосомолитичеСкОго агента хлорокина приводит к значительному увеличению /ровня трансфекции комплексом ДНК/05.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведен твердофазный синтез гомолизиновых дендримеров без структурных дефектов и гетеролизиновых дендримеров, имеющих между точками «ветвления» - диацилированш.ши остатками лизина дополнительные а-аминокислоты с различными функциональными группами и выявлено влияние химической природы дендримера на ход синтеза.

2. Впервые двумя методами молекулярной гидродинамики и ПМР спектроскопии показано, что локальная плотность структурных звеньев в молекулах полилизиновых дендримеров имеет минимум на четвертой генерации и резко увеличивается при переходе к шестой генерации. Показано, что дендримеры, построенные на основе несимметричного лизина, имеют характеристики, присущие симметричным дендримерам.

3. Разработан метод синтеза люминесцентно меченых лизиновых дендримеров высокой степени чистоты с метками антраценовой природы, ковалентно присоединенными к внешними и внутренним слоям дендримерных молекул. Методом поляризованной люминесценции показано, что плотность упаковки лизиновых фрагментов в гомодендримерах возрастает с ростом номера генерации, в то время как в гетеродендримерах она понижается.

4. Методом ГШ обнаружено явление ассоциации лизиновых дендримеров. Тенденция к ассоциации дендримеров падает с ростом номера генерации дендримера и возрастает при переходе от гомодендримера к гетеродендримеру с тем же номером генерации.

5. При сравнительном анализе особенностей комплексообразования и стабильности комплексов лизиновых дендримеров и линейного полилизина с низкомолекулярными (АНС) и высокомолекулярными (IIMAK) соединениями впервые показаны явные преимущества лизиновых дендримеров по сравнению с линейным полилизином как на стадии образования комплексов, так и при исследовании их стабильности.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. ГЛ. Власов, Г.М. Павлов, Н.В. Баянова, Е.В. Корнеева, С. Эбель, М.А. Ходорковский, Т.О. Артамонова. Дендримеры на основе ос-аминокислот: синтез и гидродинамические характеристики // ДАН. 2004. Т. 399. № 3. С. 366-368.

2. Г.П. Власов, В.И. Корольков, И.А. Гурьянов, Н.В. Баянова, А.Н. Баранов, A.B. Киселев, Е.А. Лесина, B.C. Баранов. Оптимизация трансфицирующих свойств комплексов ДНК с лизиновыми дендримерами // Биоорган. Химия. 2005. №2. С. 167-174.

3. Н.В. Баянова, Г.П. Власов, Е.В. Ануфриева, Т.Н. Некрасова, Т.Д. Ананьева, М.Г. Краковяк. Водорастворимые дендримеры на основе а-аминокислот: синтез, функциональные свойства и наносекундная динамика // Структура и динамика молекулярных систем. 2003. X (1). С. 21-23.

4. E. Anufrieva, Т. Ananieva., N. Bayanova., G. Vlasov, M. Krakovyak., O. Nazarova, T. Nekrasova, E. Panarin, and R. Srayslov. Nanosecond Mobility of the Molecules in the Research of Supramolecular Assemblies of Dendrimers, DNA, or Tullerene-Containing Compounds // Macromolecular Symposia. 2006. V. 237 (1). P. 1-6.

5. E.B. Скворцова, A.H. Скворцов, В.И. Воробьев, H.B. Баянова, И.И. Тарасенко, Г.П. Власов. Гетеродендримеры на основе лизина и гомологичные им гиперразветвленные полимеры: физико-химические свойства и взаимодействие с ДНК // Структура и динамика молекулярных систем. 2006. XIII (II). С. 245-248.

6. G. Vlasov, V. Korol'kov, G. Pankova, N. Bajanova, I.Tarasenko, V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, P. Glazkov, O. Ostapenko, and E. Lesina. Lysine dendrimers and their starburst polymer derivatives as carriers for the DNA delivery // Journal of Peptide Sciences. 2002. Suppl. 8. P. 189.

7. G. Vlasov, V. Korol'kov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Harenko, V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, P. Glaskov, O. Ostapenko, E. Lesina. Starburst polymer protein and lysine dendrimer conjugates search of DNA targeted delivery // 7-th World Conference on biodegradable polymers & plastics. Pisa, Italy. 2002. P. 61.

8. G. Vlasov1 V. Korol'kov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Harenko, V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, P. Glaskov, O. Ostapenko, E. Lesina. Starburst polymer protein and lysine dendrimer conjugates seach of DNA targeted delivery // 4th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems". St. Petersburg. 2002. P. 246.

9. N. Bajanova and G. Vlasov. Synthesis and investigation of heterogenic dendrimers on the basis of aminoacid // 4-th International Symposium "Molecular order and Mobility in Polymer Systems". St. Petersburg. 2002. P. 248.

10.Г.П. Власов, H.B. Баянова, И.А. Гурьянов, Г.А. Панкова, В.И. Воробьев, E.B. Авдеева, E.B. Чихиржина, Э. Бок, В.А. Березин. Синтез и изучение вторичной структуры FGL-фрагмента белка NCAM в димерной и тетрамерной форме // Тезисы Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва. 2003. С. 11.

11 .G. Vlasov, I. Guryanov, G. Pankova, I. Tarasenko, N. Bajanova, O. Charenko, A. Zhukov, V. Baranov, A. Baranov, A. Kiselev, E. Lesina, V. Vorobyev, E. Avdeeva, E. Chihirdzhina. Synthesis and comparative study of carriers for DNA targeted delivery // 10th Germany - Russian Peptide Symposium. Friedrichroda/Thuringia. 2003. P. 74.

12.G. Vlasov, N. Bajanova, V. Vorobyev, E. Avdeeva, E. Korneeva, N. Michailova, G. Pavlov. Lysine dendrimers: Synthesis and investigation of hydrodynamic propeties and their ability to interact with DNA H 3-th International Dendrimer Symposium. Berlin, Germany. 2003. P. 86.

13.H.B. Баянова, Г.П. Власов, E.B. Ануфриева, Т.Н. Некрасова, Т.Д. Ананьева, М.Г. Краковяк. Водорастворимые дендримеры на основе а-аминокислот: синтез, функциональные свойства и наносекундная динамика // Структура и динамика молекулярных систем. Яльчик. 2003. В. 13.

14.Г.П. Власов, Н.В. Баянова, Е.В. Корнеева, C.Ebel, Н.А. Михайлова, Г.М. Павлов. Дендримеры на основе «-аминокислот: синтез и гидродинамические и молекулярные характеристики // Третья Всероссийская Каргинская Конференция «Полимеры-2004». 2004. Т. 2. С. 208.

15.G.P. VJasov, I.A. Guryanov, N.V. Bajanova, G.A. Pankova,V.I. Vorobyov, E.V. Avdeeva, E.V. Chihirzhina, E.Bock, I.A. Berezin. Plural forms of FGL fragment of NCAM: structure and interaction with specific antibodies // J. Pept. Sci. (3rd International and 28th European peptide symposium). Prague, Czech Republic. 2004. Suppl. 10. P. 265.

16.E.B. Скворцова, Н.В. Баянова, И.И. Тарасенко, Г.П. Власов. Цепные линейные, разветвленные и сферические невирусные полимерные носители, синтезированные на основе лизина // 3-й съезд биофизиков России. Воронеж. 2004. С. 167.

17.Г.П. Власов, И А. Гурьянов, Н.В. Баянова, И.И. Тарасенко, М.Н. Богданова, В.В. Захаров, М.Г. Мосевицкий. Синтез аналогов пятнадцатичленного FGL фрагмента белка NCAM и их воздействие на процессы в аксоновых окончаниях нейронов // Мат. II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. Р. 26.

18.Е. Anufrieva, T. Nekrasova, G. Vlasov, M. Krakovyak, N. Bayanova, T. Ananieva, R. Smyslov. Formation and Dynamiic Properties of Supramolecular Structures of Dendrimers on a Lysine Basis in Water and Aqueous - salt Solution // V Itemational Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems». Sankt-Petersburg. 2005. P. 093.

Бесплатно

Напечатано методом ризографии ИВС РАН. 2007 г. тир. 100 экз.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Баянова, Надежда Витальевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Основные структурные элементы дендримерной макромолекулы.

1.2. Синтетические концепции.

1.2.1. Дивергентный метод.

1.2.2. Конвергентный метод.

1.2.3. Альтернативные методы синтеза дендримеров.

1.2.3.1. Полимеризация трехфункциональных мономеров.

1.2.4. Твердофазный метод синтеза дендримеров.

1.3. Структура дендримерных макромолекул и методы ее исследования.

1.3.1. Гидродинамические методы.

1.3.2. Спектроскопия ЯМР.

1.3.3. Масс спектрометрия.

1.3.4. Меточные подходы.

1.3.5. Люминесцирующие метки.

1.3.6. Поляризованная люминесценция.

1.4. Способы модификации дендримерных структур.

1.4.1. Поверхностная функционализация.

1.4.2. Слоевая и сегментальная фу нкционализация.

1.5. Дендримеры - носители в генной терапии.

1.5.1. Основные критерии носителей ДНК.

1.5.2. Невирусные системы генной доставки.

1.5.2.1. Катионные липиды.

1.5.2.2. Полимерные системы на основе Ь-лизина.

1.5.2.3. Полиэтиленимины.

1.5.3. Дендримеры - эффективные вектора генной доставки.

1.5.4. Дендримеры на основе Ь-лизина.

1.5.5. Методы исследования образования дендример/ДНК комплекса.

1.5.5.1. Гель электрофорез.

1.5.5.2. Спектроскопия кругового дихроизма.

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Синтез полилизиновых гомо- и гетеродендримеров на полимерном носителе.

2.1.1. Синтез гомолизиновых дендримеров.

2.1.2. Синтез гетеродендримеров на основе лизина.

2.1.3. Выделение, очистка и анализ дендримеров на основе лизина.

2.2. Исследование молекул полилизиновых дендримеров методом МА1Л31 ТОР масс спектрометрии. ^

2.3. Гидродинамические свойства дендримеров на основе лизина.

2.4. Исследование гомолизиновых дендримеров различных генераций методом ЯМР спектроскопии

2.5. Синтез люминесцентно меченых гомо- и гетеродендримеров на основе лизина. Исследование структурно-динамических свойств и комплексообразующей способности.

2.5.1. Особенности структурной организации лизиновых дендримеров различных генераций.

2.5.2. Комплексообразующая способность макромолекул лизиновых дендримеров при взаимодействии с низкомолекулярным органическим анионом.

2.5.3. Взаимодействие полилизиновых дендримеров с ионизованными молекулами полиметакриловой кислоты в водных растворах и стабильность образующихся комплексов.

2.6. Исследование взаимодействия полилизиновых дендримеров с молекулами ДНК методом спектроскопии кругового дихроизма.

2.7. Исследование дендримеров на основе лизина различных генераций в качестве носителей генных конструкций.

2.7.1. Образование комплексов дендримеров с плазмидной ДНК.

2.7.2. Анализ эффективности трансфекции комплексами ДНК/дендример.

2.7.3. Изучение эндосомолитических свойств комплексов ДНК/ОЗ и ДНК/05.

2.7.4. Изучение особенностей внутриклеточной локализации комплексов плазмидной ДНК с дендримерами после трансфекции in vitro.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Синтез гомо- и гетеролизиновых дендримеров.

3.3.2. Твердофазный синтез дендримеров.

3.3.3. Синтез люминесцентно меченых дендримеров.

3.3.4. Определение гидродинамических характеристик.

3.3.5. Спектроскопия кругового дихроизма.

3.3.6. Получение комплексов дендример-рСМУ-пЬ-Ьсг.

3.3.7. Эффективность трансфекции клеток НеЬа комплексами дендример-рСМУ-п18-1ас7.

3.3.8. Исследование структурно-динамических характеристик и комплексообразующей способности люминесцентно меченых дендримеров

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез гомо- и гетеродендримеров на основе α-аминокислот"

Водорастворимые поликатионные системы привлекают все возрастающее внимание исследователей, что обусловлено перспективами их использования в качестве полимеров-носителей биологически активных веществ (БАВ), таких как противовирусных, противобактериальных и противораковых препаратов, а также при целевом транспорте генетического материала в новых биомедицинских технологиях, связанных с генной терапией. Основной задачей генной терапии является поиск оптимальных носителей для целевого транспорта ДНК в клетки определенного вида. Ограничения, связанные с применением вирусных носителей как транспортных средств для доставки ДНК, такие как сильный иммунный ответ при многократном применении или токсический эффект, вызванный продуктами их распада, явились главной причиной активного поиска новых систем доставки ДНК с использованием синтетических носителей: так называемый невирусный способ доставки. К настоящему времени выявлены наиболее перспективные в этом плане поликатионные носители, такие как катионные липосомы, разветвленные полиэтиленимины или сверхразветвленные полиамидоаминные (ПАМАМ) молекулы - дендримеры. Носители на их основе более всего отвечают требованиям, предъявляемым к носителям ДНК, они компактизуют ее, обеспечивают эффективную защиту от расщепления нуклеазами крови, способствуют эффективному выходу комплексов ДНК из эндосом. Вместе с тем был отмечен токсический эффект, проявляемый данными носителями. В связи с этим представляется перспективным синтез и исследование дендримеров на основе природной а-аминокислоты - лизина. Данные макромолекулы, имея все преимущества выше отмеченных носителей, являются действительно биосовместимыми и биодеградируемыми. Несмотря на большое количество публикаций по синтезу и применению дендримерных макромолекул для целевого транспорта БАВ, число работ по изучению закономерностей их синтеза, физико-химических свойств и особенностей их строения весьма невелико. Актуальной остается проблема получения монодисперсных дендримерных макромолекул с высоким числом генераций и/или сложным химическим строением. Известно, что при создании каждой последующей генерации дендримера возрастают трудности достижения полной конверсии функциональных групп, что, в свою очередь, усложняет получение дендримеров без дефектов в структуре. В связи с вышесказанным разработка методов синтеза гомо- и гетеродендримеров на основе Ь-лизина, изучение их структурной организации и физико-химических свойств, а также исследование особенностей формирования интерполиэлектролитных комплексов (ИПЭК) с участием дендримеров является актуальной задачей.

Цель работы состояла в разработке оптимальных методов синтеза новых монодисперсных регулярных дендримерных макромолекул на основе Ь-лизина различных генераций с использованием твердофазного метода, в изучении влияния структуры дендримеров на ход их синтеза, исследовании структуры и свойств дендримеров, а также их комплексов с ДНК или синтетическим полианионом - полиметакриловой кислотой (ПМАК), с использованием различных методов.

Научная новизна. Впервые с использованием полимерных носителей получен ряд монодисперсных водорастворимых гомолизиновых дендримеров различных генераций; впервые осуществлен синтез регулярных гетеролизиновых дендримеров, в структуру которых между точками «ветвления» - остатками диацилированных лизинов - введены фрагменты различных аминокислот: гистидина, глутаминовой кислоты, аланина и дипептида глицил-глицина, несущие дополнительные боковые группы; определены условия синтеза данных дендримеров на твердой фазе, что позволило установить влияние структуры синтезируемого соединения на ход синтеза; показана применимость таких методов анализа как масс-спектрометрия, спектроскопия ЯМР и КД для исследования структурных и физико-химических характеристик лизиновых дендримеров; впервые применен динамический метод поляризованной люминесценции (ПЛ) для изучения структурно-динамических характеристик синтезированных дендримеров, для этого впервые синтезированы люминесцентно меченые дендримеры, имеющие ковалентно связанную люминесцирующую метку (JIM) на внешнем или внутреннем слое дендримерной макромолекулы. Применение метода ПЛ позволило впервые изучить влияние номера генерации и химического строения дендримера на его способность к формированию супрамолекулярных структур в растворе - образование ассоциатов, особенности формирования интерполимерных комплексов и комплексов с низкомолекулярными соединениями в качестве моделей широкого круга БАВ. Впервые исследовано влияние химического строения дендримеров на свойства их комплексов с ДНК.

Практическая ценность. Методом твердофазного синтеза пептидов получен ряд гомо- и гетеродендримеров на основе природных си-аминокислот различных генераций. Показана перспективность их использования в качестве носителей генетического материала в клетку. Определены пути оптимизации свойств дендримеров с целью повышения трансфекционной активности комплексов дендример/ДНК. Использование техники твердофазного синтеза потенциально позволяет автоматизировать и масштабировать процесс синтеза данного класса макромолекул.

Основные положения, выносимые на защиту;

• метод модификации дендримеров JIM по внешним и внутренним слоям;

• исследование структурно-динамических характеристик дендримеров и механизмов формирования супрамолекулярных систем с участием дендримеров в растворе;

• взаимодействие дендримеров с молекулами ДНК.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведен твердофазный синтез гомолизиновых дендримеров без структурных дефектов и гетеролизиновых дендримеров, имеющих между точками «ветвления» - диацилированными остатками лизина -дополнительные а-аминокислоты с различными функциональными группами и выявлено влияние химической природы дендримера на ход синтеза.

4. Методом ПЛ обнаружено явление ассоциации лизиновых дендримеров. Тенденция к ассоциации дендримеров падает с ростом номера генерации дендримера и возрастает при переходе от гомодендримера к гетеродендримеру с тем же номером генерации.

5. При сравнительном анализе особенностей комплексообразования и стабильности комплексов лизиновых дендримеров и линейного полилизина с низкомолекулярными (АНС) и высокомолекулярными (ПМАК) соединениями впервые показаны явные преимущества лизиновых дендримеров по сравнению с линейным полилизином как на стадии образования комплексов, так и при исследовании их стабильности.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Баянова, Надежда Витальевна, Санкт-Петербург

1. Frechet J.M.J., Tomalia D.A. Dendrimers and other Dendritic Polymers. John

2. Wiley & Sons. 2002. 648 p.

3. Newkome G.R., Moorefield C.N., Vögtle F. Dendrimers and Dendrons. Concepts, Syntheses, Applications. Wiley-VCH. 2001. 636 p.

4. Vögtle F. Dendrimers. Topics in Curr Chem. Springer. Berlin. 1998. V. 197.240 p.

5. Tomalia D.A., Majoros I. Dendrimeric supramolecular and supramacromolecular Assemblies // J. Macromol. Sei. Polymer Rev. 2003. V. 43. №3. P. 411-477.

6. Fischer M., Voegtle F. Dendrimere vom Design zur Anwendung // Angew.

7. Chem. 1999. V. 111. P. 934-955.

8. Hawker C.J. Dendritic and Hyperbranched Macromolecules Precisely Controlled Macromolecular Architectures // Adv. Polym. Sei. 1999. V. 147. P. 113-160.

9. Ardoin N., Astruc D. The molecular trees : from syntheses towards applications

10. Bull. Soc. Chim. Fr. 1995. V. 132. P. 875-909.

11. Inoue K. Functional dendrimers, hyperbranched and star polymers // Prog. Polym. Sei. 2000. 25. P. 453-571.

12. Voegtle F., Gestermann S., Hesse R., Schwierz H., Windisch B. Functional dendrimers // Prog. Polym. Sei. 2000. 25. P. 987-1041.10J Семчиков Ю.Д., Бочкарев M.H. Гибридные дендримеры // Высокомолек. Соед. Серия С. 2002. Т. 44. №12. С. 2293-2321.

13. Hecht S., Frechet J.M.J. Dendritisch eingeschlossene aktive Zentren: Anwendung des Isolationsprinzips der Natur in der Biomimetik und den Material Wissenschaften // Angew. Chem. 2001. V. 113. P. 76-94.

14. Klajnert В., Bryszewska M. Dendrimer: properties and applications // Acta Biochimica polonica. 2001. V. 48. N. 1. P. 199-208.

15. Музафаров A.M., Ребров E.A. Современные тенденции развития химии дендримеров // Высокомолек. Соед. С. 2000. Т. 42. №11. С. 2015-2040.

16. Семчиков Ю.Д. Дендримеры новый класс полимеров // Соросовский образовательный журнал. 1998. №12. С. 45-51.

17. Tomalia D.A., Baker Н., Dewald J.R., Hall М., Kailos G„ Martin S., Roeck J., Ryder J., Smith P. A new class of polymers: starburst-dendritic macromolecules // Polym. J. 1985. V. 17. №1. P. 117-132.

18. Newkome G.R., Yao Z.-Q., Baker G.R., Gupta V.K. Micelles. Part 1. Cascade molecules: a new approach to micelles // J. Org. Chem. 1985. V. 50. №11. P. 2003-2006.

19. Denkewalter R.G., Kolc J.F., Lukasavage W.J. Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units // US Pat. 1981. 4,289,872.

20. Tomalia D.A., Naylor A.N., Goddard W.A. III. Starburst-dendrimere: kontrolle von große, gestalt, oberflächenchemie, topologie und flexibilität beim Übergang von atomen zu makroskopischer materie // Angew. Chem. 1990. V. 102. №2. P. 119-157.

21. Tomalia D.A., Dvornic P.R. What promise for dendrimers? // Nature. 1994. V. 372. P. 617-618.

22. Denkewalter R.G., Kolc J.F., Lukasavage W.J. Macromolecular highly branched homogeneous compound // US Pat. 1983.4,410,688.

23. Buhlein E., Wehner W., Vögtle F. "Cascade"- and "Nonskid-Chain-like" syntheses of molecular cavity topologies // Synthesis. 1978. V. 2. P. 155-158.

24. Vögtle F., Weber E. Vielzähnige nichtcyclische Neutralliganden und ihre Komplexierung // Angew. Chem. 1979. V. 91. №10. P. 813-837.

25. Tomalia D.A., Dupont D.H. Supramolecular Chemistry: Directed synthesis and molecular recognitions // Topics in Curr Chem. Springer. Berlin. 1993. V. 197. 193 p.

26. Newkome G.R., Yao Z„ Baker G.R., Gupta V.K., Russo P.S., Saunders MJ. Chemistry of micelles series. Part 2. Cascade molecules. Synthesis and characterization of a benzene 3-arborol // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. №4. P. 849-850.

27. Newkome G.R., Moorefield C.N., Theriot K.J. A convenient synthesis of bis-homotris: 4-amino-4-l-(3-hydroxypropyl)]-l,7-heptanediol, and 1-azoniapropellane//J. Org. Chem. 1988. V. 53. №23. P. 5552-5554.

28. Aharoni S.M., Grosby C.R. Ill, Walsh E.K. Size and solution properties of globular tert-butyloxycarbonyl-poly(a,e-L-lysine) // Macromol. 1982. V. 15. P. 1093-1098.

29. Ohsaki M., Okuda Т., Wada A., Hirayama Т., Niidome Т., Aoyagi H. In Vitro gene transfection using dendritic poly(L-Lysine) // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 510-517.

30. Hummelen J.C., van Dongen J.L.J., Meijer E.W. Electrospray mass spectrometry of poly(propyleneimine) dendrimers the issue of dendritic purity or polydispersity // Chem. Eur. J. 1997. V. 3. P. 1489-1493.

31. Hawker C.J., Frechet J.M.J. A new convergent approach to dendritic macromolecules//J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990. V. 15. P. 1010-1013.

32. Hawker C.J., Frechet J.M.J. Preparation of polymers with controlled molecular architecture. A new convergent approach to dendritic macromolecules //J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. №21. P. 7638-7647.

33. Miller T.M., Neenan T.X. Convergent synthesis of monodisperse dendrimers based upon 1,3,5-Trisubstituted Bensenes // Chem Mat. 1990. V. 2. P. 346.

34. Игнатьева Г.М., Ребров E.A., Мякушев В.Д., Ченская Т.Б., Музафаров A.M. Универсальная схема синтеза кремнийорганических дендримеров // Высокомолек. Соед. А. 1997. Т. 39. №8. Р. 1271-1280.

35. Spindler R., Frechet J.M.J. Two-step approach towards the accelerated synthesis of dendritic macromolecules // J.Chem. Soc. Chem. Commun. Perkin Trans. 1. 1993. V. 8. P. 913-918.

36. Zeng F., Zimmerman S.C. Rapid synthesis of dendrimers by an orthogonal coupling strategy //J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. №22. P. 5326-5327.

37. Deb S.K., Maddux T.M., Yu L. A simple orthogonal approach to poly(phenylenevinylene) dendrimers // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. 38. P. 9079-9080.

38. Yamakawa Y., Ueda M., Takeuchi K., Asai M. One pot syntesis of dendritic polyamide // J. Polym. Sci. Part A. 1999. V. 37. P. 3638-3645.

39. Бочкарев M.H., Каткова M.A. Дендритные полимеры, получаемые одностадийным синтезом // Успехи химии. 1995. Т. 64. №11. С. 11061120.

40. Malmstrom Е., Hult A. Hyperbranched polymers: A review // J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. 1997. V. 37. P. 555-579.

41. Johansson M., Malmstrom E., Hult A. The synthesis and properties of hyperbranched polyesters // TRIP. 1996. V. 4. №12. P. 398-402.

42. Uhrich К.Е., Boegeman S., Frechet J.M.J., Turner S.R. The solid-phase synthesis of dendritic polyamides // Polymer Bull. 1991. V. 25. P. 551-558.

43. Swali V., Wells N.J., Langley G.J., Bradley M. Solid-phase dendrimer synthesis and the generation of super-high-loading resin beads for combinatorial chemistry // J. Org. Chem. 1997. V. 62. P. 4902-4903.

44. Tam J.P. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 5409-5413.

45. Власов Т.П., Корольков В.И., Панкова Г.А., Тарасенко И.И., Баранов

46. A.Н., Глазков П.Б., Киселев А.В., Остапенко О.В., Лесина Е.А., Баранов

47. B.C. Дендримеры на основе лизина и их «звездообразные» полимерные производные; возможность использования для компактизации ДНК и доставки экспрессирующих генетический конструкций in vitro // Биоорганическая химия. 2004. Т. 30. №1. С. 15-24.

48. Merrifield R.B. Festphasen-Synthese (Nobel-Vortrag) // Angew. Chem. 1985. 97(10). P. 801-812.

49. Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger C.D. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides // Anal. Biochem. 1970. V. 34. P. 595-598.

50. Кочетков H.K. Общая органическая химия. M.: «Химия», 1986. Т. 10. С. 405-408.49. de Gennes P.G., Hervet Н. Statistics of "starburst" polymers // Phys. Lett. Paris. 1983. V. 44. P. 351-360.

51. Tomalia D.A., Naylor A.M., Goddart III W.A. Starburst dendrimers -molecular-level control of size, shape, surface-chemistry, topology, and flexibility from atoms to macroscopic matter // Angew. Chem. Int. Ed. 1990. V. 29. №2. P. 138-175.

52. Lewis M., Rees D.C. Fractal surfaces of proteins // Science. 1985. V. 230. P. 1163-1165.

53. Naylor A.M., Goddard III W.A., Kiefer G.E., Tomalia D.A. Starburst dendrimers, molecular shape control // J. Am. Chem. Soc. 1989. V. 111. №6. P. 2339-2341.

54. Jansen J.F., Meijer E.W. The dendritic box shape-selective liberation of encapsulated guests//J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. №15. P. 4417-4418.

55. Jin R.H., Aida Т., Inoue S. Caged porphyrin the 1-st dendritic molecule having a core photochemical functionality // J.Chem. Soc. Chem. Commun. 1993. V. 16. P. 1260-1262.

56. Prosa T.J., Bauer B.J., Amis E.J., Tomalia D.A., Scherrenberg R. A saxs study of the internal structure of dendritic polymer systems // J.Polym. Sci. Part B. 1997. V.35.P. 2913-2924.

57. Esfand R.E., Tomalia D.A. Poly(amidoamine) (РАМАМ) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications // DDT. 2001. V. 6. P. 427-436.

58. Бреслер C.E., Ерусалимский Б.Л. M.: Наука. 1963.

59. Бочкарев М.Н., Каткова М.А. Дендритные полимеры, получаемые одностадийным синтезом // Успехи химии. 1995. Т. 64. №11. С. 11061120.

60. Павлов Г.М., Корнеева Е.В., Михайлова Н.А., Roy R., Ortega P. Cejas, Perez А. Молекулярные характеристики лактодендримеров на основе полиамидоамина // Высокомолек. соед. А. 1999. Т. 41. №11. С. 18101815.

61. Matos M.S., Hofkens J., Verheijen W., De Schryver F.C., Hecht S., PoIIak K.W., Frechet J.M.J., Forier В., Dehaen W. Effect of core structure on photophysical and hydrodynamic properties of porphyrin dendrimers // Macromol. 2000. V. 33. P. 2967-2973.

62. Brothers H.M., Piehler L.T., Tomalia D.A. Slab-gel and capillary electrophoretic characterization of polyamidoamine dendrimers // J.Chromatogr. A. 1998. V. 814. P. 233-246.

63. Meltzer A.D., Tirrell D.A., Jones A.A., Inglefield P.T., Hedstrand D.M., Tomalia D.A. Chain dynamics in poly(amido-amine) dendrimers a study of nC nmr relaxation parameters // Macromol. 1992. V. 25. P. 4541-4548.

64. Hu Q.S., Pugh V., Sabat M., Pu L. Structurally rigid and optically active dendrimers // J. Org. Chem. 1999. V. 64. P. 7528-7536.

65. Gorman C.B., Hager M.W., Parkhurst B.L., Smith J.C. Use of a paramagnetic core to affect longitudinal nuclear relaxation in dendrimers A tool for probing dendrimer conformation // Macromol. 1998. V. 31. P. 815-822.

66. Kremers J.A., Meijer E. W. Synthesis and characterization of a chiral dendrimer derived from pentaerythritol // J. Org. Chem. 1994. V. 59. P. 42624266.

67. Hood J.R., Watson J.T., Jones A.D. Resolution and mass accuracy of highmass ions in tof mass spectrometry: applications to PAMAM dendrimers // 54th Annual Conference on Mass Spectrometry. Seattle, Washington. 2006.

68. Schwartz B.L., Rockwood A.L., Smith R.D., Tomalia D.A., Spindler R. Detection of high molecular weight starburst dendrimers by electrospray ionization mass spectrometry // Rapid Comm. Mass Spectrom. 1995. V. 9. P. 1552-1555.

69. Cohen M.S., Petoud S., Raymond N.K. Synthesis and metal binding properties of salicylate-, catecholate-, and hydroxypyridinonate-functionalized dendrimers // Chem. Eur. J. 2001. V. 7. №1. P. 272-279.

70. Koper G.L., van Genderen M.H., Elissen-Roman C., Baars M.W., Meijer E.W., Borkovec M. Protonation mechanism of poly(propylene imine) dendrimers and some associated oligo amines // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6512.

71. Lottspeich F., Zorbas H. Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. 1998. K. 14. 323 p.

72. Walker K.L., Kahr M.S., Wilkins C.L., Xu Z., Moore J.S. Analysis of hydrocarbon dendrimers by laser desorption time of flight and fourier transform mass spectrometry // J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 1994. V. 5. P. 731-739.

73. Leon J.W., Frechet J.M.J. Analysis of aromatic polyether dendrimers and dendrimer-linear block copolymers by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry // Polym. Bull. 1995. V. 35. P. 449-455.

74. Kawa M., Frechet J.M.J. Self-assembled lanthanide-cored dendrimer complexes: Enhancement of the luminescence properties of lanthanide ions through site-isolation and antenna effects // Chem. Mater. 1998. V. 10. P. 286296.

75. Jiang D.L., Aida T.J. Morphology-dependent photochemical events in aryl ether dendrimer porphyrins: Cooperation of dendron subunits for singlet energy transduction // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. №42. P. 1089510901.

76. Falbe J., Regitz M. Rompp Chemie-Lexikon. Stuttgart: Georg Thieme Verlag. 1990.

77. Koller E. Fluorescent labels for use in biology and biomedicine // Appl. Fluoresc. Technol. 1989. V. 1. №2. P. 1-8.

78. Foote C.S. Chemical sensors special issue // Acc. Chem. Res. 1998. V. 31. №5. P. 199-324.

79. Fabbrizzi L., Poggi A. Sensors and switches from supramolecular chemistry // Chem. Soc. Rev. 1995. V. 24. P. 3197-3202.

80. Anufrieva E.V., Gotlib Yu.Ya. Investigation of polymers in solution by polarized luminescence // Adv. Polym. Sci. 1981. V. 40. P. 1-68.

81. Ануфриева E.B., Краковяк М.Г. Динамика полимерных цепей в процессах структурных и химических превращений макромолекул // Высокомолек. соед. А. 1987. Т. 29. С. 211-222.

82. Красовский В.Г., Садовский Н.А., Горбацевич О.Б., Музафаров A.M., Мякушев В.Д., Ильина М.Н., Дубовик И.И., Стрелкова Т.В., Панков B.C. Полиаллилкарбосилановые дендримеры с флуоресцентной меткой // Высокомолек. соед. А. 1996. Т. 38. №4. С. 714-720.

83. Краковяк М.Г. Изучение полимеризации алифатических диазосоединений: Дис. д.х.н. Л. 1968.

84. Краковяк М.Г., Лущик В.Г., Сычева Е.А., Ануфриева Е.В. 9-антрилметилизоцианаты в синтезе полимеров с люменесцирующими группами // Высокомолек. соед. Б. 1986. Т. 28. С. 289-294.

85. Ануфриева Е.В., Краковяк М.Г., Паутов В.Д., Ананьева Т.Д. Роль мелкомасштабных движений в белковой глобуле в усилении электронных взаимодействий фотоактивных групп // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. №2. С. 223-226.

86. Tomalia D.A., Naylov A.M., Goddard W.A. Starburst dendrimers -molecular-level control of size, shape, surface-chemistry, topology, and flexibility from atoms to macroscopic matter // Angew. Chem. Inter. Ed. Eng. 1990. V. 29. №2. P. 138-175.

87. Huang Q.R., Dubin P.L., Moorefield C.N., Newkome G.R. Counterion binding on charged spheres: Effect of pH and ionic strength on the mobility of carboxyl-terminated dendrimers // J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 898904.

88. Jansen J.F., Meijer E.W. The dendritic box: Shape selective liberation of encapsulated guest//J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 4417-4418.

89. Jansen J.F., de Brabander van den Berg E.M., Meijer E.W. Encapsulation of guest molecules into a dendritic box // Science. 1994. V. 266. P. 1226-1229.

90. Mekelburger H.B., Rissanen K., Vogtle F. Repetitive synthesis of bulky dendrimers a reversibly photoactive dendrimer with 6 azobenzene side-chains // Chem. Ber. 1993. V. 126. P. 1161-1169.

91. Archut A., Azzellini G.C., Balzani V., De Cola L., Vogtle F. Toward photoswitchable dendritic hosts. Interaction between azobenzene-functionalized dendrimers and eosin // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 12187-12191.

92. Okuda Т., Sugiyama A., Niidome Т., Aoyagi H. Characters of dendritic poly(L-lysine) analogues with the terminal lysines replaced with arginines and histidines as gene carriers in vitro // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 537-544.

93. Stryer L. Biochemie. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag. 1991.

94. Kim R.M., Manna M., Hutchins S.H., Griffen P.R., Yates N.A., Bernick A.M. Dendrimer-supported combinatorial chemistry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. №10. P. 012-017.

95. James T.D., Shinmon H., Takeuchi M., Shinkai S. A saccharide 'sponge'. Synthesis and properties of a dendritic boronic acid// Chem. Commun. 1996. V. 6. P. 705-706.

96. Hawker C.J., Frechet J.M.J. Unusual macromolecular architectures the convergent growth approach to dendritic polyesters and novel block copolymers // J.Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 8405-8413.

97. Lange P., Beruda H„ Hiller W., Schmidbaur H. Polynuclear gold(I) complexes of dendritic amines formation of terminal tris(triphenylphosphine)aurio(I)] ammonium groups - n(AupPh(3))i1+ // Z Natueforsch. 1994. V. 49. P. 781-787.

98. Wooley K.L., Hawker C.J., Frechet J.M.J. Unsymmetrical 3-dimensional macromolecules preparation and characterization of strongly dipolar dendritic macromolecules // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. №24. P. 1149611505.

99. Hawker C.J., Wooley K.L., Frechet J.M.J. Novel dendritic macromolecules by the convergent growth approach: hyperbranched block copolymers and monodisperse polyesters // Polym. Prepr. 1991. V. 32. №3. P. 623-625.

100. Ledley F.D. Nonviral gene-therapy the promise of genes as pharmaceutical products // Hum. Gene. Ther. 1995. V. 6. P. 1129-1144.

101. Wilson J.M. Adenoviruses as gene-delivery vehicles // N. Engl. J. Med. 1995. V. 334. P. 1185-1187.

102. Li S., Huang L. Nonviral gene therapy: promises and challenges // Gene. Ther. 2000. V. 7. P. 31-34.

103. Miller N., Vile R. Targeted vectors for gene therapy // FASEB. J. 1995. V. 9. P. 190-199.

104. Uckert W., Walther W. Retrovirus-mediated gene-transfer in cancer-therapy // Pharmacol.Ther. 1994. V. 63. P. 323-347.

105. Smaglik P. Science Publishing Evolves: Tangled in the Web // The Scientist. 1999. V. 12. P. 1-3.1113. Smaglik P. E-Biomed Becomes Pubmed Central // The Scientist. 1999. V. 13. P. 9-11.

106. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. Direct gene-transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. V. 247. P. 1465-1468.

107. Yu W.H., Kashani-Sabet M., Liggitt D., Moore D., Health T.D., Debs R.J. Topical gene delivery to murine skin // J. Invest. Dermatol. 1999. V. 112. P. 370-375.

108. Cohen H., Levy R.J., Gao J., Fishbein I., Kousaev V., Sosnowski S., Slomkowski S., Golomb G. Sustained delivery and expression of DNA encapsulated in polymeric nanoparticles // Gene. Ther. 2000. V. 7. P. 18961905.

109. Feigner P.L., Tsai Y.J., Sukhu L., Wheeler C.J., Manthorpe M., Marshall J., Cheng S.H. Improved cationic lipid formulations for in vivo gene therapy //Ann. N.Y. Acad.Sci. 1995. V. 772. P. 126-139.

110. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 4429-4432.

111. Wagner E., Cotton M., Foiser R., Birnstiel M.L. Transferrin-polycation DNA complexes: the effect of polycation on the structure of the complexes and DNA delivery // Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 1991. V. 88. P. 4255-4259.

112. Wadha M.S., Collard W.T., Adami R.C., Mckenzie D., Rice K.G. Peptide-mediated gene delivery: Influence of peptide structure on gene expression // Bioconjugate Chem. 1997. V. 8. P. 81-88.

113. Wyman T.B., Nicol F., Zelphati O., Scaria P.V., Plank C., Szoka F.C. Design, synthesis and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabiliyes bilayers // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 3008-3017.

114. Niidome T., Takaji K„ Urakawa M., Ohmori H., Wada A., Hirayama T., Aoyagi H. Chain length of cationic a-helical peptide sufficient for gene delivery into cells // Bioconjugate Chem. 1999. V. 10. P. 773-780.

115. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. Lipofection-a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 7413-7417.

116. Feigner J.H., Kumar R., Sridhar C.N., Wheeler C.J., Tsai Y.J., Border R., Ramsey P., Martin M., Feigner P.L. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations // J.Biol.Chem. 1994. V. 269. P. 2250-2561.

117. Gao X., Huang L. Cationic liposome-mediated gene transfer // Gene. Ther.1995. V. 2. P. 710-722.

118. Balasubramanian R.P., Bennet M.J., Aberle A.M., Malone J.G., Nantz M.H., Malone R.W. Structural and functional analysis of cationic transfection lipids: the hydrophobic domain // Gene Ther. 1996. V. 3. P. 163-172.

119. Stephan D.J., Yang Y.Z., San H., Simari R.D., Wheeler C.J., Feigner P.L., Gordon D., Nabel G.J., Nabel E.G. A new cationic liposome DNA complex enhances the efficitnty of arterial gene transfer in vivo // Hum. Gene. Ther.1996. V. 7. P. 1803-1812.

120. Rosenyweig H.S., Rakhmanova V.A., MacDonald R.C. Diquaternary ammonium compounds as transfection agent // Bioconj. Chem. 2001. V. 12. P. 258-263.

121. Liu Y., Liggit D., Zhong W., Tu G., Gaensler K., Debs R. Cationic liposome-mediated intravenous gene delivery // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P.24864-24870.

122. Monck M.A., Mori A., Lee D„ Tam P., Wheeler J.J., Cullis P.R., Scherrer P. Stabilized plasmid-lipid particles: pharmacokinetics and plasmid delivery to distal tumors following intravenous injection // J. Drug Target. 2000. V. 7. P. 439^152.

123. Ishiwata H., Suzuki N., Ando S., Kikuchi H., Kitagawa T. Characteristics and biodistribution of cationic liposomes and their DNA complexes // J. Control Rel. 2000. V. 69. P. 139-148.

124. Logan J.J., Bebok Z., Walker L.C., Peng S., Feigner P.L., Siegal G.P., Frizzell R.A., Dong J., Howard M. Cationic lipids for reporter gene and cftr transfer to rat pulmonary epithelium // Gene. Ther. 1995. V. 2. P. 38-49.

125. Zhou X.H., Klibanov A.L., Huang L. Lipophilic poly lysines mediate efficient DNA transfection in mammalian-cells // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1065. P. 8-14.

126. Surovoy A., Flechsler I., Jung G. A novel series of serum-resistant lipoaminoacid compounds for cellular delivery of plasmid DNA // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. V. 451. P. 461-467.

127. Benns J.M., Choi J.S., Mahato R.I., Park J.S., Kim S.W. pH-sensitive cationic polymer gene delivery vehicle: N-Ac-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine) comb shaped polymer // Bioconj. Chem. 2000. V. 11. P. 637-645.

128. Midoux P., Monsigny M. Efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes // Bioconj. Chem. 1999. V. 10. P. 406-411.

129. Erbacher P., Roche A.C., Monsigny M., Midoux P. Putative role of chloroquine in gene transfer into human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes // Exp. Cell. Res. 1996. V. 225. P. 186-194.

130. McKenzie D.L., Kwok K.Y., Rice K.G. A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 9970-9977.

131. Chiou H.C., Tangco M.V., Levine S.M., Robertson D., Kormis K., Wu C.H., Wu G.Y. Enhanced resistance to nuclease degradation of nucleic acids complexed to asialoglycoprotein-polylysine carriers // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 5349-5446.

132. Dash P.R., Read M.L., Barrett L.B., Wolfert M.A., Seymour L.W. Factors affecting blood clearance and in vivo distribution of polyelectrolyte complexes for gene delivery // Gene. Ther. 1999. V. 6. P. 643-650.

133. Ferrari S., Moro E., Pettenazzo A., Behr J.P., Zacchello F., Scarpa M. ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo // Gene. Ther. 1997. V. 4. P. 1100-1106.

134. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. №15. P. 3095-3101.

135. Pollard H., Remy J.S., Loussouarn G., Demolombe S., Behr J.P., Escande D. Polyethylenimine but not cationic lipids promote transgene delivery to the nucleus in mammalian cells // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. №13. P. 75077511.

136. Kircheis R., Kichler A., Wallner G., Kursa M., Ogris M., Felzmann T., Buchberger M., Wagner E. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery // Gene. Ther. 1997. V. 4. P. 409418.

137. Zanta M.A., Boussif O., Adib A., Behr J.P. In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine // Bioconj. Chem. 1997. V. 8. P. 839-844.

138. Haensler J., Szoka F.C. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture// Bioconj. Chem. 1993. V. 4. P. 372-379.

139. Tang M.X., Redemann C.T., Szoka F.C. In vitro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers // Bioconj. Chem. 1996. V. 7. P. 703-714.

140. Kukowska-Latallo J.F., Bielinska A.U., Johnson J., Spindler R., Tomalia D.A., Backer J.R. Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4897-4902.

141. Roberts J.C., Bhalgat M.K., Zera R.T. Preliminary biological evaluation of polyamidoamine (РАМАМ) Starburst(TM) dendrimers // J.Biomed.Mater.Res. 1996. V. 30. P. 53-65.

142. Choi J.S., Lee E.J., Choi Y.H., Park J.S. Polyethylene glycol)-block-poly(L-lysine) dendrimer: novel linear polymer/dendrimer block copolymer forming spherical water-soluble polyanionic complex with DNA // Bioconj. Chem. 1999. V. 10. P. 62-65.

143. Кантор Ч., Шиммел П. // Биофизическая химия (в 3-х томах) М.:Мир. 1984.

144. Маршелл Э. // Биофизическая химия (в 2-х томах) М.:Мир. 1981.

145. Matsuzaki J., Hotoda Н, Sekine М., Hata Т., Higuchi S., Nishimura Y., Tsuboi M. Self-complementary tetradesoxyribonucleoside triphosphates convenient chemical preparation and spectroscopic studies in solution // Tetrahedron. 1986. V. 42. P. 501-513.

146. Гиршкович А.А., Кибирев И.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. К.: Наукова думка. 1987.

147. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. JL: Наука. 1986.

148. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifiigation and lamm equation modeling // Biophys. J. 2000. V. 78. №3. P. 1606-1619.

149. Tuzimura K., Konno Т., Meguro H., Hatano M., Murakami Т., Kashiwabara K., Saito K., Kondo Y., Suzuku T.M. A Critical study of the measurement and calibration of circular dichroism // Analyt. Biochem. 1977. V. 81. №1. P. 167174.