Синтез, характеристика и биомедицинские применения золотосеребряных наноклеток и нанокомпозитов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

иио0574б0

ПАНФИЛОВА ЕЛИЗАВЕТА ВИКТОРОВНА

СИНТЕЗ, ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОМЕДИЦИНСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЗОЛОТОСЕРЕБРЯНЫХ НАНОКЛЕТОК И НАНОКОМПОЗИТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата химических наук

1 8 АПР 2013

Москва-2013

005057460

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Хлебцов Борис Николаевич ФГБУН ИБФРМ РАН, ведущий научный сотрудник

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Ревина Александра Анатольевна ФГБУН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН ведущий научный сотрудник

кандидат химических наук, доцент Букресва Татьяна Владимировна ФГБУН Институт кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН,

заведующая лабораторией

Ведущая организация: ФГБУН Институт химической физики

им. H.H. Семенова РАН

Защита диссертации состоится «16» мая 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.002.259.01 при ФГБУН Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31, корп.4.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБУН ИОНХ РАН (Москва, Ленинский проспект, д. 31).

Автореферат размещен на сайте ВАК Автореферат разослан «1» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С

кандидат химических наук ^ Т.Р.Асламазова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наноматериалы являются объектом интенсивных исследований благодаря уникальным физико-химическим свойствам и применению в электронике, фотонике, химическом катализе и биомедицине. Среди большого разнообразия современных наноматериалов особое место занимают металлические наночастицы с плазмонным резонансом (ПР), который обусловлен коллективным поведением электронов проводимости на определенных частотах, определяемых природой частицы. Чтобы отличить ПР в наночастицах от распространяющихся плазмонов, его часто называют локализованным поверхностным ПР, подчеркивая локальный характер явления и важную роль поверхности раздела. Физически явление ПР заключается в резонансном увеличении сечений поглощения и рассеяния света частицей, которые на несколько порядков превосходят соответствующие значения для обычных диэлектрических частиц. Длина волны ПР металлических наночастиц и соотношение между их сечениями поглощения и рассеяния зависят от размера, формы, материала и структуры частиц. Именно этим определяются технологические возможности управления оптическими свойствами плазмонных частиц для конкретных приложений.

Относительно новым объектом современной нанотехнологии благородных металлов являются золотосеребряные наноклетки (ЗСНК, название является переводом принятого в литературе термина Au-Ag nanocages) - полые и пористые наночастицы из серебра, золота и биметаллического сплава. Золотосеребряные наноклетки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с частицами других типов. Во-первых, варьирование материала и структуры наночастиц позволяет получить очень широкий диапазон настройки ПР от 400 им до ближней ИК-области. Во-вторых, наличие полостей внутри ЗСНК и развитой поверхности делает их перспективным шаблоном синтеза композитных наночастиц для адресной доставки лекарств и фотодинамических красителей, конструирования SERS наносенсоров и т.д. В литературе описаны успешные применения золотосеребряных наноклеток для биоимиджинга и терапии опухолей (Au et al. 2008), оптоакустической и когерентной томографии (Yang et al. 2007), для доставки целевых веществ к ядру клеток (Dam et al. 2012) и т.п. К моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с воспроизводимым получением серебряных нанокубиков (исходных шаблонов для ЗСНК), пониманием некоторых аспектов физико-химических механизмов получения золотосеребряных наноклеток и их функционализации биомолекулами. Не были исследованы возможности использования мультицветных меток на основе ЗСНК для мультиплексного дот иммуноанализа. Наконец, отсутствовали данные о получении и перспективах применения композитных наночастиц, содержащих золотосеребряные наноклетки и фотодинамические красители. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.

Целью диссертационной работы являлся синтез, исследование оптических и физико-химических свойств золотосеребряных наноклеток и композитных наночастиц на их основе для применений в твердофазном иммуноанализе, фототермической и фотодинамической терапии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:

• Определение физико-химических параметров реакции полиольного синтеза, контролирующих размер и выход серебряных нанокубиков - шаблонов для получения золотосеребряных наноклеток.

• Синтез и характеристика различных типов золотосеребряных наноклеток с плазмонными резонансами в диапазоне 450-800 нм.

• Разработка физико-химических методов функционализации и демонстрация возможности использования полученных наночастиц в качестве меток для мультицветного дот иммуноанализа.

• Синтез композитных наночастиц, состоящих из ЗСНК, покрытых диоксидом кремния и функционализованных различными производными порфирина (иттербиевый комплекс дикалиевой соли 2,4-диметоксигематопорфирина IX, гематопорфирин).

• Демонстрация возможности использования композитных наночастиц для фототермического и фотодинамического подавления роста бактерий Staphylococcus aureus и опухолевых клеток HeLa.

Научная новизна работы:

• Впервые показано, что выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами, как образование первичных монокристаллических частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств ионов примесных металлов. Предложен спектральный критерий формирования нанокубиков даже в отсутствие электронно-микроскопических (ЭМ) изображений.

• Впервые продемонстрирована возможность одновременного выявления трех типов молекул-мишеней (антител) с помощью дот иммуноанализа с использованием золотосеребряных наноклеток. При отсутствии неспецифического связывания предел обнаружения равен примерно 20 фмоль при детектировании невооруженным глазом.

• Получен новый тип композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными порфирина.

• Показано, что композитные наночастицы обладают большей фототермической и фотодинамической активностью подавления роста бактерий S. aureus по сравнению с отдельными компонентами композитной наночастицы (молекулами гематопорфирина, ЗСНК).

Научно-практическая значимость работы определяется востребованностью полученных наночастиц, их реальным применением в различных учреждениях РФ, включая ИБФРМ РАН, СГУ им. Н.Г. Чернышевского, СГМУ им. В.И. Разумовского, РОНЦ имени Н.Н. Блохина (г. Москва), ИПЛИТ РАН (г. Троицк), ИПТМУ РАН (г. Саратов) и др.

Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также согласием с результатами независимых исследований других авторов.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами как образование первичных монокристаллических серебряных частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств примесных металлов. Наличие основного и двух минорных плазмонных пиков является надежным критерием формирования нанокубиков даже в отсутствие ЭМ-изображений. Размер частиц контролируется временем реакции.

2. Реакция гальванического замещения с использованием серебряных нанокубиков позволяет осуществить эффективную настройку ПР частиц в широком диапазоне длин волн 435-800 нм с максимальной добротностью спектров поглощения и рассеяния на краях указанного спектрального диапазона.

3. Золотосеребряные наноклетки с различной степенью гальванического замещения могут быть использованы в качестве меток мультицветного дот иммуноанализа для одновременной детекции молекул-мишеней как минимум трех видов биоспецифичности с пределом детекции 20 фмоль.

4. Разработан новый тип многофункциональных композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными гематопорфирина (ГП).

5. Эффективное подавление роста патогенных бактерий композитными наночастицами 3CHK/SiO:/TCI по сравнению со свободным ГП обусловлено адсорбцией композитных наночастиц на поверхности бактерий и повышением локальной концентрации ГП.

Личный вклад диссертанта состоит в синтезе серебряных нанокубиков и золотосеребряных наноклеток, разработке протокола функционапизации наночастиц и экспериментальной апробации протокола мультицветного дот иммуноанализа на основе конъюгатов наночастиц, анализе данных электронной микроскопии, исследовании физико-химических свойств и оптимизации протоколов синтеза композитных наночастиц.

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках плановой темы НИР «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392, руководитель зав. лаб. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.

Гранты. Исследования поддерживались 2 грантами РФФИ (2011-2012 годы), государственным контрактом на проведение научно-исследовательской работы № 14.740.11.0260, Программами президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и «Фундаментальные основы технологии наноструктур и наноматериалов», грантом Президента РФ МК-1057.2011.02, грантом Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования; грантом компании ОПТЭК (2012) для поддержки молодых ученых ведущих высших учебных заведений и научных исследовательских центров (руководитель асп. Панфилова Е.В.), стипендией президента РФ 2013-2015 годах.

Апробация результатов. Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:

1. Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov, Russia, 2010.

2. 4-ый международный форум по нанотехнологиям, Москва, Россия, 2011 (серебряная медаль и премия за второе место в конкурсе молодых ученых).

3. VI съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, Россия, 2011.

4. Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, 2011).

5. 10th International Conference "Functional materials" ICFM'2011, Sec. 10: Materials for Medical and Environmental Applications. Biosensors, Partemt, Crimea, Ukraine, 2011.

6. II международная Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии", Казань, Россия, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и 16 тезисов докладов конференций, включая 9 статей из списка, рекомендованного ВАК для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 5 глав, заключения и списка цитируемой литературы, содержащего 321 ссылку. Диссертация изложена на 168 страницах текста, содержит 5 таблиц и 40 рисунков.

5

Краткое содержание работы

Во Введении обоснована актуальность темы работы и её научно-практическое значение, обсуждены объекты и задачи исследования.

В Главе I приведен аналитический обзор литературы по теме диссертации. Рассмотрены основные методы синтеза и исследования плазмонно-резонансных наночастиц, включая сферические, несферические и неоднородные частицы. Обсуждается получение биметаллических частиц методом реакции гальванического замещения. Рассмотрены основные способы синтеза серебряных нанокубиков и золотосеребряных наиоклеток, а также основные направления их биомедицинских применений. Сформулированы нерешенные проблемы и поставлены задачи исследования.

Глава 2 посвящена исследованию параметров реакции индуцированного сульфидом натрия полиольного синтеза серебряных нанокубов, контролирующих выход целевого продукта. В качестве исходных данных для оптимизации использовали протокол, описанный группой V. Х1а [4]. Синтез проводили в трехгорлой круглодонной колбе из термостойкого стекла объемом 250 мл с системой подвода и отведения инертного газа. В колбу добавляли этиленгликоль (ЭГ), выдерживали при 150°С в течение 40 мин, включали ток аргона, добавляли последовательно растворы поливинилпирролидона, сульфида натрия и нитрата серебра в ЭГ. Визуально реакция сопровождается характерными изменениями цвета. Сразу после добавления нитрата серебра, раствор приобретает бледно-пурпурный цвет, свидетельствующий об образовании сульфида серебра, Так как кристаллы Ag2S

являются катализатором

восстановления ионов Ag+ до монокристаллического серебра, то в реакционной смеси быстро образуются серебряные наночастицы малого размера, которые могут иметь моно-или поликристаллическую структуру (рис. 1). Однако только первые в дальнейшем служат центрами кристаллизации для формирования нанокубиков. Во втором случае происходит формирование

полидисперсных наночастиц неправильной, преимущественно сферической, формы. Через 30 с после добавления в реакционную колбу нитрата серебра коллоидный раствор приобретает лимонно-желтый цвет, насыщенность которого возрастает в течение 15 мин. В течение этого времени ПР в спектре экстинкции частиц локализован вблизи 400 нм с полушириной максимума около 40 нм. Данные значения положения максимума и полуширины ПР соответствуют образованию монокристаллических наночастиц. По данным ЭМ через 5 мин от начала синтеза наночастицы имеют размер 5±2 нм, а через 15 мин их размер составляет 15±5 нм. При этом происходит сдвиг ПР на 10-15 нм в красную область. Такой коллоид имеет лимонный цвет и заметно опалесцирует. При достижении наночастицами размера порядка 10 нм происходит адсорбция поливинилпирролидона из раствора на гранях {100} кристаллов серебра, и возникают анизотропные условия роста, приводящие к формированию наночастиц преимущественно кубической формы. Спустя 20 мин после начала реакции формируются частицы квазикубической морфологии (кубики с округленными ребрами). Формирование таких наночастиц сопровождается сдвигом основного резонанса до 425 нм и появлением дополнительного минорного максимума на длине волны 355 нм в спектре экстинкции. На этом этапе синтеза суспензия имеет ярко-желтый цвет и сильно опалесцирует. Дальнейший рост частиц (23 мин синтеза) приводит к

б

Монокристалли- 15 нм 30 нм

чеекие зародыши

9 мин 16 мин 20 мин 30 мин

Ад ^

ф -Х~1» & Поликристалличвские зародыши

Рис. 1. Схема формирования серебряных частиц кубической формы в реакции полиольного синтеза.

формированию более совершенных кубических частиц размером 30±4 нм. Коллоид приобретает коричневый цвет. С оптической точки зрения это выражается в появлении третьего минорного максимума около 400 нм. Через 25 мин, при изменении цвета коллоида на насыщенный красно-коричневый с характерной опалесценцией, размер нанокубиков достигает 47±5 нм. Уменьшение степени полидисперсности коллоида выражается в более четкой локализации трех максимумов экстинкции и сдвиге основного максимума в красную область до 450 нм, Спустя 30 мин изменения цвета реакционной системы прекращаются. ЭМ-изображения свидетельствует о формировании в данном случае нанокубиков со средним размером около 60 нм (рис. 2) и основным ПР в диапазоне длин волн 465-470 нм.

На этапе отработки технологии полиольного синтеза серебряных нанокубиков, даже при строгом контроле значимых параметров реакции (температуры, концентрации

реагентов, скорости добавления раствора AgNOз), получение суспензий с высоким содержанием целевых частиц носило случайный характер. Было выяснено, что существенное влияние на ход синтеза может оказывать такой трудно контролируемый параметр, как наличие в реакционной смеси следовых количеств примесных металлов. Для достижения воспроизводимости синтеза использовали только ЭГ с низким содержанием металлов (<7 млн. д.) и отмывали реакционную посуду и якорь магнитной мешалки смесью соляной и азотной кислот в течение 20 мии для удаления следовых количеств металлов. В результате была получена 100%-ная воспроизводимость синтеза с выходом нанокубиков более 90% при соответствующих оптимальных условиях, о которых речь пойдет ниже.

Так как восстановителем серебра в анализируемой реакции является гликолевый альдегид, образующийся при окислении ЭГ кислородом воздуха при нагревании, количество растворенного в ЭГ кислорода является ключевым фактором, контролирующим скорость реакции и, в конечном итоге, высокий выход целевых частиц. Для выяснения влияния степени оксигенации ЭГ на выход частиц кубической формы мы провели серию синтезов наночастиц в следующих условиях: 1) в воздушной атмосфере без тока аргона; 2) при предварительном нагревании ЭГ в течение 40 мии на воздухе и дальнейшем включении тока аргона; 3) без предварительного нагрева с постоянным током аргона; 4) пропуская аргон непосредственно через реакционную суспензию в ходе всего синтеза. В случае минимального количества растворенного кислорода (т.е. при синтезе в атмосфере арг она), вне зависимости от способа пропускания аргона, реакция протекала существенно медленнее в обоих вариантах синтеза 3 и 4. Первоначальные изменения цвета реакционной смеси (от бесцветного до желтого) при добавлении раствора нитрата серебра происходили за 3-5 мин. В дальнейшем цвет коллоида существенно не изменялся даже в течение 2 ч. Малая оптическая плотность коллоида указывала на неполное восстановление ионов металла. Данные электронной микроскопии (рис. За, вариант синтеза 4) показали наличие в коллоидном растворе большого количества серебряных частиц малого размера (около 10 нм).

400 500 600 700 800 Длина волны,нм

Рис. 2 Спектр оптической плотности и ЭМ-изображенне серебряных нанокубиков с размером 60 нм. Стрелками показаны два минорных резонанса,

Рис. 3 Обзорные и увеличенные ЭМ-изображепия частиц, полученных при постоянном токе аргона (а), в оптимальных реакционных условиях (б) и при синтезе в воздушной атмосфере (в).

Для получения коллоидов с высоким выходом целевых наночастиц необходимо включить в протокол синтеза стадию нагрева ЭГ в кислородосодержащей атмосфере перед добавлением нитрата серебра. Это необходимо для того, чтобы количество окисленного до гликолевого альдегида ЭГ было достаточным для восстановления ионов металла с образованием монокристаллических зародышей. В дальнейшем реакция носит автокаталитический характер, и избыток восстановителя отрицательно сказывается на выходе кубических частиц. Таким образом, нагрев ЭГ в течение 30-50 мин на воздухе и дальнейшее проведение реакции в атмосфере аргона является эффективным способом достижеиия высокого выхода серебряных частиц кубической формы.

Важной физико-химической задачей синтеза, помимо высокого выхода, является управление размером и формой частиц. В некоторых методах изменение концентрации реагентов, температуры и т.п. позволяет получать наночастицы (например, золотые) с заданными геометрическими и оптическими свойствами. В случае полиольного синтеза серебряных частиц ситуация значительно сложнее. Мы изменяли поочередно один из следующих параметров синтеза: температуру в диапазоне 140-160°С, финальную концентрацию нитрата серебра от 1 до 4 мг/мл, концентрацию сульфида натрия от 4 до 8 мкг/мл, скорость добавления раствора нитрата серебра от 0.1 до 20 мл/мин и исследовали спектры экстинкции и морфологию полученных частиц по ЭМ-изображениям (таблица 1).

Таблица 1 Влияние параметров синтеза на тип и выход наночастиц серебра.

Параметр Полученные частицы

Температура <145иС 145-155"С 155-160UC >160иС

Наночастиц нет, осадок Наиокубики с выходом 70-99% Наиокубики, наностержни, манопризмы Нанопроволоки, нерегулярные наночастицы

Концентрация AgNOэ 1 мг/мл 2 мг/мл 3 мг/мл 4 мг/мл

Сферы 11анокубики с выходом 50-70% 11аиокубики с выходом 70-99% Нерегулярные частицы

Концентрация Ыа28 <5 мкг/мл 5-7 мкг/мл >7 мкг/мл

Наиокубики с округлыми ребрами, выход 50-70% Наиокубики с выходом 7099% Наиокубики, наностержни, напопризмы

Скорость добавления 0.1 мл/мин 1 мл/мин 20 мл/мин

Сферы Наиокубики с выходом 7099% Наиокубики с выходом 7099%

При варьировании одного параметра все остальные были фиксированы и соответствовали стандартному протоколу [4]. Было обнаружено, что каждый из параметров критическим образом влияет на выход частиц кубической формы. При вариации параметров синтеза финальные суспензии содержали полидисперсные частицы нерегулярной формы, нанокубики с различным выходом (от 0 до 99%), нанопроволоки, нанопризмы и наностержни. Результаты всех экспериментов суммированы в таблице 1, которая иллюстрирует влияние температуры, концентрации нитрата серебра и сульфида натрия и скорости добавления нитрата серебра на тип и выход получаемых серебряных наночастиц. В таблице 1 указана комбинация экспериментальных условий, при которых можно получить высокий выход серебряных нанокубиков: температура 145-155°С, концентрация AgNOз 3 мг/мл, концентрация N828 5-7 мкг/мл, скорость добавления AgNOз 1-20 мл/мин. Вместе с отмеченными выше условиями по исключению влияния металлических примесей и учетом влияния степени оксигенации ЭГ указанный набор условий можно назвать оптимальным (стандартным) для синтеза серебряных нанокубиков, Глава 3 посвящена синтезу и исследованию физико-химических свойств золотосеребряных наноклеток. Протокол синтеза золотосеребряных наноклеток состоит из двух этапов: на первом этапе получают нанокубики, на втором этапе серебряные нанокубики используются в качестве шаблона для преобразования в золотосеребряные ианоклетки с помощью реакции гальванического замещения серебра на золото. Для синтеза наноклеток I мл коллоида серебряных нанокубиков, полученных как описано выше, добавляли к 50 мл раствора поливинилпирролидона в воде с концентрацией 1 мг/мл. Нагревали реакционную колбу на масляной бане до температуры 98"С. С помощью пипетки с максимальным объемом 200 мкл дробно добавляли 1 мМ водный раствор НАиСЦ

в количестве от 1 до 10 мл. Так как стандартный электродный потенциал для пары АиСЦ'/Аи (0,99 В относительно стандартного

водородного электрода) выше чем для пары Ag+/Ag (0.8 В), при смешении Ag наночастиц и НАиСЦ в водной среде золото будет восстанавливаться на поверхности частиц с одновременным растворением серебра. При добавлении молярного недостатка НАиСЦ образуются частицы, имеющие на поверхности «островки» сплава Au-Ag. С увеличением концентрации ионов АиС14 образуются полости внутри серебряной частицы, что приводит к формированию полой нанооболочки из сплава Au-Ag. Наконец, при структуры, названные в литературе «ианоклетки». Дальнейшее добавление НАиСЦ к коллоиду приводит к полному замещению серебра на золото и разрушению частиц с образованием фрагментов размером 10-20 нм. Изменения структуры и состава проявляются в изменении цвета коллоида с оранжево-желтого вначале до оранжевого, красного, пурпурного или синего и серого в зависимости

шШ ж "З^Ж* Ч? £ 500 пт &

¡К. 4 100 пт |

процессе формирования (1-6) и разрушения (7-8) золотых наноклеток, Обзорное и увеличенные ЭМ-изображения золотосеребряных наноклеток,

существенном избытке ионов АиС^ образуются

от морфологии частиц (рис. 4, сверху). На рис. 4 приведены обзорные и увеличенные ЭМ-изображения золотосеребряных наноклеток, которые показывают образование полых и

пористых структур различной составляет около 4-5 нм (рис. 4).

морфологии. Толщина стенки частиц типа "nanobox"

N./SN,

L =53.5+5 нм

0.4

L =48 нм

0.3

0.1

Ад

Au

°20

П]

80

На рис. 5 показаны гистограммы распределения по размерам серебряных нанокубиков со средней длиной ребра 48 нм и полученных из них золотосеребряных наноклеток со средним размером 53.5 нм, Сопоставляя размер золотосеребряных наноклеток со средним размером серебряного кубика 48 нм и толщиной стенки 4-5 нм (рис. 4), мы приходим к выводу, что стенка полой частицы растет примерно симметрично относительно серебряной грани. В этом случае величина 53,5-48 = 5,5 нм должна примерно совпадать с толщиной стенки, что близко к данным электронной микроскопии.

На рис. 6 показана трансформация спектров экстинкции и дифференциального светорассеяния серебряных нанокубиков по мере гальванического замещения серебра золотом в образцах 0-8 (рис. 4). Цифры соответствуют объему (в мл) раствора 1мМ НАиСЦ, добавляемого к серебряному коллоиду и формированию частиц различной структуры. Спектры дифференциального светорассеяния измерялись на двухлучевом спектрофотометре 8ресог<1 М-40 с приставкой для измерения светорассеяния по методу, разработанному в нашей лаборатории [5].

Увеличение степени замещения серебра золотом и постепенное формирование золотосеребряных наноклеток сопровождается сдвигом основного плазменного резонанса в красную область и сильным неоднородным уширением спектров экстинкции и рассеяния. Следует, однако, отметить, что для образца 6 были зарегистрированы наиболее добротные спектры с относительной полушириной, сопоставимой с таковой для исходного образца. ЭМ анализ показал, что в этом образце имеется наибольший выход частиц типа «золотосеребряные наноклетки», а спектры образцов 7 и 8 соответствуют их частичной

40 00

Размер частиц, нм Рис. 5, Гистограммы распределения по размерам серебряных нанокубиков и полученных из них золотосеребряных наноклеток.

0 —1-1— |--0

400 600 800 1000 400 600 800

Длина волны,нм Длина волны,нм

Рис. б. Спектры экстинкции (а) и рассеяния (б) образцов 0 (серебряные кубики), 1, 2.....В с

различным соотношением Ак/Аи. Номера образцов соответствуют рис, 4, фрагментации.

Теоретическое моделирование спектров экстинкции и рассеяния наноклеток является нетривиальной задачей в связи со сложностью точного определения параметров структуры частиц. Мы предполагаем, что основной вклад в настройку спектрального положения максимума экстинкции и рассеяния ЗСНК вносит полая внутренняя структура частицы, что позволяет построить простую теоретическую модель ЗСНК в виде золотой нанооболочки с

ю

100 200 300 Время нагрева, сек Рис. 7, Кинетика наг рева суспензий при различных концентрациях ЗС11К.

полым ядром. Предварительные данные показывают, что подобная простая модель позволяет адекватно воспроизвести положение максимума, полуширину и ряд других

особенностей экспериментальных спектров экстинкции золотосеребряных наноклеток.

Для исследования фототермических свойств золотосеребряных наноклеток был выбран образец (6), охарактеризованный выше на рис. 4 и 6. Коллоид с оптической плотностью на длине волны плазменного резонанса равной 1 нагревался под действием непрерывного лазерного излучения плотностью мощности 1 Вт/см2 в пробирке типа эппендорф, объем образца составлял 1.5 мл. Пробирка закреплялась вертикально, лазерное излучение подводилось световодом сверху. Длительность нагрева составляла 5 мин. Пространственное распределение температуры регистрировалось тепловизором сбоку пробирки, в направлении, перпендикулярном лучу лазера. На рис. 7 представлена кинетика нагрева суспензий ЗСНК, полученных двойными разведениями исходной суспензии с числовой концентрацией 2x10й' шт/мл. Очевидно, что суспензия наноклеток характеризуется эффективной конверсией света в тепло, при этом золотосеребряные наноклетки нагреваются заметно эффективнее контрольного раствора 0,15 М NaCl даже при оптической плотности суспензии около 0,1 на длине волны плазмонного резонанса. Отметим также нелинейный характер зависимости нагрева от концентрации частиц.

Глниа 4 посвящена разработке метода мультицветного дот анализа на основе серебряных нанокубиков и золотосеребряных наноклеток с различной степенью замещения серебра золотом. Метод дот иммуноанализа заключается в специфическом окрашивании

капли аналита, нанесенного на мембрану, с использованием конъюгатов узнающих молекул с метками (в нашем случае плазмонно-резонансиыми наночастицами). Этот анализ может быть модифицирован для мультицветного мечения.

Для экспериментальной реализации

мультицветного дог иммуноанализа были взяты пары антиген-антитело: IgO цыпленка - кроличьи антицыплячьи антитела (ATI), IgG крысы - кроличьи антикрысиные антитела (АТ2), и IgG мыши -кроличьи антимышиные антитела (АТЗ). Для реализации мультицветного мечения нами были выбраны три вида частиц: серебряные нанокубики -ПР 448 им, цвет коллоида - желтый, золотосеребряные кубические частицы ПР 510 нм, цвет коллоида - красный, и золотосеребряные наноклетки - ПР 670 нм, цвет коллоида - синий, Коныогаты указанных наночастиц (Kl, К2 и КЗ) были получены путем модификации частиц антителами ATI, АТ2 и АТЗ через тиольные кросс-линкеры.

На рис. 8 показаны результаты моноцветного дот

и

К1

(а)

(б)

(в)

-»Разбавление 1:2"-»

Рис. 8. Дот иммуноанализ с помощью конъюгатов Kl, К2 и КЗ.

иммуноаиализа трех указанных типов IgG с использованием конъюгатов Kl, К2 и КЗ. Концентрация суспензий всех конъюгатов была 16х 10" шт/мл. Для всех трех мембран пятно 1 соответствует антителам с концентрацией 300 мкг/мл, то есть количество нанесенных ATI, АТ2 и АТЗ было около 300 нг (2 х 10"12 моль или 12х 10" молекул IgG). Последующие пятна соответствуют двукратным разведениям исходной пробы, так что последнее 8-е окрашенное пятно содержит 300/27 = 300/128 = 2.4 нг = 2,4 х 10*" г/150 000 г/моль = 1.6 х ИГ14 моль - 16 фмоль иммуноглобулина. Таким образом, для всех проб минимальное количество антител, детектируемое невооруженным глазом, составило около 20 фмоль. Третий ряд на всех мембранах соответствует нанесению бычьего сывороточного альбумина (БСА), взятого в качестве негативного контроля в тех же концентрациях, что и антитела. Следует отметить, что ни один из 15 негативных контролей не был окрашен, что говорит об отсутствии неспецифического связывания. Для количественной оценки отличия цвета пятен нами был осуществлен элементарный компьютерный анализ изображений, основанный на использовании программы ImageJ, С помощью этого анализа нами была получена RGB-гистограмма цветов в формате вклада красного, синего и зеленого цветов в цвет каждого пятна. Был рассчитан коэффициент цвета Н, равный полусумме интенсивности красного и зеленого цветов, деленный на интенсивность синего. Желтые, красные и синие пятна могут быть дифференцированы с помощью коэффициента Н. В частности, значения Н > 1.3, 0.9 < Н < 1.3 и Н < 0.9 соответствует желтому, красному и синему цвету суспензий конъюгатов, соответственно.

На рис. 9 показаны основные принципы (а и б) и экспериментальная реализация мультицветного дот иммуноаиализа с конъюгатами трех разных цветов (в). В данном эксперименте наносили три типа аналитов (с концентрацией 100 мкг/мл) в центр каждого из расчерченных на нитроцеллюлозной мембране 5-мм квадратов. Антицыплячьи антитела наносили в квадраты А2, БЗ, В1, Г4, ДЗ и Д4; антикрысиные антитела - в квадраты AI, Б2, В4, ГЗ и Д2; антимышиные антитела - в квадраты A3, Б1, В2 и П. В качестве контроля неспецифического связывания раствор БСА с концентрацией 100 мкг/мл наносили в квадраты A4, Б4, ВЗ, Г2 и Д1. После нанесения всех аналитов мембрану помещали в смесь

Нанесение мишени

М - АТЗ К-АТ2 1 Б-БСА

1

Окрашивание в смеси конъюгатов: К1+К2+КЗ

А Б В Г д А Б В Г д А Б В Г Д

1 К М м Б 1 • • • 1 • • • •

2 К М Б К 2 • • • 2 • • • •

3 м Б К 3 • • 3 4 • • •

4 Б Б К 4 • 4 • • •

(а)

(б)

(в)

Рис, 9. Схематическая иллюстрация мультицветного дот-анализа (а, б) и его экспериментальное подтверждение (в). На первом -папе (а) антицыплячьи кроличьи антитела ATI наносились в квадраты А2, БЗ, 131, Г4, ДЗ и Д4; аптикрысипые кроличьи антитела АТ2 наносились в квадраты Al, Б2, В4, ГЗ, Д2; антимышиные кроличьи антитела АТЗ наносились в квадраты A3, Б1, В2, Г1; в качестве негативного контроля раствор БСА наносился в квадраты А4, Б4, ВЗ, Г2 и Д1. Концентрация всех аналитов составляла 100 мкг/мл, Ожидаемое окрашивание пятен смесью конъюгатов (К1 + К2 + КЗ), показано на (б). Экспериментальные данные (в) полностью совпадают с ожидаемыми результатами.

трех биоконъюгатов; К1 + К2 + КЗ. Как показано на рис. 9в, желтые, красные и синие пятна проявились в соответствии с нанесенными биоспецифическими парами, т.е. в полном согласии с ожидаемым окрашиванием пятен, показанном на рис. 96. Следует отметить, что перекрестного взаимодействия или неспецифической адсорбции биокояъюгатов не наблюдалось.

Глава 5 посвящена получению и применению композитных многофункциональных наночастиц на основе ЗСНК и производных порфирина. Среди многочисленных видов наночастиц, используемых для пассивной доставки фотосенсибилизаторов, наночастицы благородных металлов занимают особое место благодаря резонансному поглощению и рассеянию света в видимой и ИК-области спектра. В данной главе обсуждается использование для комбинированной фототермической и фотодинамической терапии (ФДТ) композитных наночастиц, содержащих ЗСНК в качестве металлического ядра и мезопористую силикатную оболочку, допированную производными порфирина.

Синтез композитных наночастиц (НК) состоит из трех основных этапов, схематически представленных на рис. 10. На первом этапе синтезируются ЗСНК, синтез которых обсуждался в главах 2 и 3 диссертационной работы. Для синтеза композитных наночастиц использовался образец наноклеток с ПР 760 им. На втором этапе эти частицы покрывали слоем диоксида кремния, который служит спейсером между металлической наночастицей и

зснк

Силикатная оболочка

иле, тэос

□

Гематопорфирин

Прекурсор

<ау2 1сн,|г

ссон соон

Нанокомпозит

|-Кг)( (СН,^

С N

I I

О н

Я = (СН .) Б) (ОС„Н5),

Рис. 10. Схема основных стадий формирования нанокомпозитов, содержащих плазменное ядро, первичную оболочку диоксида кремния и вторичную мезопористую оболочку диоксида кремния с включенными а нее молекулами гематопорфирина. Обозначения: ИПС - изопропиловый спирт, ТЭОС -тетраэтилортосиликат, АПТЭС - З-аминопропилтриэтоксисилан, ГП - гематопорфирин, ДЦК -дициклогексилкарбодиимид, ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид, ЭМ изображения частиц ЗСНК (а), ЗСНШЮг (б) и ЗСНК/вЮг/вЮг-ГП (в), синтезированных на каждом этапе,

молекулами ГП. В типичном протоколе синтеза 8 мл ЗСНК добавляют к 36 мл ИПС. При постоянном перемешивании на магнитной мешалке 1 мл 30% водного раствора аммиака и 0,05 мл ТЭОС последовательно добавляли к реакционной смеси с целью получения 10-нм оболочки диоксида кремния на поверхности ЗСНК. Реакция проводилась в течение 50 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Полученные частицы ЗСНК/8Юг были отмыты от непрореагировавших компонентов центрифугированием при 8000 § в течение 10 мин и перерастворением в воде. Концентрация ЗСНК, покрытых оболочкой диоксида кремния, составляла около 1014 шт/л, оптическая плотность равнялась 4,5 на длине волны 780 нм. На третьем этапе формировался дополнительный слой мезопористого диоксида кремния с включенными молекулами ГП. Для инкорпорации в силикатную оболочку композитной частицы молекул гематопорфирина сначала проводили реакцию ГП с АПТЭС с целью формирования прекурсора. 10 мг ГП растворяли в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО), 3.5 мг ДЦК и 5 мкл АПТЭС были последовательно добавлены к раствору ГП. Реакцию проводили в течение 20 ч при комнатной температуре. Далее 0.4 мл 0.1 М ЦТАБ, 0.1 мл 0.1 М ИаОН, 18 мкл ТЭОС и 100 мкл прекурсора были последовательно добавлены к 10 мл золотосеребряных наноклеток, покрытых оболочкой диоксида кремния. Реакция проводилась в течение 72 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию композитных наночастиц очищали с помощью 5 циклов центрифугирования-ресуспендирования в воде. В конце циклов очистки композитные наночастицы растворяли в 10 мл 10 мМ фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

Обсудим оптические свойства наночастиц. На рис. 11 представлены фотографии суспензии ЗСНК, покрытых диоксидом кремния частиц (ЗСНК/БЮ:) до включения молекул ГП в оболочку, суспензии композитных наночастиц ЗСНК/ЭЮУЗЮг-ГП (в центре, обозначено НК) и раствора гематопорфирина в воде с концентрацией 4 мг/л (справа, ГП). Видно, что раствор ГП выглядит бесцветным, а образцы ЗСНК/8Юг и НК имеют сине-зеленый цвет, характерный для суспензий золотосеребряных наноклеток с основным плазмонным резонансом в ближней ИК области. Измерения спектров экстинкции указанных суспензий и раствора ГП (рис. 11 в) показывают, что спектр экстинкции ЗСНК/8Юг имеет интенсивный резонанс в области 780-800 нм, который и определяет сине-зеленый цвет коллоида. Спектр композитных наночастиц НК имеет похожие максимумы в области 780-800 нм и цвет суспензии НК мало отличается от цвета суспензии ЗСНК/ЗЮг. Отметим, что плазмонный резонанс экстинкции композитных частиц сдвинут на несколько нанометров по отношению к резонансу ЗСНК/БЮг с первичной силикатной оболочкой за счет увеличения общей толщины диэлектрической оболочки. В отличие от спектра ЗСНК/ЗЮг, спектр НК после нескольких отмывок имеет характерный пик на 400 нм, практически совпадающий по положению с пиком раствора ГП. Суперпозиция спектров 1 и 4 на рис. 11 в практически полностью воспроизводит спектр НК, что позволяет косвенно оценить концентрацию включенных молекул ГП как 4 мг/л или 40x103 молекул ГП на частицу,

Обсудим теперь флуоресцентные свойства НК при облучении фиолетовым (405 нм) и ультрафиолетовым светом. При визуальном наблюдении кювет с образцами (рис. 116) в ультрафиолетовом освещении видна яркая красная флуоресценция суспензии НК и раствора ГП, в то время как суспензия ЗСНК/ЗЮг не флуоресцирует. Некоторое различие в цветах флуоресценции раствора ГП и НК может быть связано как с поглощением света наночастицами, так и с изменением флуоресцентных свойств самого ГП.

Обычные фотографии не позволяют сделать однозначный вывод об усилении/тушении флуоресценции ГП при образовании НК. Для количественного сравнения интенсивности флуоресценции ГП и НК на рис. Юг приведены спектры эмиссии при возбуждении светом с длиной волны 405 нм. Для флуоресцентных измерений образцы были разведены в 16 раз,

14

1

S 0.8 i

i 0.4 Л 02

О

400 600 800 1000 450 500 560 600 660 700 750

Длине волны,нм Длина волны, нм

Рис. 11. (а) Фотографии кювет с золотосерсбряными наноклетками, покрытыми силикатной оболочкой (ЗСНК/$Юз), нанокомпочитами (НК) и раствором гематопорфирина при облучении белым светом, (б) -Фотографии тех же образцов, сделанные при облучении светом УФ-области, (в) - Спектры экстинкции ГП (1), НК (2) и ЗСНК/SiOa (4); спектр (3) является суперпозицией спектров 1 и 4, (г) - Спектры флуоресценции рас твора ГП (1) и суспензии НК (2) при возбуждении светом с длиной волны 405 нм.

с целью исключения эффекта внутреннего фильтра (селективное поглощение возбуждающего света флуоресцирующим веществом). Как видно из приведенных спектров флуоресценции, их форма отличается для раствора ГП и НК. Вместо двух пиков ГП на 615 и 675 нм в спектре флуоресценции НК появляются три пика на 630, 650 и 690 нм. Эти изменения можно объяснить двумя факторами. Во-первых, при синтезе НК используется не сам ГП, а силано-гематопорфириновый прекурсор, спектр флуоресценции которого отличается от такового для ГП, Во-вторых, формирование вторичной силикатной оболочки происходит за счет образования ГП-силикатов и их адсорбции на первичной оболочке. Из рис. Юг также следует, что максимум флуоресценции для раствора ГП выше, чем для НК, хотя интегральная по всем длинам волн интенсивность приблизительно одинакова для обоих случаев. В целом анализ данных оптических измерений подтверждает эффективное включение молекул ГП во вторичную оболочку НК и формирование наноструктур, обладающих двумя важными оптическими модальностями - плазмонным резонансом поглощения и флуоресценцией.

В экспериментах по фотодинамическому и фототермическому подавлению роста микроорганизмов использовали бактерии S. aureus 209 Р (ГИСК им. J1.A. Тарасовича, Москва, Россия). Для облучения образцов использовали светоизлучающий диод (625 нм, 33 мВ/см2) и ИК лазер (808 нм, 100 мВ/см2). Все эксперименты были проведены в непрерывном режиме генерации излучения. В качестве сенсибилизаторов ФДТ использовали композитные наночастицы: 3CHK/SiCh/SiC>2-rn с концентрацией частиц 1014 шт/л и концентрацией ГП 4 мг/л. В качестве растворов сравнения использовали суспензии

15

маночастиц ЗСНК/SiOj с концентрацией (1014 шт/л), а также раствор ГП с концентрацией, соответствующей таковой для композитных наночастиц (4 мг/л). В типичном эксперименте, к 0.9 мл бактериальной культуры с концентрацией клеток 103 шт/мл добавляли 0,1 мл композитных наночастиц или соответствующего раствора сравнения и инкубировали в темноте в течение 15 мин, Из каждой проинкубированной смеси 0.1 мл помещали в лунку планшета и облучали светом в течение 5, 10, 15 и 30 мин, используя один из указанных выше источников (625 нм или 808 нм). После облучения, в ячейки планшета помещали датчик мультиметра (MY62, Mastech, Гонконг) и измеряли температуру исследуемых растворов с погрешностью ±0.5°С, Затем взвеси бактерий из ячеек переносили на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводили путем подсчета числа колон иеобразующих единиц (КОЕ) через 24 ч после инкубации при 37"С. Контролем служили взвеси бактерий, не обработанные сенсибилизатором и не подвергнутые облучению. Каждый эксперимент проводили в трехкратной повторности.

На рис. 12а представлена зависимость КОЕ от времени облучения светом с длиной волны 625 нм и плотностью мощности 33 мВт/см2 после инкубации с композитами на основе ЗСНК. Во-первых, следует отметить наличие темновой токсичности молекул ГП, Инкубация с растворами ГП в концентрации 0.4 мг/л в течение 15 мин приводит к подавлению роста до 10% от общего числа бактерий. Инкубация с ЗСНК, покрытыми кремниевой оболочкой, не приводит к существенному подавлению роста микроорганизмов по сравнению с ФСБ контролем, за исключением самых больших экспозиций (15 и 30 мин). Довольно неожиданным результатом является заметная гибель клеток (выживаемость около 60%) при их облучении в течение 30 мин в отсутствие фотодинамических агентов. Если сравнить фотодинамическое действие ГП в растворе и в составе композитных наночастиц, то видно существенное усиление фотодинамической активности препарата, включенного в наночастицы при всех временах облучения (голубой и красный столбцы), При длительности облучения в диапазоне 10-15 мин эффективность НК как антимикробных агентов в среднем в два раза выше, чем для раствора ГП. После инкубации с НК и облучения в течение 30 мин удается добиться подавления роста более 95% бактерий S. aureus. Для раствора ГП при аналогичных условиях обработки повреждение клеток составляет в среднем около 80%, На рис, 126 представлена динамика фототермического

О 5 10 15 30 О 5 10 15 30

Время, мин Время, мин

Рис. 12. (а) Зависимость жизнеспособности S. aureus (в единицах КОЕ) от времени облучения (625 нм, 33 мВт/см2) после инкубации с нанокомпозитами на основе ЗСНК. Перед облучением лазером бактериальные клетки инкубировались в темноте в течение 15 минут в растворе ФСБ (серые столбцы), в суспензии покрытых диоксидом кремния ЗСНК (зеленые столбцы), в растворе гематолорфирина (данные обозначены голубым, концентрация 0.4 мг/мл), в суспензии иапокомпозита (красные столбцы), (б) - аналогичные зависимости для облучения светом длиной волны 808 нм и плотностью мощности 100 мВт/см2.

подавления роста бактерий при облучении светом длиной волны 808 нм и плотностью мощности 100 мВт/см2 после инкубирования с композитными наиочастицами. В качестве контролей использовались бактерии, инкубированные с ФСБ, с растворами ГП и с суспензией наночастиц, покрытых диоксидом кремния. Из рис. 126 видно, что облучение ИК светом с длиной волны, близкой к плазменному резонансу НК, но далекой от полосы поглощения ГП, также приводит к существенному подавлению роста микроорганизмов. Во всех случаях НК демонстрировали самую высокую антимикробную активность по сравнению с контролями. Однако общий антимикробный эффект при облучении ИК лазером был несколько меньше, чем при облучении светом с длиной волны 625 нм. Таким образом, механизм фотодинамического подавления роста бактерий с помощью композитных наночастиц в наших условиях был более эффективен, чем фототермический.

Для количественной оценки фототермического эффекта была измерена температура суспензий после облучения ИК лазером бактерий при различных видах инкубации. Целью этого эксперимента было выяснить, не вызвано ли фототермическое подавление роста бактерий простым общим нагревом клеточных суспензий. Было обнаружено, что в среднем повышение температуры во всех случаях было не более 10 градусов. Это объясняется низкой мощностью лазера, используемого в наших экспериментах для подавления роста микроорганизмов. Таким образом, данные рис, 126 не могут быть объяснены простым общим нагревом бактерий выше физиологического порога. Поэтому мы предполагаем, что зарегистрированный фототермический антимикробный эффект при облучении на 808 нм может быть обусловлен локальным повышением температуры композитных наночастиц, находящихся вблизи бактерий.

Возможной причиной усиления фотодинамической активности композитных наночастиц по сравнению с молекулярной формой гематопорфирина может служить повышенная локальная концентрация ГП около бактерий за счет адсорбции наночастиц (рис. 13).

Иис. 13. Изображения просвечивающей (левая колонка) и флуоресцентной (центральная колонка) микроскопии бактериальных клеток, а также спектры флуоресценции бактерий после инкубации с ЗСНЮТЮг/ЗЮг-ГП (верхний ряд) и раствором гематопорфирина (нижний ряд).

Расчеты показывают, что на одну композитную наночастицу приходится несколько тысяч молекул ГП. Таким образом, при адсорбции НК на поверхности бактерии локальная

концентрация ГП около бактерий может во много раз превышать среднюю концентрацию в суспензии. Для качественной оценки различия в локальных концентрациях ГП около бактерий мы использовали флуоресцентные свойства ГП. На рис, 13 представлены просвечивающие (а, г) и флуоресцентные (б, д) микроскопические изображения бактерий, инкубированных с композитными наночастицами или с раствором ГП эквивалентной концентрации. Справа показаны спектры флуоресценции бактерий после инкубации с соответствующим фотодинамическим агентом (рис. 13в, е). В случае НК видна флуоресценция, а в случае обработки раствором ГП на рис. 13д вообще не видно флуоресцентной окраски, хотя спектр справа показывает, что ГП присутствует в системе (рис. 13е). Важно подчеркнуть, что форма спектров флуоресценции (наличие двух максимумов для раствора и трех для НК) сохраняется и после взаимодействия с бактериями. Это доказывает, что именно адсорбция НК на поверхности бактерий является причиной их повышенной фотодинамической активности.

Композитные наночастицы, содержащие плазменное ядро и диэлектрическую оболочку, допированную фотодинамическим красителем, могут быть использованы для фотодинамической диагностики и терапии раковых клеток. Нами получен новый тип композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых мезопористой оболочкой диоксида кремния, поверхность которой функционализована иттербиевым комплексом дикалиевой соли 2,4-диметоксигематопорфирина IX (препарат был предоставлен В.Д. Румянцевой, МГАТХТ им, М.В, Ломоносова). Далее для краткости будем обозначать данное соединение как Yb-ГП. Такие наноструктуры комбинируют несколько важных и перспективных свойств: легко настраиваемый плазменный резонанс наноклеток в области 600-900 нм, удобство функционализации оболочки диоксида кремния и наличие опыта применения разрешенного для ФДТ препарата гематопорфирина с ИК полосами люминесценции за счет включения иттербия в молекулу гематопорфирина. Метод получения композитов во многом аналогичен протоколу, описанному выше для ГП. Основным отличием в технологии синтеза композитных наночастиц был последний шаг -включение в состав частицы молекул красителя. В данном случае мы использовали поверхностную функционализацию частиц через амино-силановый спейсер,

С точки зрения потенциальных диагностических и ФДТ приложений, наиболее интересными представляются люминесцентные свойства полученных нами частиц. Помимо флуоресценции в красной области, композитные частицы имели пик флуоресценции в ближней ИК-области за счет включения иттербия в молекулу гематопорфирина (рис. 14а). В нашей работе это свойство было использовано для исследования биораспределения композитных наночастиц ex vivo по измерениям ИК люминесценции. Исследование проводилось на лабораторных мышах с привитой карциномой Эрлиха. Клетки карциномы Эрлиха были подкожно введены в бедро мыши, опухоль росла в течение двух недель. Подопытные животные были разделены на две группы (по 4 особи в каждой). Композитные наночастицы вводились в хвостовую вену мышей из первой группы, мышам из второй группы вводился раствор Yb-ГП. Через 20 ч после инъекции животных усыпили, и для оценки ИК-люминесценции были извлечены следующие органы животных: опухоль, печень, селезёнка, мышцы, кожа.

Для измерения ИК-люминесценции использовался волоконно-лазерный онкофлуориметр (Фрязинский филиал ИРЭ РАН, мощность излучения 20 мВт на наружном конце оптоволокна), записывающий интегральный сигнал обратно рассеянной люминесценции в диапазоне 900-1060 нм при возбуждении светом длиной волны 405 нм от пробы, помещенной в лунки микробиологического планшета. Биораспределение композитных наночастиц либо свободного гематопорфирина можно оценить с помощью средней интегральной интенсивности ИК-люминесценции. На рис. 14 представлены

18

сравнительные результаты по исследованию биораспределения свободного препарата УЬ-ГП и композитных наночастиц, функциоиализованных УЬ-ГП. Из рисунка видно, что биораспределение обоих препаратов имеет сходный характер с хорошим контрастом накопления в опухоли. Отметим, что для более ранних временных интервалов доминирует накопление препарата УЬ-ГП в печени и селезенке, в согласии с имеющимися данными по биораспределению и токсичности наночастиц.

1

а 0,8

§

0.6

I 0.4

| 0,2

3

0

- (а)

1 ,» -4......

920 060 1000 1040 Длина волны (нм)

2 3 4 Номер образца

Рис. 14. Спектр ИК-люминесценции свободного препарата УЬ-ГП (а) и средние интегральные интенсивности ИК-люминесценции (900-1060 нм) образцов тканей мыши с привитой опухолью (б), Измерения проведены через 20 ч после введения препаратов свободного УЬ-ГП (А) и коиъюгатов композитных наночастиц с УЬ-ГП (Б). Цифрами на оси абсцисс обозначены опухоль (1), печень (2), селезенка (3), мышца (4) и кожа (5).

Для оценки потенциальной возможности использования полученных композитных наночастиц в тераностике, были проведены эксперименты по оценке жизнеспособности клеток НеЬа при концентрации свободного и загруженного гематопорфирина 1.4 мг/л. Проба суспензии клеток объемом 1 мл (108 клеток/л) инкубировалась с 0,2 мл свободного УЬ-ГП или суспензии композитных наночастиц в течение 15 мин, затем смесь облучалась светодиодом (АФС аппарат светотерапевтический светодиодный, ООО «Полироник», Россия) в течение 15 мин с длиной волны излучения 625 нм и плотностью мощности 50 мВт/см2. Клетки НеЬа, не подвергавшиеся обработке, и клетки, подвергавшиеся обработке отдельно сенсибилизатором (УЬ-ГП) и композитными наночастицами (НК), а также светом, использовались в качестве контроля. Жизнеспособность (дыхательная активность) клеток измерялась с помощью МТТ-теста. Из данных рис, 15 видно, что облучение клеток Пс1а с помощью светоизлучающего диода (625 нм, 50 мВт/см2) в течение 15 мин с или без

) бвэ еброботии

Рис. 15. Жизнеспособность клеток НеЬа, определенная с помощью МТТ-теста при разных условиях обработки. Концентрация свободного УЬ-ГП равна 1.4 мг/л, концентрация нанокомпозитных частиц 1.5x10" шт/л. Длина волны возбуждающего излучения 625 нм, мощность 50 мВт/см2, время облучения 15 мин, 11оказапа также ср. кв, ошибка измерений (п=5).

добавления свободного Yb-ГП приводит к снижению жизнеспособности клеток до 75%. Однако при инкубации клеток HeLa с композитными наночастицами наблюдается снижение жизнеспособности клеток приблизительно до 30%, что свидетельствует о заметном усилении фотодинамнческого эффекта.

В заключении диссертации отмечается, что золотосеребряные наноклетки имеют большую перспективу применения в современной нанобиотехнологии. В конце работы сформулированы выводы, которые состоят в следующем:

1. В индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза выход серебряных наночастиц кубической формы критически зависит от следующих физико-химических параметров: (1) концентрации реагентов; (2) температуры реакции; (3) степени оксигенации этиленгликоля; (4) отсутствия в реакционной смеси следовых количеств примесных металлов; (5) образования монокристаллических серебряных частиц на начальном этапе синтеза. Найдены оптимальные условия для получения высокого выхода целевых частиц.

2. Сокращение времени реакции добавлением ацетона на стадии неполного восстановления позволяет эффективно контролировать размер частиц в диапазоне 30-60 нм. Успешное формирование нанокубиков характеризуется появлением в спектре экстинкции частиц двух минорных максимумов ПР на длинах волн 350 нм, 390 нм и основного пика в диапазоне 435-470 нм в зависимости от размера частиц. Наличие как минимум трех плазмонных пиков является надежным критерием формирования нанокубиков хорошего качества и позволяет контролировать эффективность синтеза даже в отсутствие ЭМ-изображений образцов.

3. Серебряные нанокубики и золотосеребряные наноклетки получены и охарактеризованы методами спектроскопии поглощения и рассеяния света, просвечивающей и сканирующей ЭМ, электронно-спектроскопического анализа, темнопольной световой микроскопии резонансного рассеяния. Показано, что реакция гальванического замещения с использованием серебряных нанокубиков в качестве шаблона позволяет осуществить настройку ПР частиц в диапазоне длин волн от 435 до 800 нм с максимальной добротностью спектров поглощения и рассеяния света на краях указанного спектрального диапазона.

4. Серебряные нанокубики и ЗСНК впервые применены в качестве маркеров для мультицветного дот иммуноанализа. Синтезированы коллоиды желтого, красного и синего цветов. Наночастицы функционализованы цыплячьими, крысиными и мышиными IgG. Полученные метки были использованы в модельном эксперименте для одновременного выявления кроличьих антител соответствующей специфичности. При отсутствии неспецифического связывания предел обнаружения в дот иммуноанализе составил 20 фмоль при детектировании невооруженным глазом.

5. Получены и охарактеризованы композитные наночастицы, состоящие из металлического ядра (золотосеребряной наноклетки) и силикатной оболочки, функционализованной фотосенсибилизаторами на основе порфирина. Композитные наночастицы обладали фототермической активностью на длине волны ПР 810 нм, люминесценцией в диапазоне 600-700 нм при возбуждении светом на длине волны 400 нм, а также фотодинамической активностью и ИК-люминесценцией при возбуждении светом на длине волны 630 нм (в случае Yb-ГП).

6. Композитные наночастицы обладают повышенной фотодинамической и фототермической активностью по отношению к бактериям S. aureus и клеткам линии HeLa по сравнению с молекулярным раствором гематопорфирина или плазмонными наночастицами в эквивалентных концентрациях. Эффективное подавление роста патогенных бактерий композитными наночастицами 3CHK/Si02/Tn по сравнению со

20

свободным ГГТ обусловлено адсорбцией композитных наночастиц на поверхности бактерий и повышением локальной концентрации ГП.

Цитированные работы:

1. Au L., Zheng D., Zhou F., Li Z.-Y., Li X., Xia Y. ACS Nemo, 2, 1645 (2008).

2. Yang X., Skrabalak S.E., Li Z.-Y., Xia Y„ Wang L.V. Nana Lett., 7, 3798 (2007).

3. Dam D.H.M., Lee J.H., Sisco P.N., Co D. Т., Zhang M., Wasielewski M.R., Odom T.W. ACS Nano, 6, 3318 (2012).

4. Skrabalak S.E., Au L„ Li X., Xia Y. Nat. Protoc., 2, 2182 (2007).

5. Богатырев B.A., Дыкман JI.A., Краснов Я.М., Плотников В.К., Хлебцов Н.Г. Коллоид, жури., 64, 745 (2002).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи в журналах из перечня, рекомендованного ВАК для публикации результатов

диссертаций:

1. Панфилова, Е.В. Исследование параметров реакции полиольного синтеза, контролирующих высокий выход серебряных нанокубиков [Текст] / Е.В. Панфилова, Б.Н. Хлебцов, A.M. Буров, Н.Г. Хлебцов // Коллоидный журнал. - 2011. - Т. 73, № б. -С. 104-114.

2. Хлебцов, Б.Н. Композитные многофункциональные наночастицы на основе золотосеребряных наноклеток, покрытых двуокисью кремния и Yb-гематопорфирином [Текст] / Хлебцов Б.Н., Панфилова Е.В., Ханадеев В.А., Маркин А.В., Терентюк Г.С., Румянцева В.Д., Иванов А.В., Шилов И.П., Хлебцов Н.Г. // Российские нанотехнологин. -2011.-Т. 6.-№7-8.-С. 112-117.

3. Khlebtsov, В. Nanocomposites containing silica-coated gold-silver nanocages and Yb-2,4-dimethoxyhematoporphyrin: Multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization, and photothermolysis [Text] / B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, G. Terentyuk, A. Ivanov, V. Rumyantseva, 1. Shilov, A. Ryabova, V. Loshchenov, N. Khlebtsov // ACS Nano. - 2011. - V. 5. - № 9. - P. 7077-7089.

4. Panfilova, E. Multiplexed dot immunoassay using Ag nanocubes, Au/Ag alloy nanoparticles, and Au/Ag nanoboxes [Text] / E. Panfilova, A. Shirokov, B. Khlebtsov, L. Matora, N. Khlebtsov // Nano Research. - 2012. - V. 5. - No. 2. - P. 124-134.

5. Khlebtsov, B.N. Plasmonic nanopowders for photothermal therapy of tumors [Text] / B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, G.S. Terentyuk, I.L. Maksimova, A.V. Ivanov, N.G. Khlebtsov // Langmuir. - 2012. - V. 28. - P. 8994-9002.

6. Хлебцов, Б.Н. Платформы для поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния на основе ассемблированных золотых наностержней [Текст] / Б.Н. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Е.В. Панфилова, С.А. Минаева, М.Ю. Цветков, В.Н. Баграташвили, Н.Г. Хлебцов // Российские нанотехнологии. - 2012. - Т. 7. - № 7-8. - С. 47-57.

7. Цветков, М.Ю. Золотые наностержни как перспективная технологическая платформа для SERS-аналитики [Текст] / М.Ю. Цветков, Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, В.Н. Баграташвили, Н.Г. Хлебцов // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). -2012. - Т. 56. - № 1-2. - С. 83-90.

8. Хлебцов, Б.Н. Новые типы наноматериапов: порошки золотых наносфер, наностержней, нанозвезд и золотосеребряных наноклеток [Текст] / Б.Н. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Е.В. Панфилова, Т.Е. Пылаев, О.А. Бибикова, С.А. Староверов, В.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, Н.Г. Хлебцов // Российские нанотехнологии. - 2012. - Т. 7. - № 11-12. - С. 7380.

9. Хлебцов, Н.Г. Биомедицинские применения золотых и композитных наночастиц: современное состояние и перспективы развития [Текст] / Н.Г. Хлебцов, Л.А. Дыкман, Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, В.А. Ханадеев, В.А. Богатырев, Г.С. Терентюк, Е.В. Тучина, В.В. Тучин, В.Д. Румянцева, А.В. Иванов // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10. - № 4. - С. 112-113.

Публикации в других изданиях и тезисы докладов конференции:

10. Khlebtsov, N. Novel multifunctional nanocomposites for theranostics [Electronic resource] / N. Khlebtsov, B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, S. Staroverov, G. Terentyuk, V. Rumyantseva, A. Ivanov // SPIE Newsroom. - 2011. DOI: 10.1117/2.1201109.003832.

11. Khlebtsov, B.N. Enhanced photoinactivation of Staphylococcus aureus with nanocomposites containing plasmonic particles and hematoporphyrin [Electronic resource] / B.N. Khlebtsov, E.S. Tuchina, V.A. Khanadeev, E.V. Panfilova, P.O. Petrov, V.V. Tuchin, N.G. Khlebtsov // J. Biophotonics. -2012. DOI: 10.1002/jbio.201200079.

12. Хлебцов, Н.Г. Золотые и композитные наночастицы для применений в качестве термосенсибилизаторов, биомаркеров и адъювантов [Текст] / Н.Г. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Т.Е. Пылаев, И.В. Видяшева, Е.В. Панфилова, О.А. Гасина, Б.Н. Хлебцов, В.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, С.А. Староверов, И.Л. Максимова, Г.С. Терентюк, В.В. Тучин // Конференции и семинары по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине». - М.: Слово. - 2010. - С. 104-105.

13. Khlebtsov, B.N. Tunable plasmonic nanoparticles for biomedical applications [Text] / B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, Т.Е. Pylaev, V.A. Khanadeev, G.S. Terentyk, V.V. Tuchin, L.A. Dykman, N.G. Khlebtsov // Proc. of III Int. Symp. Topical Problems of Biophotonics: Inst. Appl. Phys. RAS Publ. - Санкт-Петербург-Нижний Новгород (16-22 июля) - 2011. - P. 160-161.

14. Иванов, А.В. Разработка новых лекарственных форм для люминесцентной диагностики и фотодинамической терапии опухолей на основе наноразмерных композтов порфириновых фотосенсибилизаторов с амфифильными полимерами и наночастицами [Текст] / А.В. Иванов, А.Б. Соловьева, Н.Г. Хлебцов, Н.Н. Глаголев, Е.В. Панфилова, В.Д. Румянцева, Г.С. Терентюк, В.А. Ханадеев, Б.Н. Хлебцов, И.П. Шилов // «Лазеры в науке, технике, медицине», Сб. научных трудов XXII межд. научно-техн. конф. / под ред. В.А. Петрова. - М.: МНТОРЭС им. А.С. Попова. - 2011. - Т. 22. - С. 117-124.

15. Хлебцов, Н.Г. Композитные плазмонно-резонансные наночастицы для применений в тераностике [Текст] / Н.Г. Хлебцов, Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, В.А. Ханадеев, О.А. Бибикова, С.А, Староверов, А.А. Широков, Л.Ю. Матора, Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, Г.С. Терентюк, И.Л. Максимова, Е.С. Тучина, В.В. Тучин, В.Д. Румянцева, А.В. Иванов, И.П. Шилов, А.В. Рябова, В.Б. Лощенов // Конференции и семинары по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». - М.: Слово. - 2011. - С. 122-123.

16. Khlebtsov, B.N. Extinction, scattering, and depolarization of light by gold and bimetallic nanorods: towards biomedical imaging [Text] / B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, N.G. Khlebtsov // International Symposium on Laser Medical Applications - Moscow (5-6 июля). -2010.

17. Khlebtsov, B.N. Fabrication, optical and photothermal properties of silver nanocubes and gold nanocages [Text] / B.N. Khlebtsov, V.A. Khanadeev, E.V. Panfilova, I.L. Maksimova, G.S. Terentyuk, N.G. Khlebtsov // Saratov Fall Meeting, XIV International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. - Саратов (5-8 октября). -2010.

18. Хлебцов, Н. Композитные наночастицы с настраиваемым плазмонным резонансом для биомедицинских применений [Текст] / Н. Хлебцов, Б. Хлебцов, В. Ханадеев, Е. Панфилова, Г. Терентюк, Е. Тучина, В. Тучин, В. Румянцева, А. Иванов, И. Шилов, А. Рябова, В. Лощенов // Материалы VI съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, ИФПБ РАН, НИА-Природа. - Москва (15-22 сентября). - 2011. - С. 196.

19. Khlebtsov, B.N. Nanocomposites containing silica-coated gold-silver nanocages and Yb-hematoporphyrin: multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization, and photothermolysis [Text] / B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, V.A. Khanadeev, G.S. Terentyuk, N.G. Khlebtsov // Abstr. 10,h Int. Conf. «Functional materials». - Partenit, Crimea, Ukraine, (3-8 октября). - 2011. - P. 377.

20. Khlebtsov, B.N. Nanocomposites containing silica coated gold-silver nanocages and dimethoxyhematoporphyrin: multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization, and photothermolysis [Text] / B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, V.A. Khanadeev, N.G. Khlebtsov // Extended abstract of IV Nanotechnology International Forum Rusnanotech. - Moscow (26-28 октября). - 2011.

21. Panfilova, E.V. Multiplex solid-phase immunoassay using Ag/Au alloy nanoparticles [Text] / E.V. Panfilova, A.A. Shirokov, B.N. Khlebtsov, N.G. Khlebtsov // Extended abstract of IV Nanotechnology International Forum Rusnanotech. - Moscow (26-28 октября). - 2011.

22. Хлебцов, Б.Н. Нанокомпозиты, содержащие наноклетки, покрытые оксидом кремния, содержащим гематопорфирин иттербия: использование для ИК-люминесцентного детектирования, фотосенсибилизации и фототермолиза [Текст] / Б.Н. Хлебцов, Е.В. Панфилова, В.А. Ханадеев, Г.С. Тереитюк, Н.Г. Хлебцов // Тезисы докладов II Международной конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». - Казань (15-18 ноября). - 2011.

23. Khlebtsov, N.G. Theranostic and multiplexed dot immunoassay applications of Au/Ag nanocages and nanocomposites [Text] / N.G. Khlebtsov, B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, V.A. Khanadeev, A.A. Shirokov, L.Yu. Matora, G.S. Terentyuk // META'12, the 3rd International Conference on Metamaterials, Photonic Crystals and Plasmonics. - Paris, France (9-22 апреля). -2012.

24. Хлебцов, Н.Г. Золотые и композитные многофункциональные наночастицы для тераностики [Текст] / Н.Г. Хлебцов, Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, Б.Н. Хлебцов, В.А. Ханадеев, Е.В. Панфилова, Т. Е. Пылаев, О.А. Бибикова, Г.С, Терентюк, Максимова И.Л., В.В. Тучин, Е.С. Тучина, В.Д. Румянцева, А.В. Иванов, А.В, Рябова, И.П. Шилов // V Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине». - Троицк (48 июня),-2012.-Т. 2.-С. 7.

25. Khlebtsov, N. Metallic and composite functionalized plasmonic nanoparticles for biomedical applications [Text] / N. Khlebtsov, B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, V. Bogatyrev, L. Dykman // C1MTEC 2012 - Abstr. of 4th International Conference on Smart Materials, Structures and Systems. - Montecatini Terme, Tuscany, Italy (10-14 июня). - 2012. - P. 142.

26. Khanadeev, V.A. Plasmonic nanopowders of gold and gold-silver nanoparticles [Text] / V.A. Khanadeev, B.N. Khlebtsov, E.V. Panfilova, N.G. Khlebtsov // XIX Int. Summer School, Fluorescent Nanoparticles in Biomedicine. - La Cristalera, Madrid, SPAIN (16-20 июля). -2012.-P. 15.

27. Panfilova, E.V. Gold nanorods as platforms for SERS analytics [Electronic resource] / E.V. Panfilova, B.N. Khlebtsov, V.A. Khanadeev, S.A. Minaeva, M.Yu.Tsvetkov, V.N. Bagratashvili, N.G. Khlebtsov // Saratov Fall Meeting, XVI International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics. - Саратов (25-28 сентября). -2012. URL: http://sfm.eventry.org/report/48.

Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman 10, _Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 57._

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕТ"

Синтез, характеристика и биомедицинские применения

золотос^ребряных наноклеток и нанокомпозитов на их основе

02.00.04 - физическая химия

■ I

^Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель доктор физико-математических наук Хлебцов Борис Николаевич

МП

Саратов — 2013

Введение...............................................................................................................5

Глава 1 Обзор литературы и постановка задач исследования.........................12

1.1. Основные способы получения металлических наночастиц...............12

1.1.1 Квазисферические наночастицы................................................12

1.1.2 Основные способы получения несферических

наночастиц благородных металлов...........................................13

1.2. Получение биметаллических наночастиц методом гальванического замещения.............................................................................................17

1.3 Синтез золотосеребряных наноклеток................................................23

1.3.1 Получение серебряных нанокубиков.........................................23

1.3.2 Синтез золотосеребряных наноклеток. Формирование металлических наноструктур с полым внутренним пространством.............................................................................25

1.4 Основные направления биомедицинских применений золотосеребряных наноклеток.............................................................31

1.4.1 Функционализация наночастиц..................................................31

1.4.2 Применение золотых наноклеток в экспериментах для терапии раковых заболеваний....................................................33

1.4.3 Адресная доставка лекарств........................................................39

1.4.4 Применение золотых наноклеток в качестве контрастирующих агентов оптической визуализации.............42

1.4. Постановка задач исследования.........................................................48

Глава 2 Исследование параметров реакции полиольного синтеза,

контролирующих высокий выход серебряных нанокубиков.............50

2.1 Материалы............................................................................................51

2.2 Синтез и определение характеристик частиц.....................................52

2.3 Результаты и обсуждение.....................................................................56

2.3.1 Полиольный синтез серебряных нанокубиков...........................56

2.3.2 Влияние следовых количеств примесных металлов..................63

2.3.3 Влияние степени оксигенации этиленгликоля на выход частиц кубической формы.........................................................65

2.3.4 Влияние температуры реакции и концентрации реагентов......68

2.4 Заключение и выводы по Главе 2........................................................71

Глава 3 Синтез и исследование фототермических свойств

золотосеребряных наноклеток.............................................................73

3.1 Синтез и характеристика наночастиц..................................................73

3.2 Фототермические свойства золотосеребряных наноклеток...............81

3.3 Моделирование спектров экстинкции наноклеток.............................83

3.4 Выводы по Главе 3...............................................................................85

Глава 4 Мультицветный дот анализ на основе серебряных нанокубиков

и золотосеребряных наноклеток..........................................................87

4.1 Материалы и методы............................................................................88

4.2 Результаты и обсуждение.....................................................................91

4.2.1 Синтез и характеризация наночастиц.........................................91

4.2.2 Биоконъюгация наночастиц........................................................95

4.2.3 Дот анализ....................................................................................97

4.3 Заключение и выводы по Главе 4......................................................102

Глава 5 Получение и применение композитных многофункциональных

наночастиц на основе золотосеребряных наноклеток и производных порфирина....................................................................104

5.1 Усиление фотодинамической инактивации роста Staphylococcus aureus с помощью нанокомпозитов, содержащих золотосеребряные

наноклетки и гематопорфирин..........................................................104

5.1.1 Материалы и методы.................................................................107

5.2.1 Результаты и обсуждение..........................................................110

5.1.2. Оптические свойства нанокомпозитов....................................112

5.2 Нанокомпозиты, содержащие золотосеребряные наноклетки и иттербиевый комплекс дикалиевой соли гематопорфирина, для

фотодинамической диагностики и подавления роста раковых клеток

.............................................................................................................121

5.3 Заключение и выводы по Главе 5......................................................128

Заключение.......................................................................................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................133

Введение

Наноматериалы являются объектом интенсивных исследований благодаря уникальным физико-химическим свойствам и применениям в электронике [1, 2], фотонике, химическом катализе [3-8] и биомедицине [914].

Наночастицы могут быть синтезированы с помощью физических и химических методов. Физические методы, как правило, представляют собой диспергирование объемного образца до наночастиц. Химические методы основаны на восстановлении вещества из солей, как правило, в присутствии стабилизаторов, с последующей контролируемой агрегацией атомов. Химические методы более эффективны для приготовления малых однородных наночастиц, причем контролируемая агрегация атомов является параметром, определяющим размер и однородность получаемых нанообъектов.

Наноразмерные частицы, обладающие разнообразными свойствами, могут быть приготовлены практически из любого кристаллического или аморфного вещества. В общем случае можно выделить основные группы наноматериалов: металлические, полупроводниковые, керамические, полимерные и композитные.

Среди большого разнообразия современных наноматериалов особое место занимают металлические наночастицы с плазмонным резонансом (ПР), который обусловлен коллективным поведением электронов проводимости на определенных частотах, определяемых природой частицы. Чтобы отличить ПР в наночастицах от распространяющихся плазмонов, его часто называют локализованным поверхностным ПР, подчеркивая локальный характер явления и важную роль поверхности раздела. Физически явление ПР заключается в резонансном увеличении сечений поглощения и рассеяния света частицей, которые на несколько порядков превосходят соответствующие значения для обычных диэлектрических частиц. Длина

волны ПР металлических наночастиц и соотношение между их сечениями поглощения и рассеяния зависят от размера, формы, материала и структуры частиц [15-18]. Именно этим определяются технологические возможности управления оптическими свойствами плазмонных частиц для конкретных приложений.

Спектральная настройка резонансов поглощения и рассеяния для сферических наночастиц золота составляет от 515 нм (для 5 нм частиц) до 560 нм (для наночастиц с диаметром около 80 нм). Существенно больший диапазон настройки удается получить путем варьирования формы частиц от сферы к наностержню [19-23] или образования структуры в виде нанооболочки [24-27]. Принципиально важно, что для металлических наночастиц нанометрового размера частота ПР лежит в оптическом диапазоне, что объясняет необычайно яркий цвет металлических коллоидов. С физико-химической точки зрения наночастицы благородных металлов имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с наночастицами других металлов. В частности, они не подвержены окислению, стабильны в водных дисперсиях и могут быть легко функционализованы.

Относительно новым объектом современной нанотехнологии благородных металлов являются золотосеребряные наноклетки (ЗСНК, название является переводом принятого в литературе термина Au-Ag nanocages [28]) - полые и пористые наночастицы из серебра, золота и биметаллического сплава. ЗСНК имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с частицами других типов. Во-первых, варьирование материала и структуры наночастиц позволяет получить очень широкий диапазон настройки ПР от 400 нм до ближней ИК-области. Во-вторых, наличие полостей внутри ЗСНК и развитой поверхности делает их перспективным шаблоном синтеза нанокомпозитов для адресной доставки лекарств и фотодинамических красителей, конструирования SERS наносенсоров и т.д. В литературе описаны успешные применения ЗСНК для биоимиджинга и

терапии опухолей [29], оптоакустической и когерентной томографии [30], для доставки целевых веществ к ядру клеток [31] и т.п.

Технология получения таких частиц известна с 2005 года [32] и заключается в синтезе монодисперсных серебряных наночастиц и последующем гальваническом замещении металла на золото или сплав. Несмотря на наличие более чем 100 работ, опубликованных за последнее десятилетие в области синтеза, исследования оптических свойств и биомедицинских применений золотосеребряных наноклеток, к моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с воспроизводимым получением серебряных нанокубиков (исходных шаблонов для ЗСНК), пониманием некоторых аспектов физико-химических механизмов получения ЗСНК и их функционализации биомолекулами. Не были исследованы возможности использования мультицветных меток на основе ЗСНК для мультиплексного дот иммуноанализа. Наконец, отсутствовали данные о получении и перспективах применения нанокомпозитов, содержащих ЗСНК и фотодинамические красители. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации.

Целью диссертационной работы являлся синтез, исследование оптических и физико-химических свойств золотосеребряных наноклеток и композитных наночастиц на их основе для применений в твердофазном иммуноанализе, фототермической и фотодинамической терапии.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:

• Определение физико-химических параметров реакции полиольного синтеза, контролирующих размер и выход серебряных нанокубиков -шаблонов для получения золотосеребряных наноклеток.

• Синтез и характеристика различных типов ЗСНК с плазмонными резонансами в диапазоне 450-800 нм.

Разработка физико-химических методов функционализации и демонстрация возможности использования полученных наночастиц в качестве меток для мультицветного дот иммуноанализа. Синтез композитных наночастиц, состоящих из ЗСНК, покрытых диоксидом кремния и функционализованных различными производными порфирина (иттербиевый комплекс дикалиевой соли 2,4-диметоксигематопорфирина IX, гематопорфирин).

Демонстрация возможности использования композитных наночастиц для фототермического и фотодинамического подавления роста бактерий Staphylococcus aureus и опухолевых клеток HeLa.

Научная новизна работы: Впервые показано, что выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами, как образование образование первичных монокристаллических частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств ионов примесных металлов. Предложен спектральный критерий формирования нанокубиков даже в отсутствие электронно-микроскопических (ЭМ) изображений.

Впервые продемонстрирована возможность одновременного выявления трех типов молекул-мишеней (антител) с помощью дот иммуноанализа с использованием золотосеребряных наноклеток. При отсутствии неспецифического связывания предел обнаружения равен примерно 20 фмоль при детектировании невооруженным глазом.

Получен новый тип композитных наночастиц, состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными порфирина.

Показано, что композитные наночастицы обладают большей фототермической и фотодинамической активностью подавления роста

бактерий S. aureus по сравнению с отдельными компонентами композитной наночастицы (молекулами гематопорфирина, ЗСНК).

Научно-практическая значимость работы определяется востребованностью полученных наночастиц, их реальным применением в различных учреждениях РФ, включая ИБФРМ РАН, С ГУ им. Н.Г. Чернышевского, СГМУ им. В.И. Разумовского, РОНЦ имени НН Блохина (г. Москва), ИПЛИТ РАН (г. Троицк), ИГПМУ РАН (г. Саратов) и др.

Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Выход серебряных частиц кубической формы в индуцированной сульфидом натрия реакции полиольного синтеза определяется такими физико-химическими параметрами как образование первичных монокристаллических серебряных частиц, степень оксигенации этиленгликоля и отсутствие в реакционной смеси следовых количеств примесных металлов. Наличие основного и двух минорных плазмонных пиков является надежным критерием формирования нанокубиков даже в отсутствие ЭМ-изображений. Размер частиц контролируется временем реакции.

2. Реакция гальванического замещения с использованием серебряных нанокубиков позволяет осуществить эффективную настройку ПР частиц в широком диапазоне длин волн 435-800 нм с максимальной добротностью спектров поглощения и рассеяния на краях указанного спектрального диапазона.

3. Золотосеребряные наноклетки с различной степенью гальванического замещения могут быть использованы в качестве меток мультицветного

дот иммуноанализа для одновременной детекции молекул-мишеней как минимум трех видов биоспецифичности с пределом детекции 20 фмоль.

4. Разработан новый тип многофункциональных композитных наночастиц состоящих из золотосеребряных наноклеток, покрытых диоксидом кремния и функционализованных производными гематопорфирина (ГП).

5. Эффективное подавление роста патогенных бактерий композитными наночастицами ЗСНК/БЮг/ГП по сравнению со свободным ГП обусловлено адсорбцией композитных наночастиц на поверхности бактерий и повышением локальной концентрации ГП.

Личный вклад диссертанта состоит в синтезе серебряных нанокубиков и золотосеребряных наноклеток, разработке протокола функционализации наночастиц и экспериментальной апробации протокола мультицветного дот иммуноанализа на основе конъюгатов наночастиц, анализе данных электронной микроскопии, исследовании физико-химических свойств и оптимизации протоколов синтеза композитных наночастиц.

Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в рамках плановой темы НИР «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392, руководитель зав. лаб. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.

Гранты. Исследования поддерживались 2 грантами РФФИ (2011-2012 годы), государственным контрактом на проведение научно-исследовательской работы № 14.740.11.0260, Программами президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и «Фундаментальные основы технологии наноструктур и наноматериалов», грантом Президента РФ МК-1057.2011.02, грантом Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях

высшего профессионального образования; грантом компании ОПТЭК (2012) для поддержки молодых ученых ведущих высших учебных заведений и научных исследовательских центров (руководитель асп. Панфилова Е.В.) стипендией президента РФ 2013-2015 годах.

Апробация результатов

Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:

1. Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics, Saratov, Russia, 2010.

2. 4-ый международный форум по нанотехнологиям, Москва, Россия, 2011 (серебряная медаль и премия за второе место в конкурсе молодых ученых).

3. VI съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, Россия, 2011.

4. Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта Photonics4Life FP-7, Саратов, 2011).

5. 10th International Conference "Functional materials" ICFM'2011, Sec. 10: Materials for Medical and Environmental Applications. Biosensors, Partenit, Crimea, Ukraine, 2011.

6. П международная Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии", Казань, Россия, 2011.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 статей и 16 тезисов докладов, включая 9 статей из списка, рекомендованного ВАК для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Глава 1 Обзор литературы и постановка задач исследования

1.1. Основные способы получения металлических наночастиц

1.1.1 Квазисферические наночастицы

Поскольку сфера обладает наименьшей поверхностной энергией, восстановление соли металла в растворе в общем случае приводит к образованию квазисферических наночастиц [33]. Изменяя параметры синтеза: концентрацию металла-прекурсора, концентрацию восстановителя и стабилиза