Синтез и структурно-функциональные исследования α-конотоксинов и их аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ОСОБЕННОСТИ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДВЕ И БОЛЕЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ.

1 .Введение.

2.Защитные группы тиольной функции цистеина.

3. Подходы к синтезу пептидов с двумя дисульфидными связями.

4. Подходы к синтезу пептидов с тремя и более дисульфидными связями.

5. Проблемы синтеза пептидов содержащих внутри- 50 и межмолекулярные дисульфидные связи.

ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1 .Подходы к синтезу а-конотоксинов.

2. Выбор последовательностей.

3.Синтез а-конотоксинов.

4. Исследование взаимосвязи между структурой 71 и биологической активностью а-конотоксинов и их аналогов.

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ

Ацетилхолиновый рецептор из электрического органа ската Torpedo californica был одним из первых наиболее полно охарактеризованных мембранных многосубъединичных рецепторов. К настоящему времени проведены различные структурно-функциональные исследования этого белка, известны многие его физические характеристики. Существенный вклад в эти исследования был сделан Институтом биоорганической химии : в течение многих лет никотиновый ацетилхолиновый рецептор изучали здесь прежде всего с использованием а-нейротоксинов змей ( конкурентных антагонистов АХР, узнающих два участка связывания на рецепторе и необратимо блокирующих холинергическую передачу). Однако за два последних десятилетия был выявлен новый класс конкурирующих антагонистов холинорецепторов, действующих примерно на те же участки, что и а-нейротоксины змей - это а-конотоксины.

Альфа-конотоксины, впервые выделенные в 1981 г. из морских улиток семейства Conus - небольшие пептиды, состоящие из 12-18 аминокислотных остатков, конформация которых фиксируется двумя внутримолекулярными дисульфидными связями. Конотоксины, а также их фотоактивируемые и радиоактивные производные, могут служить для определения участка связывания на поверхности рецептора, функционально важного участка, поскольку связывание лиганда с рецептором является основой механизма передачи сигнала от одной клетки к другой. Одновременно, установление трехмерной структуры конотоксинов может прояснить пространственное строение комплементарной поверхности рецептора. Поскольку каждый конотоксин нацелен на специфичный рецепторный белок плазматической мембраны клетки, эти пептиды являются химическими зондами с мощной разрешающей способностью. В настоящее время, конотоксины используются во многих лабораториях для широкого спектра физиологических и фармакологических исследований в нервных системах как позвоночных, так и беспозвоночных. В последнее время ряд конотоксинов предложен для фармацевтического применения, наиболее продвинутое в этом отношении соединение - Зиконотид (Elan Pharmaceuticals)- является синтетическим со-конотоксином MVIIA, который блокирует N-тип кальциевых каналов, включенных в болевой путь, и рекомендован для применения пациентам с хронической болью. Несмотря на то, что терапевтический индекс этого соединения (отношение терапевтического к побочным эффектам) очень низок, оно является единственным доступным соединением, селективно блокирующим Ы-тип кальциевых каналов и не вызывающим привыкание, как в случае опиатной терапии . Некоторые другие конотоксины исследуются в настоящее время в качестве лекарств при различных болезненных состояниях : хроническая боль, эпилепсия, кардиовазкулярные болезни, психиатрические расстройства, рак, парилич, расстройства движения. Кроме того, нейромышечные блокирующие агенты (альфа-конотоксины) исследуются как средства анестезии, например, быстрый паралич гортанной мышцы облегчает трахеальное зондирование .

Выделение конотоксинов из яда морских улиток является трудоемкой и непростой задачей,так как яд содержит от 40 до 200 компонентов пептидной природы, и для выделения нескольких микрограммов токсина требуется от 100 до 500 особей улиток. Поэтому прямой химический синтез этого класса соединений является актуальной задачей. Результатом представляемой работы явилась разработка эффективной схемы синтеза конотоксинов, основанной на применении одной защитной группы для всех остатков цистеина и одновременном замыкании двух дисульфидных связей.

Литературный обзор посвящен рассмотрению схем синтеза дисульфидсодержащих пептидов.

Выводы.

1. Разработана эффективная схема твердофазного синтеза природных а-конотоксинов и их аналогов. Использование предложенной схемы позволяет сократить число стадий в ходе наращивания пептидной цепи, не требует ортогональных защит для тиольной функции остатков цистеина, позволяет провести одновременное образование всех дисульфидных связей и уменьшить время окисления линейных предшественников, приводит к более высоким выходам целевых продуктов.

2. С применением разработанной схемы синтезированы 8 природных а-конотоксинов и 17 новых аналогов. В их числе 4 фотоактивируемых аналога а-конотоксина GI, три из которых оказались высокоспецифичными лигандами АХР Torpedo и были использованы для его исследования.

3. Биологическая активность природных а-конотоксинов и большинства их аналогов показана в опытах по связыванию с ацетилхолиновым рецептором (АХР) из электрического органа Torpedo, с экстрацеллюлярным доменом al субъединицы нейронального АХР крысы, а также в электрофизиологических опытах на нейрональных АХР крысы, гетерологически экспрессированных в ооцитах Xenopus.

4. Путем введения положительно заряженных остатков получены аналоги а-конотоксинов GI и SLA более активные чем природные соединения.

Заключение.

Анализ данных литературы позволяет сделать вывод о том, что успех синтеза дисульфидсодержащих пептидов в основном определяется выбором стратегии образования дисудьфидных мостиков. Причем выбор метода замыкания дисульфидных связей в конечном продукте определяет всю стратегию синтеза и должен быть выбран на самом первом этапе работы. Если при получении длинных пептидов или пептидов, содержащих 4 и более дисульфидные связи, обычно исследователи делают выбор в пользу одновременного замыкания Б-Б мостиков, то в случае более коротких пептидов, содержащих 2 или 3 дисульфидные связи, вопрос о том, какая стратегия образования Б-Б связей предпочтительнее, остается открытым, и для синтеза каждой группы соединений трубуется свое решение этой задачи.

Проблема выбора стратегии образования дисульфидных связей в полной мере относится к а-конотоксинам, содержащим 12-18 аминокислотных остатков и 2 дисульфидные связи. Подавляющая часть работ, посвященных синтезу а-конотоксинов, проведена с использованием стратегии поэтапного образования дисульфидных связей. Однако стоит отметить, что в последние годы многие исследователи при синтезе конотоксинов начали делать выбор в пользу одновременного замыкания Б-Б связей. Данные литературы, посвященные синтезу конотоксинов, показывают, что отсутствие дающих высокий выход методов синтеза конотоксинов и их аналогов делает эту группу чрезвычайно важных соединений малодоступной для проведения широкомасштабных структурно-функциональных исследований.

ГЛАВА II. Результаты и обсуждение.

1. Подходы к синтезу а-конотоксинов.

Впервые выделенные из ядов морских улиток семейства Conus в 1981 г., а-конотоксины представляют собой пептиды, содержащие 12-18 а.о. и две дисульфидные связи, их структура схематично может быть изображена следующим образом: ХьзС'С^Хз^сЪСз^С4, где X - аминокислотные остатки, в подстрочном индексе указано их возможное число, С1'2'3'4- остатки цистеина. Поскольку а-конотоксины присутствуют в ядах Conus лишь в очень небольших количествах, необходимы методы их синтеза для проведения более детальных исследований биологической активности, установления пространственных структур и т.д. Можно также ожидать, что с помощью синтеза удастся получить модифицированные аналоги, превосходящие природные соединения по эффективности и/или избирательности действия.

Развитие методологии пептидного ( прежде всего твердофазного) синтеза в последние десятилетия позволяет в настоящее время синтезировать довольно большие молекулы, содержащие более 100 аминокислотных остатков, а синтез коротких пептидов, содержащих до 20 а.о., давно превратился в достаточно рутинное занятие. Однако решение задачи по синтезу а-конотоксинов, содержащих в своем составе две дисульфидные связи, требует тщательного подбора как стратегии синтеза, так и методов, применяемых на каждой стадии синтеза.

До недавнего времени а-конотоксины получали главным образом твердофазным методом с использованием ортогональных защит для двух пар цистеинов (первый-третий, второй-четвертый), образующих впоследствии две дисульфидные связи [74,76-78,82-86,89,118,154]. При этом для защиты тиольной функции первой пары цистеинов используют кислотолабильные группы (MBzl-группу в случае Вос-схемы защитных групп и Trt-группу для Fmoc-схемы), которые отщепляются при деблокировании пептида вместе с остальными защитными группами. Вторую пару цистеинов, напротив, защищают кислотостабильными группами (как правило, Асш), которые селективно удаляют с одновременным образованием дисульфидной связи только после того, как была образована дисульфидная связь между первым и третьим цистеинами. Описанная стратегия обладает несомненным достоинством: в конце синтеза получают индивидуальное соединение с известным расположением дисульфидных связей. Недостаток этого способа в его многостадийности; в результате неизбежные потери приводят к низкому выходу конечного продукта, составляющему не более 10% в расчете на стартовую аминокислоту [1,18].

Использованная нами в настоящем исследовании стратегия синтеза а-конотоксинов заключается в одновременном замыкании обеих дисульфидных связей. Такой подход позволяет значительно повысить выход конечного продукта за счет сокращения стадий синтеза. Подобная стратегия была ранее применена к синтезу а-конотоксинов в нескольких работах зарубежных авторов при синтезе а-конотоксинов Е1 [60], 1ш1 [55], но как основной метод синтеза а-конотоксинов используется исследователями лишь в последние 6 лет. В рамках этой стратегии синтеза нами были выбраны наиболее подходящие для синтеза а-конотоксинов полимер и система защитных групп аминокислот, а также оптимизированы следующие стадии синтеза: наращивание полипептидной цепи на полимере, деблокирование пептида, образование дисульфидных связей. Одновременно с нашими работами, отраженными в публикациях [71,72,172180], принципиально на такой же подход к синтезу а-конотоксинов перешли и зарубежные лаборатории [59,68,69]. Кроме того, на завершающих этапах работы для синтеза нами был использован роботизированный синтезатор, что делает синтез более экономичным и позволяет получать одновременно несколько синтетических аналогов а-конотоксинов. Это открывает новые возможности в исследованиях структурно-функциональных взаимоотношений в а-конотоксинах.

2. Выбор последовательностей.

Поскольку все синтезированные в данной работе а-конотоксины и их аналоги были использованы для исследования АХР, то выбор аминокислотных последовательностей для синтеза определялся задачами, возникающими в ходе исследования рецептора.

В качестве базовых последовательностей для синтеза были выбраны два а-конотоксина, различающие два участка связывания в молекуле АХР мышечного типа: а-конотоксины И и М1 ("мышечные" а-конотоксины) (табл.4), а также два а-конотоксина, взаимодействующие по литературным данным только с одним участком мышечного рецептора:

1. Кудрявцева Е.В., Сидорова М.В., Евстигнеева Р.П. Особенности синтеза цистеинсодержащих пептидов. Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 611-630.

2. Atherton Е., Sheppard R.C., Ward P. Solid-phase synthesis of conotoxin GI. J.Chem.Soc. 1985. V.l. P. 2065-2073.

3. Pearson D.A., Blanchette M., Baker M.L., Guindon C.A. Trialkysilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 2739-2742.

4. Kaiser Т., Nicholson G.J., Kohlbau H.J., Voelter W. Racemization studies of Fmoc-Cys(Trt)-OH during stepwise Fmoc-solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 1187-1190.

5. McCurdy S.N. The investigation of Fmoc-cysteine derivatives in solid phase peptide synthesis. Peptide Res. 1989. V. 2. 147-152.

6. Kamber В., Hartmann A., Eisler K., Riniker В., Rink H., Sieber P., Rittel W. The synthesis of cystine peptides by iodine oxidation of S-trityl-cysteine and S-acetamidomethyl-cysteine peptides. Helv. Chim. Acta. 1980. V. 63. P. 899-915.

7. Sieber P., Kamber B, Hartmann A, Johl A, Riniker B, Rittel W.Total synthesis of human insulin. IV. Description of the final steps (author's transl). Helv.Chim.Acta. 1977. V. 60. P. 27.

8. Lamthanh H., Roumestand C., Deprun C., Menez A. Side reaction during the deprotection of (S-acetamidomethyl)cysteine in a peptide with a high serine and threonine content. Int.J.Peptide Protein Res. 1993. V. 41. P. 85-95.

9. Kiso Y., Satomi M., Ukawa K., Akita T. Efficient deprotection of N -tosylarginine with a thioanizole-trifluoromethanesulphonic acid system. J.Chem.Soc., Chem. Comm. 1980. P.1063-1064.

10. Lamthanh H., Virelizier H., Frayssinhes D. Side reaction of S-to-N acetamidomethyl shift during disulfide bond formation by iodine oxidation of S-acetamidomethyl-cysteine in a glutamine-containing peptide. Peptide Res. 1995. V. 8. P. 316-320.

11. Weber U., Hartter P. S-Alkylmercapto groups for protection of the SH-function of cysteine. I. Synthesis and stability of some S-(Alkylmercapto) cysteines. J. Phisiol. Chem. 1970. V. 351. P. 1384-1388.

12. Ruegg U.T., Gattner H-G. Reduction of S-sulpho groups by tributylphosphine: an improved method for the recombination of insulin chains. J. Phisiol. Chem. 1975. V. 356. P. 1527-1533.

13. Frischmann P., Schafer W., Barlos K., Gatos D. Synthetic studies on human necrosis factor a. Proc. 23rd European Peptide Symposium. 1993. P. 305.

14. MatsuedaR., AibaK. // Chem. Lett. 1978. P. 951.

15. Akaji K., Fujino K., Tatsumi T., Kiso Y. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 11384-11392.

16. Kudryavtseva E.V., Sidorova M.V., Ovchinnikov M.V., Bespalova Zh. D., Bushuev V.N. Comparative evaluation of different methods for disulfide bond formation in synthesis of the HIV-2 antigenic determinant J. Pept. Res. 1997. V. 49. P. 52-58.

17. Andrey D., Albericio F., Sole N.A., Munson M.C., Ferrer M., Barany G. Peptide Synthesis Protocols (Eds Pennington M.W., Dunn B.M.). Hymana Press. New Jersey. 1994. P. 91.

18. Zafaralla G.C., Ramilo C., Gray W.R., Karlstron R., Olivera B.M., Cruz LJ. Phylogenetic specificity of cholinergic ligands: alpha-conotoxin SI. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 7102-7105.

19. Martinez J.S., Olivera B.M., Gray W.R., Craig A.G., Groebe D.R., Abramson S.N., Mcintosh J.M. alpha-Conotoxin EI, a new nicotinic acetylcholine receptor antagonist with novel selectivity. Biochemistry. 1995. V. 33. P. 14519-14526.

20. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. P. 70-77.

21. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determiation of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharm. 1961. V. 7. P. 88-95.

22. Stewart J.M., Young J.D. //Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chem. Company. New York. 1984.

23. Laloo D., Mahanti M.K. //Oxyd.Commun. 1988. V. 11. P. 231.

24. Hopkins C., Grilley M., Miller C., Shon K.J., Cruz L.J.,Gray W.R., Dykert J., Rivier J., Yoshikami D., Olivera B.M. A new family of Conus peptides targeted to the nicotinic acetylcholine receptor. J.Biol.Chem. 1995. V. 270. P. 22361-22367.

25. Rabenstein D.L., Yeo P.L. Kinetics and Equilibria of the Reduction of Arginine Vasopressin and Oxytocin by Thiol/Disulfide Interchange with Glutathione and Cysteine J.Org.Chem. 1994. V. 59. P. 4223.

26. Tam J.P., Wu C-R., Liu W., Zhang J-W. // J.Am.Chem.Soc. 1991. V. 113. P. 6657-6662.

27. Koide Т., Otaka A., Fujii N. Investigation of the dimethylsulfoxide-trifluoroacetic acid oxidation system for the synthesis of cystine-containing peptides. Chem. Pharm. Bull. 1993. V. 41. P. 1030-1034.

28. Otaka A., Koide Т., Shide A., Fujii N. Application of dimethylsulphoxide (DMSO)/ trifluoroacetic acid (TFA) oxidation to the synthesis of cystine-containing peptide. Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. P. 1223-1226.

29. Kiso Y., Fujii N., Yajima H. New disulfide bond-forming reactions for peptide and protein synthesis. Braz. J. Med. Biol. Res. 1994. V. 27. P. 2733-2744.

30. Хиски P.Г., Pao B.P., Роудс В.Дж. В кн. Защитные группы в органической химии. Мир, Москва, 1976. С. 224.

31. Satoh К., Okuda H., Horimoto H., Kodama H., Kondo M. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1990. V. 63. P. 3467.

32. Buku A., Blandina P., Birr C., Gazis D. Solid phase synthesis and biological activity of mast cell degranulating (MCD) peptide: a component of bee venom. Int. J. Pept. Protein Res. 1989. V. 33. P. 86-93.

33. Chaturvedi S., Bahl О.Р. Synthesis of cystine peptides 21-25/70-73 and 35-39/5659 of the beta-subunit of human choriogonadotropin. Int. J. Pept. Protein Res. 1990. V. 35. P. 133-140.

34. Drozdz R., Eberle A.N. Synthesis and iodination of human (phenylalanine 13, tyrosine 19) melanin-concentrating hormone for radioreceptor assay. J. Pept. Sci.1995. V. 1. P. 58-65

35. Fourqet P., Bahraoni E., Fontecilla-Camps J.C. Immunochemistry of scorpion toxins. Synthesis and antigenic properties of a model of a loop region specific to alpha-toxins. Int. J. Pept. Protein Res. 1988. V. 32. P. 81-88.

36. Barany G., Merrifield R.B. In The Peptides. 1981. V. 2. (Eds Gross E., Meienhofer J.). Academic Press. New York. P.3.

37. Сидорова М.В., Кудрявцева Е.В., Молокоедов А.С., Овчинников М.В., Беспалова Ж.Д. Синтез этиламида цикличеческого ундекапептида последовательности 593-603 трансмембранного гликопротеина gp41 ВИЧ-2. Биоорг. Химия. 1995. Т. 21. С. 675-683.

38. Fujii N., Otaka A., Funakoshi S., Bessho K.H., Yajima H. Application of S-l-adamantylcysteine to the synthesis of a 37-residue peptide amide corresponding to human calcitonin gene-related peptide (hCGRP). J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1987. P. 163-164.

39. Albericio F., Hammer R.P., Garsia-Echeveria C., Molins M.A., Chang J.L., Munson M.C., Pons M., Giralt E., Barany G. Cyclization of disulfide-containing peptides in solid-phase synthesis. Int. J. Pep. Protein Res. 1991. V. 37. P. 402-413.

40. Akaji K., Tatsumi T., Yoshida M., Kimura T., Fujiwara Y., Kiso Y. Synthesis of cystine-peptide by a new disulphide bond-forming reaction using the silyl chloride-sulphoxide system. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1991. P.167-168.

41. Akaji K., Tatsumi T., Yoshida M., Kimura T., Fujiwara Y., Kiso Y. Disulfide bond formation using the silyl chloride-sulfoxide system for the synthesis of a cystine peptide. J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. P. 4137-4143.

42. Koide T., Otaka A., Suzuki H., Fujii N. Synlett. 1991. P. 345.

43. Gray W.R., Olivera B.M., Cruz L.J. Peptide toxins from venomous Conus snails. Ann. Rev. Biochem. 1988. V. 57. P. 665-700.

44. Van Rietschoten J., Granier C., Rochat H., Lissitzky S., Miranda F. Synthesis of apamin, a neurotoxic peptide from bee venom. Eur. J. Biochem. 1975. V. 56. P. 35-40.

45. Mcintosh J.M., Yoshikami D., Mahe E., Nielsen D.B., Rivier J.E., Gray W.R., Olivera B.M. A nicotinic acetylcholine receptor ligand of unique specificity, alpha-conotoxin Iml. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 16733-16739.

46. Wu C.H., Narahashi Т. Mechanism of action of novel marine neurotoxins on ion channels. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1988. V. 28. P. 141-161.

47. Knorr R., Trzeciak A., Bannwarth W., Gillesen D. New coupling reagents in peptide chemistry. Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 1927-1930.

48. Martinez J.S., Olivera B.M., Gray W.R., Craig A.G., Groebe D.R., Abramson S.N., Mcintosh J.M. alpha-Conotoxin EI, a new nicotinic acetylcholine receptor antagonist with novel selectivity. Biochemistry. 1995. V. 33. P. 14519-14526.

49. Gray W.R. Echistatin disulfide bridges: selective reduction and linkage assignment. Protein Sci. 1993. V. 2. P. 1732-1748.

50. Zafaralla G.C., Ramilo C., Gray W.R., Karlstron R., Olivera B.M., Cruz L.J. Phylogenetic specificity of cholinergic ligands: alpha-conotoxin SI. Biochemistry. 1988. V. 27. P. 7102-7105.

51. Кудрявцева E.B., Сидорова M.B., Молокоедов A.C., Овчинников М.В., Беспалова Ж.Д. Направленное и спонтанное замыкание дисульфидных связей с помощью перекиси водорода в синтезе эндотелинов-1 и -3. Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. С. 107-116.

52. Kudryavtseva E.V., Sidorova M.V., Ovchinnikov M.V., Bespalova Z.D. Hydrogen peroxide for disulfide bridge formation in methionine-containing peptides. J. Peptide Sci. 2000. V. 6. P. 208-216.

53. Hill J.M., Oomen C.J., Miranda L.P., Bingham J-P. Alewood P.F., Craik D.J. Three-dimensional solution structure of alpha-conotoxin МП by NMR spectroscopy: effects of solution environment on helicity. Biochemistry. 1998. V. 37. P. 15621-15630.

54. Hu S-H., Gehrmann J., Guddat L.W., Alewood P.F., Craik D.C., Martin J.L. The 1.1 A crystal structure of the neuronal acetylcholine receptor antagonist, alpha-conotoxin PnLA from Conus pennaceus. Structure. 1996. V. 4. P. 417-423.

55. Hu S-H., Gehrmann J., Guddat L.W., Alewood P.F., Craik D.C., Martin J.L. Crystal structure at 1.1 A resolution of conotoxin PnIB: comparison with conotoxins PnLA and GI. Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11323-11330.

56. Жмак M.H., Кашеверов И.Е., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И., Вольпина О.М., Иванов В.Т. Эффективная схема синтеза а-конотоксинов и их аналогов. Биоорганическая химия. 2001. Т. 27. С. 83-88.

57. Nishiuchi Y., Sakakibara S. Primary and secondary structure of conotoxin GI, a neurotoxic tridecapeptide from a marine snail. FEBS Letters, 1982, V. 148 (2), P. 260-262.

58. Guddat L.W., Martin J.A., Shan L., Edmundson A.B., Gray W.R. Three-dimensional structure of the alpha-conotoxin GI at 1.2 A resolution. Biochemistry. 1996. V. 35. P. 11329-11335.

59. Almquist R.G., Kadambi S.R., Yasuda D.M., Weitl F.L., Polgar W.E., Toll L.R. Paralytic activity of (des-Glul)conotoxin GI analogs in the mouse diaphragm. Int. J. Peptide Protein Res. 1989. V. 34. P. 455-462.

60. Zhang R., Snyder G.H. Factors governing selective formation of specific disulfides in synthetic variants of alpha-conotoxin. Biochemistry. 1991. V. 30. P. 11343-11348.

61. Groebe D.R., Gray W.R., Abramson S.N. Determinants involved in the affinity of alpha-conotoxins GI and SI for the muscle subtype of nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry. 1997. V. 36. P. 6469-6474.

62. Gehrmann J., Alewood P.F., Craik D.J. Structure determination of the three disulfide bond isomers of alpha-conotoxin GI: a model for the role of disulfide bonds in structural stability. J. Mol.Biol. 1998. V. 278. P. 401-415.

63. Kaerner A., Rabenstein D.L. Stability and structure-forming properties of the two disulfide bonds of alpha-conotoxin GI. Biochemistry. 1999. V. 38. P. 5459-5470.

64. Hargittai B., Barany G. Controlled syntheses of natural and disulfide-mispaired regioisomers of alpha-conotoxin SI. J. Peptide Res. 1999. V. 54. P. 468-479.

65. Myers R.A., Zafaralla G.C., Gray W.R., Abbott J., Cruz L.J., Olivera B.M. alpha-Conotoxins, small peptide probes of nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry. 1991. V. 30. P. 9370-9377.

66. Gray W.R., Rivier J.E., Galyean R., Cruz L.J., Olivera B.M. Conotoxin MI. Disulfide bonding and conformational states. J.Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 12247-12251.

67. Jacobsen R.B., DelaCruz R.G., Grose J.H., Mcintosh J.M., Yoshikami D., Olivera B.M. Critical residues influence the affinity and selectivity of alpha-conotoxin MI for nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry. 1999. V. 38. P. 13310-13315.

68. Cartier G.E., Yoshikami D., Gray W.R., Luo S., Olivera B.M., Mcintosh J.M. A new alpha-conotoxin which targets alpha3beta2 nicotinic acetylcholine receptors. J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 7522-7528.

69. Quiram P.A., Sine S.M. Structural elements in alpha-conotoxin Iml essential for binding to neuronal alpha7 receptors. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 1100111006.

70. Luo S., Nguyen T.A., Cartier G.E., Olivera B.M., Yoshikami D., Mcintosh J.M. Single-residue alteration in alpha-conotoxin PnIA switches its nAChR subtype selectivity. Biochemistry. 1999. V. 38. P. 14542-14548.

71. Jacobsen R., Jimenez E.C., Grilley M., Watkins M., Hillyard D., Cruz L.J., Olivera B.M. The contryphans, a D-tryptophan-containing family of Conus peptides: interconversion between conformers. J. Peptide Res. 1998. V. 51. P. 173-179.

72. Mezo G., Drakopoulou E., Vita C., Hudecz F. Synthesis and immunological studies of alpha-conotoxin chimera containing an immunodominant epitope from the 268-284 region of HSV gD protein. J. Peptide Res. 2000. V. 55. P.7-17.

73. Drakopoulou E., Uray K., Mezo G., Price M.R., Vita C., Hudecz F. Synthesis and antibody recognition of mucin 1 (MUCl)-alpha-conotoxin chimera. J. Peptide Sci. 2000. V. 6. P. 175-185.

74. Iwai M., Kobayashi M., Tamura K., Ishii Y., Yamada H., Niwa M. Direct identification of disulfide bond linkages in human insulin-like growth factor I (IGF-I) by chemical synthesis. J. Biochem. 1989. V. 106. P. 949-951.

75. Barthe P., Rochette S., Vita C., Roumestand C. Synthesis and NMR solution structure of an alpha-helical hairpin stapled with two disulfide bridges. Protein Sci. 2000. V. 9. P. 942-955.

76. Walker C.S., Steel D., Jacobsen R.B., Lirazan M.B., Cruz L.J., Hooper D., Shetty R., DelaCruz R.C., Nielsen J.S., Zhou L.M., Bandyopadhyay P., Craig A.G.,

77. Olivera B.M. The T-superfamily of conotoxins. J. Biol.Chem. 1999. V. 274. P. 30664-30671.

78. Flinn J .P., Murphy R., Boublik J.H., Lew M.J., Wright C.E., Angus J.A. Synthesis and biological characterization of a series of analogues of omega-conotoxin GVIA. J. Peptide Sci. 1995. V. 1. P. 379-384.

79. Flinn J.P., Pallaghy P.K., Lew MJ., Murphy R., Angus J.A., Norton R.S. Role of disulfide bridges in the folding, structure and biological activity of omega-conotoxin GVIA. Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1434. P. 177-190.

80. Rivier J., Galyean R., Gray W.R., Azimi-Zonooz A., Mcintosh J.M., Cruz L.J., Olivera B.M. Neuronal calcium channel inhibitors. Synthesis of omega-conotoxin GVIA and effects on 45Ca uptake by synaptosomes. J.Biol.Chem. 1987. V. 262. P. 1194-1198.

81. Nishiuchi Y., Kumagaye K., Noda Y., Watanabe T.X., Sakakibara S. Synthesis and secondary-structure determination of omega-conotoxin GVIA: a 27-peptide with three intramolecular disulfide bonds. Biopolymers. 1986. V. 25. P. 61-68.

82. Flinn J.P., Murphy R. Effect of buffer system on the refolding of synthetic co-conotoxin GVIA. Letters Pept. Sci. 1996. V. 3. P. 113-116.

83. Becker S., Liebe R., Gordon R.D. Synthesis and characterization of an N-terminal-specific 1251-photoaffinity derivative of mu-Conotoxin GIIIA which binds to the voltage-dependent sodium channel. FEBS. 1990. V. 272. P. 152-154.

84. Kubo S., Chino N., Watanabe T.X., Kimura T., Sakakibara S. Solution synthesis of mu-conotoxin GIUB: optimization of the oxidative folding reaction. Pept. Res. 1993. V. 6. P.66-72.

85. Becker S., Atherton E., Gordon R.D. Synthesis and characterization of mu-conotoxin Ilia. Eur.J.Biochem. 1989. V. 185. P. 79-84.

86. Ramilo C.A., Zafarala G.C., Nadasdi L., Hammerland L.G., Yoshikami D., Gray W.R., Kristipati R., Ramachandran J., Miljanich G., Olivera B.M., Cruz L.J. Novel alpha- and omega-conotoxins from Conus striatus venom. Biochemistry. 1992. V.31. P.9919-9926.

87. Nielsen K.J., Adams D.A., Alewood P.F., Lewis R.J., Thomas L., Schroeder T., Craik D.J. Effects of chirality at Tyrl3 on the structure-activity relationships of omega-conotoxins from Conus magus. Biochemistry. 1999. V.38. P.6741-6751.

88. Hopkins C., Grilley M., Miller C., Shon K-J., Cruz L.J., Gray W.R., Dykert J., Rivier J., Yoshikami D., Olivera B.M. A new family of Conus peptides targeted to the nicotinic acetylcholine receptor. J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.22361-22367.

89. Chung D., Gaur S., Bell J.R., Ramachandran J., Nadasdi L. Determination of disulfide bridge pattern in omega-conopeptides. Int.J.Peptide Protein Res. 1995. V.46. P.320-325.

90. Price-Carter M., Hull M.S., Goldenberg D.P. Roles of individual disulfide bonds in the stability and folding of an omega-conotoxin. Biochemistry. 1998. V.37. P.9851-9861.

91. Sasaki T., Kobayashi K., Kohno T., Sato K. Combinatorial synthesis of omega-conotoxin MVIIC analogues and their binding with N- and P/Q-type calcium channels. FEBS Letters. 2000. V.466. P.125-129.

92. Sasaki T., Feng Z-P., Scott R., Grigoriev N., Syed N.I., Fainzilber M., Sato K. Synthesis, bioactivity, and cloning of the L-type calcium channel blocker omega-conotoxin TxVII. Biochemistry. 1999. V.38. P. 12876-12884.

93. Newcomb R., Palma A., Fox J., Gaur S., Lau K., Chung D., Cong R., Bell J.R., Home B., Nadasdi L., Ramachandran J. SNX-325, a novel calcium antagonist from the spider Segestria florentina. Biochemistry. 1995. V.34. P.8341-8347.

94. Flinn J.P., Murphy R., Johns R.B., Kunze W.A.A., Angus J.A. Synthesis and biological characterisation of a series of iberiotoxin analogues. Int.J.Peptide Protein Res. 1995. V.45. P.320-325.

95. Lozanov V., Guarnaccia C., Patthy A., Foti S., Pongor S. Synthesis and cystine/cysteine-catalyzed oxidative folding of the amaranth alpha-amylase inhibitor. J.Peptide Res. 1997. V.50. P.65-72.

96. De Filippis V., Quarzago D., Vindigni A., Di Cera E., Fontana A. Synthesis and characterization of more potent analogues of hirudin fragment 1-47 containing non-natural amino acids. Biochemistry. 1998. V.37. P.13507-13515.

97. Houghten R.A., Ostresh J.M., Klipstein F.A. Chemical synthesis of an octadecapeptide with the biological and immunological properties of human heat-stable Escherichia coli enterotoxin. Eur.J.Biochem. 1984. V.145. P.157-162.

98. Daquinag A.C., Sato T., Koda H., Takao T., Fukuda M., Shimonishi Y., Tsukamoto T. A novel endogenous inhibitor of phenoloxidase from Musca domestica has a cystine motif commonly found in snail and spider toxins. Biochemistry. 1999. V.38. P.2179-2188.

99. Daly N.L., Love S., Alewood P.F., Craik D.J. Chemical synthesis and folding pathways of large cyclic polypeptides: studies of the cystine knot polypeptide kalataBl. Biochemistry. 1999. V.38. P.10606-10614.

100. Dawson N.F., Craik D.J., McManus A.M., Dashper S.G., Reynolds E.C., Tregear G.W., Otvos L., Wade J.D. Chemical synthesis, characterization and activity of RK-1, a novel alpha-defensin-related peptide. J. Peptide Sci. 2000. V.6. P.19-25.

101. Yang Y-S., Mitta G., Chavanieu A., Calas B., Sanchez J.F., Roch P., Aumelas A. Solution structure and activity of the synthetic four-disulfide bond Mediterranean mussel defensin (MGD-1). Biochemistry. 2000. V.39. P. 1443614447.

102. Hackeng T.M., Fernandez J.A., Dawson P.E., Kent S.B.H., Griffin J.H. Chemical synthesis and spontaneous folding of a multidomain protein: anticoagulant microprotein S. PNAS. 2000. V.97. P.14074-14078.

103. Hackeng T.M., Mounier C.M., Bon C., Dawson P.E., Griffin J.H., Kent S.B.H. Total chemical synthesis of enzymatically active human type II secretory phospholipase A2. PNAS. 1997. V.94. P.7845-7850.

104. Li C.H., Yamashiro D., Hammonds R.G., Westphal M. Synthetic insulin-like growth factor II. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V.127. P.420-424.

105. Diaugustine R.P., Henry R., Sewall C.H., Suarez-Quian C.A., Walker M.P. Synthesis and properties of an EGF-like domain (residues 361-406) in the extreme N-terminal region of the mouse EGF precursor. Growth Factors. 1999. V.17. P.37-48.

106. Takenouchi T., Kadosaka M., Shin S.Y., Munekata E. Chemical synthesis and biological activities of the EGF-like domain of mouse schwannoma-derived growth factor (SDGF). Int. J. Peptide Protein Res. 1995. V.46. P.391-396.

107. Yamashiro D., Li C.H. Chemical synthesis of insulin-like growth factor II. Int. J.Peptide Protein Res. 1985. V.26. P.299-304.

108. Shin S.Y., Shimizu M., Ohtaki T., Munekata E. Synthesis and biological activity of N-terminal-truncated derivatives of human epidermal growth factor (h-EGF). Peptides. 1995. V.16. P.205-210.

109. Shon K-J., Hasson A., Spira M.E., Cruz L.J., Gray W.R., Olivera B.M. Delta-conotoxin GmVIA, a novel peptide from the venom of Conus gloriamaris. Biochemistry. 1994. V.33. P.l 1420-11425.

110. Mcintosh J.M., Hasson A., Spira M.E., Gray W.R., Li W., Marsh M., Hillyard D.R., Olivera B.M. A new family of conotoxins that blocks voltage-gated sodium channels. J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.16796-16802.

111. Pennington M.W., Festin S.M., Maccecchini M.L., Kem W.R. Synthesis and characterization of a disulfide bond isomer of omega-conotoxin GVIA. Toxicon. 1992. V.30. P.155-164.

112. Shon K-J., Stocker M., Terlau H., Stuhmer W., Jacobsen R., Walker C., Grilley M., Watkins M., Hillyard D.R., Gray W.R., Olivera B.M. kappa-Conotoxin PVILA is a peptide inhibiting the shaker K+ channel. J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.33-38.

113. Kellenberger C., Hietter H., Luu B. Regioselective formation of the three disulfide bonds of a 35-residue insect peptide. Peptide Res. 1995. V.8. P.321-327.

114. Husbyn M., Orning L., Sakariassen K.S., Fischer P.M. Peptides corresponding to the second epidermal growth factor-like domain of human blood coagulation factor VII: synthesis, folding and biological activity. J.Peptide Res. 1997. V.50. P.475-482.

115. Hackeng T.M., Dawson P.E., Kent S.B.H., Griffin J.H. Chemical synthesis of human protein S thrombin-sensitive module and first epidermal growth factor module. Biopolymers. 1998. V.46. P.53-63.

116. Escher S.E., Sticht H., Forssmann W.G., Rosch P., Adermann K. Synthesis and characterization of the human CC chemokine HCC-2. J.Peptide Res. 1999. V.54. P.505-513.

117. Maruyama K., Nagasawa H., Isogai A., Tamura S., Ishizaki H., Suzuki A. Synthesis of bombyxin-IV, an insulin-like heterodimeric peptide from the silkworm, Bombyx mori. Peptides. 1990. V.ll. P. 169-171.

118. Nagata K., Maruyama K., Nagasawa H., Urushibata I., Isogai A., Ishizaki H., Suzuki A. Bombyxin-II and its disulfide bond isomers: synthesis and activity. Peptides. 1992. V.13. P.653-662.

119. Bullesbach E.E., Schwabe C. Total synthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phase peptide synthesis and site-directed chain combination. J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.10754-10761.

120. Bullesbach E.E., Steinetz B.G., Schwabe C. Chemical synthesis of a Zwitterhormon, insulaxin, and of a relaxin-like bombyxin derivative. Biochemistry. 1996. V.35. P.9754-9760.

121. Sieber P., Kamber B., Hartmann A., Johl A., Riniker B., Rittel W. Total synthesis of human insulin. IV. Description of the final steps (author's transl) Helv. Chim. Acta. 1977. V.60. P.27-37.

122. Bullesbach E.E., Schwabe C. Synthesis and conformational analysis of the insulin-like 4 gene product. J.Peptide Res. 2001. V.57. P.77-83.

123. Nagasawa H., Maruyama K., Sato B., Hietter H., Kataoka H., Isogai A., Tamura S., Ishizaki H., Semba T., Suzuki A. // In: Shiba T., Sakakibara S., eds. Peptide Chemistry 1987. Osaka: Protein Reserch Foundation; 1988. P.123-126.

124. Utkin Yu., Zhmak M., Methfessel C., Tsetlin V. Aromatic substitutions in alpha-conotoxin Iml. Synthesis of iodinated photoactivatable derivative. Toxicon. 1999. V.37. P.1683-1695.

125. Utkin Yu., Kasheverov I., Davydov V., Krivoshein A., Zhmak M., Hucho F., Tsetlin V. Photoactivatable neurotoxin derivatives in the structural studies of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurochem. 1998. V.71(suppl.). P. S23.

126. Kasheverov I., Zhmak М., Rozhkova A., Utkin Yu., Tsetlin V. Photoactivatable analogues of a-conotoxins in the studies of nicotinic acetylcholine receptor. J.Neurochem. 1999. V.73(suppl.). P. S136D.

127. Cruz L.J., Gray W.R., Yoshikami D., Olivera B.M. Conus venoms: a rich source of neuroactive peptides. J. Toxicol.-Toxin Reviews. 1985. V. 4. P. 107132.

128. Olivera B.M., Rivier J., Scott J.K., Hillyard D.R., Cruz L.J. Conotoxins. J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.22067-22070.

129. Mcintosh J.M., Jones R.M. Cone venom—from accidental stings to deliberate injection. Toxicon. 2001. V.39. P. 1447-1451.

130. Pearson D.A., Blanchette M., Baker M.L., Guindon C.A. Trialkysilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 2739-2742.

131. Udenfriend S., Meienhofer J. //The Peptides. 1987. V. 9. P. 28.

132. Hashimoto, K., Uchida, S., Yoshida, H., Nishiuchi, Y., Sakakibara, S., Yukari, K. Structure-activity relations of conotoxins at the neuromuscular junction. Eur. J. Pharmacol. 1985. V.118. P.351-354.

133. Papineni, R. V. L., Sanchez, J. U., Baksi, K., Willcockson, I. U., and Pedersen, S. E. Site-specific charge interactions of alpha-conotoxin MI with the nicotinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem. 2001.V. 276. P.23589-23598.

134. Rogers, J. P., Luginbuhl, P., Pemberton, K., Harty, P., Wemmer, D. E., and Stevens, R. C. Structure-activity relationships in a peptidic alpha7 nicotinic acetylcholine receptor antagonist. J. Mol. Biol. 2000. V.304. P.911-926.

135. Utkin, Yu.N., Kobayashi, Y., Hucho, F. & Tsetlin, V.I. Relationship between the binding sites for an alpha-conotoxin and snake venom neurotoxins in thenicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica. Toxicon.1994. V. 32. P.1153-1157.

136. Sugiyama, N., Marchot, P., Kawanishi, C., Osaka, H., Molles, B., Sine, S.M., Taylor, P. Residues at the subunit interfaces of the nicotinic acetylcholine receptor that contribute to alpha-conotoxin Ml binding. Mol. Pharmacol. 1998. V.53. P. 787-794.

137. Bren N., Sine S.M. Hydrophobic pairwise interactions stabilize alpha-conotoxin MI in the muscle acetylcholine receptor binding site. J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.12692-12700.

138. Sine S.M. Identification of equivalent residues in the gamma, delta, and epsilon subunits of the nicotinic receptor that contribute to alpha-bungarotoxin binding. J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 23521-23527.

139. Переплет изготовлен в издательстве АО "Диалог-МГУ. ЛР № 063999 от 04.04.95 г. Тел. 928-2227, 928-1042. Факс 924-3384. 101000, Москва, ул.Мясницкая д.40 стр.6, офис 609