Синтез магнитовосприимчивых полимерных дисперсий биомедицинского назначения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

РГ6 од

2 - ПИТ КУ

БУРЯКОВ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СИНТЕЗ МАПШТОВОСШ'ИИМЧИВЫХ

ПОЛИМЕРНЫХ ДИСПЕРСИЙ БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степепи кандидата химических наук

Работа выполнена в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В .Ломоносова и Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович, доктор химических наук, профессор Грицкова Инесса Александровна.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Чалых Анатолий Евгеньевич, доктор химических наук, профессор Паписов Иван Михайлович.

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, Химический факультет.

Защита диссертации состоится « 0£ » июня 2000г. в на заседании диссертационного Совета Д 063.41.05 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, ул. М.Пироговская, д. 1. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке академии по адресу:

Москва, ул. М.Пироговская, д. 1. Отзывы на автореферат можно направлять по адресу:

117571, Москва, пр. Вернадского, 86, МГАТХТ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «2?» апреля 2000г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы определяется необходимостью создания магнитовосприимчивых полимерных микроносителей биолигандов для использования в биохимии, биологии, биотехнологии, медицине и экологически чистых химических производствах. Магнитовосприимчивые полимерные микроносители позволяют успешно проводить выделение, очистку и концентрирование различных биологически активных соединений, получать вещества с высокой степенью чистоты и сохранением нативных свойств, решать задачи иммобилизации клеток и ферментов, а также существенно упрощать операции выделения биополимеров при значительном сокращении времени этих процессов.

Цель работы: Синтез полимерных дисперсий, обладающих суперпарамагнитными свойствами, доступных в широком диапазоне диаметров частиц и характеризующихся относительно узким распределением по размерам,

Научная новизна:

• Предложен новый подход к синтезу магнитонаполненных полимерных дисперсий в присутствии олигомерных веществ, выполняющих одновременно роль инициаторов полимеризации и стабилизаторов полимерной дисперсии. Определены условия регулирования распределения частиц по размерам и распределения магнитного наполнителя по объему частиц.

• Показано, что при полимеризации виниловых мономеров в присутствии магнитного наполнителя, устойчивость реакционной системы и однородное распределение магнитного наполнителя по объему частиц достигается только при использовании предварительно полученного, агрегативно- и седиментационно-устойчивого, коллоидного раствора магнитного наполнителя в мономере или смеси мономеров.

• Синтезированы магнитовосприимчивые полимерные композиционные микросферы с диаметрами частиц в интервале 0.5 - 8 мкм, содержащие флуоресцентный краситель во внешнем полимерном, немагнитном слое и функциональные карбоксильные, диметиламино- и эпоксидные группы на поверхности.

• Впервые методом анионной полимеризации получены полиакролеиновые дисперсии со строением магнитное ядро - полимерная оболочка и узким распределением частиц по размерам.

• Предложены пути регулирования пористости частиц магнитовосприимчивых полимерных дисперсий.

Практическая значимость:

Разработан магнитовосприимчивый полимерный носитель для культивирования клеток тканей животных и человека.

Созданы магнитовосприимчивыс полимерные дисперсии для использования в процессах магнитной сепарации.

Функциональные полимерные дисперсии с размерами частиц до 0.15 мкм и узким распределением прошли клинические испытания на фирме "Bayer AG" в качестве носителей для приготовления диагностических средств, применяемых в реакциях псевдогомогенного иммуноанализа.

Автор защищает:

• Способы синтеза магнитовосприимчивых полимерных дисперсий с размерами частиц 0.04 - 0.5 мкм путем полимеризации и сополимеризации виниловых мономеров, условия получения дисперсий с высоким выходом наполненных частиц, и узким распределением по размерам.

• Метод получения магнитовосприимчивых полимерных дисперсий с размерами частиц 0.5 - 8.0 мкм, 90 - 300 мкм, концентрацией магнитного наполнителя 10 - 50% мае и однородным составом по наполнителю.

• Условия модификации магнитовосприимчивых полистирольных и полибутилметакрилатных микросфер различными функциональными мономерами в присутствии красителя или без него.

• Влияние природы и концентрации стабилизаторов на устойчивость и наполнение полимерных частиц магнетитом (РезОД

• Способ регулирования пористости частиц полимерных дисперсий.

• Способ получения частиц полиакролеиновых магнитовосприимчивых дисперсий со структурой ядро - оболочка.

• Использование магнитовосприимчивых полимерных дисперсий в процессах магнитной сепарации.

Публикации и апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ и получено 5 авторских свидетельств на изобретения. Отдельные результаты работы докладывались на Российских конференциях

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, исходные вещества и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы; включает -fS" таблиц и ■ZO _ рисунков. Библиография содержит m наименовании.

Во ВВЕДЕНИИ дано обоснование актуальности работы и сформулирована ее

цель.

Глава I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР, в котором рассматриваются способы получения магнитовосприимчивых полимерных носителей и их применение в различных областях биохимии, биотехнологии и медицины.

Глава П ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Исходные вещества. Мономеры: стирол, винилтолуол, бутилметакрилат, метилметакрилат, акролеин очищали по стандартным методикам. Мономеры: этиленгликольдиметакрилат, диметиламиноэтилметакрилат, дивинилбензол (80%), глицидилметакрилат, метакриловую кислоту - использовали без дополнительной очистки. Инициаторы: дибензоилпероксид, дициклогексилпероксидикарбонат; стабилизаторы: поливиниловый спирт с молекулярными массами 72.000., 100.000., 124.000- 186.000; поливинилпирролидон с молекулярными массами 20.000. и 360.000., эмульгаторы: додецилсульфат натрия, оксиэтилированный спирт С-40, олеат калия 40%, ундециленовую кислоту использовали марок "analytical grade" и "research grade".

Реактивы: персульфат аммония, гидроксид калия, аммиак водный, сульфат железа(П), хлорид железа(Ш), использовали марок "чда"

Растворители: ацетон, толуол, гексан, применяли марки "чда". Инициаторы-стабилизаторы, пероксиполиэтиленгликоль-9 и олигомер ВАГ, красители и др. использовали без дополнительной очистки. Вода - дистиллят

Методы исследования.

Магнитовосприимчивые полимерные дисперсии получали в стеклянном реакторе ёмкостью 0.5 л, снабжённым теплообменной рубашкой, вводом для механической мешалки с регулируемым числом оборотов и системой для продувки инертного газа (азота, аргона). Полимеризацию проводили при температурах: 0-80(±0.5)°С и скоростях вращения вала: 120-2000 об/мин.

Кинетику полимеризации изучали гравиметрическим и дилатометрическим методами.

Размеры частиц магнитовосприимчивых полимерных дисперсий определяли методами просвечивающей электронной микроскопии на приборе "JEOL-120M" (Япония) и сканирующей электронной микроскопии на приборе "Hitachi S-570 " (Япония), с помощью субмикронного анализатора частиц "Coulter N4 МО"(Франция).

Концентрацию водных растворов акролеина, его олигомеров определяли с использованием спектрофотометра "Beckman DU-70" (Германия).

Осаждение, разделение, очистку и фракционирование магнетита и частиц магнитовосприимчивых полимерных дисперсий проводили методом магиитофореза в поле постоянного SmCo магнита с напряженностью порядка 5.5 кЭ.

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Проблема суспензионного культивирования клеток предполагает создание прогрессивного аппарата культивирования, поскольку существующие технические решения не в полном объеме удовлетворяют требованиям, предъявляемым к процессу выращивания клеток. Как правило, это относится к созданию "щадящего" гидродинамического режима и высокой концентрации поверхностно-зависимой культуры. Одним из перспективных технических решений в настоящее время является создание культиватора, суспензионные носители которого перемешивались бы при помощи внешнего магнитного поля, что позволило бы проводить процесс культивирования клеток в условиях "мягкого" гидродинамического режима, слабо травмирующего клетки.

Высокая концентрация получаемой культуры достигалась бы за счёт обширной поверхности субстрата.

В этом случае к суспензионным носителям для культивирования клеток предъявляются следующие требования: химическая инертность материала по отношению к клеткам, среде и продуктам клеточного метаболизма, термостойкость в условиях

стерилизации, соизмеримость плотности микроносителя с плотностью среды, диаметр частиц в диапазоне 100 - 250 мкм, стабильность при проведении обычных цитологических процедур. Кроме того, дополнительным требованием к магнитным носителям является лёгкость управления магнитными полями, с напряжённостями порядка 3-4 кЭ, широко применяемыми в технике.

Синтез полимерного магнитовосприимчивого микроносителя проводили методом полимеризации мономера в суспензии, в которой органической фазой являлся коллоидный раствор магнетита (РезОд) в стироле или винилтолуоле.

Было показано, что полимеризация стирола (винилтолуола) в среде устойчивой к разделению фаз дисперсии магнетита в мономере существенно отличается от полимеризации мономера в присутствии магнитного наполнителя, диспергированного в водной среде. Полимерно-мономерные частицы в первом случае образуются из капель наполненной магнетитом мономерной фазы, а во втором - из капель мономера. Наполнение магнетитом капель мономера имеет случайный характер, поскольку осуществляется посредством захвата частиц наполнителя растущими полимерно-моиомерными частицами. Это не позволяет получать частицы с заданными свойствами, так как магнетит является гидрофильным материалом и включение его в полистирольную матрицу затруднительно. По этой причине, невозможно получать частицы с одинаковым содержанием наполнителя и одинаковой плотностью, так как не удаётся добиться равномерного распределения его по частицам.

С этой точки зрения коллоидный раствор высокодисперсного магнитного наполнителя с размерами частиц 30-150А в мономере (магнитная жидкость) является наиболее подходящим объектом для получения магнитного полимерного микроносителя, так как представляет собой среду, в которой достаточно равномерно распределен магнетит.

Основной проблемой получения магнитовосприимчивых полимерных микрочастиц, является создание устойчивой дисперсии магнитной жидкости с заданным размером капель и сравнительно узким распределением их по размерам. Вторым важным моментом следует считать сохранение стабильности дисперсии органической фазы в процессе полимеризации.

Синтез магнитовосприимчивых полимерных микроносителей с размерами частиц в интервале 100 - 250 мкм.

Суспензионная полимеризация является сложным процессом, зависящим от многих и, нередко, противоположно влияющих факторов. Параметры процесса,

влияющие на гидродинамический режим, отвечают за размер капель суспензии и распределение частиц по размерам и, частично, за форму частиц. Такими параметрами являются: объемное соотношение мономер/водная фаза, плотность и вязкость мономера и водной фазы, форма и размеры реактора, скорость вращения вала и форма мешалки, температура процесса. Поэтому для разработки методики проведения суспензионной полимеризации стирола или вншштолуола, содержащего высокодисперсный магнетит, использовали цилиндрический реактор, снабженный механической 6-ти лопастной одноярусной мешалкой. Объем реакционной смеси в реакторе не менялся во всех экспериментах и составлял 1/2 его рабочего объема, скорость вращения вала мешалки при суспензионной полимеризации составляла 120±10 об/мин.

Основная задача состояла в создании дисперсии капель магнитной жидкости с требуемыми размерами (100 - 250) мкм и поддержание стабильности системы от коалесценции, а затем и коагуляции в течение процесса полимеризации. Наиболее эффективными и изученными стабилизаторами частиц при суспензионной полимеризации являются высокомолекулярные поверхностно-активные вещества: поливиниловый спирт и поливинилпирролидон.

Сначала изучали полимеризацию мономера в системе, состоящей из водной фазы -раствора поливинилового спирта (ММ-72.000.), взятого в интервале концентраций 0.052.5% мае и инициатора- персульфата аммония, концентрацию которого изменяли в пределах 1.5-2.5% мае в расчете на мономер. Органическая фаза - коллоидный раствор магнетита в стироле (вшшлтолуоле) с добавками дивинилбензола, взятого в количестве 1-15% в расчете на объем основного мономера. Объемное соотношение фаз составляло 1/10. Полимеризацию проводили при температуре 50°С. Было установлено, что ПВС при концентрациях в интервале 0 05-0.5% мае в водной фазе слабо влиял на дисперсный состав исходной системы, кроме того, ПВС, в указанном интервале концентраций, не в состоянии обеспечить стабильность системы, вследствие чего она была склонна к коагуляции. Повышение концентрации Г1ВС от 0.5 до 1% в водной фазе приводит к появлению фракции полимерных микрочастиц с размерами меньшими, чем требовалось. Размеры конечной дисперсии лежали в пределах 50-600 мкм, против 240-3100 мкм в предыдущем случае. Использование ПВС в более высоких концентрациях (1-2% мае) приводило к существенному расширению распределения частиц по размерам (1-400 мкм). При дальнейшем увеличении концентрации ПВС наблюдалось резкое возрастание количества частиц с размерами менее 50 мкм.

Замена ПВС другим высокомолекулярным стабилизатором поливинилпирролидоном (ПВП), приводила к описанным выше результатам.

Таким образом, исследованные высокомолекулярные ПАВ - ПВС (72.000.) и ПВП (20.000.) не обеспечивали необходимой стабильности суспензии и не позволяли формировать суспензию требуемого дисперсного состава.

В присутствии низкомолекулярных • ПАВ различной природы были получены полимерные дисперсии с заданными размерами частиц, однако их концентрация была низкой. Так, в присутствии неионного ПАВ оксиэтилированного спирта С-40, были получены частицы с размерами в интервале 100-200 мкм, концентрация которых не превышала 40%. В этих суспензиях всегда присутствовала фракция мелких частиц, причем их присутствие фиксировали уже при концентрации С-40 равной 0.5% в водной фазе. Кроме того, наблюдалось образование несферичных частиц, а при конверсиях около 45-50% (ТП^50"С) образовывался коагулюм.

В присутствии ионных эмульгаторов, например,- анионоактивного алкилсульфоната натрия Е-30, также были получены частицы в требуемом диапазоне размеров, но, как и в предыдущем случае, в количестве не более 50%.

Для всех исследованных низкомолекулярных ПАВ характерно то, что при повышении их концентрации в водной фазе сверх 2% мае наблюдается частичное или полное разрушение коллоидного раствора наполнителя с образованием, в том числе, "обращенно-стабилизированных" гидрофильных частиц магнетита. Это происходило вследствие адсорбции молекул ПАВ на поверхности ультрадисперсных частиц магнетита и перехода их в водную фазу. В результате конечная система практически не содержала полимерных микрокапсул с размерами более 10 мкм, имела широкое распределение частиц по размерам, а также высокий процент ненаполненных полимерных частиц с размерами в диапазоне 0.3-1.5 мкм.

Добавление цетилового спирта в качестве со-ПАВ также не привело к удовлетворительным результатам.

Положительные результаты удалось получить только в присутствии веществ, молекулы которых, с одной стороны, совместимы с органической фазой, обладают поверхностно-активными свойствами, а с другой, взаимодействуя с магнетитом, являются инициатором полимеризации. В качестве такого вещества использовали полиэтиленгликольдитретбутоксипиромеллитат (ППЭГ-9), общей формулы:

о

о

о

о

н—о--

о-

•с—о

.С-О-(СН,СНгО),

-С-ОН

-О

О О

О О

О О

о о

я

я

я

о

п=2-5, ММ-1500-5000

Результаты первых экспериментов показали, что с помощью ППЭГ-9 удается эффективно диспергировать стирольную магнитную жидкость. Кроме того, наличие пероксидных групп ведет к аутоинициированию реакции полимеризации в мономерной фазе за счет протекания окислительно-восстановительной реакции. Однако, количество П11ЭГ-9, позволяющее добиться эффективного диспергирования, существенно превосходит известные концентрации, при которых образуются суспензии или эмульсии мономера в воде. Это явление можно объяснить образованием химических связей между фрагментами пиромеллитовой кислоты молекул стабилизатора-инициатора и ионами железа Ге(11),(Ш) кристаллической решетки поверхности наночастиц магнетита. Это должно приводить к модификации поверхности магнетита и может вызывать структурообразование в магнитной жидкости за счет взаимодействия одной молекулы стабилизатора- инициатора, имеющего относительно крупную молекулу(1.500. - 3.750.) с несколькими частицами магнетита, размер которых лежит в пределах 30-150 А. Вследствие этого часть молекул ППЭГ-9, по-видимому, лишается возможности выхода на границу раздела фаз магнитная жидкость - вода и блокируется внутри капель мономерной фазы, не принимая участия в диспергировании системы, и поддержании стабильности образовавшейся дисперсии.

Структурообразование может существенно менять так же и реологические свойства мономерной фазы, особенно при высоких концентрациях магнетита, когда поведение магнитной жидкости уже далеко от поведения ньютоновских жидкостей (магнитная жидкость проявляет свойства псевдопластической жидкости). При этом возможно образование кластеров, состоящих из частиц магнетита, молекул инициатора-стабилизатора и мономера.

С точки зрения чистоты конечной системы, необходимой для культивирования клеток, целесообразно было бы ограничиться использованием одного вещества, ППЭГ-9, однако оно не обеспечивает устойчивости системы и в процессе полимеризации образуется коагулюм (20 - 30%). Для повышения устойчивости системы от коалесценции капель на начальных стадиях процесса и в процессе полимеризации добавляли низкомолекулярный анионоактивный эмульгатор, додецилсульфат натрия (ЯОЙ). При

малых концентрациях 0.05 - 0.5% мае в водной фазе получали устойчивую реакционную систему и БОБ не оказывал заметного влияния на дисперсный состав.

Исследование зависимости выхода полимера от времени показало, что с увеличением концентрации ППЭГ-9 скорость полимеризации растет. Так, при концентрации ГГПЭГ-9, равной 7.2% в расчете на мономер скорость полимеризации составляла 6% кон в/час, а при снижении концентрации ППЭГ-9 в 2 раза скорость полимеризации уменьшалась в 5.3 раза; при этом конечная конверсия тоже снижалась с 84% до 43%. Было установлено, что с увеличением температуры возрастает скорость полимеризации и конечная конверсия мономера. Например, при 50°С процесс проходил со скоростью 22% конв/час на линейном участке, завершался за 7 час при конечной степени превращения 92%. При температуре 20°С процесс полимеризации проходил с существенно более низкой скоростью 6% конв/час, через 24 часа максимальный выход полимера составлял 84%.

По результатам экспериментов установлено, что среднечисловой диаметр частиц возрастает с увеличением содержания магнитного наполнителя. Это, по-видимому, объясняется, с одной стороны, возрастанием плотности и поверхностного натяжения среды вследствие сольватации защитных оболочек магнетита, образованных олеиновой (ундециленовой) кислотой, и удержания ими значительной части дисперсионной среды. С другой, - образованием кластеров (ансамблей частиц магнитного наполнителя с молекулами стабилизатора- инициатора) в мономерной фазе. При этом, к трудностям суспензионного процесса, таким как поддержание седиментационной устойчивости системы практически только за счет механического воздействия- перемешивания, добавляются затруднения, связанные с диспергированием мономерной фазы, особенно при высоком содержании магнитного наполнителя (выше 30%). Известно, что для удобства управления магнитовосприимчивыми полимерными микросферами содержание магнетита желательно не менее 25% по массе частиц. Возникла необходимость провести поиск оптимальной концентрации магнетита и остальных компонентов системы, а также темпера-1уры процесса. Найдено, что параметром, эффективно влияющим на размеры и дисперсный состав магнитовосприимчивых полимерных микросфер, является массовое соотношение магнетита и инициатора-стабилизатора ППЭГ-9 (вследствие чрезвычайной сложности определения поверхностной концентрации ионов Ре(И) на частицах магнетита в дальнейшем использовали общее массовое соотношение С=Ре304/ППЭГ-9.

Было установлено, что среднечисловой диаметр ((!„) линейно зависит от Г . Наблюдавшиеся аномалии в распределении частиц по размерам в серии экспериментов, по-видимому, объясняются влиянием на распределение частиц по размерам массового соотношения количеств ионов Ре(П), доступных для подвижных сегментов молекул инициатора-стабилизатора, содержащих пиромеллитовую кислоту, с функциональными 1-бутилпероксидными группами.

Изучение зависимости степени полидисперсности (к) от Г (в интервале 0.5-4) показало снижение степени полидисперсности системы. Можно предположить, что в диапазоне 1.5-1.9 соотношения находится точка, соответствующая эквимолярному составу комплекса, образующегося вследствие химического взаимодействия (модификация поверхности магнетита) между ионами Ре(Ц), Бе(Ш) поверхности частиц магнетита, доступными для подвижных сегментов молекул инициатора- стабилизатора, содержащих пиромеллитовую кислоту с функциональными I- бутилпероксидными группами.

Наблюдаемое диспергирование мономерной фазы на капли с близкими размерами, возможно, происходит по границе раздела кластеров. Это означает, что в дисперсии магнетита в стироле (мономерной фазе) фактически образуется новая фаза с физико-химическими свойствами, отличными от свойств исходной магнитной жидкости. Она имеет собственную межфазную поверхность, а межкластерная среда отличается от исходной мономерной фазы. Следует отметить, что одновременно с формированием кластеров начинается процесс прививочной полимеризации к адсорбирующимся на поверхность магнетита молекулам ППЭГ-9. Полимеризация начинается, в этом случае, сначала внутри кластеров за счет радикальных окислительно-восстановительных реакций псроксидных групп инициатора-стабилизатора с ионами Ре(П) поверхности частиц магнитного наполнителя. Процессы адсорбции и полимеризации протекают с разными скоростями и, при температуре получения стирольной магнитной жидкости в присутствии ППЭГ-9 (0°С в течение 30 мин) существенного накопления полимера в среде не происходит. Кроме того, накопление полимера в этом случае должно происходить, прежде всего, внутри самих кластеров (ансамблей частиц магнетита с адсорбированными молекулами ППЭГ-9) и увеличивать различия в свойствах кластеров и окружающей мономерной фазы.

Размеры кластеров, вероятно, зависят от массового соотношения Рез04/ППЭГ-9. При высоких концентрациях инициатора-стабилизатора (7.2% мае в расчете на мономер) и малых концентрациях магнетита (3.5% мае в расчете на органическую фазу)

образуются частицы со среднечисловым диаметром 57 мкм, к=1.16. В ситуации, когда концентрация ППЭГ-9 равна 7.2% мае в расчете на мономер, а магнетита 52% мае в расчете на органическую фазу d„=396 мкм, степень полидисперсиости системы максимальна и составляет 1.19. По-видимому, в первом случае избыток ППЭГ-9 приводит к тому что поверхность частиц магнегита полностью "покрыта" адсорбированными молекулами инициатора-стабилизатора и кластеры либо вообще не образуются (расстояние между соседними частицами магнетита достаточно велико), либо имеют существенно меньшие размеры. Остающийся в свободном состоянии в мономерной фазе ППЭГ-9 выполняет свои "обычные" функции- диспергирования и стабилизации. Во втором случае практически весь инициатор-стабилизатор адсорбирован частицами магнетита, количество которых велико, а расстояния между ними малы. Тот факт, что увеличение концентрации ППЭГ9при сравнительно высоком содержании магнетита (f=1.67, f=2.91) приводит к снижению среднего диаметра частиц, что свидетельствует в пользу механизма диспергирования по границам раздела между кластерными образованиями.

Общая тенденция возрастания среднего диаметра частиц с увеличением содержания магнитного наполнителя в органической фазе всегда соблюдается. Некоторый сдвиг в сторону увеличения среднего диаметра частиц при соблюдении найденных массовых соотношений Рез04/ППЭГ-9, 1.67 и 2.91, наблюдаемый, против ожидаемого, при повышении концентраций магнетита и ППЭГ-9, может объясняться увеличением размеров кластеров при этих условиях как ответ на общее повышение содержания магнетита в магнитной жидкости.

Наилучшие результаты по снижению полидисперсности магнитовосприимчивых полимерных микросфер получены при массовом соотношении Рез04/ППЭГ-9= 1.67 и содержании магнетита в органической фазе, равном 12% мае. Степень полидисперсности в этом случае минимальна - 1.11, а средний диаметр частиц составляет 129 мкм. Определен диапазон массового соотношения РезОд/ППЭГ-Э от 0.8 до 3.8, в пределах которого получаются суспензии в заданном интервале размеров 100 - 250 мкм, которые могут использоваться для решения биотехнологических задач. Электронные микрофотографии образцов магнитовосприимчивых полимерных микросфср представлены на рис. 1.

I, . <* ( поверхностно-зависимых клеток зависит от

*> !

"] Известно, что прикрепление и пролиферация

^ топографических свойств поверхности частиц 1 носителя. Клетки предпочотают шероховатую

\

* поверхность частиц гладкой. По этой причине

' 1

* * необходимо было сформировать поверхность,

I

Г 1 удобную для клеток. Электронные микрофотографии

образцов свидетельствуют о том, что поверхность

В некоторых случаях образующиеся частицы

ЩЩ§т

^"ШРОДу'1' I

деформированы, иногда разрушены. Как правило, это

Рис.1.Сканирующая элект-

происходит при высоком содержании магнетита

ронная микрофотография Наличие дефектных частиц можно объяснить образца магнитовоспрним- следующими причинами. Полимеризация начинается в

чивого полнетиролышго

микроносителя для суспен- областях с повышенным содержанием радикалов, и

знойного культивирования можст прохекать по типу ш . полимеризации.

где концентрации обоих компонентов окислительно-восстановительной реакции выше, чем в окружающей среде. Полимер образуется локально-неоднородно, преимущественно в областях с повышенным содержанием частиц магнетита. Формируются пористые структуры с локальными напряжениями. Области с механическими перенапряжениями возникают прежде всего в кластерах, следствием чего могут являться разломы, проходящие преимущественно по поверхностям частиц магнетита по причине значительного различия в прочностных свойствах магнегита и полимера. Повышение температуры процесса до 50°С также приводит к образованию пористых частиц, хотя пористость их поверхности ниже, чем у частиц, полученных при 20°С и содержании магнетита 30-50% (но массе частиц). Повышение температуры полимеризации выше 55°С приводило, как правило, к потере стабильности системы и к коагуляции.

Найдены условия регулирования пористости путем изменения температуры полимеризации в интервале 20-50°С, а также путем изменения концентрации сшивающего агента - дивинилбензола в интервале 2-7% объема в расчете на мономер. Высокопористые частицы были получены при концентрациях ДВБ в интервале 5-7% объема в расчете на мономер.

клеток.

Подобная ситуация может наблюдаться в кластерах,

) ■

.'ГП

„Л

Таким образом, условия получения магнитовосприимчивых полимерных

микроносителей, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к микроносителям для культивирования клеток следующие: температура полимеризации в интервале 25-50°С, массовое соотношении Ре304Л1ПЭГ-9 в интервале 0.8-3.8 при содержании магнитного наполнителя не более 36% по массе частиц.

Синтез магнитовосприимчивых полимерных микросфер с размерами в интервале 0.5 - 8 мкм.

К магнитовосприимчивым полимерным микросферам с размерами в интервале 0.5 - 8 мкм для магнитной сепарации различных биолигандов тоже предъявляются достаточно жесткие требования: отсутствие остаточной

намагниченности(суперпарамагнитные свойства), легкость управления магнитными полями, широко применяемыми в технике (с напряженностями порядка 3-4 кЭ); устойчивость к нагреванию при 95°С не менее 10 мин, устойчивость к наличию в среде малых количеств хлороформа, фенола, отсутствие деструкции при значениях рН среды 8-10 и достаточная однородность по размерам

Обеспечение суперпарамагнитных свойств является основной задачей при синтезе, поскольку при многократных операциях намагничивания частицы носителя не должны собираться в ассоциаты вследствие остаточной намагниченности.

Имеющиеся в настоящее время способы получения магнитных полимерных микроносителей представлены исключительно в патентной литературе и описывают 5 способов синтеза. Два способа направлены в основном на решение задачи получения частиц с узким распределением по размерам, два - ориентированы на повышение содержания магнитного наполнителя в частицах и один - на равномерность распределения наполнителя по частицам.

Рис.2. Сканирующая электронная микрофотография поверхности магпитовосприим-чивого поливинилтолуольного микроносителя.

Предварительные исследования показали, что наиболее эффективно диспергирование мономерной фазы происходило при скорости вращения вала мешалки 1600 об/мин. Процесс проводили при объемном соотношении фаз равном 1/11. Исходную систему готовили в течение 1 часа при 0°С.

Было отмечено существенное влияние на дисперсный состав природы высокомолекулярного ПАВ. Наиболее эффективными в качестве стабилизаторов оказались ПВС (ММ 100.000. и 86-89% гидролизованных групп), ПВС (ММ 124.000 -186.000., 87-89% гидролизованных групп), а также ПВП (ММ 360.000.) Размеры частиц, полученных в их присутствии, составляли 2-14 мкм и 0.4-2.6 мкм соответственно.

Полимеризацию инициировали маслорастворимыми инициаторами дибензоилпероксидом (ВР) и дициклогексилпероксидикарбонатом (СНРС), концентрацию которых изменяли в интервале 2-5% мае в расчете на мономер. Полимеризация протекала и при температурах в интервале 0-20°С. Было установлено, что при 0°С скорость полимеризации при инициировании дибензоилпероксидом составляла 0.15-0.3 % час, СНРС 0.9-1.6% час. Полимеризация с использованием РВ при температурах 20-40°С протекала со скоростью 1.2-1.5% конв/час и до конверсий порядка 60-70%, после чего, выход полимера практически не изменялся. Повышение температуры процесса до 70°С ускоряло полимеризацию, однако становилось затруднительно получать полимерные дисперсии с наполнением выше 16% мае магнетита в расчете на микросферы, поскольку падала стабильность системы. Использование более эффективного инициатора СНРС позволило снизить температуру полимеризации и проводить процесс в интервале 30-50°С. Полимеризация завершалась на конверсиях 7696.8% в течение 15-24 часов.

В исследованном интервале концентраций инициатора 2-5% мае в расчете на мономер не было отмечено существенного влияния повышения концентрации на скорость полимеризации.

Влияние изменения массового соотношения магнетит/инициатор (0 в интервале значений 3-12.6 на размеры наполненных полимерных микросфер и дисперсный состав не наблюдалось.

Изменение массового соотношения Г отражалось на скорости' полимеризации в начальный период (до конверсий 40- 50%), скорость составляла от 0.5 до 1% конв/мин. Возрастание £ приводило в общем случае к некоторому ускорению полимеризации. Поскольку увеличение этого параметра отражает повышение концентрации ионов Ре(П)

кристаллической решетки магнетита, то это может приводить к возрастанию скорости инициирования в окислительно-восстановительной реакции инициирования.

Проведенные исследования позволили выбрать для дальнейшего использования магнитные жидкости с характеристиками, приведенными в таблице 1

Таблица 1.

Состав магнитных жидкостей, использованных для полимеризации.

Среда Концентрация РезО4, %мас

Стирол 48

Винилтолуол 52

Бутилметактилат/метилметакрилат: 3/2 30

Получаемые наполненные полимерные дисперсии имеют достаточно широкое распределение частиц по размерам.

Таким образом, в результате оптимизации исходных систем и условий полимеризации были разработаны магнитовосприимчивые полимерные дисперсии с удовлетворительным распределением частиц по размерам, не уступающие некоторым зарубежным коммерческим продуктам.

Магнитовосприимчивые полимерные композиционные микросферы с диаметрами частиц в интервале 0.5- 8 мкм, содержащие флуоресцентный краситель во внешнем полимерном немагнитном слое и функциональные карбоксильные, диметиламино- и эпоксидные группы на поверхности были получены методом затравочной полимеризации. В этом случае предварительно было изучено набухание частично-сшитых полистирольных (0.25% ДВБ в расчете на полимер) и полибутилметакрилатных (0.5% ДМЭГ в расчете на полимер) затравочных частиц. Набухание проводили смесями функциональных мономеров, содержащими маслорастворимые флуоресцентные красители (в интервале концентраций 0.05-3% мае в расчете на мономер или смесь мономеров). Кроме того, были найдены массовые соотношения частиц наполненных затравочных дисперсий и мономера (10/1 - 15/1), позволяющие исключить образование новых частиц. Исследование образцов полученных композиционных микросфер в поле зрения оптического микроскопа в ультрафиолетовом свете показывало интенсивную флуоресценцию их внешней оболочки.

полимерных микросфер в указанном диапазоне размеров имеет ряд характерных особенностей. Прежде всего, необходимо обеспечить полное инкапсулирование частиц наполнителя в полимер, для предотвращения взаимодействия магнетита с внешней средой (поверхность часгнц магнетита должна быть надежно экранирована слоем

Получение наполненных полимерных дисперсий с размерами частиц 0.04 - 0.5 мкм.

Синтез

магнитовосприимчивых

Рнс.З. Оптическая фотогра-

фия образца магнито- полимера) Предварительно было установлено, что

дисперсности, наблюдается полное или частичное разрушение коллоидного раствора магнетита в мономере с необратимой агрегацией частиц магнетита и формированием полидисперсной системы как по частицам магнетита, так и по мономеру (мицеллы, микрокапли, в том числе и содержащие отдельные частицы магнетита).

Использование ультразвука для диспергирования системы в присутствии высокомолекулярных стабилизаторов, ЛВС и 11В11, привело к образованию полидисперсной эмульсии магнитной жидкости с размерами капель 0.2-1.5 мкм, а также к частичному ее разрушению и появлению свободного мономера, как было описано ранее.

Наполненные магнетитом дисперсии были получены путем полимеризации мономера (стирол, метилметакрилат, бутилметакрилат и др.), предварительно набухшего в дисперсии водной магнитной жидкости, стабилизированной ионными ПАВ. Однако, в конечных системах присутствовали частицы "свободного" магнетита наряду с ненаполненными частицами полимерной дисперсии, причем количество как одних, так и других колебалось в пределах 15- 30%. Для дальнейшего использования подобные системы малопригодны, вследствие сложности и дороговизны разделения на фракции и очистки выделенных фракций, наполненных частиц.

И в этом случае оказались предпочтительны поверхностно-активные инициаторы пероксидного и гидропероксидного типа, дающие малоподвижные, достаточно гидрофобные радикалы, например терполимер винилацетата, акриловой

восприимчивой полисти-рольной дисперсии, (1„=5.7 мкм.

использование ПАВ различной природы при концентрациях, необходимых для получения капель магнитной жидкости определенной

кислоты и винилацетиленового гидропероксида- ВАГ с молекулярной массой 5000 -6000, следующего массового состава:

Таблица 2.

Массовый состав сополимера ВАГ.

Иищиатор Винилацетат, % Акриловая кислота, % Винилацетиленовый гидропероксид, %

ВАШ 2.4 60 37.6

ВАПП 6.0 70 24.0

В его присутствии были получены магнитовосприимчивые полимерные дисперсии с размерами частиц в диапазоне 40-90 нм

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение инициаторов, подобных ВАГ, позволяет синтезировать магнитовосприимчивые полимерные носители на основе гидрофобных и слабополярных мономеров с высоким выходом наполненных частиц.

В целях оптимизации процесса полимеризации и свойств конечной дисперсии было изучено влияние массового соотношения компонентов системы и найден оптимум, при котором выход магнитовосприимчивых полимерных микроносителей близок к 100%.

Синтез магнитовосприимчивых полиакролеиновых микросфер.

Альдегидная группа является одной из наиболее удобных функциональных групп, позволяющих связывать белки по амнно - группе в одну стадию (реакция образования основания Шиффа).

Попытки синтеза полиакролеиновых наполненных микросфер с инициированием полимеризации по радикальному механизму ( Ре(П) - БгО/' и Ре(П) -НОО-ВАГ ) и коллоидного раствора магнетита в воде успеха не имели. Поэтому для получения полиакролеиновых наполненных микроносителей использовали дисперсионную анионную полимеризацию акролеина. Однако при использовании водной магнитной жидкости для наполнения содержание магнитовосприимчивых полимерных частиц не превышало 25%. Вероятно, это является следствием электростатических взаимодействий частиц магнетита и полиакролеиновых микросфер, заряженных одноименно, а также малого сродства к полимеру как самого магнетита, так и магнетита, содержащего на поверхности частиц адсорбированные ПАВ типа солей алифатических карбоновых кислот, алкилсульфонатов,

алкилсульфатов щелочных металлов (олеат калия, БББ, Е-30), или неионный эмульгатор С-40. Кроме того, полученные ненаполненные полиакролеиновые дисперсии неустойчивы к агрегации и коагулируют через некоторое время после получения.

Хорошие результаты были получены при использовании в качестве стерического стабилизатора химически модифицированного ВАГ (ВАГ растворяли в 0,Ш щелочи - КОН, которая являлась одновременно инициатором полимеризации). В результате реакции карбоксильные группы блоков акриловой кислоты ионизируются и происходит частичное омыление поливинилацетатных групп в блоках поливинилацетата. Получающийся водорастворимый полиэлектролит имеет сходство с полиакролеином, синтезированным при значениях рН порядка 11.

Следует отметить, что полученный полиэлектролит должен взаимодействовать с ионами Рс(П) и Рс(ГП) поверхности магнетита с образованием прочных связей, в том числе и хелатного типа. Это было косвенно подтверждено успешными экспериментами по получению устойчивой водной дисперсии РеяО.1 с использованием щелочного раствора ВАГ в качестве стабилизатора микрочастиц магнетита.

Полученный стабилизатор позволил синтезировать хорошо сформированные, наполненные, устойчивые к агрегации полиакролеиновые микросферы. Данные трансмиссионной электронной микроскопии подтверждают капсулирование микрочастиц магнетита полимером (рис. 4). Полученные микросферы имеют строение ядро - оболочка, как правило, с центральным расположением "зерна" или группы "зерен"магнетита

Правильное строение частиц дисперсии, по-видимому, можно объяснить протеканием матричной полимеризации акролеина на молекуле полианиона ВАГ. Высокое содержание магнитной фазы обусловлено, вероятно, взаимодействием ионизированных карбоксильных групп и, возможно, гидроксильных (омыленные поливинилацетатные звенья) с поверхностью микрочастиц магнетита по типу стабилизации частиц высокодисперсного магнетита в магнитных жидкостях анионами алифатических кислот (СП- С19). Один полианион может реагировать с несколькими микрочастицами магнетита. Только использование щелочного раствора ВАГ, в ряду исследованных стабилизаторов и эмульгаторов, приводит к формированию магнитовосприимчивых полимерных дисперсий. Уменьшение числа блоков гидропероксида в молекуле стабилизатора (ВАГП и ВАГШ) не сказывается на

результатах. Это может свидетельствовать об отсутствии вклада радикального механизма в процесс полимеризации.

Диаметром магнитовосприимчивых полимерных микросфер можно управлять меняя концентрации катализатора (щелочь) и стабилизатора (ВАГ). Исследование влияния изменения этих концентраций па среднечисловой диаметр микросфер показало, что повышение концентрации как стабилизатора, так и катализатора в системе вызывает уменьшение диаметров

образующихся микросфер.

Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен тем, что повышение концентрации сильного электролита (щелочи) и увеличение ионной силы раствора и, возможно, самого полиэлектролита, вызывает компактизацию молекул полиэлектролита, сворачивание в глобулы, причем тем меньшего диаметра, чем выше концентрация сильного электролита. Это, должно приводить к снижению вероятности взаимодействия нескольких микрочастиц магнетита с одной молекулой стабилизатора, уменьшению диаметров магнетит - полиэлектролитных комплексов с одновременным возрастанием их числа. Увеличение числа центров полимеризации в системе должно закономерно вызывать уменьшение диаметров частиц дисперсии с возрастанием их количества. Мономер при этом расходуется только на рост частиц в заранее сформированных центрах полимеризации. Это фактически подтверждается отсутствием "пустых" частиц в дисперсии.

Таким образом содержание наполнителя в микросферах можно изменять, используя заранее сформированные частицы магнетита определенных размеров.

Синтезированные магнитовоспринмчивые полиакролеиновые микросферы были проверены на пригодность для связывания с определенными зонами поверхности клеток, а также были использованы для магнитной сепарации клеток.

Рис. 4. Трансмиссионная электронная микрофотография образца магнитовосприим-чивого полиакролеинового латекса, с!„= 0.48 мкм.

Глава IV. ВЫВОДЫ.

1 На основе систематических исследований полимеризации виниловых мономеров предложен новый подход к синтезу магнитонаполненных полимерных дисперсий в присутствии олигомерных веществ, выполняющих одновременно роль инициаторов полимеризации и стабилизаторов полимерной дисперсии.

2 Показано, что для получения агрегативно-устойчивых наполненных полимерных дисперсий с одинаковым содержанием магнетита в частицах и равномерным распределением его внутри частиц необходимо предварительное приготовление агрегативно, седиментационно, и магнитофорстичсски устойчивой дисперсии магнитного наполнителя в мономере или смеси мономеров.

3 Определены условия синтеза и впервые получены полиакролеиновые дисперсии со строением магнитное ядро - полимерная оболочка и узким распределением частиц по размерам методом анионной полимеризации.

4 Разработан способ синтеза магнитовосприимчивых полимерных композиционных микросфер с диаметрами частиц в интервале 0.5 - 8 мкм, содержащих флуоресцентный краситель во внешнем полимерном немагнитном слое и функциональные карбоксильные, диметиламино- и эпоксидные группы на поверхности.

5 Получены магнитовосприимчивые полимерные носители для использования в процессах магнитной сепарации и культивирования клеток тканей животных и человека. ,

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Буряков А.Н., Грицкова И.А., Зубов В.П., Получение магнитных жидкостей на основе мономеров. IV Всесоюзная конференция по магнитным жидкостям. (Плесс, май 1985), Тезисы докладов, т.1, с.77-78.

2. Буряков А.Н., Лукин Ю.В., Туркин С.И., Применение магнитных жидкостей на основе воды для получения магнитных латексов. IV Всесоюзная конференция по магнитным жидкостям. (Плесс, май 1985), Тезисы докладов, т.1, с.75-76.

3. Буряков А.Н., Исследование методов синтеза магнитных латексов. Отчет НИИ Механики МГУ им. М.В. Ломоносова № 3174, М: 1985, с. 1-76.

4. Лукин Ю.В., Буряков А.Н., Егоров В.В., Туркин С.И., Зубов В.П., Грицкова И.А., Заиченко A.C., Воронов С.А., Пучин В.А. и Праведников А.Н., Способ получения магнитных латексов. A.c. СССР № 1290690, 1986.

5. Е.А. Марквичева, Ю.В. Лукин, А.Н. Буряков, P.A. Али-заде, С.Н. Подойницин, С.И. Туркин, Ю.А. Плявиньш, Культивирование клеток животных и человека на магнитных микроносителях. V Всесоюзная конференция по магнитным жидкостям. (Плесс, май 1988), Тезисы докладов, т. 2, с.4-5.

6. P.A. Али-заде, А.Н. Буряков, Ю.В. Лукин, В.П. Зубов, Исследование физических характеристик ультрадисперсных магнитных частиц. V Всесоюзная конференция по магнитным жидкостям. (Плесс, май 1988), Тезисы докладов, т. 1, с.4-5.

7. P.A. Али-заде, Ю.В. Лукин, М.М. Майоров, Ю.А. Плявиньш, А.Н. Буряков,

М.Э. Лаува, С.И. Туркин, Э.Я. Блум, В.П. Зубов, V Всесоюзная конференция по магнитным жидкостям. (Плесс, май 1988), Тезисы докладов, т. 1, с. 91-94.

8. Лукин Ю.В., Буряков АН., Зубов В.Г1., Способ получения магнитных латексов. A.c. СССР № 1654296, 1989.

9. Буряков АН., Лукин Ю.В., Туркин С.И., Грицкова И.А., Зубов В.П., Дончак В.А., Федорова В.А., Воронов С.А., Пучин В.А., Способ получения магнитонаполненных полимеров. A.c. СССР№ 1628478, 1989.

10. Буряков А.Н., Шихмурзаев Ю.Д., Способ местного травления изделий. A.c. СССР № 1516508, 1989.

11. С.Н. Подойницин, В.Н. Бахарев, ГО.В. Лукин, С.И. Туркин, И.А. Грицкова, В.П. Зубов, А.Н. Буряков, Высокоградиентная магнитная сепарация клеток, меченных магнитными латексными частицами. I. Осаждение меченых клеток. Биотехнология, 1989, т.5, с. 371 -375.

12. Бахарев В.Н., Буряков АН., ., Лукин Ю.В., Грицкова H.A., Зубов В.П. и Гусев С.А., Способ получения полиакролеиновых латексов., A.c. СССР № 1565846, 1990.

13. С В. Купцова, А.Н. Буряков, Е.А. Марквичева, Е.А. Варламова, Г.А. Вихорева, М.М. Бодоров, Л.Д. Румш., Новые магнитные полимерные носители для иммобилизации ферментов. 7-я Международная плесская конференция по магнитным жидкостям (Иваново, 1996), Тезисы докладов, с. 132-133.

14. В.В. Березкин, А.Н. Буряков, Д.Л. Загорский, А.Н. Нечаев, Т.В. Цыганова, Б.В. Мчедлншвили., Исследование структурно-селективных свойств трековых мембран методом растровой электронной микроскопии. Известия Академии Наук, серия физическая, 1998, т. 62, № 3, 528-532.

15. Генералова А.Н., Буряков А.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П., Турбидиметрические исследования реакции латексной агглютинации при определении 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Бноорган. химия, 2000, т. 26, № 6, с. 478 - 483

16. Е. Markvicheva, S. Kuptsova, A. Buryakov, Т. Dugina, S. Strukova, E. Varlamova, V. Babak and L. Rumsh, Proteases entrapped in polymer composite hydrogels : preparation methods applications// Int. conference Biocatalysis-2000 : Fundamentals and applications (Moscow, June, 2000), Abstracts (in press).

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР (МАГНИТОВОСПРИИМЧИВЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОНОСИТЕЛИ).

1.1. Магнитовосприимчивые носители - конструкция и пути синтеза. б

1.2. Магнитные жидкости, способы получения и свойства.

1.3. Методы синтеза высокодисперсных частиц металлов и жидкостей на их основе.

1.4. Получение магнитных жидкостей на основе магнетита.

1.5. Магнитовосприимчивые микросферы - способы получения и области применения.

1.6. Полимерные микроносители - возможности применения и пути синтеза.

1.6.1. Микроносители для культивирования клеток.

1.6.2. Суспензионная полимеризация как метод получения 31 полимерных микроносителей.

Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

II. 1. Исходные вещества.

11.2. Методы исследования.

11.3. Способы синтеза.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Синтез магнитовосприимчивых полимерных микроносителей с размерами частиц в интервале

100-250 мкм.

111.2. Синтез магнитовосприимчивых полимерных микросфер с размерами интервале 0.5-8 мкм.

111.3. Получение наполненных полимерных дисперсий с размерами частиц в диапазоне 0.04-0.5 мкм.

111.4. Синтез магнитовосприимчивых полиакролеиновых микросфер.

Глава IV. ВЫВОДЫ.

Магнитовосприимчивые микроносители, как одна из разновидностей магнитоуправляемых дисперсных систем, являются наиболее интенсивно развивающимися современными средствами для решения целого ряда задач, биомедицинской биотехнологии, микробиологии, иммунологии, клеточной биологии и медицины, паразитологии, биохимии и экологии.

Магнитовосприимчивые микроносители представляют собой частицы различных природных и синтетических материалов с размерами от 0.01 до 1000 мкм, содержащие высоко дисперсные частицы железа, кобальта, никеля, различных магнитных оксидов и других веществ, обладающих магнитными свойствами.

Такие микроносители используются в аппаратах для проведения ферментативных реакций, в качестве биоаффинных сорбентов для выделения различных биологически-активных веществ и клеточных органелл из смесей таких веществ и клеточных гомогенатов, для выделения клеток отдельных линий, культивирования клеток, в различных видах иммуноанализа, в качестве магнитных меток, для направленного транспорта лекарств в организме человека с помощью магнитного поля .

Метод магнитной сепарации с использованием магнитовосприимчивых дисперсных систем позволяет существенно упростить и ускорить процессы разделения ценных биологически-активных соединений по сравнению с различными вариантами колоночной хроматографии и другими методами. Кроме того, метод магнитной сепарации предоставляет возможность проводить некоторые операции, неосуществимые другими способами -например, позволяет освобождать кровь пациентов от поражённых клеток, возвращая её обратно без замены на донорскую.

Для большинства областей использования требуются микроносители с суперпарамагнитными свойствами, то есть практически не имеющие остаточной намагниченности частиц и несклонные образовывать ассоциаты частиц в отсутствие магнитного поля после хотя бы однократного намагничивания.

В зависимости от того, в какой из вышеперечисленных областей будет использована магнитовосприимчивая дисперсная система, требуется различный размер частиц дисперсной фазы.

Лёгкость управления частицами магнитовосприимчивых полимерных дисперсий магнитными полями зависит от степени наполнения частиц дисперсий магнитным материалом и его магнитных свойств. Учитывая, что в технике обычно используются магнитные поля с напряжённостями, как правило, 3-4 кЭ, применяются дисперсии с относительно высоким содержанием магнитного наполнителя (не менее 10% в расчёте на массу частиц).

Следует также отметить, что магнитовосприимчивые микроносители должны иметь возможно более узкое распределение частиц по размерам. Полидисперсность таких систем приводит к различным скоростям дрейфа частиц в магнитном поле, что накладывает серьёзные ограничения на использование их в вышеуказанных целях.

Таким образом, для применения магнитовосприимчивых полимерных дисперсий в различных тонких и наукоёмких технологиях необходимо располагать системами, доступными в широком диапазоне размеров частиц с узким распределением частиц по размерам и относительно высоким содержанием магнитного наполнителя.

Метод магнитной сепарации на магнитовосприимчивых полимерных микроносителях позволяет получать вещества с высокой степенью чистоты и сохранением нативных свойств.

Магнитовосприимчивые микроносители могут найти применение также для очистки сточных вод от промышленных загрязнений, в том числе слабозагрязненных вод (наиболее сложные и дорогостоящие операции в процессах очистки), для опреснения и обесщелачивания воды, кроме того, могут успешно конкурировать с традиционными сорбентами в технологиях различных процессов разделения.

Биотехнология, как отрасль материального производства, использует биологические процессы и системы для получения разнообразных продуктов. Методы биотехнологии могут в немалой степени ускорить и сам процесс создания новых продуктов, предназначенных для использования в медицине, сельском хозяйстве и других областях практической деятельности человека.

Одной из важнейших задач биотехнологии, особенно - биомедицинской биотехнологии, является выращивание культур клеток тканей животных и человека. Культивирование клеток данного типа довольно сложный и трудоемкий процесс. Рост культуры возможен лишь в условиях прикрепления клеток к какой-либо нетоксичной подложке - субстрату. Ранее для этого использовались плоскостенные фляги из органического или обычного стекла. При малых площадях прикрепления клеток и трудностях, связанных с обеспечением необходимого для нормальной жизнедеятельности клеток газо-и массообмена, эффективность процесса незначительна. Интенсификация газо- и массообмена за счет перемешивания среды в аппаратах роллерного типа, вращающихся бутылях, на эффективности процесса сказывается мало.

Метод культивирования на микроносителях вследствие существенного увеличения площади поверхности субстрата позволяет значительно повысить плотность клеток в данных объемах (до 108 кл/мл против 10б кл/мл) и добиться удовлетворительной эффективности процесса. Микроноситель представляет собой микрокапсулы природных или синтетических полимеров с размерами 90 - 350 мкм. Однако серьезные сложности возникают при перемешивании микроносителя с иммобилизованными (прикрепленными) на нем клетками. Частые столкновения частиц носителя приводят к повреждению клеточных мембран и даже их разрушению. Это вызывает гибель клеток и загрязняет среду продуктами разрушения. Замена лопастных перемешивающих устройств аэролифтом позволяет несколько снизить клеточный "травматизм", однако, 6 это нежелательное явление не устраняется. Клетки повреждаются самими газовыми пузырьками при их схлопывании в жидкой среде, а также возникает проблема гашения пены в культиваторе. Таким образом, сейчас сохраняется актуальность разработки способа культивирования в "щадящих" условиях и создание соответствующего аппарата.

Большой интерес представляют магнитовосприимчивые полимерные микрокапсулы, которые могут быть использованы в качестве носителя для суспензионного культивирования эукариотических клеток.

Основное преимущество магнитовосприимчивых полимерных микроносителей - возможность удержания и перемещения частиц с растущими на них клетками внешним магнитным полем без механического перемешивания среды.

Настоящая работа является частью работ по созданию новых полимерных дисперсных систем биомедицинского назначения, проводимых в лаборатории "Полимеры для биологии" ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и кафедре "Синтеза полимеров" МГАТХТ им. М.В. Ломоносова. Цель работы состоит в синтезе полимерных дисперсий, обладающих суперпарамагнитными свойствами, доступных в широком диапазоне диаметров частиц и характеризующихся относительно узким распределением по размерам.

Глава IV ВЫВОДЫ.

1 На основе систематических исследований полимеризации виниловых мономеров предложен новый подход к синтезу магнитонаполненных полимерных дисперсий в присутствии олигомерных веществ, выполняющих одновременно роль инициаторов полимеризации и стабилизаторов полимерной дисперсии.

2 Показано, что для получения агрегативно-устойчивых наполненных полимерных дисперсий с одинаковым содержанием магнетита в частицах и равномерным распределением его внутри частиц необходимо предварительное приготовление агрегативно, седиментационно, и магнитофоретически устойчивой дисперсии магнитного наполнителя в мономере или смеси мономеров.

3 Определены условия синтеза и впервые получены полиакролеиновые дисперсии со строением магнитное ядро - полимерная оболочка и узким распределением частиц по размерам методом анионной полимеризации.

4 Разработан способ синтеза магнитовосприимчивых полимерных композиционных микросфер с диаметрами частиц в интервале 0.5-8 мкм, содержащих флуоресцентный краситель во внешнем полимерном, немагнитном слое и функциональные карбоксильные, диметиламино- и эпоксидные группы на поверхности.

5 Получены магнитовосприимчивые полимерные носители для использования в процессах магнитной сепарации и культивирования клеток тканей животных и человека.

1. 1.o Safafik, Marika Safarikova, Review. Use of magnetic techniques for the isolation of cells.// Journal of Chromatography B, 1999, v. 722, p.33-53.

2. Hirschbein B.L., Whitesides G.M., Appl. Biochem., Biotechnol., 1982, v.7, №3, p.157-176.

3. Molday R.S., Yen S.P.S., Rembaum A., Nature (London), 1977, v.268, №4, p.437-438.

4. Instruments and Reagents for Magnetic Cell Sorting, Information Booklet Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany, 1999.

5. Guesdon J.L., Thierry R. & Avrameas S., Magnetic enzyme immunoassay for measuring human IgE.// J. Allergy clin. Immun., 1978, v.61, p.23-27.

6. Mary Meza, Application of magnetic particles in immunoassays., Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers edited by U.Hafeli et al.// Plenum Press, New York, 1997, p. 303-309.

7. Senyei A., Widder K., Czerlinski G., Magnetic guidance of drug-carrying misrospheres.// J. Appl. Phys., 1978, v.49, №6, p.3578-3583.

8. Cell Separation and and Protein Purification, Information Booklet, Dynal, Oslo, Norway, 1996.

9. Munro P.A., Dunnill P. & Lilly M.D., Nonporous magnetic materials as enzyme supports: studies with immobilized chymotrypsin.// Biotechnol. Bioeng,, 1977,v.19, p.101-124.

10. Вонсовский C.B., Магнетизм,- M.: Наука, 1971, 1032 с.

11. Mosbach К., Andersson L., Magnetic ferrofluids for preparation of magnetic polymers and their application in affinity chromatography.// Nature, 1977, v.27, №5634, p.259-261.

12. Hailing P.J., Dunnill P., Ensyme. Microbiol. Technol,, 1980, v.2, p.2

13. HershL.S., Clin. Chim. Acta, 1975, v.63, p.69-72.

14. Margel S. and Bamnolker H, Synthesis and use of new magnetic and non-magnetic, solid and hollow microspheres.// 1995, Patent pending (PCT, US 12988).

15. Andres U.T., Magnetic liquids.// Mater. Sei. Eng., 1976, v.26, №2, p.269-275.

16. Widder К., Fleuret G., Senyei A., Magnetic microspheres: synthesis of novel parenteral drug carrier.// J. Pharm. Sei., 1979, v.68, p.79-82.

17. Charles F. Driscoll, Robert M. Morris, Andrew E.Senyei, Kenneth J. Widder and Gerald S. Heller, Magnetic Targeting of Microspheres in Blood Flow.// Microvascular Res., 1984, v.27, p.353-369.

18. Kandzia J. et al., J. Immunol. Meth., 1984, v.75, p.31-41.

19. Molday R.S., Mackenzy D., Immunospecific ferromagnetic iron-dextrane reagents for the labeling and magnetic separation of cells.// J. Immunol. Meth., 1982, v.52, №3, p.353-367.

20. Kronic R.L., Campball G.L., Joseph K., Science, 1978, v.200, p.1074-1076.

21. Rembaum A., Yen S,P.S., Molday R.S., Synthesis and Reactions of Hydrophilic Functional Microspheres for Immunological Studies.// J. Macromol. Sei., 1979, A-13, №5, p.603-632.

22. S.P.S Yen, A. Rembaum, R.S. Molday, W.J. Dreyer, Emulsion Polymerization.// ACS Symposium Series, Washington, D.C., 1979, №24, p.236-257.

23. Бибик E.E., Автореферат докторской диссертации, ЛГИ им. Ленсовета, 1971.

24. Воюцкий С.С., Курс коллоидной химии, М„ Химия, 1975.

25. Elmore W.C., Phys. Rev., 1938, v.54, p.309.

26. Rosensweig R.E. et al., J. Coll. Sei., 1969, v.29, p.680.27