Синтез производных фосфонтиокарбоновых кислот и модифицированных нуклеотидов с потенциальной противовирусной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

МУРАБУЛДАЕВ АРСЕН МАУЛЕТЖАНОВИЧ

СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ ФОСФОНТИОКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОТИДОВ С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004 г.

Работа выполнена в Лаборатории синтеза физиологически-активных соединений Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии РАСХН,

в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Хохлов Петр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович

доктор химических наук, ст. н. с. Козлов Владимир Андреевич

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии" (ФГУП "ТосНИИОХТ")

Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М В. Ломоносова (119571, г. Москва, пр. Вернадского д. 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. М. Пироговская, д. 1.)

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета: К.Х.Н., СТ. Н. С.

А. И. Лютик

Актуальность работы.

В ряду фосфорорганических соединений важное место занимают фосфорилированные карбоновые кислоты и их производные. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты являются аналоговыми антиметаболитами пирофосфата. Они ингибируют активность фермента ДНК полимеразы, ответственной за репликацию генома вирусов. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты, а также ряд их производных являются высокоактивными ингибиторами репликации многих вирусов, в том числе вируса простого герпеса, цитомегаловируса, вирусов гепатита, инфекционного энцефалита, иммунодефицита.

Тринатриевая соль фосфонмуравьиной кислоты, препарат "фоскарнет", находит широкое применения при терапии болезней, вызываемых вирусом герпеса

Однако для терапии таких вирусных заболеваний, как ВИЧ, фосфонмуравьиную кислоту применяют в виде внутривенной инъекции. При этом она оказывает вредное воздействие на почки и другие внутренние органы. В связи с этим поиск новых менее токсичных биологически активных соединений в ряду производных фосфонкарбоновых кислот является важной и актуальной задачей.

Одним из перспективных направлений в снижении токсичности противовирусных фосфонкарбоновых кислот и пролонгирования терапевтического действия является введение атомов серы в молекулы этих соединений. Известно, что серусодержащие фосфорные соединения менее токсичны для теплокровных, в сравнении с их кислородными аналогами. В ходе метаболизма тиофосфонатов происходит обмен серы на кислород и можно ожидать, что в организме серусодержащие фосфонкарбоновые кислоты постепенно будут превращаться в их противовирусные кислородные аналоги.

В последние годы также показано, что конъюгаты модифицированных нуклеозидов с различными эфирами фосфонкарбоновых кислот в некоторых случаях обладают большей противовирусной активностью, чем исходные нуклеозиды.

В связи с этим, исследования в ряду серусодержащих фосфонкарбоновых кислот и конденсация с модифицированными нуклеозидами являются весьма актуальными.

Часть работы, которая касается синтеза модифицированных нуклеотидов была поддержана грантом МНТЦ (проект 1244 (1999-2001 г.).

■'ос национальная { библиотека | С.Петербург ,/Т, • О» ЩтЦ(/

нал]

ш

Цель работы Целью настоящей работы является поиск новых методов синтеза производных фосфонтиокарбоновых кислот, получение их нуклеозидных аналогов и синтез модифицированных нуклеотидов, обладающих противовирусной активностью.

Научная новизна работы. Впервые была изучена реакция тиолирования хлорметилфосфонатов, приводящая к образованию фосфонтиоформамидов, а также применение карбонилдиимидазола для введения серы в производные фосфонуксусной кислоты. Впервые синтезированы конъюгаты фосфонуксусной и фосфонтиоуксусной кислоты с ацикловиром. Синтезированы новые модифицированные 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты, которые представляют собой новый тип ингибиторов синтеза провирусной ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ.

Практическая ценность работы. Разработан препаративный метод синтеза новой фосфонтиоуксусной кислоты и в результате исследований проведенных в ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (г. Покров) и ВНИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург) было установлено вирусстатическое (ингибирующее) действие фосфонтиоуксусной кислоты на репродукцию возбудителя короновирусной инфекции у человека Был предложен удобный препаративный метод синтеза амидов дифенилфосфинилтиомуравьиной кислоты и диэтоксифосфорилтиомуравьиной кислоты.

Ситезирован новый, меченный биотином фосфонометильный аналог 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, который селективно узнается человеческими ДНК-полимеразами а и б и может быть использован для изучения этих ДНК-полимераз с помощью электронной микроскопии.

Защищаемые положения:

1. Синтез фосфонтиоуксусной кислоты, обладающей активностью против РНК-содержащих вирусов.

2. Реакция функционализации хлорметилзамещенных фосфорильных соединений серой в присутствии аминов

3. Синтез конъюгатов фосфонуксусной и фосфонтиоуксусной кислоты с ацикловиром. Применение карбониддиимидазола для введения серы в производные фосфонуксусной кислоты.

4. Синтез модифицированных 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов, как субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ нового типа и их устойчивость в пуповинной сыворотке крови человека.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1999 г.), на международном

симпозиуме «Текущие проблемы молекулярной генетики и микробиологии» (Москва, 2000 г.) и на 13-й Международной конференции по химии соединений фосфора (ICCPC-ХШ) (Санкт-Петербург, 2002 г.)

Публикации. По теме диссертации имеется 7 печатных работ, включая 1 европейский патент.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит^¿.рисунков, $ таблиц и состоит из введения, списка сокращений, шести глав, выводов, списка литературы включающего приложения.

Первая глава представляет собой литературный обзор, посвященный методам синтеза, химическим свойствам и практической значимости серусодержащих фосфонкарбоновых кислот. Вторая глава посвящена разработке новых методов синтеза производных фосфонтиокарбоновых кислот. В третьей главе обсуждены опыты по синтезу модифицированных нуклеотидов. Четвертая глава посвящена гидролизу модифицированных нуклеотидов в пуповинной сыворотке крови человека. В пятой главе рассмотрена биологическая активность синтезированных соединений. В тестой главе приведены экспериментальные данные по синтезу производных фосфонтиокарбоновых кислот и модифицированных нуклеотидов и общая методика определения времени гидролиза половинного количества модифицированных и природных нуклеотидов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Фосфонтиокарбоновые кислоты

Фосфонкарбоновые кислоты и их производные представляют интерес в качестве вирусстатических препаратов. Однако практическое применение ограничивается относительно высокой токсичностью и сравнительно коротким периодом действия. Для пролонгации терапевтического эффекта в их структуру вводят различные заместители. В литературе описаны некоторые серусодержащие производные фосфонкарбоновых кислот, обладающие антивирусной активностью, однако их количество ограничивается в основном соединениями, содержащими серу в фосфонильной группе. В тоже время противовирусная активность производных фосфонкарбоновых кислот, содержащих серу в карбоксильной

группе, оставалась неизученной. В настоящем исследовании основное внимание уделено синтезу производных фосфонтиокарбоновых кислот и их аналогов.

1.1. Синтез фосфонтноуксусной кислоты

В литературе фосфонтиоуксусная кислота неизвестна, однако можно предполагать, что замена атома кислорода на атом серы в карбонильной группе снизит раздражающее и токсическое действие фосфонкарбоновых кислот без потери их антивирусной активности.

Фосфонтиоуксусную кислоту синтезировали используя следующую схему: конденсацией триэтилфосфита с метиловым эфиром хлоруксусной кислоты, при 150°С, получали метиловый эфир диэтилфосфонуксусной кислоты (1) и последний под действием гидроксида калия в среде этилового спирта превращали в диэтилфосфонуксусную кислоту (2).

Далее диэтилфосфонуксусную кислоту (2) под действием ЭОСЬ превращали в хлорангидрид (3), а последний немедленно конденсировали с сероводородом. Реакцию проводили при охлаждении до 5-10°С и в результате получали диэтоксифосфорилтиоуксусную кислоту (4) с выходом 63 %.

Попытка гидролиза диэтоксифосфорилтиоуксусной кислоты (4) соляной кислотой привела к ее разложению. Поэтому этоксигруппы удаляли, обработав диэтоксифосфорилтиоуксусную кислоту трехкратным количеством триметилбромсилана с дальнейшим нагреванием с пятикратным количеством этилового спирта и в результате получали фосфонтиоуксусную кислоту (5) с выходом 60% в виде стеклообразной массы.

Строение полученной кислоты подтверждено данными л1Р ЯМР- 'Н ЯМР-спекгров, а также элементным анализом. Следует отметить, что в спектре 31Р-ЯМР фосфонтиоуксусной кислоты наблюдается синглет с хим. сдвигом 18,4; в то время как для фосфонуксусной кислоты характерным является сигнал 3,Р при 15,5 м.д. Соответственно, в 'Н-ЯМР-спектре фосфонтиоуксусной кислоты присутствует дублет при 3,18 м.д., а у фосфонуксусной кисло гы он сдвигается до 2,74 м.д., при этом константа 2,/яр изменяется незначительно.

1.2. Производные фосфонтиомуравьиной кислоты

1.2.1. Синтез фосфонтиомуравьиной кислоты.

Фосфонтиомуравьиная кислота известна только в виде эфиров. Нами изучались методы получения ее солей.

В качестве исходного соединения для синтеза фосфосфонтиомуравьиной кислоты использовали диэтиловый эфир фосфористой кислоты (6), который обрабатывали натрием, а затем карбонилсульфидом.

Гидролиз сложноэфирных групп проводили двумя способами. Первый заключался в щелочном гидролизе. Реакционную массу нагревали с раствором 10 N NaOH 1час.

В результате после очистки получали белый порошок, который после исследования с помощью 'Н и "РЯМР спектроскопии идентифицировали как фосфористую кислоту (7), из чего можно заключить, что целевой продукт разложился при гидролизе до фосфористой кислоты.

Второй способ заключался в силилировании сложноэфирных групп с образованием промежуточного триметилсилилового эфира и дальнейшей реакцией с метилатом натрия, но и в этом случае основным продуктом являлась фосфористая кислота.

Анализ этих данных позволяет сделать вывод, что целевой продукт возможно является нестабильным и быстро разлагается до фосфористой кислоты при комнатной температуре. Для создания более стабильных структур нами было решено синтезировать амиды эфиров фосфонтиомуравьиной кислоты.

1.2.2. Синтез амидов фосфонтиомуравьиной кислоты. функционализаиин хлорметильной группы при атоме фосфора.

Реакция

Известно, что хлорметильная группа в соединениях четырехкоординированного фосфора малоактивна по сравнению с хлорметильной группой в соответствующих карбонильных соединениях. Нами впервые проведена функционализация хлорметильного фрагмента при атоме фосфора серой в присутствии аминов.

В качестве модельного соединения был использован

дифенилхлорметилфосфиноксид, поскольку наличие ароматических заместителей позволяло следить за ходом реакции по ТСХ и получать стабильные кристаллические тиоамиды. Исходный дифенилхлорметилфосфиноксид (8) был получен известным способом по следующей схеме:

В результате выполненных исследований было показано, что для успешной функционализации хлорметильной группы в соединении (8) необходимо предварительно приготовить раствор серы и соответствующего амина в диметилформамиде, который сразу следует использовать в реакции

В результате с хорошими выходами были получены продукты (9-12) Таким образом, был предложен удобный препаративный метод синтеза амидов дифенилфосфинилтиомуравьиной кислоты

Разработанный нами подход был использован для синтеза целевого морфолида диэтоксифосфорилтиомуравьиной кислоты (15).

Исходный диэтилхлорметилфосфонат (14) синтезировали из дихлорангидрида хлорметилфосфоновой кислоты, кипячением последней, с трехкратным избытком этилового спирта в присутствии триэтиламина.

Дихлорангидрид хлорметилфосфоновой кислоты (13) получали по модифицированной нами схеме с использованием в качестве катализатора трихлорида бора и процесс проводили при температуре 250° С.

Структура и состав полученных соединений подтверждены данными 31Р, 'Н, "С ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии.

2. Синтез модифицированных нуклеотидов.

Представлялось целесообразным синтезировать конъюгаты фосфонтиокарбоновых и фосфонкарбоновых кислот с модифицироваяными нулеозидами, а также некоторые нуклеотиды, модифицированные, как по фосфатной, так и по углеводной части, как соединения потенциально превосходящие по противовирусной активности свои фосфонкарбоновые и нуклеозидные предшественники.

2.1. Нуклеозидные производные фосфонтиоуксусной кислоты.

Фосфонтиоуксусная кислота возможно является тиокарбоксианалогом природных пирофосфатов. Для поиска противовирусных соединений представлялось интересным изучение нуклеотидных производных фосфонтиоуксусной кислоты.

Известно, что одним из широко и эффективно используемых медицинских препаратов против болезней, вызываемых вирусами герпеса, в ряду производных нуклеозидов, является ацикловир (9-[(2-гидроксиэтилокси)метил]гуанин). Однако по отношению к нему быстро развивается резистентность вирусов.

Действие ацикловира основано на блокировании синтеза вирусной ДНК. Фосфокарбоновые кислоты имеют другой механизм действия на вирус, который заключается, по всей видимости, в том, что они ингибируют ДНК полимеразу. Создание химического соединения способного действовать на вирус используя оба эти механизма, на наш взгляд, позволит замедлить развитие резистентности к этому вирусстатику. В соответствии с этим нами проведены исследования по синтезу гуанинового производного фосфонтиоуксусной кислоты.

Синтез нуклеотидных производных проводили в 2 стадии. На 1 стадии получили гуаниновое производное фосфонуксусной кислоты, а на второй произвели замену кислорода в карбоксильной группе на серу, с помощью диимидазолилкарбоксилатного метода.

2.1.1 Синтез карбоксиметилфосфоната ацикловира.

В качестве исходного соединения использовали триэтилфосфоноацетат (16). Его обрабатывали избытком триметилбромсилана с образованием промежуточного триметилбромсилилового эфира, который затем гидролизовали водным пиридином. Далее реакционную смесь 2 раза упаривали с пиридином, снова растворяли в пиридине и вводили в

реакцию с ацикловиром (17) и 12 кратным избытком дициклогексилкарбодиимвда (БСС). Смесь перемешивали при комнатной температуре и продукт очищали на колонке с ДЕАЕ-Тоуореаг!. Получили амммонийную соль этоксикарбонилметилфосфонага ацикловира с выходом 76%.

ЕЮ „ 2 ОЕ1 ВО ОЯМе3

16

Ру + Н20

НО—I виа

°чЧ 11^0АС7 17 О ^ он ЕЮ ОН ОСС ЕЮ ОН

ОН" п О

>-сн2-р: но „в он

Далее щелочным гидролизом получили карбоксиметилфосфонат ацикловира (18), который после фильтрации через Бошех 50 (Г^НТ-форма) превращался в соответствующую аммонийную соль. После лиофилизации выход составил 86%.

2.1.2. Синтез тиокарбоксиметнлфосфоната ацикловира.

В качестве исходного соединения использовали карбоксиметилфосфонат ацикловира (18). Была получена его трибутиламмонийная соль, которую превратили в соответствующий имвдозолид реакцией с карбонилдиимидазолом в диметилформамиде (10 минут, 20°С) и после пропускания сухого сероводорода, получили целевой продукт (19) с выходом 84%.

Строение полученных соединений подтверждены 'Н-, "Р ЯМР- и УФ-спектрами. а также элементным анализом. Анализ ЯМР спектров показывает, что замена атома кислорода в карбоксильной группе на серу приводит к изменению хим сдвига метиленовой группы при фосфоре с 2,63 м.д на 3 12 м д В то же время фосфорный сигнал сдвигается с 16,30 м д. до 17,60 м д. В целом эти изменения согласуются с ожидаемыми

2.2. Синтез модифицированных нуклеотидов, как потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.

Известен ряд модифицированных нуклеозидов, ингибирующих обратную транскриптазу ВИЧ Однако, для проявления своего действия они должны пройти каскад внутриклеточного фосфорилирования, что требует времени и резко снижает их активную концентрацию в инфицированных ВИЧ клетках.

Решить эту проблему могло бы создание фосфорилированных форм нуклеозидных ингибиторов, которые подавляли бы репродукцию ВИЧ сразу же после его диффузии в клетку. В последние годы удалось найти две новые активности присущие ДНК-полимеразам. Первая реакция в этом ряду обеспечивает укорочение новосинтезируемой цепи ДНК на один или несколько нуклеотидных остатков, в результате чего образуются 5,5'-ди-(2'-дезоксинуклеозид)-тетрафосфаты Во второй реакции эти соединения при определенной концентрации служат субстратами элонгации биосинтеза ДНК. Исходя из вышеизложенного, представляется весьма актуальным синтез модифицированных нуклеозид-5'-монофосфатов,

нуклеозид-5'-трифосфатов, а также модифицированных по нуклеозиду и тетрафосфатному участку 5,5'-динуклеозид1етрафосфатных структур, как нового типа субстратных ингибиторов вирусных ДНК-полимераз.

2.2.1. Синтез изостерных аналогов монофосфатов d4T и сС2Т.

Синтез изостерного с4Т-фосфона1а (24) мы проводили руководствуясь ранее

описанной в литературе схемой, однако условия реакций на каждой стадии нами были изменены Исходным соединением служил тимидин (20) который окислили, используя хромат пиридиния в диметилформамиде, получив 5'-тимидиловую кислоту (21) с выходом 70%. Затем провели декарбоксилирование, используя динеопентилацеталь-К,К-диметилформамида, при этом гликаль (22) получен с выходом 90%. Следующую стадию осуществили используя диэтил (щдроксиметил) фосфонат и 1Вг и получили соответствующее З'-иодопроизводное изостерного тимидин 5'-монофосфата (23). Затем, действием триметилбромсилана, получили соответствующий триметилсилиловый эфир, который, не выделяя, вовлекли в реакцию с диазабициклоуцдеценом (БВЦ), элиминировали Н1 и щдролизовали триметилсилиловый эфир. После очистки с помощью ионообменной хроматографии получили целевое вещество (24), которое в дальнейшем использовали для синтеза полифосфатов и синтеза изостерного с12Т-фосфоната. Все промежуточные и конечное соединение охарактеризовали с помощью 'Н и 3|Р ЯМР и УФ спектроскопии.

ОН 20

ОН 21

22 с

О

О

II

ТЬу

а: СЮз/Ру; Ь: динеопентилаце1аль-К,К-диметилформамцда; с: 1Вг, (ЕЮ)2Р(0)СН20Н; <1: Ме351Вг,0Ви,Н20

Впервые удалось восстановить изостерный сС4Т-фосфонат (24) до изостерного С2Т-фосфоната (25). Гидрирование проводили водородом в водном спирте в присутствии 10% И/С Строение было подтверждено 'Н, "Р ЯМР и УФ спектроскопией. В частности, превращение двойной связи при 2',3' положении в одинарную подтверждается исчезновением в 'Н-ЯМР спектре сигналов при 6,11 и 6,31 мд. (суммарная интенсивность - 2Н), и появлением группы сигналов при 2,03 - 2,33 мд. (интеграл - 4Н).

Синтезированный изостерный аналог 2',3'-дидезокси-2',3'-

дилегццротимидинмонофосфата был использован для получения новых модифицированных 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов и модифицированных нуклеозид-5'-трифосфатов.

2.2.2. Синтез модифицированных 5',5'- динуклеозидтетрафосфатов.

Как было отмечено выше, для изучения нового типа субстратных ингибиторов вирусных ДНК-полимераз, были синтезированы модифицированные 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты. В качестве исходных соединений для синтеза использовали с14Т и изостерный аналог его монофосфата (24)

2.2.2.1. Синтез изостерного аналога динуклеозидтетрафосфата.

Синтез проводили в две стадии. Исходный изостерный фосфонат (24) в виде пиридиниевой соли, активированный карбонилдиимидозолом, конденсировали с трибутиламмониевой солью ортофосфорной кислотой и получили изостерный аналог дифосфата (25).

Затем дифосфат (25) разделили на 2 равные части и первую часть активировали карбонилдиимидозолом, и полученный при этом имидазолид конденсировали со свободным дифосфатом (25) После очистки с помощью ионообменной хроматографии получили динуклеозидтетрафосфорное производное (26) с выходом 40%. Промежуточное и конечное соединение охарактеризовали с помощью 'Н, "Р ЯМР и УФ спектроскопии.

2.2.2.2. Синтез ё4Т динуклеозидтетрафосфата.

2,,3'-Дидезокси-2',3,-дидегидротимидин превратили в дифосфат прямым фосфорилированием в триэтилфосфате и добавлением через сутки

трибутиламмониевой соли ортофосфорной кислоты, а затем по аналогии с вышеописанным синтезом в п. 2.2.2.1., получили и динуклеозидтетрафосфат (27).

Структура соединений была подтверждена с помощью 'Н, 3|Р ЯМР и УФ спектроскопии.

2.2.3. Синтез изостерного d4Т, изостерного d2T и d4T трифосфатов.

Синтез изостерных трифосфатов d4T и d2T (28-29) проводился по единой методике. Исходные модифицированные монофосфаты активировали карбонилдиимидозолом и затем вводили в реакцию с трибутиламмониевой солью пирофосфата, получая соответствующие трифосфаты. Трифосфат d4T (30) был получен из d4T реакцией с хлорокисью фосфора в триэтилфосфате и последуещей реакцией с трибутиламмониевой солью пирофосфорной кислоты. Все трифосфаты были охарактеризованы с помощью ЯМР и УФ спектроскопии.

2.3. Синтез биотинилированного аналога 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата.

Для изучения свойств репликативных ДНК-полимераз с помощью электронной микроскопии мы синтезировали биотинилированный аналог модифицированного по фосфатной части 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата. Исходным соединением для синтеза явился 2'-дезоксиуридин (31) На первом этапе синтеза мы защитили 5'-гидроксильную группу действием бензоилхлорида в пиридине. Затем защитили З'-гидроксильную группу действием дигидропирана в кислой среде в тетрагидрофуране. Удалили бензоильную защиту действием водного аммиака и провели конденсацию 3'-защищенного нуклеозида с этиловым эфиром иодмегилфосфоновой кислоты в присутствии гидрида натрия. Затем одновременно удалили тетрагидропиранильную защиту и этильную группу эфира обработкой триметилбромсиланом и получили 5'-фосфонометил-2'-дезоксиуридин (32), который в

присутствии карбонилдиимидозола конденсировали с трибутиламмониевой солью пирофосфата, получая соответствуюший трифосфат (33).

На втором этапе синтеза мы провели модификацию по нуклеиновому основанию, присоединив по С-5-му положению урацила биотин на линкере. Для этой цели мы сначала мсркурировали ацегатом ртути по С-5 положению нуклеиновое основание, а затем к полученному меркурионуклсотиду присоединяли аллиламин в присутствии катализатора 0,1 М КгРёСЦ в 1 М КС1. Таким образом был получен синтон (34), который можно использовать для введения различных репортерных групп в молекулу аналога ёЦТР. Полученный синтон конденсировали с М-оксисукцинимидным эфиром М-биотинил-6-аминогексановой кислоты в ДМФА в присутствии триэтиламина и М-метилимидазола в качестве катализаторов, получая биотинилированный аналог (35).

Структура конечного и промежуточных соединений была доказана с помошью УФ и 'Н, 31РЯМР спектроскопии.

Р ЯМР спектры модифицированных три и тетрафосфатов:

Соединение 31Р ЯМР спектр (020; 5, м. д,./, Гц)

29 8,6 д(1Р,./27, Ра),-6,3 м (1Р, Р,),-21,6 м(1Р, Рр)

28 8,9д(1Р,У27,Р.), -6,5 м(1Р, Р(), -21,3 м(1Р, Рр)

26 8,1 д(1Р, У15, Ра), -22,9 д(1Р, Ро)

27 -11,4 м (1Р, Р»), -23,0 М (1Р, Рр)

30 -11,2 м (1Р, РД -6,7 м (1Р, Рг), -21,4 м (1Р, Рц)

33 9,4 д (Ро.Ур».рр 26,1), -9,2 д (Р,. Ур, рц 19,81),-22 дд (Рр)

34 9,4 д (Ра. /ра. рц 26), -9,1 д(Рг, Ур,, рр 20), -21,8 дд (Рр)

35 9,7 д (Ра. ^ „ 26), -9,1 д(Р,, Ур,, РВ 20), -21,8 дд (Р„)

3. Гидролиз модифицированных три- и тетрафосфатов в пуповинной сыворотке крови человека.

Для подтверждения нашего предположения о большей устойчивости в крови человека динуклеозидтетрафосфатов в сравнении с природными трифосфатами соединения инкубировали при 37°С в пуповинной сыворотке крови человека и через определенные промежутки времени отбирали пробы, предварительно осадив спиртом белки крови. Анализ проводили предварительно с помощью тонкослойной хроматографии, а затем с помощью ВЭЖХ на колонках С18 №дс1ео$Ц 5 и. Соединения элюировали метанолом от 0 до 7,5%. Полученные данные суммированы в таблице:

Исследуемое соединение т » (время гидролиза половинного количества)

Трз (природный) 40 мин.

ТрД" (природный) 40 мин.

idiTp3 (28) 90 мин

idiTpjidjT (26) 90 мин.

djp, (30) 50 мин.

cL,Tp4d,T (27> 50 мин.

Из таблицы видно, что устойчивость в сыворотке динуклеозидгетрафосфатов не существенно отличается от нуклеозидтрифосфатов и выше, чем у природных нуклеозидтрифосфатов.

4. Биологическая активность синтезированных соединений.

В ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (г. Покров) и ВНИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург) было изучено вирусстатическое (ингибирующее) и вирулицидное (инактивирующее) действие фосфонтиоуксусной кислоты в культуре клеток с возбудителем коронавирусной инфекции; в указанную группу вирусов входит и возбудитель атипичной пневмонии (SARS). В ходе исследований был определен химиотерапевтический индекс, который является отношением максимально переносимой дозы к минимально

крови человека соответствующих

эффективной. Было установлено, что фосфонтиоуксусная кислота обладает вирусстатическим действием на репродукцию РНК-содержащих вирусов, в том числе против возбудителя коронавирусной инфекции (Акт испытаний прилагается).

По результатам испытаний рекомендовано изучение ее лечебно-профилактической активности на лабораторных и сельскохозяйственных животных, при инфекционных болезнях вирусной природы.

В Институте молекулярной биологии им. ВА. Энгельгардта. РАН модифицированные 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты и нуклеозид-5'-трифосфаты были введены в реакцию с праймер-матричным комплексом, при катализе обратной транскриптазой ВИЧ и все синтезированные соединения оказались хорошими субстратами, вызывая терминацию растущей цепи.

По данным Д. Ю. Мозжерина (Department of Pharmacological Sciences, University Medical Center, State University of New York), биотинилированный аналог 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (35) является селективным субстратом ДНК-полимераз а и 5 из плаценты человека в реакциях синтеза ДНК, катализируемых ими.

ВЫВОДЫ

1. Проведено систематическое исследование способов получения фосфонтиокарбоновых кислот и впервые синтезирована фосфонтиоуксусная кислота

2. Впервые осуществлена функционализация хлорметилфосфонатов и хлорметилфосфиноксидов серой и аминами, получен ряд новых амидов дифенилфосфинилтиомуравьиной и диэтоксифосфорилтиомуравьиной кислот.

3. Разработан новый метод тиолирования замещенных карбоновых кислот, основанный на их последовательном взаимодействии с карбонилдиимидазолом, а затем с сероводородом и синтезирован тиокарбоксиметилфосфонат ацикловира

4. Синтезированы новые модифицированные 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты и нуклеозид-5'-трифосфаты, и разработаны удобные методы их получения.

5. Исследование биологической активности полученных производных фосфонтиокарбоновых кислот привело к обнаружению новых противовирусных соединений, эффективных против РНК-содержаших вирусов.

6 Показано, что модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты и 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты являются терминаторными субстратами в реакции с праймер-матричным комплексом, при катализе обратной транскриптазой ВИЧ. Показано, что

стабильность модифицированных нуклеозвд- 5'-трифосфагов и 5',5'-дииуклеозидтетрафосфатов в сыворотке крови человека отличается несущественно, и выше, чем у природных нуклеозвд- 5 -трифосфатов.

7. Показано, что биотинилированный аналог 2-дезоксиурвдин- 5'-трифосфата является селективным субстратом ДНК- полимеразы а и S из плаценты человека

Автор выражает благодарность академику РАН Краевскому АА и кхн. ст.н.с. Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток ИМБ РАН Александровой ЛА за всемерную поддержку и помошь при выполнении данной работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мурабулдаев А.М., Закирова Н.Ф., Александрова ЛА Синтез биотинилированного аналога 2'-дезоксиурвдин-5'-трифосфата // Биоорганическая химия. -1998. -т. 24,№6.-С.474-475.

2. Alexandiova LA, Skoblov AJu., Jasko M.V., Murabuldayev AM., Victorova L.S., IKiavevskv AA| 2'-Deoxynucleoside 5'-triphosphates with reported groups modified at a-, p,y- or y- phosphates as substrates for DNA polymerases // Nucleosides & Nucleotides. - 1999. - 18, № 4&5, - P. 963-964.

3. 1Краевский AA.j Викторова Л.С., Скоблов А.Ю., Широкова ЕА, Мурабулдаев А.М., Хавдажинская АЛ., Сосунов В.В. Новые реакции, катализируемые ДНК-полимеразами; конструирование новых ингибиторов репродукции вируса иммунодефецита человека (ВИЧ) // Тезисы докладов VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии». Москва, 25-29 октября - 1999. - С. 65-67.

4. Victorova L.S., Sosunov V.V., Skoblov AYu., Murabuldacv AM., Alexandrova A.L., Krayevsky AA New substrates of DNA polymerases. New terminating substrates of HIV reverse transcriptase // Symposium "Current problems of molecular genetics and cell biology". Moscow, October 19-21. - 2000. - P. 258-264.

5. Alexandrova A.L., Khandazhynskaya AL., Krayevsky A.A| Shirokova EA, Skoblov AYu., Murabuldaev A.M., Victorova L.S. Dinucleoside 5',5'-tetraphosphates with modifications at sugar and tetraphosphate residues as inhibitors of viral revers transcriptases and viruses // Patent number VVO0112644 AI-2001-02-22.

6. Осипов В.Н., Мурабулдаев А.М., Заварчин И.В., Хохлов П.С. Применение реакции Киндлера для хюрметилфосфорных соединений // Тезисы докладов 13-й Международной конференции по химии соединений фосфора (ICCPС) и 4-го Международного симпозиума по химии и применению фосфор-, сера- и кремнийорганических соединений «Петербургские встречи», Санкт-Петербург. - 2002. - С. 126.

7. Хохлов П.С, Мурабулдаев А М, Осипов В.Н., Игнатенко А.В., Заварзин И.В. Функционализация хлорметилзамещенных фосфорильных соединений серой в присутствии аминов// Известия РАН, Сер. хим. -2003.- №10. С. 2172-2173.

Подписано в печать Формат 60x84/16. Бумага писчая.

Отпечатано на ризографе. Уч изд. листов 1.6.Тираж 100 экз. Заказ

№ /5?..

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 от 15.12.2000

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

Введение.

Список сокращений.

ГЛАВА 1. Синтез и свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот (литературный обзор). l. I. Методы получения серусодержащих фосфонкарбоновых кислот.

1.1.1. Синтез серусодержащих фосфонкарбоновых кислот из их кислородных аналогов.

1. 1.2. Методы синтеза, основанные на присоединении серы к производным трехвалентного фосфора.

1.1.3. Синтез тиофосфонкарбоновых кислот из серусодержащих полупродуктов.

1.1.4. Синтез производных фосфонкарбоновых кислот, содержащих атом серы в метиленовом мостике.

1.2. Химические свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот.

1.2.1. Реакции гидролиза эфиров серусодержащих фосфонкарбоновых кислот.

1.2.2. Этерификация.

1.2.3. Реакции восстановления.

1.2.4. Алкилирование.

1.2.5. Расщепление фосфоруглеродной связи.

1.3. Практическая значимость серусодержащих фосфонкарбоновых кислот.

ГЛАВА 2. Фосфонтиокарбоновые кислоты.

2.1. Синтез фосфонтиоуксусной кислоты.

2.2. Производные фосфонтиомуравьиной кислоты.

2.2.1. Синтез фосфонтиомуравьиной кислоты.

2.2.2. Синтез амидов фосфонтиомуравьиной кислоты. Реакция функционализации хлорметильной группы при атоме фосфора.

ГЛАВА 3. Синтез модифицированных нуклеотидов.

3.1. Нуклеозидные производные фосфонтиоуксусной кислоты.

3.1.1. Синтез карбоксиметилфосфоната ацикловира (конденсация фосфонуксусной кислоты с ацикловиром).

3.1.2. Синтез тиокарбоксиметилфосфоната ацикловира (коньюгат фосфонтиоуксусной кислоты с ацикловиром).

3.2. Синтез модифицированных нуклеотидов, как потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.

3.2.1. Синтез изостерных аналогов монофосфатов d4T и d2T.

3.2.2. Синтез модифицированных

5 ',5дину кл еозидтетрафосфатов.

3.2.2.1 Синтез изостерного аналога динуклеозидтетрафосфата.

3.2.2.2. Синтез d4T динуклеозидтетрафосфата.

3.2.3. Синтез изостерного d4T, изостерного d2T и .d4T трифосфатов.

3.3. Синтез биотинилированного аналога

2'-дезоксиуридин-5'трифосфата.

ГЛАВА 4. Гидролиз модифицированных три- и тетрафосфатов в пуповинной сыворотке крови человека.

ГЛАВА 5. Биологическая активность синтезированных соединений.

ГЛАВА 6. Экспериментальная часть.

Выводы.

Актуальность темы: В ряду фосфорорганических соединений важное место занимают фосфорилированные карбоновые кислоты и их производные. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты были синтезированы Нилиным в 1924 г. Однако химия их интенсивно начала развиваться лишь в последние десятилетия. Интерес к этим соединениям вызван, прежде всего, их практической значимостью. Различные производные фосфонкарбоновых кислот находят практическое применение в органическом синтезе. Эфиры и нитрилы фосфонуксусной кислоты широко используются в реакции Хорнера для синтеза эфиров и нитрилов ненасыщенных карбоновых кислот. В том числе арахидоновой кислоты и феромонов, нашедших практическое применение. Производные фосфонкарбоновых кислот представляют интерес также в качестве средств защиты растений, лекарственных препаратов, экстрагентов, антипиренов, активаторов отбеливателей в целлюлозной промышленности и в других целях. Так производные фосфонуксусной кислоты предложены к использованию в качестве гербицидов [1,2], фунгицидов [3,4] и бактерицидов [5], биоцидов [6] а также промышленных микробиоцидов [7] и лекарственных препаратов. Особенно большой интерес производные фосфонкарбоновых кислот представляют для изыскания новых лекарственных препаратов для терапии вирусных болезней челозека и животных, а также для борьбы с вирусными болезнями растений. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты являются аналоговыми антиметаболитами пирофосфата [8,9]. Они ингибирует активность фермента DNK-полимеразы, ответственной за репликацию вирусов. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты и ряд их производных являются высокоактивными ингибиторами репликации многих вирусов, в том числе вирусов герпеса [10,11,12,13,14], вирусов гепатита, инфекционного энцефалита, иммунодефицита [15,16] и др. Фосфонуксусная кислота в основном активна в отношении ДНК-содержащих вирусов. В конц. 25 мкг/мл фосфонуксусная кислота полностью подавляла репликацию вируса простого герпеса. Но при конц. выше 500 мкг/мл оказывает раздражающее действия на кожу и вызывает образование долго незаживающих язв. Кроме того, к фосфонуксусной кислоте развивается резистентность вирусов. Она также ингибирует развитие иммунитета к вирусным болезням. Все это ограничивает возможности практического использования ее в терапевтических целях.

Более широким спектром противовирусной активности обладает фосфонмуравьиная кислота. Тринатривая соль фосфонмуравьиной кислоты, препарат «фоскарнет», находит широкое применение для терапии вирусных болезней, вызываемых вирусом герпеса. Фосфонмуравьиная кислота рекомендована для терапии ряда других вирусных болезней, в том числе больных иммунодефицитом. В отношении вируса простого герпеса и вируса гепатита фосфонмуравьиная кислота оказалась в 100 раз активнее фосфонуксусной кислоты. Фосфонмуравьиная кислота действует на резистентные к фосфонуксусной кислоте и к ацикловиру штаммы вирусов. Фосфонмуравьиная кислота проявляет также значительный синергический эффект с некоторыми известными антивирусными препаратами [17,18,19]. Необходимо также отметить, что фосфонмуравьиная кислота малотоксична по отношению к теплокровным и немутогенна [20].

Однако для терапии таких вирусных заболеваний как вирус иммунодефицита фосфомуравьиную кислоту применяют внутривенной инъекцией. При этом она оказывает вредное воздействие на почки и другие внутренние органы. Известные антивирусные фосфонкарбоновые кислоты так же отличаются нежелательной токсичностью, коротким периодом жизни в организме, действуют только на репликацию вирусов и не действуют на латентные вирусы. В связи с этим поиск новых менее токсичных биологически активных соединений в ряду производных фосфонкарбоновых кислот является важной и актуальной задачей. Для снижения токсичности и увеличения продолжительности противовирусного действия фосфонкарбоновых кислот проведены исследования по разработке пролекарств. С этой целью получены разнообразные 1-0-алкил-1,3-пропандиолофосфонкарбоновые кислоты, являющиеся аналогами фосфолипидов [21]. Липидные пролекарства на основе фосфонмуравьиной кислоты оказались в 30 раз менее токсичны для теплокровных в сравнении с фоскарнетом [21]. Положительные результаты по пролонгированию действия и снижению токсичности были получены также при изучении конъюгатов фосфонуксусной и фосфонмуравьиной кислоте модифицированными нуклеозидами [22,23,24,25,26,27].

Одним из перспективных направлений в снижении токсичности противовирусных фосфонкарбоновых кислот и пролонгирования их терапевтического действия является введение атомов серы в молекулы этих соединений. Известно, что серусодержащие фосфорные соединения менее токсичны для теплокровных в сравнении с их кислородными аналогами. В ходе метаболизма тиофосфонатов происходит обмен серы на кислород и можно ожидать, что в организме серусодержащие фосфонкарбоновые кислоты постепенно будут превращаться в их противовирусные кислородные аналоги.

В связи с этим, исследования в ряду серусодержащих фосфонкарбоновых кислот и конденсация их с модифицированными нуклеозидами, на наш взгляд, являются весьма актуальными.

Известно, что все лекарства, разрешенные для лечения ВИЧ-инфекций в мире, являются ингибиторами либо обратной транскриптазы, либо протеазы ВИЧ. Однако ингибирование обратной транскриптазы имеет значительные преимущества, так как подавляет репродукцию ВИЧ на ранней стадии его репликации, до включения провирусной ДНК в состав генома клетки. Но все известные ингибиторы этого фермента нуклеозидно-нуклеотидной природы для проявления своего действия должны пройти каскад внутриклеточного фосфорилирования, что требует времени, а также резко снижает их активную концентрацию в инфицированных ВИЧ клетках.

Решить эту проблему могло бы создание фосфорилированных форм нуклеозидных ингибиторов, которые подавляли бы репродукцию ВИЧ сразу же, после диффузии его в клетку. Более того, такие соединения могли бы вообще предотвратить инфицирование крови человека ВИЧ и, таким образом, служить «химическими вакцинами».

Однако, эта задача еще не решена и главной проблемой здесь является низкая стабильность трифосфатного остатка модифицированных нуклеозидтрифосфатов в крови.

В последние годы удалось найти две новые активности, присущие ДНК-полимеразам. Первая реакция в этом ряду обеспечивает укорочение новосинтезируемой цепи ДНК на один или несколько нуклеотидных остатков, в результате чего образуются 5',5'-ди-(2'-дезоксинуклеозид)-тетрафосфаты. Во второй реакции эти соединения при определенной концентрации служат субстратами элонгации биосинтеза ДНК [28,29,30]. Исходя из вышеизложенного, представляется весьма актуальным синтез модифицированных 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов, как субстратных ингибиторов вирусных ДНК-полимераз нового типа, изучение их противовирусных свойств и стабильности в крови человека.

Целью диссертационного исследования является поиск новых методов синтеза производных фосфонтиокарбоновых кислот, коденсация их с модифицированными нуклеозидами, а также синтез модифицированных нуклеотидов, а именно 5\5'динуклеозидтетрафосфатов, нуклеозид-5'-трифосфатов и нуклеозид-5'-монофосфатов модифицированных по нуклеозиду, фосфатному участку и нуклеиновому основанию, обладающих потенциальной противовирусной активностью.

Научная новизна и практическая ценность работы: В соответствии с поставленной задачей нами впервые была изучена реакция тиолирования хлорметилфосфонатов, приводящая к образованию фосфонтиоформамидов, а также применение карбонилдиимидазола для введения серы в производные фосфонуксусной кислоты. Разработаны новые простые методы введения атомов серы в карбоксильную группу фосфонкарбоновых кислот и получены новые соединения, обладающие противовирусной активностью. Синтезированы новые модифицированные 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты, которые представляют собой новый тип ингибиторов синтеза провирусной ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ.

Апробация: Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1999 г.), на международном симпозиуме «Текущие проблемы молекулярной генетики и микробиологии» (Москва, 2000 г.) и на 13-й Международной конференции по химии соединений фосфора (ICCPC-XII1) (Санкт-Петербург, 2002 г.)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи, 1 патент, 3 тезиса докладов.

Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, списка сокращений, шести глав, выводов, списка литературы и приложения.

выводы

1. Проведено систематическое исследование способов получения фосфонтиокарбоновых кислот и впервые синтезирована фосфонтиоуксусная кислота.

2. Впервые осуществлена функционализация хлорметилфосфонатов и хлорметилфосфиноксидов серой и аминами, получен ряд новых амидов дифенилфосфинилтиомуравьиной и диэтоксифосфорилтиомуравьиной кислот.

3. Разработан новый метод тиолирования замещенных карбоновых кислот, основанный на их последовательном взаимодействии с карбонилдиимидазолом, а затем с сероводородом и синтезирован тиокарбоксиметилфосфонатацикловира.

4. Синтезированы новые модифицированные 5\5'-динуклеозидтетрафосфаты и нуклеозид-5'-трифосфаты, и разработаны удобные методы их получения.

5. Исследование биологической активности полученных производных фосфонтиокарбоновых кислот привело к обнаружению новых противовирусных соединений, эффективных против РНК-содержащих вирусов.

6. Показано, что модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты и 5',5'-динуклеозидтетрафосфаты являются терминаторными субстратами в реакции с праймер-матричным комплексом, при катализе обратной транскриптазой ВИЧ. Показано, что стабильность модифицированных нуклеозид-5'-трифосфатов и 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов в сыворотке крови человека отличается несущественно, и выше, чем у природных нуклеозид-5'-трифосфатов.

7. Показано, что биотинилированный аналог 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата является селективным субстратом ДНК- полимеразы а и 5 из плаценты человека.

1. Пат. 59101438 84101438. Япония, МКИ A 01 N 57/02. 2,2-Dichloro-3,3-dimetylceclopropanemethanol derivatives.- Chem. Abstr. -1984.- Vol. 101.-191205g

2. Ho A.W. 2,2-Bis(haloalkenyl)-l-substituted-1-dialkoxyphosphoroethylene Fungicides. // Пат. 4427667 США, МКИ A 01 N 57/18. Chem. Abstr.-1984.-Vol. 100.- 175067n

3. Hayashi Т., Ogita T. Preparation of Amino Acids and Dipeptide Phosphorohydrazidates as Antibacterials. // Пат. 63132896 88132896. Япония, МКИ С 07 F 9/24. Chem. Abstr.- 1989.- Vol. 110.- 213353u.

4. Effenberger R., Direktor. Process for Control of Microorganisms with Phosphorus-Based Compositions. // D-Пат. 2222368 Великобритания, МКИ A 01 N 57/02, Chem. Abstr.- 1990.-Vol. 113.- 54316c.

5. Effenberger R., Direktor D. Preparation of Phosphonates as Industrial Microbicides // Пат. 2636810 Франция, МКИ A 01 N 57/04 Chem. Abstr.-1990.- Vol. 113.-206707.

6. Львов Н.Д., Самойлович E.O., Тихончук И.А. и др. Проти во герпетическая активность отечественных производных фосфоновой кислоты и их сочетаний с индуктором интерферона намодели офтальмогерпеса. // Вопросы Вирусологии.-1989,- Т.34-, № 2. С. 186-192.

7. Ю.Мао J.C.H, Otis E.R., Vonesch A.M. and et. al. Structure-Activity Studes on Phosphonoacetate. // Antimicrob. Agent. Chemother.- 1985.-Vol.27, № 2.- P. 197-202.

8. I.Eriksson В., Oeberg В., Phosphonoformate and Phosphonoacetate.// Dev. Mol. Virol. -1984.- Vol.4.- P. 127-142.

9. McKenna C.E., Khawi L.A., Barat A. and et. al. Inhibition of Herpesvirus and Human DNA polymerases by a-Halogenates Phosphonoacetates. // Biochem. Pharmacol.-l 987- Vol.36, № 19.-P. 3103-3106

10. Blackburn G.M., Brown D., Martin S.J., A Novel Synthesis of Fluorinated Phosphonoacetic Acids.// J. Chem. Reseach (S).- 1985.- №3.- P. 92-93

11. Diana G.D., Zalay E.S., Salvador V.I. and et. al. Synthesis of Some Phosphonates with Antiherpetic Activity.// J. Med. Chem., № 5, P. 691-694.

12. Шувенин C.B., Царева H.B., Ситникова Ю.Б. и др. Клонирование и экспрессия в бактериях Escherichia coli рол-области генома вируса иммунодефицита человека. // Доклады АН СССР.-1990.- Т.310.№1, С. 210-213.

13. Blum H., Klenner Т., Schmaehl D., Wingen F. Synergistic Neoplasm Ingibitor Comprasing a Cytostatic Agent and a Phosphono Derivative. // Пат. 3804686 Германия, МКИ A 61 К 31/66.- Chem. Abstr.- 1991.-Vol. 113.-52505g

14. Smith K.O. Antiviral Composition Containing Synergistic Combination of 9-(2-Hydroxy-l-(hydroxymetyl)-ethoxy)-metyl.guanine and at Least One other Antivirally Active Drug. // Пат. 4902678 США, МКИ A 61 К 31/70.- Chem. Abstr.-1991- Vol.113.- 145325

15. Zhang M., Cao Y., Ye Y., Zheng J. Detection of the Mutagenicity of Phosphonoformic Acid whith Ames, MN and SCE Tests. // Nanjing Daxue Xuebao Ziran Kexue.- 1989.- Vo!.24.-№ 1. P. 114-121

16. Hostetler, Karl Y.; Kini, Ganesh D. Preparation of glycerophospholipids as virucides.//Патент WO 9615,132, 1996, CA 125, 143217m.

17. Herfried Griengl, Walter Hayden, Gerhard Penn, Erik De Clercq, and Brigitte Rosenwirth. Phosphonoformate and Phosphonoacetate Derivatives of 5-Substituted 2'-Deoxyuridines: Synthesis and Antiviral Activity.// J. Med. Chem. 1988, 31, P. 1831-1839.

18. Rosowsky A, Saha J, Fazely F, Koch J, Ruprecht RM. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by phosphonoformate esters of 3'-azido-3'-deoxythymidine.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. - Oct. 15; 172(1): P. 288-94.

19. Rosowsky A, Fu H, Pai N, Mellors J, Richman DD, Hostetler KY. Synthesis and in vitro activity of long-chain 5'-(alkoxycarbonyl)phosphinyl.-3'-azido

20. З'-deoxythymidines against wild-type and AZT-and foscarnet-resistant strains of HIV-1 //J. Med. Chem. 1977. - Aug. 1; 40(16): P. 2482-90.

21. Meyer P. R., Matsura S. F. So A. G, and Scott W. A. Unblocking of chain-terminated primer by HIV-1 revers transcriptase through a nucleotide-dependent mechanism. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - 95, P. 1347113476.

22. Victorova L., Sosunov V., Skoblov A., Shipitsyn A., and Krayevsky A. New substrates of DNA-polymerases. // FEBS Lett. 1999. - 453, 6-10.

23. Sosunov V. V., Santamaria F., Victorova L. S., Gosselin G., Rainer В., and Krayevsky A. A. Stereochemical control of DNA biosynthesis. // Nucleic Asids Rec. 2000. - 28(5), С. 1170-1175.

24. Москва B.B., Исмаилов B.M.,Разумов //Производные замещенных винилфосфоновых кислот. Реакции а-гало-Р-алкоксивинилфосфоновых и тиофосфоновых кислот эфиров и хлоридов с алкоголятами. // А.И. ЖОХ, 1971.-т.41,№7, С. 1495-1498.

25. McKenna.C.E. Preparation and use of sulfur-containing phosphonoformate derivatives and analogs. // Патент WO 00/02566. C.A. 2000. - v. 132, 9470.

26. Monsanto Chemical Co. Производные щелочных металлов и дигидрокарбилоксифосфинилтиоформиатов // Пат. США 3004886 (17.10.1961); РЖХим- 1963 7Н296П.

27. Макомо Hubert, Masson Serge and Saquert Monique. Reductions of phosphonodithioformates: Synthesis of a-phosphonyl thiols and hemidithioacetals. //Teyrahedron, 1994. - Vol. 50, №34 , P. 10277-10288.

28. Кашемиров Б.А., Стрепихеев Ю.А.,Чверткин Б.Я., Хохлов П.С. // ЖВХО,- 1987.-Т.32, 5, С. 596-598

29. Мс Kenna С.Е. // Пат США N 5072032, WO 96/ 15132.

30. Хайруллин В.К., Васянина М.А., Дмитриева Г.В. и Пудовик А.Н. Синтез хлорангидридов и диалкилтиофосфиновых кислот.// Известия Ак. наук СССР, 1971. - вып.12, С. 2767-2773.

31. Новикова З.С., Скоробогатова С.Ю., Прищенко А.А., Лысенко И.Ф. Синтез дифосфор-замещенных эфиров уксусной кислоты // ЖОХ,- 1976. т.46, № 3, С. 571-575.

32. Измаилов Р.К., Разумов А.И., Зыкова В.В., Ниязов Н.А. Синтез и свойства эфиров пирокатехинфосфонуксусной кислоты// ЖОХ, 1983. -т.53, № 9, С. 2000-2003.

33. Myska J., Stanek J., Bomar M. Organische herbicide IV. Einige neue 3-chlorphenylthiocarbamidsaureester. // Collec. Czechoslovak. Chem. Comm., -1968. vol. 33, № 12, P. 4416-4418.

34. Коваленко Л.В., Бувашкина Н.И, Соснов. А.В. Синтез амидов диалкоксифосфорилтиомуравьиных кислот//ЖОХ, 1994. - т. 64, № 10, С. 1634-1638.

35. Коваленко Л.В., Бувашкина Н.И, Соснов А.В., Синтез эфиров фосфонтиомуравьиной кислоты // ЖОХ, 1994. - т.64, N 10, С. 16341638

36. Popoff Ivan С. and Massengale John Т. Pesticides. // Пат США U.S. 3,342,907, 1967 г. СА. 1968, № 11, 49764v.

37. Пудовик А.Н., Хайрулин В.К.,Висянина М.А. Синтез диалкиламидов хлортиомуравьиной кислоты и их реакции с эфирами кислот трехвалентного фосфора. // ЖОХ, 1988. - т. 58, № 7, С. 1489.

38. Красильникова Е.А., Москва Н.А. Разумов А.И. Взаимодействие этилового эфира диэтилтиофосфинистой кислоты с хлоруксусным эфиром. // ЖОХ, 1970. - т.40, № 12, С. 2765.

39. Grisley D.W. The reactions of sodium dialkyl phosphonates with carbonyl sulfide and with carbon disulfide // J.Org.Chem. 1961 - v.26, P. 2544-2548.

40. Петров K.A., Неймышева A.A. Присоединение диалкилфосфористых кислот к алкилизотиоцианатам. //ЖОХ, 1959. - т.29, № 6, С. 1819-1821.

41. Алексеев В.В., Малиновский М.С. Диапкильные и бисхлорапкильные эфиры ариламидофосфонтиомуравьиной кислоты. // ЖОХ, 1975. - т. 45, №7, С. 1484-1486.

42. Пудовик А.Н., Коновалова И.В., Зимин М.Г. Двойнишникова Т.А. Перегруппировка фенилтиокарбамаилфосфонатов // Доклады Акад. наук СССР, -1976. т.228, № 3, С. 617-618.

43. Зимин М.Г.,Бурилов А.Р., Пудовик А.Н. О взаимодействии натрийдиапкилфосфитов с фенилизотиоцианатом и о перегруппировке фенилтиокарбамоилфосфонатов // ЖОХ, 1981, т.51, № 2, С. 469.

44. Tashma Zeev (N-Alkylthiocarbamoyl)phosphonic asid esters. 1. Preparation and spectral properties. //J. Org. Chem., 1982. - v. 47, № 15, P. 3012-3015.

45. Tashma Zeev. (N-Alkylthiocarbamoyl)thionophosphonic asid esters. // J. Org. Chem., 1983. - v. 48, №22, P. 3966-3969.

46. Аладжева Н.М.,Одинец И.Л., Мастрюкова Т.А. Алкилирование гидротиофосфорильных соединений в условиях межфазового переноса // ЖОХ, 1992. - т.62, № 5, С. 1181-1183.

47. Аладжева И.М., Одинец И.Л., Петровский П.В., Мастрюкова Т. А., Кабачник М.И. Алкилирование гидротиофосфорильных соединений в условиях межфазового катализа. // ЖОХ, 1993. - т.63, № 3, С. 611-616.

48. Kozlara A., Zwierzak A. Action of hydrogen sulphide on alkyl n,n-dialkylphosphoroamidochloridites. Synthesis of monoalkyl phosphorothioamidites (RO)(R2'N)P(S)H. // Bull. Acad. Pol. Ser Sci. Chim., -1967. v.15, №11, P. 509-515.

49. Пудовик A.H., Гурьянова И.В., Зимин М.Г., Раевская О.Е. Реакция неполных эфиров кислот фосфора с этиловым эфиром бензоилмуравьиной кислоты. //ЖОХ, 1968. - т. 38, № 7, С. 1539-1545.

50. Бурилов А.Р., Пудовик М.А.,Усманова Л.И.,Пудовик А.Н. S-фосфорилированные Р (III) производные этилового эфира тиогликолевой кислоты. //ЖОХ, 1985. -т. 55, № 10, С. 2401.

51. Усманова Л.Н., Бурилов А.Р. Белялов Р.Д., Газизов Т. X., Пудовик М.А., Пудовик А.Н. Синтез диалкил-8-алкилтиофосфитов. //. ЖОХ, 1987. - т. 57, №6, С. 1429.

52. Бурилов А.Р., Газизов Т.Х., Усманова Л.Н., Пудовик М.А., Дроздова Я.А., Пудовик А.Н. К вопросу об изомеризации некоторых тиоэфиров Р(Ш) под действием кислорода. // ЖОХ, 1989. - т. 59, № 7, С. 179-180.

53. Бурилов А.Р., Баруллин М.А., Пудовик М.А. Синтез и некоторые свойства S-фосфорилированных производных эфиров меркаптоуксусной кислоты. // ЖОХ, 1995. - т.65, № 3, С. 373.

54. Мельников Н.Н., Мандельбаум Я.А., Попов П.В., Варшавский С.Л., Ломакина В.И., Кофман Л.П., Украинец Н.С. Приготовление эфировдиалкоксифосфонтиоуксусной кислоты // Авт.свид. СССР 116879; РЖХим.- 1960 № 1, 6299П.

55. Маврин В.Ю., Москва В.В. Этилдиэтоксифосфорилтионацетат // ЖОХ, 1987. - т.57, N 12, С. 2792-2793.

56. Арбузов Б.А. и др. // Авт. свид СССР 1583425; РЖХим. 1990. - 24Н 183П.

57. Kirilov М., Ivanov D., Petrov G. Golemshinski G. Phosphonation of polyfunctional organometallic reagents. I. Metal derivatives of phenylacetic asid and its ethyl ester. // Bull. Soc. Chim. Fr. 1973. - 11, pt. 2, P. 30513053.

58. Schaumann Ernst, Mergardt Bernd, Fittkau Stefan. Synthesis of a, b -ansaturated thiocarboxylic asid S-esters via homer — emmons oleflnation. //. Synthesis, 1990. - № 1, P. 472.

59. Coutrot Philippe, Ghribi Abdellaziz. A facile and general, one-pot synthesis of 2-oxoalkane phosphonates from diehyl phosphono-carboxylic asid chlorides and organometallic reagents. // Synthesis, 1986. - № 8, P. 661-664.

60. Mikolajczuk Marian, Midura Wanda.H. Diethyl-a(methylthio)phosphonoacetic asid: a new bifunctional reagent. Synthesis of unsaturated five and six — membered lactones // Synlett. — 1991. - № 4, P. 245-247.

61. Aboujaoude E.E., Collingnon N., Savignac Ph. // J. organomet. Chem. — 1984. v. 264, № 1-2, P. 9-17.

62. Кашемиров Б.А., Осипов B.H., Емельянович A.M., Хохлов П.С. Реакция триизопропилового эфира фосфонуксусной кислоты с сульфенилхлоридами при катализе изопропилатом алюминия. // ЖОХ, -1992. т.62, № 5, С. 1195-1196.

63. Кашемиров Б.А., Осипов В.Н., Савенков Н.Ф. Чверткин Б.Я., Хохлов П.С. Тиоцианирование фосфонфтов // ЖОХ, 1992. - т.62, вып. 6, С 1268-1271.

64. Kise, Masahiro; Kura, Kohey, Suno, Keuji. Preparation of 2-(l,3-dithiol-2-ylidene)-2-dialkoxyphosphinylacetate esters for treatment of liver disease. // Пат. Япония Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 62,192,393. 1987. - CA 1988, v. 108, №21, 18985b.

65. Макомо Hubert, Masson Serge and Saquert Monique. Convenient Synthesis of a-mercaptomethyl phosphonates // Tetrahedron Lett, 1993. - v. 34, № 45, P. 7257-7258.

66. Dahl Otto and Larsen Ole. Phosphinodithioformates II. S-alk>l P,P-disubstituted thiophosphinoyldithioformates // Acta chem. Scand. 1969. -v.23, № 10, P. 3613-3615.

67. Баймашев Б.А., Полежаева H.A., Арбузов Б.А. Синтез 2-(диизопропоксифосфорилметил) тиазолов // ЖОХ, 1993. - т. 63, № 1, С. 219-220.

68. Козлов В.А., Желтова Е.В., Негребецкий В.В., Грапов А.Ф., Мельников Н.Н. Фосфорсодержащие тиоамиды карбоновых кислот в синтезе гетероциклических соединений. //ЖОХ, 1990. - т.60, вып. 1, С. 49-56.

69. Казаков П.В., Одинец И.Л., Петровский П.В., Коваленко Л.В., Мастрюкова Т.А. Синтез тиофосфорилзамещенных производных циклоалканкарбоновых кислот. // Изв. АН СССР. Сер. Хим. 1992. -вып. 2, С. 391-397.

70. Полозов A.M., Антипин И.С., Гареев Р.Ф., Хотинен А.В., Коновалов А.И. Равновесная СН-кислотность диметил-2-диметоксифосфорилмалоната и его тиофосфорного аналога. // Изв. АН. СССР, сер. хим. 1993. - вып. 2, С. 410-411.

71. Ямада Ясуо. Фунгицид для сельского хозяйства и садоводства // Японская з-ка № 62-89606 (1987). РЖХим. 1988. - 17.0.351П

72. Пудовик А.Н., Гурьянова И.В., Бандерова Л.В., Романов Г'.В. О фосфонат-фосфатной перегруппировке эфиров а-оксиалкилфосфиновых кислот.//ЖОХ,- 1968. -т38,№ 1,С. 143-150

73. Романов Г.В., Гурьянова И.В. // Вестник студенческого научного общества, 1968. - № 4, С. 72-78.

74. Романов Г.В., Ягфаров М.Ш., Коновалов А.И., Пудовик А.Н., Коновалова И.В., Юсупова Т.Н. О термодинамических и кинетических характеристиках фосфонат-фосфатной перегруппировки.//ЖОХ, 1973. - т.43, № 11, С. 2378-2386.

75. Болдескул И.Е., Лактионова Р.А., Репина Л.А., Лысенко И.Ф. Конформационная изомерия и спектральные свойства некоторых илидов фосфония и сульфоксония, стабилизированных карбонильной группой // ЖОХ, 1977. -т.47, № 12, С. 2735-2740

76. Vasilev, Georg N. Growth regulating and herbicidal activities of benzylphosphonic asid derivatives obtained by the Ivanov reaction. // Bulg. Chem. Commun. 1995. - v. 28, №. 2, P. 231-2145.

77. Vasiltv G.N., Kirilov M., Petrov G., Iliev L.K., Ivanov D. Chemical structure and herbicidal activity of some new a-cyano- and alkoxycarbonylbenzylphosphonates and -thiophosphonates. // Dokl. Bulg. Akad. Nauk- 1975. v.28, № 1, P. 91-93

78. Menard M., Martel A., Bristol Myers Co. 2,6-Дизамещенные соединения ряда пенема, способ получения и фармацевтические композиции с антибактериальным действием // Заявка 454779 Швеция, 1986 г. РЖХим. - 1989. - 6.О. 93 П.

79. Нихон сода кабусики кайся. Инсектицидные препараты // Японский пат. 12150,31.07.1961, РЖХим. 1963. - 16Н 328 П.

80. Hutchinson D.W., Masson S., The antiviral potential of compounds containing the thiophosphoryl group. // IRCS Med Sci. 1986. - v. 14, № 2, P. 176-177.

81. McKenna, Charles E. Thiophosphonoformic acid (TPFA) for inhibiting cytomegalovirus replication. // Патент, WO 9639148.

82. Straw, James A.; Loo, Ti Li; DeVera, C.; Nelson, Phillip D.; Tompkins, Wayne A.; Bai, Stephen A. Pharmacokinetics of potential anti-AIDS agents thiofoscarnet and foscarnet in the cat. // J. Acquired Immune Defic. Syndr., -1992, 5(9), P. 936-942.

83. Дец M.M., Канович JI.Т., // "Нефтепереработка и нефтехимия", 1981. -№ 5, 22-23; СА 95, С. 206399.

84. Петров К.А., Чаузов В.А., Ерохина Т.С. Аминоалкильные фосфорорганические соединения // Успехи химии, 1974. - 43, С. 2045.

85. Цветков Е.Н., Борисов Г., Сивриев X., Малеванная Р.А., Кабачник М.И. Синтезы на основе тетраметилолфосфонийхлорида. Некоторые превращения три(хлорметил)фосфина и окиси метилди(хлорметил)фосфина // ЖОХ, 1970. - 40, С. 285.

86. Краевский А.А., Бибилашвили Р.Ш., Куханова М.К., Райфельд Ю.Е. Пути поиска лекарственных средств против СПИД // Молек. Биол. -1988. -Т.22, № 11. С. 1289-1302.

87. Краевский А.А. Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, подавляющие репродукцию ВИЧ: анализ ситуации и вероятная перспектива И Молек. Биол. 1992. - Т.26, вып.4. — С. 725-744.

88. Jones A.S., Williamson A.R., and Winkley M. The chromium trioxide-pyridine oxidation of deoxyribonucleosides and deoxyribonucleotides // Carbohydrate Res., 1965. - 1, P. 187-195.

89. Zemlicka J., Gasser R., Freisler J.V., Horwitz J.P. Decarboxylative Elimination of 2'-Deoxynucleoside Uronic Acids // J. Am. Chem. Soc. -1972.-37, P. 3213-3217.

90. Kim Choung Un, Luh Bing Y., Martin John C. Regiospecific and Highly Stereoselective Electrophilic Addition to Furanoic Glycals: Synthesis of Phosphonate Nucleotide Analogues with Potent Activity against HIV // J. Org. Chem. 1991. - 56, P. 2642-2647.

91. Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-Iabeled polynucleotides: novel nucleic asid affinity probes // P.N.A.S. USA -1981.-5, P. 6633-6637.

92. Bobst A.M., Ozincas A.J., De Clerq E. Synthesis and biological activities of C(5)-N-spin-labeled uridines and related derivatives // Helvetica Chemica Acta 1983.-66, P. 534-541.

93. Ясько M.B., Новиков H.A., Тарусова Н.Б. Новый способ синтеза 5'-метиленфосфоновых эфиров 2'-дезоксинуклеозидов // Биоорганическая химия 1992.- 18, №9, С. 1258-1259.

94. Юб.Ясько М.В., Новиков Н.А., Тарусова Н.Б. Новые возможности синтеза 5'-0-фосфонометильных производных нуклеозидов и их аналогов // Биоорганическая химия — 1994. 20, 1, С. 50-54.

95. Dale R.M., Livingstoun D.C., Ward D.C. The synthesis and enzymatic polimerization of nucleotides containing mercury: potential tools for nucleicacid secquencing and structural analysis // P.N.A.S. USA 1973. - 70, 8, P. 2238-2242.

96. Bergstrom D., Lin X., Wang G., Rotstein D., Beal P., Norrix K., Ruth J. Substituted Nucleoside Analogs // Synlett. 1992. - № 3, P. 179-188.

97. Мозжерин Д. Ю., Атражев А. М., Куханова М. К.// Молекулярн. биология. -1992. Т. 26. № 5. С. 999-1010.

98. Ю.Колочева Т. И., Невинский Г. А.// Молекулярн. биология. 1993.- Т. 27. №6. С. 1368-1379.

99. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J.// Molecular Cloning: Laboratory Manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

100. Chidgeavadze Z. G., Beabealashvili R. Sh., Krayevsky A. A., Kukhanova M. K.// Biochim. et biophys. acta. 1986. - V. 868. № 2. P. 145-152.