Синтез производных карбоксиметилхитина и их реакции с N-нуклеофилами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Дударев Владимир Геннадьевич

СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ КАРБОКСИМЕТИЛХИТИНА И ИХ РЕАКЦИИ С 1М-НУКЛЕОФИЛАМИ

02.00,03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-3 КОЯ 2011

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011

4858854

Работа выполнена на кафедре химической технологии лекарственных веществ и витаминов ГБОУВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия».

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Иозеп Анатолий Альбертович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Попова Лариса Михайловна

доктор химических наук, профессор Севбо Дмитрий Петрович

Ведущая организация:

Институт высокомолекулярных соединений РАН

Защита состоится 23 ноября 2011 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.231.02 при Санкт-Петербургском государственном технологическом университете растительных полимеров по адресу: 198095, г. Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПб ГТУРП по адресу: 198095, г. Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д.4.

Автореферат разослан октября 2011 г.

диссертационного совета, к. х. н.

Ученый секретарь

А.Н. Евдокимов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из путей совершенствования лекарственных средств является создание их полимерных аналогов. Это позволяет регулировать фармакокинетику низкомолекулярных веществ (биодоступность, распределение в организме, длительность действия и направленный транспорт к мишени), а также снижать скорость их метаболизма и токсичность. Для получения полимерных лекарств широко используются природные полисахариды. Среди них большой интерес представляет хитин, сырьевая база которого огромна и полностью возобновляема. Хитин и его производные применяются в качестве биоде-градируемых компонентов при создании таблеток, пленок, мембран, микрокапсул и других лекарственных форм. Производные хитина оказывают выраженное влияние на иммунитет и неспецифические факторы защиты организма, обладают ранозаживляющим действием. Их ценные свойства применяются не только в фармации и медицине, но и в биотехнологии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других областях народного хозяйства.

Для конструирования физиологически активных полимеров пригодны в основном растворимые носители, например карбоксиметилхитин. Карбоксиметили-рование не только придаёт полимеру растворимость в воде, но и позволяет использовать карбоксильную группу для химической модификации. К сожалению, в доступной литературе удалось обнаружить только 2 работы, в которых авторы использовали карбоксиметилхитин в реакциях с низкомолекулярными веществами. В связи с этим исследования химических свойств карбоксиметилхитина имеют как теоретическую, так и практическую ценность. Работа выполнена как часть проводимых в СПХФА исследований по направлению "Поиск новых лекарственных средств в ряду модифицированных полисахаридов".

Целью исследования было изучить ацилирующую способность карбоксиметилхитина (KMX) в реакциях с О- и N-нуклеофилами и свойства образующихся продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: а) синтезировать растворимые образцы карбоксиметилхитина; б) отработать методику получения Н-формы KMX, изучить её ацилирующую способность в реакциях со спиртами, аминами и гидразидами и определить степень деацети-лирования хитина в процессе его химической модификации; в) разработать методику синтеза гидразида карбоксиметилхитина и изучить взаимодействие его с ароматическими альдегидами; г) синтезировать азид KMX, изучить его устойчивость и ацилирующую активность в реакциях с N-нуклеофилами; е) определить условия ковалентного связывания с карбоксиметилхитином некоторых биологически активных веществ и изучить противомикробное действие продуктов.

Научная новизна. Работа является первым исследованием реакций карбоксильной группы карбоксиметилхитина с целью создания физиологически активных полимеров, в ходе которого получены около 30 ранее неизвестных производных полисахарида.

В исследовании впервые показано, что: карбоксиметилхитин в реакциях со спиртами, аминами и гидразидами образует соответственно сложные эфиры, замещенные амиды и гидразиды; гидразид карбоксиметилхитина с ароматическими альдегидами образует полимерные ацилгидразоны альдегидов; нитрозирование гидразида карбоксиметилхитина приводит к образованию азида, который устойчив в кислой среде при низкой температуре и ацилирует ароматические, алифатические амины и гидразиды. Исследованы условия и определены параметры, влияющие на скорость выше перечисленных реакций. Впервые получены полимерные производные некоторых бета-лактамных антибиотиков и 5-

нитрофурфурола на основе карбоксиметилхитина и показано, что эти производные сохраняют противомикробную активность.

Практическая значимость работы. Разработана схема химической модификации карбоксиметилхитина. Простые технологичные методы синтеза его ацильных производных позволяют вводить в полимер заданное количество низкомолекулярных фрагментов. Для всех синтезированных соединений разработаны методики анализа. При проведении предварительных испытаний противомик-робной активности среди исследованных производных карбоксиметилхитина выявлены соединения, которые представляют интерес для дальнейшего изучения. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры химической технологии лекарств и витаминов СПХФА (акт внедрения).

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на научно-практической конференции "Фармация из века в век" (2008 г., Санкт-Петербург), на межвузовской научной конференции студентов и молодых учёных "Фармация в XXI веке: эстафета поколений" (2009 г., Санкт-Петербург), на межрегиональной конференции "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2010 г.), на Десятой Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Нижний Новгород, 2010 г.) и на научно-практической конференции, посвящён-ной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств СПХФА (Санкт-Петербург, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б статей, из них 2 в журнале, рекомендованном ВАК, и тезисы одного доклада.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав (обзора литературы по теме исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, описания экспериментов) и выводов, содержит 33 таблицы и 42 рисунка. Список литературы включает 175 ссылок, из них 89 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, его научная и практическая значимость.

В главе 1 проведён анализ литературных сведений о биологической активности хйтина и его производных, применении их как носителя лекарственных веществ и о методах синтеза карбоксиалкильных производных хитина.

В главе 2 приведены результаты использования карбоксиметилхитина в качестве матрицы для создания физиологически активных полимеров, и их обсуждение, данные по противомикробной активности синтезированных соединений и методы их стандартизации.

В главе 3 описаны материал и методы синтеза и анализа производных хитина.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

СХЕМА ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ХИТИНА

:н,он

О. ... aCH.COOH.NaOH ^ОСН2СООЫа

СН2ОСН2СООН

о.

ШАс Хитин

—о

>ШАс

1МНАс

Амид КМХ или Ацилгидразид КМХ

СН£>СН£СШа СЦРЩДЖШ<:НАг А^ио-/\ о. еюн,

АсОН

СЩХНзССЮН СЩ)СТ^С00А1к

ШАс ШАс

Эфир КМХ

а) \Н2КН2*Н20

б) N3011

СВрСНзССШа О^ШзСОМНШг

ШАс ШАс

Гидразоны альдегидов

уЩХНгСООКа СНДСЩХКЖ

ШАс ШАс

Амид или ацилгидразид КМХ

оХрн

1)ККН2,

2) N8011

ШАс ШАс

ГидразидКМХ

N»N02, СГзСООН

ОТОСН^СООН СТ^ОСН^СО^'з

МНЙс Азид КМХ

ЫНАс

где:

Н5, С3Н7, С^Нд, С5Нц,

И - п, м, о-СНзОСбЩ-, п, м, 0-СН3С6Н4-, С6Н5-, и-ВгСеЩ-, л-ЕЮСОСбЩ-, л-02КС6Н4-, ФРуСОШ-.о-НОСбЩСОШ-, ^-.СН-СН-СНгОН ко(~)-сн-со-

ОН» ... \=/ |

О-СН-СО-КН 5 снз

ссюн

в сн3 сн3 соон

N4^5 СН3 4-1ЦЛСН3 0 СООН

'\-CH-CO-NH

(ЬуЧн,

соон

Аг- и-(СНз)2ЫС6Н4-,п-Н0С6Н4->С6Н5>п-С1С6Н4->п-К02С6Н4>0-НСХ6Н4-> о, л-(НО)2С6Н3-,

2.1. Синтез карбоксиметилхитина

Синтез карбоксиметилхитина (KMX) достаточно изучен, поэтому нашей задачей было, используя известные методики, получить растворимые в воде оо-

кислотой (ХУК) (2-5 моль на «оносаха-ридное звено) в изопропиловом спирте (ИПС) в щелочной среде при 60 С Для набухания полисахарида и повышения выхода растворимого продукта хитин предварительно активировали смесью изопропилового спирта и 50/о раствора NaOH. "Замачивание" проводили от 15 минут до 2 часов. Чтобы уменьшить гидролиз ацетамидных групп, в ряде случаев хитин для активации растворяли в /о растворе UCI в диметилацетамиде, добавляли ИПС, образовавшийся осадок отделяли и использовали для алкилирования без сушки. Продукт разделяли н ас-творимую и нерастворимую части. Раствор карбоксиметилхитина очищали диализом, концентрировали в вакууме и осаждали спиртом. nnunill,]n

Наличие карбоксиметильных групп в полисахариде определяли с помощью ИК спектроскопии по появлению полос поглощения валентных колебании кар-

боксилат-иона около 1600 и 1420 см"1.

В 13С ЯМР спектре KMX помимо сигналов хитина наблюдаются пики атомов углерода карбоксиметильной группы (178 и 70,8 ррт), а также смещение сигнала ¿в слабое поле от 61 до 69 ррт (С6*). По интенсивности пиков С6 иi можно предположить, что алкилирование гидроксила в б-м положении моносахарид-ного звена хитина прошло приблизительно на 80%, что согласуется с литературными данными о преимущественном алкилировании хитина по первичному гид-

Р°КСИСтепень карбоксиметилирования хитина - Ст (число карбоксиметильных rpvnn на моносахаридное звено полимера) рассчитывали по результатам кондук-тометрического титрования натриевой соли KMX кислотой, а также по результатам объёмного титрования щелочью Н-формы KMX, полученной на колонке с ка-тионитом КУ-2-8. Титрование кислотой и щелочью дает сходные результаты

(ТабЛ'^1килирование хитина завершается уже через 1,0 ч, и независимо от избытка ХУК Скм составляет около 1. В ряде случаев ХУК загружали порциями что позволило увеличить Скм на 10-12%. Установлено, что для достижения больших значений степени замещения необходимо использовать многократное алкилирование полисахарида (табл. 1).

Таблица 1 - Зависимость степени карбоксиметилирования хитина от количества хлоруксусной кислоты (время реакции 2 часа при 60 С)-

--- — ГгП^лтдлпнмпй иягти. опоелелен:

№ опыта

1 2

3

4

5а 6б

Хлоруксусная кислота (в молях на моль моносаха-ридного звена)

2

3

4

5

6 3

, растворимой части, определённая по результатам

кондуктометрического _титрования

1,00 1,05 0,99 1,05

1Д1

1,29

титрования Н-формы KMX

1,05

1.03

1.04

1.05

1,12 1,3

ГТримечания: а расчетное количество ХУК и N30,Н загружено двумя порциями

через 2 ч (время реакции 4 ч); 6 - хитин карбоксиметилировали 2 раза -

В работе использовали образцы хитина из разных источников. При этом оказалось, что выход растворимого в воде карбоксиметилхитина существенно зависит от объекта выделения полисахарида. Так, при алкилировании образцов хи-

6

тина из краба заводов им. Войкова и "Биопрогресс" после «замачивания» их в смеси щелочь - ИПС в течение 2 ч нерастворимый в воде остаток составляет 2030 и 10% от массы исходного хитина соответственно (табл. 2). Заметно легче карбоксиметилируется хитин из креветок: для его активации щелочью достаточно всего 15 мин, и нерастворимый остаток составляет не более 4%. Таблица 2 - Результаты карбоксиметилирования образцов хитина из разных источников (60°С, 2 ч, ХУК 3 моля на моль моносахаридного звена

хитина)

Источник хитина и производитель Время «замачивания» в смеси щелочь - ИПС, ч Растворимая фракция KMX Нерастворимая фракция, в % от массы исходного хитина3

Скм выход, %

Краб (завод им. Войкова) 0,5 2,0 0,8-0,9 1,0-1,1 30-50 65-70 40-50 15-30

Краб (ЗАО "Биопрогресс") 2,0 0,9-1,0 75-80 2-10

Креветка (НПО "Атлант") 0,25 0,9-1,0 75-85 1-4

Примечание

а- Скм нерастворимых образцов карбоксиметилхитина по данным титрования не более 0,5.___

Образцы KMX, полученные из хитина, активированного переосаждением из 5% раствора LiCI в диметилацетамиде, были полностью растворимы в воде и имели Скм больше по сравнению с традиционным методом (табл. 3).

Таблица 3 - Результаты карбоксиметилирования хитина, предварительно активированного переосаждением из 5% раствора 1ЛС1 в диметилацетамиде (60°С, 3 ч, 6 моль ХУК на моносахаридный фрагмент) _

№ Скм, рассчитанная по результатам

образца кондуктометрического титрова- титрования щелочью Н-формы

ния ка рбокси м етилхити на

1 1,17 1,19

2 1,20 1,15

3 1,26 1,27

4* 1,52 1,60

Примечание - * образец, карбоксиметилированный дважды

Таким образом,

- выход растворимого в воде карбоксиметилхитина существенно зависит от объекта выделения полисахарида и времени «замачивания» в щелочи.

- карбоксиметилирование хитина, активированного раствором хлорида лития в диметилацетамиде, позволяет получать полностью растворимые в воде образцы с содержанием карбоксиметильных групп до 1,6 моль на моносахаридное звено.

2.2. Совершенствование методик анализа аминогрупп в производных хитина

Используемые в работе образцы хитина наряду с ацетамидными группами содержат некоторое количество свободных аминогрупп, которое может увеличиться в процессе алкилирования хитина и реакции карбоксиметилхитина с нук-леофилами. Наличие аминогрупп создаёт трудности при анализе синтезированных образцов и приводит к побочным реакциям во время химических превращений. Поэтому хитин и карбоксиметилхитин обязательно ацетилировали. В то же

время появление аминогрупп в конечном продукте модификации полисахаридов может оказаться выгодным, поскольку они придают полимеру ценные биологические свойства, например противомикробные.

В этой связи нашей задачей был выбор наиболее удобных методик определения свободных аминогрупп в хитине и его производных. Общее число аминогрупп в хитине и карбоксиметилхитине определяли потенциометрическим титрованием. Число первичных аминогрупп в карбоксиметилхитине определяли двумя вариантами спектрофотометрического метода. Первый из них основан на цветной нингидриновой реакции, второй - на анализе салицилиденового производного аминогруппы. Ошибка определений первичных аминогрупп в хитозане и карбоксиметилхитине не превышала б% (п=5). Оба метода анализа дают сопоставимые результаты.

По нашим данным и данным производителей в образцах хитина от 4 до 9% ацетамидных групп гидролизованы. Для определения влияния условий алкили-рования хитина на содержание в нем аминогрупп, полисахарид предварительно ацетилировали в водной суспензии при комнатной температуре до исчезновения нингидриновой реакции.

Таблица 4 - Результаты определения аминогрупп в образцах карбоксиме-тилхитина_

№ опыта Время активации смесью 50% NaOH и ИПС, ч Число аминогрупп в карбоксиметилхитине

общее первичных

1 0,5 0,06 0,03

2 0,5 0,06 0,03

3 2,0 0,10 0,07

4 2,0 0,13 0,06

Установлено, что в результате карбоксиметилирования хитина (табл. 4) гидролизуется 6-13% ацетамидных групп. Наименьшая степень деацетилирова-ния (до б%) наблюдается при малом времени активации смесью 50% NaOH/изопропиловый спирт (до 30 мин). Освободившиеся аминогруппы частично алкилируются хлоруксусной кислотой. Ацетилирование карбоксиметилхи-тина позволяет уменьшить число первичных аминогрупп до 0-0,01 молей на звено хитина.

С помощью спектрофотометрического метода, основанного на нингидриновой реакции, нами было показано, что в процессе получения этилового и пропи-лового эфиров карбоксиметилхитина при автокатализе и этилового эфира в присутствии хлороводорода 0,05 моль/л (см. раздел 2.4) заметного деацетилирова-ния не наблюдается. В условиях реакции Н - формы KMX с л-фенетидином в среде водного 1-пропанола отщепление ацетамидной группы также не происходит, а в реакции с гидразидом салициловой кислоты за 4 ч (см. раздел 2.5) отщепляется 3-5% ацетильных групп.

Определить свободные аминогруппы в гидразиде карбоксиметилхитина (см. раздел 2.6) сложнее, так как гидразидные группы, как и аминогруппы, реагируют с нингидрином и салициловым альдегидом. Поэтому для определения степени деацетилирования хитина во время гидразинолиза алкилового эфира KMX в качестве модели использовали натриевую соль карбоксиметилхитина. Установлено, что при обработке карбоксиметилхитина гидразингидратом при комнатной температуре в течение 1-3 ч не происходит заметного гидразинолиза ацетамидной группы, а за 24 ч реакции освобождается только'около 1% первичных аминогрупп.

Таким образом, при химической модификации хитина наибольшая степень гидролиза ацетамидных групп наблюдается при карбоксиметилировании полиса-

харида. Ацетилирование полученных образцов позволяет удалить свободные аминогруппы, которые на последующих стадиях образуются в незначительных количествах.

2.3 Получение Н-формы карбоксиметилхитина

Кислотную форму карбоксиалкилполисахаридов получают с использованием минеральной кислоты или ионообменной хроматографии. Ранее для получения Н-формы карбоксиметилхитина его раствор подкисляли до рН 2 и диалйзо-вали. Ионообменная хроматография для этой реакции не использовалась. Поэтому нашей задачей было выбрать оптимальный способ получения Н-КМХ.

Установлено, что подкисление раствора карбоксиметилхитина не приводило к полному обмену ионов натрия на протоны, возможно из-за установления равновесия между карбоксиметильной группой и минеральной кислотой. Колоночная ионообменная хроматография с катионитом КУ-2-8 имеет преимущество, поскольку приводит к полному превращению карбоксилат-анионов и не требует очистки продукта от минеральных солей. Раствор кислотной формы концентрировали в вакууме и осаждали ацетоном. Несмотря на наличие небольшого количества аминогрупп, выход Н-КМХ достигает 90%.

В ИК спектре кислотной формы KMX исчезает полоса поглощения карбок-силат-иона при 1600 см"1 и появляется полоса карбоксильной группы при 1730 см"1.

Таким образом, Н - форму карбоксиметилхитина со степенью замещения не менее 0,9 можно получать из его натриевой соли с помощью ионообменной хро-. матографии.

2.4 Синтез алкиловых эфиров карбоксиметилхитина

Алкиловые эфиры карбоксиметилполисахаридов являются удобными аци-лирующими агентами при конструировании полимерных лекарств на основе антибиотиков, ферментов, аминокислот и других веществ. Алкиловые эфиры используются для синтеза гидразидов карбоксиметилполисахаридов. Однако об эфирах карбоксиметилхитина и их свойствах практически ничего не известно. Поэтому задачей нашего исследования было получение и стандартизация некоторых алкиловых эфиров KMX.

Синтез сложных эфиров карбоксиметилхитина проводили нагреванием Н-формы KMX с избытком спирта при 78-117°С в условиях автокатализа или с добавлением минеральной кислоты. Выход при автокатализе 93-97%, а при кислотном катализе - около 50%.

Качественный и количественный анализ сложных эфиров KMX осуществляли по спектрофотометрической методике, основанной на гидроксамовой реакции. В тех случаях, когда эфиры KMX растворяются в воде (например, этиловый и пропиловый), проводили объемное титрование карбоксильных групп, не вступивших в реакцию этерификации.

В ИК спектрах продуктов реакции полосу поглощения v(C=0) сложного эфира 1745 см"1 можно обнаружить только после перевода карбоксильной группы, которая имеет полосу поглощения 1730 см"1, в карбоксилат-анион.

По результатам анализа полученных образцов рассчитывали степень ал-коксикарбонилметилирования Сакм (число сложноэфирных групп, в расчете на мономерное звено полисахарида) и степень превращения карбоксильных групп в эфирные Спр, %.

Установлено, что Н-форма карбоксиметилхитина, как и карбоксиметильные производные других полисахаридов, при нагревании с избытком спирта в усло-

виях автокатализа образует сложные эфиры. Однако реакционная способность Н-формы KMX ниже, чем у поликислот, полученных из дексграна (КМД-Н) и целлюлозы (КМЦ-Н) (рис. 1). Равновесие в реакции этилового спирта с Н-формой карбоксиметилпроизводных декстрана и целлюлозы при автокатализе достигается за 1-2 ч, в то время как в реакции с КМХ-Н - только через 8 часов. При этом степень этерификации карбоксиметильных групп декстрана и целлюлозы составляет 49 и 37% соответственно,^ хитина - 33% (рис. 1).

Рис. 1 - Зависимость степени превращения Спр карбоксильных групп КМХ-Н С»и 1,05 {1), КМД-Н Скм 0,84 (2), КМЦ-Н Ск„ 0,92 (3) в реакции с кипящим этанолом при автокатализе, KMX с добавлением 0,05 моль/л хлороводорода (4) от времени реакции (данные для КМД заимствованы из диссертационной работы Ильиной, 1995 г.) Этилового спирта 50 молей на моль карбоксильной группы.

Реакционная способность рассматриваемых карбоксиметилполисахаридов, скорее всего, определяется строением и надмолекулярной структурой этих полимеров, а, следовательно, и разным распределением карбоксиметильных групп в моносахаридном фрагменте. Действительно, спектры гидроксаматов железа, полученные из их эфиров, отличаются. Так, А„аКс в спектрах КМД 470 нм, у КМЦ 480 нм, а у KMX 485-490 нм. Это можно объяснить тем, что карбоксиметилирование декстрана идет, в основном, в положение 2, целлюлозы - в положение 2 и б, а хитина - в б.

При взаимодействии КМХ-Н с кипящим пропиловым и бутиловым спиртом достигаются более высокие степени этерификации поликислоты, чем с этиловым спиртом, что можно объяснить более высокой температурой реакции. Так, Н-форма карбоксиметилхитина реагирует с этиловым, пропиловым и бутиловым спиртами через 4 ч на 17, 25 и 24%, а за 8 ч - на 31, 48 и 57% соответственно. Этерификация поликислоты с добавлением каталитических количеств минеральной кислоты проходит быстрее (за 2 ч) со степенью превращения до 60% (рис. 1).

Таким образом, Н - форма карбоксиметилхитина, также как и другие кар-боксиметилполисахариды, образует алкиловые эфиры со спиртами в условиях автокатализа, при этом реакция ацилирования идёт медленнее, чем у соответствующих производных декстрана и целлюлозы.

2.5 Ацилирование аминов и гидразидов Н-формой карбоксиметилхитина

Карбоксиметилпроизводные декстрана, целлюлозы и некоторых других полисахаридов с успехом используются для ацилирования ароматических и гетероциклических аминов и производных гидразина, при этом продукты реакции нередко приобретают противомикробную активность, не свойственную исходным низкомолекулярным веществам. Реакции Н-формы карбоксиметилхитина с ами-

время реакции,ч

нами проводились только в присутствии производных карбодиимида, а с гидра-зидами кислот - не описаны. Поэтому одной из наших задач было исследовать N-ацилирующую способность КМХ-Н в реакциях с аминами и некоторыми гидрази-дами.

Для синтеза замещенных амидов и гидразидов KMX Н - форму KMX смешивали с амином или гидразидом (4,7 -г 5 моль реагента на 1 моль карбоксиме-тильной группы), добавляли растворитель, и смесь кипятили от 1 до 7 часов. В среде высококипящих растворителей реакционную массу нагревали при 100°С с перемешиванием. Продукт выделяли этанолом, переосаждали из раствора NaOH для очистки от ионно-связанного амина, центрифугировали, промывали этанолом или ацетоном и сушили в вакууме. Выход 80-97%.

Синтез замещенных амидов и гидразидов KMX контролировали с помощью УФ спектрофотометрии. В качестве модельных веществ для качественного и количественного анализа производных карбоксиметилхитина служили N-ацетилпроизводные исходных аминов и гидразидов. Для определения чистоты синтезированных веществ использовали ТСХ и УФ спектрофотометрию, поскольку Атах исходных веществ и продуктов реакции отличаются. Нерастворимые в воде гидразиды анализировали йодометрическим титрованием. Реакцию характеризовали степенью превращения Спр карбоксильных групп, %.

В ИК спектрах N-ариламидов KMX обнаружены полосы поглощения ароматических колец v(C=C) около 1600 и 1500 см"1 и б(С-Н) в области 840-690 cm'í, отсутствующие в спектре исходного КМХ-Н. Кроме того, в спектрах синтезированных веществ в солевой форме в сравнении со спектром карбоксиметилхитина полосы "амид I" (1660 см'1) и "амид И" (1550 см"1) более интенсивны и лучше различимы на фоне полосы карбоксилат-аниона (1600 см"1). В спектрах продуктов взаимодействия KMX с гидразидами салициловой и изоникотиновой кислоты полосы поглощения v(C=0) около 1730-1700 и 1660-1630 см"1 широкие и асимметричные из-за вклада поглощения диацилгидразина. В спектрах полученных веществ в кислотной форме полоса карбоксильной группы становится заметно меньше, чем в исходном КМХ-Н, в связи с частичным превращением в амиды или гидразиды.

Для определения влияния растворителя на процесс ацилирования ароматических аминов Н - формой KMX использовали безводные или содержащие 5% воды растворители различной полярности.

Таблица 5 - Результаты ацилирования анилина Н-формой карбоксиметилхитина со Скм 0,95-1,15 в разных средах, в течение 4 ч, при ЮО°С или при температуре кипения реакционной массы (а)_

Растворитель £ Степень превращения Спп, %

в безводном растворителе в растворителе с 5% воды

Анилин 7,0 55 56

н-Гептан 2,38 16s 19 а

Толуол 2,379 6 10a

1,4-Диоксан 2,2125 6a 13a

Метилцеллозольв 1630 16 21

1-Бутанол 17,720 - 15

- 22a

1-Пропанол 20,720 15a 23a

Этиленгликоль 34,520 17 12

ДМФА 36,71 5 -

ДМСО 45,00 2 -

Среди полученных нами результатов реакции KMX с анилином строгой закономерности Спр карбоксильной группы от свойств растворителя найти не удалось. Однако взаимодействие идёт заметно лучше в протонных растворителях: метилцеллозольве, 1-пропаноле и этиленгликоле (Спр 15-17%) в сравнении с ап-ротонными толуолом и 1,4-диоксаном (Спр 6%) (табл. 5). При проведении реакции в ДМСО и ДМФА, несмотря на их высокую диэлектрическую проницаемость и то, что полисахарид частично или полностью растворяется, наблюдается низкая степень превращения карбоксильных групп (2-5%). Вероятно, это можно объяснить тем, что диполярные апротонные растворители сильно сольватируют карбоксильную группу, но в отличие от протонных растворителей не способны образовывать с ней водородных связей и не способствуют отщеплению воды.

Как и в случае КМД, при добавлении к растворителю 5% воды, реакция ацилирования анилина карбоксиметилхитином идёт с более высокой степенью превращения (до 21-23%). Наибольшая степень превращения карбоксильных групп KMX в реакции ацилирования анилина (Спр до 55%) наблюдалась в отсутствие растворителя (табл. 5).

Для определения влияния структуры исходного ароматического амина на результаты его реакции с Н-формой KMX использовали п-замещенные анилины. Реакцию вели в среде 1-пропанола и 1,4-диоксана, содержащих 5% воды. Как и ожидалось, электронодонорныё заместители в /7-положении бензольного кольца аминов (фенетидин, толуидин) ускоряют процесс ацилирования аминов, а элек-троноакцепторные (броманилин, анестезин, нитроанилин) - замедляют. При этом число амидных групп в образцах карбоксиметилхитина линейно зависит от кон' станты Гаммета заместителя в амине (рис. 2).

-0.5 0 0.5

а-константа Гаммета заместителя

Рис. 2 - Зависимость степени превращения Спр КМХ-Н в амиды от апара константы Гаммета заместителя в амине при проведении реакции 1 - в водном 1-пропаноле, 2 - в водном 1,4-диоксане.

Время реакции 4 часа при температуре кипения реакционной массы.

Гидразиды кислот - салициловой и изоникотиновой, как оказалось, ацили-руются Н-формой KMX быстрее и с большим выходом, чем ароматические амины (рис. 3), что можно объяснить высокой нуклеофильностью и низкой основностью гидразидной группы.

Рис. 3 - Зависимость степени превращения Спр КМХ-Н от времени реакции с анилином (I), и с гидрази-дом салициловой кислоты (2) в водном 1-пропаноле при температуре кипения

- ' . с о реакционной массы.

О L 4 b о

время реакции, ч

Взаимодействие Н-формы KMX с ароматическими аминами, как и в случае других полисахаридов, идёт с заметной скоростью только при температуре выше 80°С, при этом нельзя повышать её более 120°С из-за возможности деструкции полисахарида.

Карбоксиметилхитин реагирует с анилином, как и со спиртами, хуже по сравнению с другими карбоксиметилполисахаридами (табл. б).

Таблица б - Результаты реакций полисахаридкарбоновых кислот с анили-'С,

Карбоксиметилпроизводное Скм Время реакции,ч Спс, %

Декстрана* 0,9 6 43

Целлюлозы* 0,91 < б 27

Хитина 1,05 4 6

Примечание - * данные для карбоксиметилпроизводных декстрана и целлюлозы взяты из диссертационной работы Сибикиной, 2000 г._

Если карбоксиметилпроизводные декстрана и целлюлозы реагируют с анилином с превращением карбоксильных групп на 43 и 27% соответственно, то карбоксиметилхитин - только на 6% (ранее показано, что Спр мало меняется после 4 часов реакции).

Таким образом, Н - форма карбоксиметилхитина при нагревании с растворами аминов и гидразидов образует замещённые амиды и гидразиды. При этом реакция ацилирования идёт с меньшим выходом, чем у соответствующих производных декстрана и целлюлозы.'

2.6 Синтез гидразида карбоксиметилхитина

Гидразидная группа часто является фрагментом лекарственных веществ (например изониазида и нитрофуранов), поэтому полимерные гидразиды представляют интерес как биологически активные вещества. Кроме этого, из полимерных гидразидов могут быть получены ацилгидразоны альдегидов и азиды. Последние являются хорошими ацилирующими средствами. Гидразид карбоксиметилхитина в литературе не описан, поэтому нашей задачей была разработка методик его синтеза и стандартизации.

Гидразид карбоксиметилхитина получали либо нагреванием поликислоты карбоксиметилхитина с избытком гидразингидрата при 100°С в течение 4 часов, либо обработкой этилового или пропилового эфира KMX избытком гидразингидрата при комнатной температуре в течение 1-24 часов. Продукт осаждали этанолом и переосаждали из раствора гидроксида натрия этанолом для удаления ион-но-связанного гидразина и сушили в вакууме. Выход до 90%.

Образцы гидразида KMX (ГКМХ), полученные из поликислоты, содержат по данным йодометрического титрования 0,3 моля гидразидных групп на звено хитина, но нерастворимы в воде. Ранее подобный результат наблюдался при нагре-

вании с гидразингидратом карбоксиметилпроизводных некоторых других полисахаридов и объяснялся сшивкой полимерных цепей за счёт образования диацил-гидразинов. В связи с этим в дальнейшем гидразид KMX получали из его алкило-вых эфиров. Чистоту гидразида определяли с помощью ТСХ.

ИК спектры гидразида, полученного из эфира и Н-формы карбоксиметилхи-тина, сильно отличаются. Так, в спектре гидразида, полученного гидразинолизом эфира, полосы поглощения "амид I" и "амид II" становятся интенсивнее и хорошо различимы на фоне полосы v(COO"). В спектре гидразида, полученного гидразинолизом Н-формы KMX, нет чётко выраженной полосы карбоксилат-аниона, но имеется широкая полоса в районе 1660-1630 см'1, которую можно отнести к поглощению v(C=0) амида и диацилгидразина и v(N-H) аминогруппы, которая образуется в результате гидразинолиза ацетамидной группы.

Образцы гидразида характеризовали степенью гидразинокарбонилметили-рования Сгк„ (числом гидразидных групп, приходящимся на моносахаридный фрагмент хитина), которую определяли йодометрическим титрованием и с помощью спектрофотометрического метода, основанного на гидроксамовой реакции (табл.7).

Таблица 7 - Количественные характеристики гидразидов карбоксиметил-хитина_

Эфир KMX Характеристика эфира KMX Qkm гидразида KMX, найденная Степень превращения эфирных групп, %

0<м Сакн гидроксамо-вым методом йодометрическим методом

Поликислота 0,95 0 - 0,30 -

Этиловый 0,38 0,62 0,63 0,62 100

Пропиловый 0,57 0,43 0,35 0,37 86

Бутиловый 0,38 0,62 0,39 0,40 65

Амиловый 0,47 0,53 0,33 0,37 70

Примечание - Относительная погрешность гидроксамового и йодометрического методов 3 и 2% соответственно.___

Для определения оптимальных условий синтеза гидразида KMX использовали этиловый, пропиловый, бутиловый и амиловый эфиры KMX, и время реакции изменяли от 1 до 24 часов. Оказалось, что гидразинолиз эфиров KMX при комнатной температуре идёт достаточно быстро и, в основном, завершается за 23 часа. Было замечено также, что при увеличении длины радикала в эфире KMX от этила до бутила, степень превращения эфирных групп в гидразидные уменьшается от 100 до 65%, что, вероятно, можно объяснить увеличением роли конкурирующей реакции гидролиза сложноэфирных групп (табл. 7).

Таким образом, гидразинолиз алкиловых эфиров карбоксиметилхитина при комнатной температуре является лучшим способом синтеза его гидразидов, при этом этиловый эфир реагирует полностью.

2.7 Синтез и анализ азида карбоксиметилхитина

Азиды полисахаридкарбоновых кислот являются активными ацилирующими агентами и широко используются для конструирования физиологически активных полимеров. С их помощью полисахариды модифицируют аминами, в том числе лекарственными субстанциями. Азид карбоксиметилхитина (АзКМХ) в литературе не описан, поэтому нашей задачей было, используя существующие методики,

синтезировать азид из гидразида карбоксиметилхитина и исследовать его устойчивость в водных растворах.

Азиды KMX получали, обрабатывая гидразид KMX водными растворами нитрита натрия и трифторуксусной кислоты при 0°С и рН<2 в течение 2-3 мин. Для подкисления использовали сильную органическую кислоту, поскольку целевой продукт легче очищается от её натриевой соли промывкой спиртом. Избыток азотистой кислоты удаляли мочевиной. Продукт реакции, как правило, использовали для ацилирования аминов без выделения из раствора. Однако в некоторых случаях азиды осаждали из раствора ацетоном, промывали хлористым метиленом и сушили в вакууме при 18-25°С.

Наличие азидных групп в модифицированном полисахариде было подтверждено с помощью ИК спектроскопии по появлению полосы поглощения v(N3) 2160 см"1. Число азидных групп в полимере определяли спектрофотометрическим методом после добавления к ним гидроксиламина и хлорида железа (III). Для проверки полноты реакции образования азида его гидролизовали водной щёлочью при 0°С. Оказалось, что такие образцы содержат гидразидные группы по данным йодометрии (0,02-0,03 моля на моносахаридный фрагмент), однако гидроксамовый метод анализа даёт отрицательный результат. Это можно объяснить наличием диацилгидразиновых групп, поскольку азид KMX в процессе его синтеза может ацилировать ещё не вступивший в реакцию гидразид.

Для определения оптимальных условий реакции азидов с аминами была изучена устойчивость водных растворов АзКМХ в зависимости от времени, температуры и pH среды (рис. 4).

Рис. 4 - Содержание азидных групп Na3 в образцах KMX (% от числа в момент образования) в зависимости от времени т (мин) выдержки их водных растворов при 0°С. Значение рН 2 (1), 4 (2), б (3), 8(4), 10 (5), 12 (б).

Оказалось; что спустя 2 ч с момента образования при рН 2 число азидных групп в образцах составляет около 90% от первоначального значения, при рН 4 - 80, б - 45, 8 - 26%. В сильнощелочной среде азид KMX разрушается почти полностью за 5 минут. Повышение температуры растворов уменьшает устойчивость азида. Например, при 17-22°С через 2 ч при рН 2 сохраняется около 58% азидных групп, рН 4 - 22, б - 13, 8 - 7%. Азид KMX более устойчив, чем азид карбоксиметилдекстрана, но менее устойчив, чем азид карбоксиэтилдекстрана.

Таким образом, при нитрозировании гидразида карбоксиметилхитина получается азид, который наиболее устойчив в сильнокислом водном растворе при 0°С.

0 20 40 60 80 100 120 время, мин

2.8 Ацилирование аминов и гидразидов азидом карбоксиметилхи-тина

В литературе имеются сведения об использовании азидов карбоксиметил-полисахаридов для ацилирования аминов, в том числе антибиотиков и ферментов. При этом активность антибиотиков-аминогликозидов в ряде случаев увеличивалась на 10-20%, а стабильность фермента - в разы. В этой связи большой интерес представляют азиды KMX (АзКМХ), однако их реакционная способность не описана, поэтому нашей задачей было исследовать влияние условий ацилирования на выход целевого продукта в реакциях азидов KMX с аминами и гидрази-дами кислот.

В качестве моделей в реакции использовали анилин и его производные с заместителями в о-, м- и л-положении, 01.-трео-1(п-нйтрофенил)-2-амино-1,3-пропандиол, а также гидразиды изоникотиновой и салициловой кислот, некоторые из которых являются лекарственными субстанциями или полупродуктами для их синтеза.

Для ацилирования аминов и гидразидов использовали водные растворы азида KMX, полученные из гидразида KMX. К раствору азида добавляли 3-15 молей нуклеофила на моль азидной группы в виде спиртового раствора, создавали значение рН от 1 до 12,5 с помощью кислоты или щёлочи и вели реакцию при 0°С в течение 0,25-24 ч. По окончании выдержки продукт осаждали этанолом, переосаждали из водного раствора гидроксида натрия для удаления ионосвязан-ного нуклеофила и сушили в вакууме. Выход 55-65%.

ИК и УФ спектры продуктов реакции азида KMX и Н-формы KMX с аминами и гидразидами совпадают, поэтому качественный и количественный анализ, а также определение их чистоты осуществляли, как описано в разделе 2.5.

Замещенные амиды и гидразиды KMX характеризовали степенью превращения азида в амидные или гидразидные группы (Спр, в %). При этом мы учитывали, что не вступившие в реакцию азидные группы гидролизуются до карбоно-вых кислот в процессе реакции и выделения.

Как и в опытах с азидами карбоксиметил- и карбоксиэтилдекстрана и аль-гиновой кислоты, наибольшее влияние на полноту превращения азидных групп карбоксиметилхитина в замещенные амидные или гидразидные группы оказывают сила и избыток нуклеофила и кислотность среды (табл. 8).

Таблица 8 - Результаты взаимодействия азида карбоксиметилхитина с аминами при оптимальных значениях рН, 0°С, в течение 1 ч, 5 молей Ы-нуклеофила на моль азидной группы __

Амин РКа On рН среды Спо азида, %

л-Анизидин 5,3 -0,27 5-7 70

л-Толуидин 5,1 -0,17 5-7 66

Анилин 4,6 0 5-7 64

л-Броманилин 3,9 0,232 3-5 60

Анестезин 2,4 0,45 1 33

Как и ожидалось, для реакции азида KMX с ароматическими аминами существуют оптимальные значения рН, при которых достигаются максимальные степени превращения азидов в замещенные амиды. Наоборот, реакция азида KMX с гидразидом изоникотиновой кислоты практически не зависит от рН среды (рис. 5). Это, вероятно, можно объяснить тем, что гидразиды являются значительно более слабым основаниями, чем анилин, и мало протонируются (рКа 1,9 и 4,6 соответственно). При этом нуклеофильность гидразидной группы аномально высокая по сравнению с ее основностью. Поэтому реакции гидразида с азидом KMX идут быстрее и с большим выходом, чем с анилином. Реакция с алифатическим амином ОЬтрео-1(п-нитрофенил)-2-амино-1,3-пропандиолом легче всего идёт

при рН>7, поскольку в кислой среде алифатическая аминогруппа образует прочные соли.

г

90 - ПР

Рис. 5 - Зависимость Сг

■пр

60

1

азида карбоксиметилхити-на от величины рН среды в реакции с гидразидом изо-

30

\

3 никотиновой кислоты (1), анилином (2), и с DL-трео-1(/7-нитрофенил)-2-ам.ино-1,3-пропандиолом (3). Температура 0°С, 1 ч, 5

О

т- моль амина на 1 моль ази-

2

4 6

8 10

12 ДЭ-

рН

Исследуя взаимодействие азида KMX с N-нуклеофилами, обнаружили, что его реакция с анилином завершается примерно за 30 мин, а с гидразидом изони-котиновой кислоты и 01_-трео-1(л-нитрофенил)-2-амино-1,3-пропандиолом - за 15 мин, что согласуется с результатами проведенных ранее исследований с азидом карбоксиметилдекстрана.

Однако при ацилировании анилинов с сильными электроноакцепторными заместителями в л-положении, нуклеофильность которых значительно ниже нук-леофильности анилина, реакцию можно проводить в кислой среде дольше, чем 30 мин, т.к. при этих значениях рН азид KMX устойчив длительное время. Так, при ацилировании анестезина при рН 2 увеличение выдержки с 1 ч до 24 ч приводит к росту степени превращения азида в амид с 33 до 63%.

Таким образом, азид KMX ацилирует ароматические и алифатические амины и гидразиды ароматических кислот, при этом результат реакции зависит в основном от аетивности N-нуклеофила и рН среды.

2.9 Ацилирование антибиотиков бета-лактамидов азидом карбок-симетилхитина

Модификация антибиотиков бета-лактамного ряда карбоксиметилхитином и противомикробная активность таких полимеров не изучалась. Трудность этого исследования связана, прежде всего, с тем, что р-лактамный цикл в присутствии щелочей, а часто и кислот, гидролизуется, и антибиотик теряет свою активность. Поэтому нашей задачей было найти условия модификации хитина, при которых малоустойчивый р-лактамный цикл антибиотиков сохраняется.

В работе использовались антибиотики р-лактамиды, содержащие первичную аминогруппу. б-Аминопенициллановую кислоту, ампициллин, амоксициллин и цефалексин в твердом виде прибавляли при перемешивании к раствору азида KMX и доводили рН раствором щёлочи до 8-8,5. При этом антибиотик растворялся, и реакцию ацилирования проводили при 0°С в течение 18 ч. Продукт реакции осаждали спиртом и для очистки переосаждали из воды, промывали спиртом и ацетоном и сушили в вакууме при комнатной температуре. Выход продукта 5277%.

Предварительные исследования показали, что выдержка выбранных бета-лактамидов в условиях реакции более 2 суток не приводит к заметному гидролизу лактамного цикла. Наоборот, в сильнощелочной среде, которая используется для очистки модифицированных полисахаридов от ионно-связанного амина, лак-

там быстро разрушается. Однако дополнительные исследования показали, что используемые антибиотики являются слабыми основаниями и для очистки от них продуктов реакции не требуется переосаждение из водной щелочи.

Ковалентное связывание антибиотика доказывали с помощью ИК и УФ спектроскопии и йодометрического титрования. В ИК спектрах полученных веществ обнаружена полоса в области 1770-1740 см"1, характерная для 3-лактамного цикла. В сравнении со спектром натриевой соли KMX усиливаются полосы "амид I" (около 1660 см"1) и "амид И" (около 1550 см"1) за счет амидной связи антибиотика и новой амидной связи. Полосы в районе 1500 и 1600 см"1 (последняя заметна, когда карбоксильная группа в кислотной форме) характерна для валентных колебаний связей С=С бензольного кольца. В спектрах продуктов ацилирования ампициллина и цефалексина обнаружена полоса около 700 см"1, амоксициллина - при 840 см"1, которые можно отнести к внеплоскостным колебаниям связей С-Н ароматического кольца.

Количественный анализ полисахаридных образцов, содержащих цефалек-син и амоксициллин, осуществляли методом УФ спекгрофотометрии благодаря их высокому молярному коэффициенту поглощения. Универсальными методами анализа бета-лакгамидов являются йодометрическое титрование, которое позволяет определить число неразрушенных бета-лактамных циклов. Полимерные производные характеризовали числом фрагментов антибиотика (Сзаи) на звено хитина. Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9 - Результаты ацилирования некоторых бета-лактамных анти-

биотиков азидом карбоксиметилхитина

Бета-лактамный антибиотик Сгкм гидразида KMX Мольное отношение амин: азид KMX Сзам производных KMX, определённая Доля сохранившихся р-лактамных циклов, % от исходного

спектро-фометрией йодомет-рией

б-АПК 0,48 0,37 3 - 0,09 92

5 - 0,04

Амоксициллин 0,48 0,37 3 0,18 ОДО 85

5 ОДО 0,06

Ампициллин 0,48 0,37 3 - 0,09 100

5 - 0,04

Цефалексин 0,48 0,37 3 0,10 0У07 90

5 0,13 0,09

Таким образом, степень превращения азидных групп карбоксиметилхитина в амидные относительно невысока (11-21%), что, вероятно, объясняется малой нукпеофильностью и доступностью аминогруппы субстратов в реакциях с полимерным ацилирующим агентом. Однако в условиях реакции более 85% лактамно-го цикла связанного с полимером антибиотика сохраняется.

2.10 Синтез полимерных гидразонов альдегидов

Среди гидразонов имеются вещества с противомикробной, в. т. ч. противотуберкулёзной, противоопухолевой и другими видами биологической активности. В связи с этим при создании новых и совершенствовании уже известных лекарственных веществ большой интерес представляют.полимерные гидразоны. Реакции гидразида карбоксиметилхитина с карбонильными соединениями не описаны, поэтому нашей задачей было исследование его взаимодействия с ароматическими альдегидами.

Ранее для модификации гидразидов полисахаридкарбоновых кислот их. ки пятили с 10-кратным избытком альдегида в спиртовой среде. Реакции гидразида KMX в таких условиях проходили легко и количественно. Для получения поли-ме^ых гидразонов альдегидов с меньшим расходом субстрата мы несколько из-

SS2 S555. Гидразид KMX растворяли в ОД н рааворе ГмГ н™бь™

и прибавляли равный объем этанольного раствора

ком 30-100%. Реакционную массу перемешивали при теМпера^ре 18 25 С от б мин до 24 ч. Продует осаждали этанолом, центрифугировали, промывали этано

лом или ацетоном и сушили в вакууме. Выход 75-85%. „япкп*гиметил-

Удобным методом контроля числа связанных альдегидов в карбоксиметил хитине оказалась УФ спеетрофотометрия, которая использовалась в двух вариан^

тах Из гидразона формальдегидом вытесняли альдегид в среде 0,1н. раствора

уксусной кислоты (калибровочные графики строили, используя 'Гполимер'е ис-япьлргилыЧ либо напрямую определяли гидразоновые группы в полимере, ис noZ™ в качестве модельных"соединений ацетилгидразоны альдегидов. Эти методы дают сходимые результаты. ^^^^^^^Гот творов полученных веществ и ацетилгидразонов совпадают ^J^^omZ IL исходных альдегидов, что позволяет судить об отсутствии в образцах приме

С6Й ТиТГет^ученных веществ имеющиеся

пятствуют обнаружению поглощения гидразона (1580-1660 см ), однако ^у ально полоса "амид I" увеличивается. Наличие ароматического ФР^нта^дока_ зано по полосам неплоскостных С-Н колебании в области 695-840 я Л <-■ лебанийТоколо 1500 см'1 и около 1600 см"1, последняя заметна, когда СООН группа в кислотной форме), а также по поглощению нитрргруппы (1520 и 1345 2Гу производного л- нитробензальдегида и 1356 см1 у производного 5-

нитрофурфурола)^. гидразоны характеризовали степенью превращения гидразид-

НЫХ ' ПрПи сравнении активности альдегидов с различными положении бензольного кольца оказалось, что гидразид карбоксиме™ уже через 6 мин реагирует с л-нитробензальдегидом на 75%, с бензальдегидом на 50% а с л-гидрокси- и л-диметиламинобензальдегидом - на 28% и И /о соот ветственно (рис. 6) При этом" число введённых гидразоновых групп в хитине зависит линейно от о-константы Гаммета заместителя (у=0,150х+0,167, п ь, R2=0.980).

П-N(CH3)2

80 п 60

"л-НО 20 ■

Спр,%

л-N02

л-С1

л-Н

-0.5 0 0.5

константа Гаммета заместителей

-1 1

Рис. 6 - Зависимость степени превращения гидразидных групп в хитине (СпР, %) от свойств заместителя в п-положении

бензальдегида; 1,3 моля альдегида на моль гидразидной группы, 6 мин реакции

Увеличение времени реакции, концентрации и соотношения реагентов позволило достичь количественного превращения гидразидных групп KMX.- ■

Таким образом, гидразид карбоксиметилхитина количественно реагирует с ароматическими альдегидами в водно-этанольном растворе при 18-25°С с образованием полимерных ацилгидразонов.

2.11 Исследование противомикробной активности синтезированных производных карбоксиметилхитина

Общеизвестно, что связывание лекарственных субстанций с полимером приводит к снижению их токсичности и пролонгации действия. Однако известно также, что полимерные производные в зависимости от типа носителя и его связи с введённым фрагментом могут сохранять, а также частично или полностью терять активность. При этом отмечается, что антибиотик бета-лактамного ряда ампициллин, присоединённый к полимерам прочной амидной связью, медленнее всего инактивируется пенициллиназой и более активен в отношении резистентных штаммов бактерий (Афиногенов, Панарин, 1993). Поэтому нашей задачей было исследовать, сохраняется ли противомикробная активность синтезированных нами на основе KMX полимерных производных бета-лактамидов, 5-нитрофурфурола и некоторых других альдегидов, аминов и гидразидов.

Определение противомикробной активности проводили на кафедре микробиологии СПХФА под руководством канд. биол. наук доцента О. М. Тихомировой. Активность определяли методом двукратных серийных разведений на жидких питательных средах. В качестве тест-культур использовали штаммы типичных представителей грамположительных, грамотрицательных бактерий, дрожжевых и мицелиальных грибов (Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р, Escherichia coli АТСС 25922, Candida albicans АТСС 10231 и Aspergillus niger АТСС 9642). Микробная нагрузка составляла 10s клеток на 1 мл. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) производных карбоксиметилхитина выражали в пересчёте на содержание введённого фрагмента, за исключением самого KMX и его гидразида.

Согласно полученным данным (табл. 10), полимер-носитель - карбоксиме-тилхитин в концентрации 10000 мкг/мл не подавлял рост исследованных штаммов микроорганизмов. Замещённые амиды KMX, содержащие амоксициллин, ампициллин и цефалексин, проявляли активность в отношении S. aureus и Е. coli, однако в 4-16 раз меньшую, чем у исходного антибиотика. Исключение составило действие производного б-АПК против S. aureus: оно достоверно не отличается от действия исходной б-АПК. Предшественник для синтеза левомицетина "треоамин" (01.-трео-1(/7-нитрофенил)-2-амино-1,3-пропандиол) слабо действовал только на бактерии (МИК не менее 500 мкг/мл), а после образования амида с карбоксиметилхитином не подавлял рост ни одного исследованного тест-микроорганизма в концентрации не менее 800 Мкг/мл.

Активность замещённых гидразидов KMX невысока (МИК>1000 мкг/мл) или не обнаруживалась. Так, N'-изоникотиноилгидразид KMX не действовал на использованные тест-микроорганизмы при концентрации 2000 мкг/мл, хотя сам гидразид изоникотиновой кислоты при такой концентрации не подавлял рост большинства выбранных нами тест-культур. Из литературы, однако, известно, что подобное производное карбоксиметилдекстрана обладает в 30 раз меньшей активностью по сравнению с изониазидом в отношении М. tuberculosis. Для N'-салицилоилгидразида KMX в опытах с Е. coli и С. albicans зафиксировано соответственно 2- и 8-кратное уменьшение действия в'сравнении с исходным гидра-зидом, а подавление роста данным производным других тест-культур не выявле-

Таблица 10 - Результаты определения противомикробной активно-

сти некоторых производных карбоксиметилхитина

№ п/п Полимерные производные и вещества сравнения Содержание в полисахариде введённого фрагмента масс. % МИК* в отношении микроорганизмов, мкг/мл

S. aureus Е. coli С. albicans . А. niger

1 карбоксиметилхитин - >10000 >10000 >10000 >10000

2 гидразид KMX (Сгкм 0,4) - 5000 >10000 >10000 >10000

I. Замеш ённые амиды карбоксиметилхитина

3 Амоксициллин - 0,5 ......ш..... действие не определяли, т. к. грибы не входят в спектр активности бета-лактамных антибиотиков

"Амоксициллин"-КМХ 14 '2,0 62,5

4 Ампициллин - ..А25 ......7Ж.....

"Ампициллин"-КМХ 11 2,0 125,0

5 Цефалексин - 1,0 15,6

"Цефал ёкси н"- KMX 8 16,0 124,8

6 6-АПК - 125j0 31,3

"6-Ärik"-KMX 5 250,0 500,0

II. Ацилгид разоны

7 ацетилгидразон 5-нитрофурфурола - 3,9 3,9 500 125,0

фурацилин - .....М..... >500 250,0

5- нитрофурфурилиден ГКМХ 22 31,2 ...... 124j8 250,0 125,0

11 31,2 62j4 250,0 125,0

5 15,6 31,2 125,0 125,0

Примечание: * - для производных карбоксиметилхитина (кроме KMX и ГКМХ) приведена их удельная активность, то есть в пересчёте на введённый фрагмент.

Гидразид KMX обладал лишь слабой бактериостатической активностью в отношении S. aureus в концентрации не менее 5000 мкг/мл, и не проявлял активности против других тест-культур в концентрации до 10000 мкг/мл.

Среди исследованных нами полимерных гидразонов альдегидов (2-гидрокси-, 4-гидрокси-, 2, 4-дигидроксибензальдегида, 5-нитрофурфурола) наибольшую активность проявили производные 5-нитрофурфурола. 5-нитрофурфурилиденгидразон KMX действовал в отношении бактерий слабее (табл. 10) в сравнении с ацетилгидразоном 5-нитрофурфурола (в 4-8 раз в отношении S. aureus и в 16-32 раза в отношении Е. coli). Однако в отношении грибов полимерные производные 5-нитрофурфурола были равны по действию (в отношении A. niger) или даже в 2-4 раза превосходили (в отношении С. albicans) аце-тилгидразон 5-нитрофурфурола. При сравнении полимерных гидразонов 5-нитрофурфурола с разной степенью замещения между собой, то оказывается, что производное с 5% заместителя обладает в 2-4 раза большей удельной активностью, чем производное с 22% заместителя. Эта закономерность прослеживается в отношении S. aureus, Е. coli и С. albicans.

Полимерные производные 2-гидрокси- и 2, 4-дигидроксибензальдегида, как правило, были в 2-4 раза менее активны ацетилгидразонов (МИК не менее 500 и 1000 мкг/мл соответственно), а действие 4-гидроксибензилиденгидразида KMX в концентрации до 1000 мкг/мл не выявлено.

Несмотря на то, что связывание выбранных нами противомикробных веществ с карбоксиметилхитином чаще всего приводило к снижению их активности, от полимерных лекарств можно ожидать меньшую токсичность и пролонгирование действия.

Таким образом, полученные полимерные производные некоторых антибиотиков бета-лактамного ряда и 5-нитрофурфурола сохранили противомикробное действие, но, как правило, меньшее в сравнении с низкомолекулярными веществами. Установлено, что удельная активность 5-нитрофурфурилиденгидразида карбоксиметилхитина в отношении S. aureus, Е. coli и С. albicans возрасла с уменьшением степени замещения.

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие карбоксиметилхитина, его сложных эфиров, гидразидов и азидов с аминами, гидразидами и альдегидами в водных и органических средах -удобный метод создания физиологически активных полимеров, позволяющий варьировать число низкомолекулярных фрагментов, вводимых в полимерную цепь.

2. Карбоксиметилирование хитина, переосаждённого из раствора хлорида лития в диметилацетамиде, позволяет получать полностью растворимые образцы полисахарида с содержанием карбоксиметильных групп до 1,6 моль на моносаха-ридное звено.

3. При химической модификации хитина наибольшая степень гидролиза аце-тамидных групп наблюдается при карбоксиметилировании полисахарида. Ацети-лирование полученных образцов позволяет удалить свободные аминогруппы, которые на последующих стадиях образуются в незначительных количествах.

4. Н-форму карбоксиметилхитина со степенью замещения более 0,9 можно получать из его натриевой соли с помощью ионообменной хроматографии. Н-форма карбоксиметилхитина, также как и другие карбоксиметилполисахариды, образует алкиловые эфиры со спиртами в условиях автокатализа, а при нагревании с растворами аминов и гидразидов образует замещённые амиды и гидрази-ды. При этом ацилирующая способность карбоксиметилхитина меньше, чем соответствующих производных декстрана и целлюлозы.

5. Гидразинолиз алкиловых эфиров карбоксиметилхитина при комнатной температуре является лучшим способом синтеза его гидразидов, при этом гидразинолиз ацетамидной группы идёт не более чем на 1%.

6. Гидразид карбоксиметилхитина количественно реагирует с ароматическими альдегидами в водно-этанольном растворе при 18-25°С с образованием полимерных ацилгидразонов.

7. При нитрозировании гидразида карбоксиметилхитина получается азид, который более устойчив в водных растворах, чем азид карбоксиметилдекстрана, и ацилирует ароматические и алифатические амины и гидразиды кислот при опре-делёных значениях pH среды.

8. Полученные полимерные производные некоторых антибиотиков беталак-тамного ряда и 5-нитрофурфурола сохранили противомикробную активность, но, как правило, меньшую по сравнению с низкомолекулярными веществами.

Список публикаций

1. Дударев, В. Г. Синтез и исследование производных хитина/В. Г. Дударев, А. А. Иозеп/Др. науч.-пр. конф. "Фармация из века в век". Ч. 5. Санкт-Петербург. - СПб.: СПХФА, 2008. - С. 71-75.

2. Дударев, В. Г. Ацилирование ароматических аминов азидом карбоксиме-тилхитина/В. Г. Дударев, А. А. Иозеп//Тез. докл. межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых "Фармация в XXI веке: эстафета поколений". Санкт-Петербург. - СПб.: СПХФА, 2009. - С. 131-132.

3. Дударев, В. Г. Синтез гидразида, азида и замещенных амидов кар-боксиметилхитина/В. Г. Дударев, А. А. Иозеп//Журнал прикладной химии. - 2009. - Т. 82. - Вып. 10. - С. 1715-1718.

4. Дударев, В. Г. Определение аминогрупп в продуктах химической модификации хитина /В. Г. Дударев, А. А. Иозеп// Сб. науч. тр. "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции". Пятигорск. -Пятигорск, 2010. - С. 315-317.

5. Дударев, В. Г. Карбоксиметильная схема модификации хитина/В. Г. Дударев, А. А. Иозеп//Материалы Десятой Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". Нижний Новгород, 29 июня-2 июля 2010 года. - Нижний Новгород: ННГУ, 2010. - С. 25-28.

6. Дударев, В. Г. Синтез бензилиденгидразидов карбоксиметилхитина /В. Г. Дударев, А. А. Иозеп//Журнал прикладной химии. - 2010. -Т.83. - Вып. 10. - С. 1714 - 1717.

7. Дударев, В. Г. Взаимодействие карбоксиметилхитина с И-нуклеофилами/ В. Г. Дударев, А, А. Иозеп, П. И. Харькина/Научн.-практич. конф., посвящ. 65-летию факультета промышленной технологии лекарств: сб. науч. тр. -Санкт-Петербург, 3 декабря 2010 г. - СПб.: СПХФА, 2010. - С. 55-59.

На правах рукописи

Дударев Владимир Геннадьевич

Синтез производных карбоксиметилхитина и их реакции с 1Ч-нуклеофилами

Специальность 02.00.03 — органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Печать Н. В. Андриановой

Подписано к печати 12.10.2011. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. _Гарнитура «Тайме». Печ. л. 1,0. Тираж 75 экз. Заказ 978

Санкт-Петербург 2011

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1 Основные области применения хитина и его производных.

1.2 Медицинское применение хитина и его производных.

1.3 Использование хитина и его производных для приготовления лекарственных форм.

1.4 Особенности химических превращений хитина.

1.5 Методы синтеза карбоксиалкильных производных хитина.

1.6 Производные хитина с ковалентносвязанными биологически активными веществами.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Синтез карбоксиметилхитина.

2.2 Совершенствование методик анализа аминогрупп в производных хитина.

2.3 Получение Н-формы карбоксиметилхитина.

2.4 Синтез алкиловых эфиров карбоксиметилхитина.

2.5 Ацилирование аминов и гидразидов Н-формой карбоксиметилхитина.

2.6 Синтез гидразида карбоксиметилхитина.

2.7 Синтез и анализ азида карбоксиметилхитина.

2.8 Ацилирование аминов и гидразидов азидом карбоксиметилхитина.

2.9 Ацилирование антибиотиков бета-л акта мидов азидом карбоксиметилхитина.

2.10 Синтез полимерных гидразонов альдегидов.

2.12 Исследование противомикробной активности синтезированных производных карбоксиметилхитина.

2.13 Стандартизация наиболее биологически активных производных карбоксиметилхитина.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Общие физико-химические методы исследования.

3.2 Объект исследования.

3.3 Химический синтез соединений на основе хитина.

3.4 Качественные реакции на фрагменты, введённые в карбоксиметилхитин.

3.5 Определение чистоты производных карбоксиметилхитина.

3.6 Количественный анализ синтезированных производных карбоксиметилхитина.

3.6.1 Определение степени деацетилирования (Сд) хитина потенциометрическим титрованием.

3.6.2 Определение степени карбоксиметилирования (Скм) и степени деацетилирования (Сд) карбоксиметилхитина.

3.6.3 Определение числа сложноэфирных групп в алкиловых эфирах карбоксиметилхитина.

3.6.4 Определение числа гидразидных групп в карбоксиметилхитине.

3.6.5 Определение числа заместителей в натриевых солях N-замещенных амидов и замещённых гидразидов KMX.

3.6.6 Определение числа гидразонов в KMX.

3.7 Методы миробиологического исследования.

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. Одним из путей совершенствования лекарственных средств является создание их полимерных производных. Это позволяет регулировать фармакокинетику низкомолекулярных веществ (биодоступность, распределение в организме, длительность действия и направленный транспорт к мишени), а также снижать скорость их метаболизма и токсичность. Для получения полимерных лекарств широко используются природные полисахариды. Среди них большой интерес представляет хитин, сырьевая база которого огромна и полностью возобновляема. Хитин и его производные применяются в качестве биодеградируемых компонентов при создании таблеток, пленок, мембран, микрокапсул и других лекарственных форм. Производные хитина оказывают выраженное влияние на иммунитет и неспецифические факторы защиты организма, обладают ранозаживляющим действием. Их ценные свойства применяются не только в фармации и медицине, но и в биотехнологии, сельском хозяйстве и других областях народного хозяйства.

Для конструирования физиологически активных полимеров пригодны в основном растворимые носители, например карбоксиметилхитин. Карбоксиметилиро-вание не только придаёт полимеру растворимость в воде, но и позволяет использовать карбоксильную группу для химической модификации. К сожалению, в доступной литературе удалось обнаружить только 2 работы, в которых авторы использовали карбоксиметилхитин в реакциях с низкомолекулярными лекарственными веществами. В связи с этим работы по исследованию химических свойств карбоксиметилхитина имеют как теоретическую, так и практическую ценность. Работа выполнена как часть проводимых в СПХФА исследований по направлению "Поиск новых лекарственных средств в ряду модифицированных полисахаридов".

Целью исследования было изучить ацилирующую способность карбоксиметилхитина (KMX) в реакциях с О- и N-нуклеофилами и свойства образующихся продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи-, а) синтезировать растворимые образцы карбоксиметилхитина; б) отработать методику получения Н-формы KMX, изучить её ацилирующую способность в реакциях со спиртами, аминами и гидразидами и определить степень деацетилирования хитина в процессе его химической модификации; в) разработать методику синтеза гидразида карбоксиметилхитина и изучить взаимодействие его с ароматическими альдегидами; г) синтезировать азид KMX, изучить его устойчивость и ацилирующую активность в реакциях с N-нуклеофилами; е) определить условия ковалентного связывания с карбоксиметилхитином некоторых биологически активных веществ и изучить противомикробное действие продуктов.

Научная новизна работы. Работа является первым целенаправленным исследованием реакций карбоксильной группы карбоксиметилхитина с целью создания физиологически активных полимеров, в ходе которого получены около 30 ранее неизвестных производных полисахарида.

В работе впервые показано, что: карбоксиметилхитин в реакциях со спиртами, аминами и гидразидами образует соответственно сложные эфиры, замещенные амиды и гидразиды; гидразид карбоксиметилхитина с ароматическими альдегидами образует полимерные ацилгидразоны альдегидов; нитрози-рование гидразида карбоксиметилхитина приводит к образованию азида, который устойчив в кислой среде и ацилирует ароматические, алифатические амины и гидразиды. Исследованы условия и определены параметры, влияющие на скорость выше перечисленных реакций. Впервые получены полимерные производные некоторых бета-лактамных антибиотиков и 5-нитрофурфурола на основе карбоксиметилхитина и показано, что эти производные сохраняют противо-микробную активность.

Практическая значимость работы. Разработана схема химической модификации карбоксиметилхитина. Простые технологичные методы синтеза его ацильных производных позволяют вводить в полимер заданное количество низкомолекулярных фрагментов. Для всех синтезированных соединений разработаны методики анализа. При проведении предварительных испытаний противомикробной активности среди исследованных производных карбоксиметилхитина выявлены соединения, которые представляют интерес для дальнейшего изучения. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры химической технологии лекарств и витаминов СПХФА (акт внедрения).

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на научно-практической конференции "Фармация из века в век" (2008 г., Санкт-Петербург), на межвузовской научной конференции студентов и молодых учёных "Фармация в XXI веке: эстафета поколений" (2009 г., Санкт-Петербург), на б межрегиональной конференции "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2010 г.), на Десятой Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитоза-на" (Нижний Новгород, 2010 г.), на научно-практической конференции, посвя-щённой 65-летию факультета промышленной технологии лекарств СПХФА (Санкт-Петербург, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей, из них 2 в журнале, рекомендованном ВАК, и тезисы одного доклада.

выводы

1. Взаимодействие карбоксиметилхитина, его сложных эфиров, гидразидов и азидов с аминами, гидразидами и альдегидами в водных и органических средах - удобный метод создания физиологически активных полимеров, позволяющий варьировать число низкомолекулярных фрагментов, вводимых в полимерную цепь.

2. Карбоксиметилирование хитина, активированного раствором хлорида лития в диметилацетамиде, позволяет получать полностью растворимые образцы полисахарида с содержанием карбоксиметильных групп до 1,6 моль на моноса-харидное звено.

3. При химической модификации хитина наибольшая степень гидролиза аце-тамидных групп наблюдается при карбоксиметилировании полисахарида. Аце-тилирование полученных образцов позволяет удалить свободные аминогруппы, которые на последующих стадиях образуются в незначительных количествах.

4. Н - форму карбоксиметилхитина со степенью замещения более 0,9 можно получать из его натриевой соли с помощью ионообменной хроматографии. Она, также как и другие карбоксиметилполисахариды, образует алкиловые эфиры со спиртами в условиях автокатализа, а при нагревании с растворами аминов и гидразидов образует замещённые амиды и гидразиды. При этом ацилирующая способность карбоксиметилхитина меньше, чем соответствующих производных декстрана и целлюлозы.

5. Гидразинолиз алкиловых эфиров карбоксиметилхитина при комнатной температуре является лучшим способом синтеза его гидразидов, при этом гидразинолиз ацетамидной группы идёт не более чем на 1%.

6. Гидразид карбоксиметилхитина количественно реагирует с ароматическими альдегидами в водно-этанольном растворе при 18-25°С с образованием полимерных ацилгидразонов.

7. При нитрозировании гидразида карбоксиметилхитина получается азид, который более устойчив в водных растворах, чем азид карбоксиметилдекстрана и ацилирует ароматические и алифатические амины и гидразиды кислот при определённых значениях рН среды.

8. Полученные нами полимерные производные некоторых антибиотиков бета-лактамного ряда и 5-нитрофурфурола сохраняют противомикробную активность, но, как правило, меньшую по сравнению с активностью низкомолекулярных веществ.

1. Албулов, А. И. Хитозан в косметике/А. И. Апбулов, А. Я. Самуйленко, М. А. Фролова// Хитин и хитозан: получение, свойства и применение/под ред. Г. К. Скрябина и др. М.: Наука, 2002. - С. 360-363.

2. Ансон, С. И. Азид альгиновой кислоты и его реакции с ароматическими аминами /С.И. Ансон, Е.В. Новикова, A.A. Иозеп//Ж. прикл. химии. 2009. - Т. 82. - Вып. 3. - С. 451-454.

3. Ансон, С. И. О гидразиде альгиновой кислоты и его реакции с ароматическими альдегидами/ С. И. Ансон, А. А. Иозеп//Ж. прикл. химии. 2008. -Т. 81. - Вып. 4. - С. 611-613.

4. Афиногенов, Г. Е. Антимикробные полимеры/Г. Е. Афиногенов, Е. Ф. Пана-рин. СПб.: Гиппократ, 1993. - 264 с.

5. Бао Чи-мин. Использование хитина для производства искусственного волокна/ Бао Чи-мин//Хим. волокна. 1960. - №1. - С. 39-41.

6. Бессонова, Н. К. Разработка карбоксиэтильной схемы химической модификации полисахаридов с целью создания новых лекарственных веществ: дис. . канд. хим. наук:15.00.02/Н. К. Бессонова; СПХФА. СПб., 1998. -181 с.

7. Быкова, В. М. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитоза-на/В. М. Быкова, С. В. Немцев//Хитин и хитозан: получение, свойства и применение/под ред. Г. К. Скрябина и др. М.: Наука, 2002. - С. 7-23.

8. Вихорева, Г. А. Плёнки и волокна на основе хитина и его производных/ Г. А. Вихорева, Л. С. Гальбрайх// Хитин и хитозан: получение, свойства иприменение. Под ред. Г. К. Скрябина и- др. М1.: Наука, 2002. - С. 254279. ; ./ J '■,'" /■• .

9. Гланц, С. Медико-биологическая статистика/ С. Гланц. М.: Практика, 1999. - 460 с. . ■ ' ; , ' V

10. Горовой, Л. Ф. Сорбционные свойства хитина и его производных/Л. Ф. Го-ровой, В. Н. Косяков// Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. Г. К. Скрябина и др. Ml: Наука, 2002. - С. 217-246.

11. Государственная фармакопея Российской Федерации. XII изд. - М.: "Научный центр экспертизы средств медицинского применения", 2008. -704 с.

12. Государственная фармакопея СССР. X изд. - М.: Медицина, 1968. - 1042 с.

13. Данилов, С. Н. Изучение хитина. IV. Получение и свойства карбоксиметил-хитина/С. Н. Данилов, Е. А. Плиско//Журн. общей химии. 1961. - Т. 31. -- №2. - С. 469-473.

14. Дубинская, A.M. Применение хитина и его производных в фармации / A.M. Дубинская, А.Е. Добротворская//Хим.-фарм. журнал. 1989. - Т.23. — № 5. - С. 623-628.

15. Евстратова, К.И. Физическая и коллоидная химия: учеб. для фарм. вузов и факультетов/ К.И. Евстратова, H.A. Купина, Е.Е. Малахова. М.: Высш. шк., 1990. - 400 с.

16. Зеленков В. И. Применение хитозана в медицинской биотехнологии и лечебной косметике/В. И. Зеленков// Материалы 5-й конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана» 25.05.1999-27.05.1999. -Москва-Щелково: из-во ВНИРО, 1999. С.140-144.

17. Ильина, Т. Ю. Синтез замещенных гидразидов карбоксиметилдекстрана/Т. Ю. Ильина, М. Н. Пономаренко, А. А. Иозеп//Ж. прикл. химии. 1999. -Т. 72. - Вып. б. - С. 985-990.

18. Ильина, Т. Ю. Синтез и исследование замещенных амидов карбоксиметил-декстрана: дис. . канд. фарм. наук: 15.00.02 / Т. Ю. Ильина; СПХФИ. -СПб., 1995. 180 с.

19. Иозеп, А. А. Ацилирование аминов азидами карбоксиметилпроизводных полисахаридов/ А. А. Иозеп, М. Н. Пономаренко, Б. В. Пассет// Ж. прикл. химии. 1998. - Т.71. - Вып. 1. - С. 140-145.

20. Иозеп, А. А. Исследование ацилирующей способности сложных эфиров карбоксиметилдекстрана в реакциях с первичными и вторичными алифатическими аминами/А. А. Иозеп, Т. Ю. Ильина, Б. В. Пассет//Ж. прикл. химии. 1995. - Т. 68. - Вып. 1. - С. 106-109.

21. Иозеп, А. А. Реакции карбоксиметидекстрана и его сложных эфиров с ароматическими аминами/А. А. Иозеп, О. В. Сибикина, Т. Е. Кузнецова, Б. В. Пассет// Ж. прикл. химии. 1995. - Т. 68. - Вып. 2. - С. 307-311.

22. Иозеп, А. А. Синтез гидразидов, азидов и замещенных амидов карбокси-этилдекстрана/А. А. Иозеп, Н. К. Бессонова, Б. В. Пассет// Ж. прикл. химии. 1998. - Т. 71. - Вып. 6. - С. 998-1003.

23. Иозеп, А. А. Синтез замещенных амидов и гидразидов карбоксиметилауба-зидана/А. А. Иозеп, Л. Н. Горделянова, Б. А. Ивин//Ж. общей химии. -1992. Т. 62. - Вып. 8. - С. 1869-1877.

24. Иозеп, А. А. Синтез замещенных амидов карбоксиметилдекстрана/А. А. Иозеп, Т. Ю. Ильина, Б. В. Пассет//Ж. прикл. химии. 1994. - Т. 67. - Вып. 1. - С. 470-474.

25. Иозеп, А. А. Синтез и анализ гидразидов карбоксиметилпроизводных некоторых микробных полисахаридов/А.А. Иозеп, Л.Н. Куприянова, М.Н. Пономаренко, Б.А. Ивин, Б.В. Пассет//Ж. прикл. химии. 1996. - Т. 69. - IM. 9. - С. 1537-1542.

26. Иозеп, А. А. Синтез сложных эфиров карбоксиметилдекстрана/А. А. Иозеп, Т. Ю. Ильина, Б. В. Пассет//Ж. прикл. химии. 1993. - Т. 66. - Вып. 5. -С. 1106-1110.

27. Капуцкий, Ф. Н. Лекарственные препараты на основе производных целлюлозы/ Ф. Н. Капуцкий, Т. Л. Юркштович. Минск: Университетское, 1989. - 111 с.

28. Красникова, А. В. Ацилирование аминов азидами карбоксиэтилдекстрана /А. В. Красникова, А. А.'Иозеп//Ж. прикл. химии. 2004. - Т. 77. - Вып. 2. - С. 265-267.

29. Красникова, А. В. Ацилирование аминокислот производными декстрана/А.

30. B. Красникова, А. А. Иозеп//Ж. прикл. химии. 2004. - Т. 77. - Вып. 5.1. C. 801-804.

31. Красникова, А. В. Синтез и исследование полисахарид-аминокислотных конъюгатов: дис. . канд. хим. наук:15.00.02/А. В. Красникова; СПХФА. -СПб., 2004. 138 с.

32. Красникова, А.В. Спектрофотометрическое определение пенициллиновых антибиотиков/ А.В. Красникова, А.А. Иозеп // Хим.-фарм. журнал 2003. -Т. 37. - № 9 - С. 49-51.

33. Кращенко, В. В. Хитозан многофункциональная пищевая добавка при производстве продуктов из гидробионтов/В. В. Кращенко//Приморье -край рыбацкий: материалы научно-практической конференции. Владивосток, 26 апреля 2002 г. - Владивосток, 2002. - С. 109-111.

34. Леваньков, С. В. Адсорбционные свойства хитозана по отношению к белковым веществам/С. В. Леваньков, Е. В. Якуш//Изв. Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра. 2001. - С. 121-128.

35. Максимов, В.И. Метод измерения гексозаминов в хитиновых гидролиза-тах/В. И. Максимов, В. Е. Родоман, Е. В. Максимова//Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35. - № 2. - С. 227-230.

36. Марч, Дж. Органическая химия, в 4-х томах. Т. 2./Дж. Марч. М.: Мир, 1987, - 504 с.

37. Милушева, Р. Ю. О структурных особенностях хитина ракообразных Арала, хитозанов на их основе и их применения/ Р. Ю. Милушева, Н. Л. Воропаева, И. Н. Рубан, Г. В. Никонович, С. Ш. Рашидова //Химия природных соединений. 2000. - N2. - С. 97-99.

38. Нудьга, Л. А. О-алкилирование хитозана/Л. А. Нудьга, Е. А. Плиско, С. Н. Данилов //Журн. общей химии. 1973. - Т. 43. - Вып. 12. - С. 2752-2756;

39. Нудьга/ Л. А. Производные хитина и хитозана и их свойства/Л. А. Нудьга/ Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Прд ред. Г. К. Скрябина идр: Мі: Наука, 2002. - С. 141-177. \ ./■'

40. Нудьга> Л. А. Цианэтилирование хитозана/Лі А. Нудьга; Е. А: Плиско; С. Н.

41. Данилов//Ж. общей химии. 1975. - Т. 45. - Є. 1145-1149;'

42. Озерецковская, О. Л. Хитозан как элиситор индуцированной устойчивости растений/О. Л. Озерецковская, Н. И. Васюкова, С. В. Зйновьва// Хитин и хитозан:. получение, свойства и применение. Под ред^ Г." К. Єкрябина и др. М.: Наука, 2002. - С. 339-346.

43. Платэ, H. A. Физиологически' активные , полимеры/Н- А. Платэ, А. Е. Васильев. М.: Химия, 1986. - 296 с.

44. Пономаренко, М. Н. Синтез и исследование антибиотик- и фермент-полисахаридных конъюгатов: дис. . канд. фарм. наук:15.00.02/М. Н. Пономаренко; СПХФА. СПб., 1998. - 174 с.

45. Пономаренко, М. Н. Синтез и исследование рибонуклеаза-полисахаридных препаратов/М. Н. Пономаренко, А. А. Иозеп, Б. В. Пассет//Ж. прикл. химии. 1999. - Т. 72. - Вып. 5. - С. 823-827.

46. Райхардт, К. Растворители и эффекты среды в органической химии/К. Рай-хардт. М.: Мир, 1991. - 763 с.

47. Регистр лекарственных средств России РЛС энциклопедия лекарств. 17 вып./Гл. ред. Г. Л. Вышковский. - М.: "РЛС - 2009'!, 2008. - 1440 с.

48. Российское хитиновое общество Электронный ресурс. Электрон, дан. (1 файл). - М., [2000-]. - Режим доступа: http:/ www.chitin.ru/historv.htm, свободный. - Загл. с экрана. - Яз. рус.

49. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/под ред. Р. У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. - 832 с.

50. Самойлова, Н. А. Новые ионообменные и аффинные сорбенты на основе полиэлектролитных комплексов хитозана/Н. А. Самойлова, М. А. Краюхи-на, И. А. Ямсков//Журн. физ. хим. 2002. - Т. 76. - N9. - С. 1660-1665.

51. Свердлова, О. В. Электронные спектры в органической химии/О. В. Свердлова. 2-е изд. - Л.: Химия, 1985. - 248с.

52. Сибикина, О. В. Ацилирование ароматических аминов карбоксиметилдек-страном в присутствии малых количеств воды/О. В. Сибикина, А. А. Иозеп, Б. В. Пассет// Ж. прикл. химии. 2004. - Т. 77. - Вып. 7. - С. 1161-1163.

53. Сибикина, О. В. Исследование реакции карбоксиметилполисахаридов и их этиловых эфиров с аминами/О. В. Сибикина, А. А. Иозеп, Б. В. Пассет// Ж. прикл. химии. 2004. - Т. 77. - Вып. 2. - С. 268-270.

54. Сибикина, О. В. Химическая модификация микробных полисахаридов биологически активными аминами: дис. . канд. хим. наук:15.00.02/ О. В. Сибикина; СПХФА. СПб., 2000. - 150 с.

55. Соколов, В. Б. Синтез и исследование лактонов полисахаридкарбоновых кислот и ацилирование ими низкомолекулярных БАВ: дис. . канд. хим. наук:15.00.02 / В. Б. Соколов; СПХФА. СПб, 1999. - 167 с.

56. Способ получения карбоксиметилового эфира хитина: авт. свид. 1666459: С08 В37/08/Д. Ю. Гладышев, Г. А. Вихорева, Л. С. Гальбрайх; опубл. 30.07.1991. 2 с.

57. Усманов, Т.И. Исследование распределения заместителей в карбоксимети-ловых эфирах полисахаридов методом ЯМР 13С/ Т.И. Усманов, У.Г. Каримова, А. Сарымсаков // Высокомолекулярные соединения. 1990. - Т. 32А. -№6. - С. 1176-1183.

58. Феофилова, Е. П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы и использования/Е. П. Феофилова // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение/под ред. Г. К. Скрябина и др. М.: Наука, 2002. - С. 100-112.

59. Цыган, В.Н. Хитозан как парафармацевтик/ В.Н. Цыган, К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин//Рынок БАД. 2002. - 2(4). - С. 316-317.

60. Энциклопедия полимеров. Ч. 1 /гл. ред. В. А. Каргин. М., "Советская энциклопедия", 1972. - С. 954.

61. Amaral, I. F. Chemical modification of chitosan by phosphorylation: An XPS, FT-IR and SEM study / I. F. Amaral, P.L. Granja, M. A. Barbosa //Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 2005. - Vol. 16. - N12. - P. 15751593.

62. Anwendung Mittex. Mishvliese aus polyelectrolytpierid mikroaftern mit heilungsaktiver wirkang fur die mediziniisdu/ Anwendung Mittex//Sheweizerische Fachschrift fur die Textilwirtschaft. 2000. -N5. - P. 10.

63. Badawy M. E. I. Bactericidal and fungicidal activities of different molecular weight chitosan samples/ Badawy M. E. I., Ahmed S. M., Rabea E. I.//J. Pest. Cont. and Environ. Sci. 2006. - Vol. 14. - N.2. - P. 19-34.

64. Carboxymethyl-chitin derivatives and use thereof: US Patent: 5298488, A61 K37/02; C07/K5/08 /Masajoshi Kojima, Hiroyuki Komazawa; Mar. 29, 1994. -22 p.

65. Chang, Jin. Application of nanoparticles in controlled release of anticancer drugs: preparation and evaluation in vitro of methtrexate-carboxymethylchitosan nanoparticles/ Chang, Jin//Chin. J. Biomed. Eng. -1996. Vol. 15. - N. 2. - P. 102-106.

66. Chen Li-Hong. Preparation and controlled release of imiclapro-mide/carboxymethylchitosan gel-beads/Chen Li-Hong, Zhao Jing//Fine chem. 2005. - Vol. 22. - N9. - P. 653-657.

67. Chen, L. Relationship between molecular structure and moisture-retention ability of carboxymethylchitin and chitosan/ L. Chen, Y. Du, H. Wu, L. Xiao//J. Appl. Polym. Sci. 2002. - Vol. 83. - P. 1233-1241.

68. Chen, Xiguang. Studies on the cell toxicity of б-O-carboxymethylchitosan/ Chen Xiguang; Wang Zhen; Liu Wanshun; Liu Chenguang//Tsingtao Qingdao Haiyang Daxue Xuebao. 2000. - Vol. 30. - N2. - P. 221-224.

69. Curotto, E. Quantitative determination of chitosan and the percentage of free amino groups/E. Curotto, F. Aros//Anal. Biochem. 1993. - Vol. 211. - P. 240-241.

70. De Abreu, F. Preparation and characterization of carboxymethylchitosan/F. de Abreu, S. P. Campana-Filho//Polimeros: Cientia e Tecnologia. 2005. - Vol.• 15. N.2. - P. 79-83.

71. Du Zhilong. Изучение влияния хитозанового покрытия и других видов обработки скорлупы на сохранение свежести яиц/ Du Zhilong, Gao Zhenjiang, Wu Wei, Li Gang//J. China Agr. Univ. 2004. - Vol. 9. - N3. - P. 82-84.

72. Feisal Khoushab. Chitin research revisited/Feisal Khoushab, Montarop Yamab-hai//Mar. Drugs. 2010. - Vol. 8. - P. 1988-2012.

73. Film selectively permeable to carbon dioxide and food packaging film comprising the same: заявка 1245617: ЕПЦ, МП К7, C0805/18, B32 В9/02/ Hosoda Tomonori, Oba Hiroyuki, Saika Toru, Kawaguchi Katsumi; опубл. 02.10.2002.

74. Gao, Huiju. Study on effect of N-carboxymethylchitosan on detached mulberry leaves and silkwarm physiology/Gao, Huiju; Mu, Zhimei; Min, Weiwei; Li, Hua//Canye Kexue. 2003. - 29. - N4. - 387-390.

75. Geng Yanli. Preparation a novel calcium phosphate cement using N-methylene phophonic chitosan a gelling agent/Geng Yanli, Ruan Ziwei, Li Dongxu //J. Wuhan Univ. Mater. Sci. Ed. 2005. - N20. - P. 304-307.

76. Gonzales, G. Pepsin Immobilised by Covalent Binding to a Chitosan Deriva-tive/G. Gonzales, J. Alea//J. Chem. Technol. Biotechnol. 1995. - Vol. 63. -N3. - P. 247-248.

77. Guinesi L. S. The use of DSC curves to determine the acylation degree of chitin and chitosan samples/ Guinesi L. S., Cavalheiro E. T.//Thermochimica Acta. 2006. - Vol. 444. - P. 128-133.

78. Hu Ken. Получение и свойства осажденного гибридного покрытия фосфат кальция/хитозан на поверхности титанового сплава/ Ни Ken, Ни Hao-Bing, Lin Chang-Sian//Chem. J. Chin. Univ. 2002. - Vol. 23. - N11. - P. 21422146.

79. Hu, Qiaoling. Study on a new antiarthritic injection of O-carboxymethylchtosan/ Ни, Qiaoling; Zhang, Zhongming; Zhang, Ming; Gao, Gende//Shengwu Yixue Gongchengxue Zazhi. 2004. - Vol. 21. - N1. - P. 25-27.

80. Hua Deng-feng. Обесцвечивание красителей в сточных водах хитозаном, сульфатом алюминия или полиаммоний хлоридом/ Hua Deng-feng//J. Qing-dao Univ. Eng. Technol. Ed. 2004. - Vol. 19. - N3. - P. 65-68.

81. I. M. van der Lubben. Chitosan for mucosal vaccination/ I. M. van der Lubben, J. C. Verhoef, G. Borchard and H. E. Junginger//Advanced Drug Delivery4Re-wiews. 2001. - Vol. 52. - Iss. 2. - P. 139-144'.

82. Ilium, L. Novel- chotosan-based delivery systems for the nasal administration of a LHRH-analogue/ L. Ilium, P. Watts, A. N. Fisher, Gill I., Jabbal, Davis S. S.//STP pharma sci. 2000. - Vol. 10. - N1'. - P. 89-94.

83. Kast С. E. Chitosan-thioglycolic acid conjugate as scaffold in tissue engeneer-ing/Kast С. E., Frick W., Kapeller В., Eberl H., Falkner E., Macfelda^ K., Bern-cop-Schnarch A.//Sci.pharm. 2001. - 69. - N3. - S. 111-112.

84. Kato, Y. Application of Chitin and Chitosan Derivatives in the Pharmaceutical Field/ Y. Kato, H. Onishi, Y. Machida//Current Pharmaceutical Biotechnology.2003. Vpl. 4. - N. 5 - P. 303-309.

85. Kato, Y. N-succinyl-chitosan as a drug carrier: water-insoluble and water-soluble conjugates/ Y. Kato, H. Onishi, Y. Machida//Biomaterials. 2004. -Vol. 25. - P. 907-915.

86. Kawai, Norisha. The effect of natural polysaccharide focusing on marine polysaccharides/ Kawai, Norisha//Fragrance journal. 2005. - Vol. 33. - N3. - P. 39-44.

87. Kilinq, AN. Immobilisation of Pancreatic Lipase on Chitin and Chitosan/Ali Kilinq, Teke Mustafa, Onal Seqil, Telefoncu Azmi//Preparative Biochemistry and Technology. 2006. - Vol. 36. - N. 2. - P. 153-163.

88. Koide, S. S. Chitin-chitosan: benefits and risks/S. S. Koide//Nutrition Research. 1998. - Vol. 18. - N. 6. - P. 1091-1101.

89. Krajewska, B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a rewiew/ B. Krajewska//Enzyme and Microbial Technology.2004. Vol. 35. - Issue. 2-3. - P. 126-139.

90. Large intestinal delivery composite: пат. 6248362 США/ МПК7 A61 K9/16 /Meiji Seika Kaisha et а!.; Опубл. 19.06.2001. 5 p.

91. Li, Zhi. Antimicrobial activity of О-carboxymethylchitosan/ Li, Zhi; Liu, Xiaofei; Guan, Yunlin//Riyong Huaxue Gongye. 2000. - Vol. 30. - N3. - P. 10-11.

92. Liu, Wanshun. Study on toxicity of carboxymethylchitosan/Liu Wanshun;Chen Xiguang; Zhang Xuecheng; Liu Chenguang; Long Rishan; Jin Liu; Lang Gang-hua; Wang Senmin//Zhongguo Haiyang Yaowu. 1997. - Vol. 16. - N3. - P. 17-19.

93. Liu, X. F. Antimicrobial action of chitosan and carboxymethylated chitosan/X. F. Liu, Y. L. Guan, D. Z. Yang//J. Appl. Polym. Sci. 2001. - Vol. 79. - N7. -P. 1324.

94. Masuko, T. Thiolation of Chitosan. Attachment of Proteins via Thioether Formation/T. Masuko et al.//Biomacromol. 2005. - Vol. 6. - P. 880-884.

95. Method of manufacturing an osteoconductive substance: заявка 105739 ЕПЦ МПК7 A61K6/097 Аб1Кб/0331М00110201/Заявл. 17.05.2000; опубл. 22.11.2000. 5 с.

96. Miwa, A. Development of novel chitosan derivatives as micellar carriers of tax-ol/ Miwa, Akio; Ishibe, Atsuo; Nakano, Mari; Yamahira, Tohomoro; Itai, Shige-ru; Jinno, Shuji; Kahahara, Hiroyuki//Pharm. Res. 1998. - Vol. 15. - N12. -P. 1844-1850.

97. Muzzarelli, R. A. A. Chitin /R. A. A. Muzzarelli. N. -Y.: Pergamon Press, 1977. - 309 p.

98. Muzzarelli, R. A. A. Immobilisation of Enzymes on Chitin and Chitosan/R. A. A. Muzzarelli//Enzyme and Microbial Technology. 1980. - Vol. 2. - Issue. 3 - P. 177-184.

99. Nishimura, S. Bioactive chitin derivatives. Activation of mouse-peritoneal macrophages by O-carboxymethylchitins/S. Nishimura, N. Nishi, S. Toku-ra//Carbohydr. Res. 1986. - Vol. 146. - P. 251-258.

100. Ohonogi, S. Влияние типов носителей на физико-химические свойства и растворимость твердой дисперсии офлоксацина/ S. Ohonogi, J. Sirithunya-lung, В. Sirithunyalung, P. Walschann, H. Viernstein //Sci. Pharm. 2002. -70. - N3. - c. 309-316.

101. Ohya, Y. Synthesis and antitumor activity of 6-O-carboxymethylchitin fixing 5-fluorouracils through pentamethylene, monomethylene spacer groups via amide, ester bonds / Y. Ohya//Chem. Pharm. Bull. 1992. - Vol. 40. - N2. -P. 559-561.

102. Onishi, H. Preparation of Carboxymethyl-chitin Nanoparticles by Covalent Crosslinking and Their In Vitro Evaluation/ H. Onishi, K. Kume, K. Koyama and Y. Machida//The Open Drug Delivery Journal. 2008. - Vol. 2. - P. 20-25.

103. Ouchi, T. Synthesis and antitumor activity of chitosan carrying fluorouracils/T. Ouchi, T. Banba, M. Fujimoto, S. Hamamoto//Macromol. Chem. 1989. - Vol. 190. - P. 1817-1825.

104. Process of preparation of disinfectant solution of simple chitosan quaternary ammonium salt complexed with I2: CN 1470107: CI A01N43/16 / Zhao, Xia; Yu, Guanli; Faming Zhuanli; Publ. 17 June 2003. 5 p.

105. Rabea Entsar I. Chitosan as Antimicrobial Agent: Application and Mode of Ac-tion/E. I. Rabea, M. E.-T. Badawy, С. V. Sevens, G. Smagghe, W. Steur-baut//Biomacromol. 2003. - Vol. 4. - N. 6. - P. 1457-1465.

106. Rocha A. V. L. Проникновение лекарств через хитозановые мембрэны/Rocha А. V. L., Dantas Т. N. L., Fonseca 3. L. С., Pereira М. R.//J. Appl. Polym. Sci. 2002. - Vol. 84. - N1. - P. 44-49.

107. Ruan Ziwen. Preparation and compressive strength of calcium phosphate bone cement containing N,0-carbohymethylchitosan/Ruan Ziwen, Weng Weihao, Gong Yanli, Li Dongwu//J. Wuhan Univ. Mater. Sci. Ed. 2005. - Vol. 20. - P. 297-300.

108. San Tin. Synergistic Combinations of Chitosans and Antibiotics in Staphylococcus aureus/Chu Sing Lim, Meena Kishore Sakharkar and Kishore Ramaji Sak-harkar//Letters in Drug Design & Discovery. 2010. - Vol. 7. - P. 31-35.

109. Sashiwa, H. Novel N-alkylation of chitosan in Michael type reaction/ H. Sashiwa, Y. Shigemasa, Roy Rene//Chem. Lett. 2000. - N8. - P. 862-863.

110. Seo S.-B. Приготовление многофункционального низкомолекулярного хи-тозана и его применение в косметических препаратах/Seo S.-B., Ryu C.-S., Kim hh-B., Aha G.-W., Jo B.-K., Kajiuchi T.//Journal Eng. Vers. 2002. - Vol. 128. - N9. - P. 46-47.

111. Sevim Rollas. Biological activities of hydrazone derivatives/Sevim Rollas, S. Guniz Kucukzugel//Molecules. 2007. - Vol. 12. - P. 1910-1939.

112. Siang, Y. Влияние покрытия хитозаном на срок хранения и качество плодов Dinocarpus longan/Siang Y., Li Y.//Food chem. 2001. - Vol. 73*. - N2. -P. 139-149.

113. Singh, D. K. Biomedical applications of chitin, chitosan, and their derivatives/D. K. Singh, A. R. Ray//Rev. Macromol. Chem. Phys. 2000. - C40. -N1. -P. 69-83.

114. Solid preparations containing chitosan powder and process for producing the same: заявка 1203500 ЕПВ: МПК7 A61K47/36; Опубл. 08.05.2002. 5 c.

115. Stiedeh К. M. Evaluation of chitosan-succinate and chitosan phthalate as enteric coating polymers for diclofenac sodium tablets/Stiedeh К. M., Taha M. O., Al-Khatib H.//Drug Deliv. Sci. and Technol. 2005. - Vol. 15. - N3. - P. 207211.

116. Struszczyk, H. New applications of chitin and it's derivatives in plant protection/ H.Struszczykj H. Pospiesznyi//Appl^ Chitin Chitosan. 1997. - P- -171184. ' .■."■' ■ ' ■

117. Struszczyk, H. Bioactivity of chitosans/i HL Struszczyk;; H. Pbspieszny; O:; KiVe-• kas//Chitin Enzymol., Proc. Int. Symp.,.2nd . -1996.: P. 497-502. .'.

118. Sun,. L. Синтез: гидрогелей карбоксиметилхитозана w их применение; для регулируемого выделения лекарств/ l. Sun, Y. Du, Li. Chen, К. Huang, X. Chen //Acta Polym. Sin.,- 2004. N2. - P. 191-195.

119. Sun,. L. .Preparation, characterizationfand^antimicbobial activity of quarternised carboxymethylchitosamand application? as pulp-cap/ L. Sun; Y. Du;. L. Fan; X. Chen; J. Yang //Polymer. 2006. - Vol.47. -N6; - P. 1796-1804'.

120. Thanon, M; Trimethylated chitosan derivatives; are:effective.and safe: penetration? enchancers; for oral: peptide:drug.delivery>and=adsorbtion/ MIThanon; J. C.

121. Verhoeg //STP pharma sci. 2000. - Vol. 10.- N4. - P. 315-319. /

122. Thawatchai Phaechamud. Hydrophobically Modified? Chitosans and^Their Phar-.maceutical Applications/ ThawatchanPhaechamud//Iht.'.j; Pharm: Sci-Tech.2008. Vol. 1. - Iss. 1. - P. 1-9. ' ; \ \ ' ; :

123. Trink Binh. Токсичность хитина и хитозана/Trink Binh; Pham Le Dung, Cao Van Diem//Tap Chi Hoa Hoc. 2002. - Vol. 40. - №2. - P.-74-76.

124. Trujillo, R. Preparation of carboxymethylchitin/Ralph Trujillo//Carbohydr. Res. 1968. - Vol. 7. - P. 483-485.

125. Vikhoreva, G. A. Immobilisation of proteolytic enzymes in carboxymethylchitin films and sponges (rewiew)/ G. A. Vikhoreva, K. P. Khomyakov, I. Yu. Sakha-rov, L. S. Galbraikh//Fibre Chemistry. 1995. - Vol. 27. - N. 5. - P. 337.

126. Vikhoreva, G. A. Rheological properties of solutions of chitosan and carbox-ymethylchitin/G. A. Vikhoreva, L. S. Galbraikh//Fibre Chemistry. 1997. -Vol. 29. - N5.—P. 287-291.

127. Wang Qin. Гидратационные и увлажняющие свойства N-сукцинилхитозанов/ Wang Qin, Wang Li, Wang Ai-qin//China Surfact. Deterg. and Cosmet. 2005. - Vol. 35. - N4. - P.223-226.

128. Wang Xue-feng. Получение адсорбентов металлов на основе хитозана и их характеристика/Wang Xue-feng, Yang Nong-shou, Chen Tian//J. Funct. Polym. 2003. - Vol. 6. - N3. - c. 327-331.

129. Wishiewska-Wrona, M. Estimation of polymer compositions containing chitosan for veterinary applications/ M. Wishiewska-Wrona, A. Niekrasrewicz; H. Struczcyk; K. Guzinska //Fibres and Text. East. Eur. 2002. - Vol. 10. - N3. -P. 82-85.

130. Wu, Zhenghong. Hypoglaemic efficacy of TMC-coated insulin liposomes after oral administration in mice/ Wu, Zhenghong; Ping, Qinneng; Lei, Xiaomin; Chen, Yan//Zhongguo Yaoxue Zazhi. 2003. - Vol. 38. - N9. - P. 678-682.

131. Xu Ping. Исследование бактериостатического действия производных хитина в табаке/Xu ping, Ning Ming, Yu shi-sha//J. Funct. Polym. 2002. - 15. -N1. - c. 53-58.

132. Yong, Jisheng. Application of carboxymethylchitosan in cosmetics/ Yong, Ji-sheng//Jingxi Huagong. 1997. - Vol. 14. - N4. - c. 62-64.

133. Zhang, Hong-Juan. Design, synthesis and characterization of O-carboxymethyl galactosylated chitosan derivatives/ Zhang, Hong-Juan; Ding, Ya; Zhang, Can; Shen, Jian Zhong-guo //Tianran Yaowu. 2004. - Vol. 2. - 6. - P. 354-358.

134. Zhanyong Guo. Novel derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro/Zhanuong Guo et al.//Carbohydr. Res. 2006. - Vol. 341. - P. 351-354.

135. Zhu Ai-ping. Preparation and characterization of a novel Si-containing cros-slinkable O-butyryl chitosan/Zhu Ai-ping, Wu Hao, Shen Jian//Colloid and Polymer Science. 2004. - Vol. 282. - №11. - c. 1222-1227.

136. Выражаю глубокую признательность за помощь и поддержку в работе своему научному руководителю профессору кафедры химической технологии лекарственных веществ и витаминов Анатолию Альбертовичу Иозепу.

137. Выражаю благодарность за оказанную помощь и содействие при проведении микробиологических испытаний доценту кафедры микробиологии Ольге Михайловне Тихомировой.

138. За предоставленную возможность выполнения диссертационного исследования благодарю руководство Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии.